オルガノシススライス培養は、神経発達および変性または再生過程を研究するための強力なツールです。この技術は、迅速にそれらの神経保護電位の候補分子をスクリーニングするために使用することができます.この方法は、組織セットアーキテクチャおよびネイティブ細胞結合がセクションの平面内に保存されるため、解約された一次細胞培養物と比較して、生体内の状態を密接に模倣する。
ここでは、発達中の小脳におけるプルキンエ細胞死の研究を示す。しかし、オルガノシスのスライス培養は、ほぼすべての中枢神経系領域における神経変性疾患をモデル化するのに同様に適している。ジェニファー・ラコトマモンジとの手順を実証するのは、私の研究室の技術者ショーン・マクダーモットです。
小脳スライスを収穫する前に、滅菌されたバイオセーフティキャビネットで、6ウェル培養プレートの各ウェルを1ミリリットルの真空濾過培養培地で満たし、目的の薬理剤を治療井戸に加え、同量の車両を制御井戸に加える。滅菌鉗子を使用して、各ウェルに1つの0.4マイクロメートルの孔サイズPTFE膜フィルターインサートを置き、各膜と媒体の界面で気泡を避け、37°Cと5%の二酸化炭素インキュベーターで2時間平衡化します。小脳を収穫するには、ストレートドレッシング鉗子を使用して鼻で子犬の頭をつかみ、まっすぐなアイハサミを使用して後端から正中線に頭皮を切り開きます。
小脳に損傷を与えないように、はさみの先端を外側に向けて頭蓋骨を切り開き、ヘラを使って冷たいHBSSとグルコース1ミリリットル当たり5ミリグラムを含む60ミリメートル皿に脳を移す。ストレートドレッシング鉗子を使用して小脳を慎重に解剖し、滅菌湾曲した細かい鉗子を使用して組織チョッパーの切断テーブルのプラスチックディスクに組織を置きます。切断テーブルを回転させて、パラサジタル切片の獲得を可能にする組織の向きを変え、ブレードが組織の端に配置されるまで、テーブルリリースノブを右に引いて切断テーブルを移動させます。
その後、スライスの厚さを350マイクロメートルに調整し、ブレードの速度を中程度に調整し、チョッパーを開始します。小脳全体がスライスされたら、チョッパーをオフにします。滅菌鉗子を使用して、新しい60ミリメートル皿の上にディスクを保持します。
スライスが皿に落ちるようにディスク上のHBSSプラスグルコースを洗い流すために転送ピペットを使用してください。次に、サンプルをできるだけ最小限に触れ、マイクロプローブを使用してスライスを分離します。トランスファーピペットを使用して、ベルミに近い小脳のセクションを6ウェルプレートの個々の細胞培養挿入物に選択し、マイクロプローブを使用して各インサートの中央にスライスを配置します。
すべてのスライスが配置されたら、余分なHBSSとグルコースを慎重に吸引し、プレートを細胞培養インキュベーターに戻します。免疫蛍光染色の場合は、各ウェルから上清を取り除き、挿入物をPBSで洗浄します。各インサートのウェルに冷たい4%パラホルムアルデヒドの1ミリリットル、1時間の各挿入物の上に500マイクロリットルでスライスを固定します。
固定の終わりに、各挿入物の下に新鮮なPBSの1ミリリットルと軌道シェーカー上の各洗浄ごとに各挿入物の上に新鮮なPBSの500マイクロリットルで10分間4回挿入物を洗浄します。24ウェルプレートの各ウェルに500マイクロリットルのPBS-TBを事前に充填し、ペイントブラシを使用して各細胞培養インサートの小脳スライスを24ウェルプレートの個々のウェルに移します。室温でスライスを1時間透過してブロックします。
インキュベーションの終わりに、細胞に、軌道シェーカーの摂氏4度で一晩PBS-TBで希釈された目的の一次抗体の200マイクロリットルで細胞にラベルを付ける。翌朝、シェーカーで1回10分間スライスを10分間洗浄し、500マイクロリットルの新鮮なPBSを洗浄してから、サンプルに適切なフルオロフォア共役二次抗体をシェーカーの室温で2時間標識し、光から保護する。インキュベーションの終わりに、光から保護された室温で10分間、ウェルあたり500マイクロリットルの適切な核染色を有するセクションに対抗する。
そして、ガラスのスライドにスライスをマウントするために転送ピペットを使用しています。その後、PBSで水分補給し、約80マイクロリットルの取り付け媒体でコーティングされたカバーリップで組織を取り付ける前に、セクションを完全に乾燥させます。取り付け媒体が硬化したら、小脳部はイメージ化する準備ができている。
出生後6日目には、プルキンエ細胞の生存率は対照サンプルにおいて低く、既知の脆弱性ウィンドウと一致する。ドナー動物が高齢になり、この重要な期間を終了するにつれて生存率が増加します。塩化カリウムの高濃度で小脳スライスの治療は、それらの脱分極と生存の誘導に成功をもたらす。
一貫した再現性のある結果を得るためには、健康な小脳部を選択し、培養を可能な限り効率的に行うことが重要です。培養後のアプリケーションは、免疫蛍光を超えています。organotypicスライスは、ゲノムタンパク質発現研究、および電気生理学およびカルシウムライブイメージングを用いた神経回路活動のモニタリングに使用することができる。
