この原稿は2011年5月26日に亡くなった博士Wenlan王の記憶に捧げられています。我々は寛大に本研究で用いたHBG3 MES細胞を提供するために博士はダグラスA.カーに感謝します。この作品は、ヌムールによって資金を供給され、研究資源のナショナルセンター（NCRR）、およびセンターをサポートするNCRRからCOBRE助成賞（5 P20 RR020173-05）のINBREプログラムの下で助成金（2 RR016472-10）子供たちは、ウィルミントン、デラウェア州、アメリカ合衆国のためにアルフレッドI.デュポン病院で小児研究。

1。ステップ1：マウス胚性幹（MES）細胞培養（タイミング：3日間） 1。めっきの主マウス胎児線維芽細胞（PMEF） <ol><li> PMEF接着のためにゼラチンでコート4 100 mmの組織培養皿。各ディッシュに0.1％ゼラチン溶液（StemCell Technologies）を8 mlを加え、室温で30分間インキュベートする。 </li><li>料理からゼラチンの過剰を削除します。お皿を洗わない。 </li><li>約が含まれているマイトマイシンC不活化PMEF（ミリポア社製）1バイアルに希釈する。 5×10 6 PMEFメディアの40ミリリットルに細胞（ 表1のレシピを参照）および4 100 mmの組織培養皿上にプレート。 PMEFは、MES細胞のフィーダー層を提供しています。 </li><li> PMEFは、MESの細胞培養を追加する前に、少なくとも一日に播種する必要があります。 PMEFは、めっき後1週間まで使用することができます。 </li></ol> 2。メッキMES細胞運動ニューロンにMES細胞の分化の効率を監視するには、我々はHBG3、運動ニューロン特異的プロモーターの制御下Hb9 eGFPを発現するトランスジェニックマウス由来のES細胞株を使用していました。 <ol><li>霜37℃の水浴でHBG3 MES細胞の1バイアル（約1×10 7、博士ダグラスカー、ジョンズ·ホプキンス大学によって寄贈されました）。 15 mlのチューブにES培地（ 表1に示すレシピを参照してください）5 mlを加え、5分間800rpmで細胞をスピンダウンする。 </li><li>は10 ng / mlの最終濃度で新しく追加された白血病抑制因子（LIF）とESのメディアを20mlの上清を吸引し、再懸濁しMES細胞。注：LIFは、使用日に追加されるべきであり、未分化状態のMES細胞を維持する必要があります。 </li><li>各皿にPMEFから10ミリリットルPMEFメディアを取り出して、それぞれの皿にHBG3 ES細胞懸濁液10mlを追加します。 </li><li>メッキ後24時間は、MESの細胞は、サイズが図1Bに矢印で示されたコロニーに似た小さなコロニーを形成しています。メッキ後72時間、コローニサイズのESの増加は、多くは直径が約100μm（ 図1B、矢印で示される）である。これらの細胞は、分化のための準備が整いました。メディアは、細胞の増殖を維持するために、毎日交換する必要があります。 </li></ol> 2。ステップ2：神経誘導（タイミング：2日間） 運動ニューロンにMES細胞の分化を誘導するために、MES細胞はPMEFから分離し、懸濁液の環境で栽培する必要があります。ゼラチンコートしたフラスコをMES細胞からPMEFを区切るために使用されています。 <ol><li> MESのコロニーは、神経誘導（分化0日として定義される）、室温で30分間0.1％ゼラチン（18ミリリットル/フラスコ）でコート2 T150フラスコの準備ができていると、余分なゼラチンを削除し、1X PBSで三回洗浄するとき。注：各100mmディッシュの文化はPMEFを分離する1つのT150-ゼラチンコートしたフラスコが必要になります。 </li><li>慎重に緩く接続されたコロニーを取り除くために、ないことを確認し、吸引して、メディアを削除します。 10ミリリットルのPBSを簡単に追加LYし、洗浄ステップを完了するために吸引して除去します。 </li><li> PMEFからMES細胞を分離するために、トリプシン/ EDTA（3ミリリットル/皿、StemCell Technologies）を0.25％を追加して、プレートからの幹細胞とPMEFデタッチされるまで37℃で3〜5分間インキュベートする。コロニー（約15-20倍）を破るには、上下LIFおよびピペット細胞なしで15ミリリットル新鮮なESのメディアを追加します。その後、0.1％ゼラチンでコーティングされたT150フラスコに追加して、37℃で30分間インキュベート℃、 ES細胞は、フローティングでなければなりませんしながらインキュベートした後、PMEFはゼラチン表面に添付しなければなりません。 50 mlチューブに浮遊MES細胞を収集します。 </li><li> （ 表1のレシピを参照してください）神経分化培地の10ml中に800回転と再懸濁した細胞でスピンダウンする。 </li><li>血球計算板を用いて細胞数をカウントし、プレート100 mmの細菌または懸濁液を培養皿の上に約2×10 6 MES細胞。これらのプレートは、懸濁培養の成長を許可し、胚様体（EBS）の形成を推進しています。 </li><li>差異にる1日目は、MESの細胞は光学顕微鏡下に表示されている小さな浮遊凝集体（EBS）を形成する。任意のキャリーPMEFは皿に添付してください。 3分間低速（500 rpm）で15 mlのチューブと遠心分離機に懸濁細胞とメディアを転送します。慎重に培地を吸引除去する、新たな細菌の皿にプレートの細胞をペレット化しEBSに新鮮な神経分化培地10mlを追加し、。メディアの補充に加えて、このステップは、前のステップから引き継がれ、任意のPMEFを削除します。 </li><li>分化2日目に、EBは運動ニューロンに誘発される準備が整いました。 </li></ol> 3。ステップ3：運動ニューロン仕様（タイミング：5日間） <ol><li>分化2日目、スワール培養皿上で、15 mlチューブにメディアとEBSを転送します。 EBを重力（〜10分）または3分間低速（500 rpm）で遠心分離によって沈殿しましょう​​。 </li><li> （レシピを参照してくださいにおける運動ニューロンの分化の10ミリリットル（MND）培地で注意深く再懸濁したEB培​​地を吸引<strong&gt;表1）。プレートのEB新しい細菌の皿の中で、5日間毎日メディアを変更します。 </li><li>直径200μmの強力なGFPシグナル（ 図1C）を発現すべき-分化7日目に、EBは約150である必要があります。これらのEBはpoly-DL-ornithine/lamininコーティングされた料理やカバースリップの上に分離し、めっきする準備が整いました。 </li></ol> 4。ステップ4：Poly-DL-ornithine/lamininコーティングカバーガラスの調製（タイミング：2日間） 二日EBS（分化5日目にIE）を解離する前に、poly-DL-ornithine/laminin-coatedカバースリップを準備します。 <ol><li>場所24ウェルプレートの底部に12mmの円形のカバー（ワーナー·インスツルメンツ）。 10Xストック溶液（1 mg / ml）を取得するには25mgを25ミリリットルのポリ-DL-オルニチン（Sigma-Aldrich）を、滅菌蒸留水（D 2 H 2 O）を溶解する。するときに使用する準備ができて、コンセントを取得するために、D 2、H 2 Oでポリ-DL-オルニチンの1/10希釈を作る100μg/ mlの比。一晩4℃、24ウェルプレートとインキュベートの各ウェル℃に0.5ミリリットルを追加します。 </li><li>次の日（分化6日目）、吸引ポリ-DL-オルニチンおよび組織培養フード内プレートとカバースリップは、空気乾燥させます。 D 2 H 2 Oで三回プレートのウェルを洗浄します。別の時間空気乾燥してみましょう。 </li><li> 100×ストック溶液（200μg/ mlの）を作るために氷冷した1×PBS 5 mlに1 mgのマウスラミニン（ミリポア社製）を溶解する。するときに使用する準備ができて、アイス冷1X PBS（2μgのラミニン/ ml）を1/100希釈してください。 0.5ミリリットルを追加/ウェル4の24ウェルプレートとインキュベート℃、一晩のために。細胞を播種する前に、過剰なラミニンを削除する必要があり、井戸は、1X PBS 2回すすいだ。カバースリップは、MND培地（0.5ミリリットル/ウェル）に格納することができます。 </li></ol> 5。ステップ5：軸索伸長（タイミング：2日間） <ol><li>分化7日目に、（約3分）を15 mlのチューブにEBを収集し、EBを解決することができます。吸引メディアと再秒PBSでuspendのEB。 EBを解決し、その後PBSを吸引することができます。このステップを3回繰り返します。穏やかに混合し、室温で5分間インキュベートし、EBSにアキュマックス（ミリポア社製）1mlを追加します。その後、EBを覆う過剰ACCUMAXを吸引除去する。 </li><li> EBを解除するには、MNDの培地3mlを追加します。 EBを混乱させる1ミリリットルエッペンドルフピペット（ブルーチップ）を使用して、ピペットを上下に20回。室温で2分間インキュベートします。単一細胞懸濁液を得るために、セルストレーナーキャップ（BDファルコン）で12x75 mmのチューブに細胞懸濁液を転送します。単一細胞の収率を豊かにするようにフィルターに保持され、残りの塊と細胞とは、この解離のステップを繰り返します。最終的に単一の細胞懸濁液は、6ミリリットルになります。 </li><li>穏やかに、この単一の細胞懸濁液を混合し、血球計算板を用いて細胞をカウントします。 ml当たり2×10 5細胞の密度にMND培地（10各BDNFのng / mlで、GDNF、CNTF、およびNT-3添加）に細胞を希釈します。 POを含む24ウェルプレートに細胞懸濁液（0.5ミリリットル/ウェル）を追加ly-DL-ornithine/lamininコーティングしたカバーガラス（上記のように事前に準備された）。分化した細胞は、培養中の2日間（ 図1D）の後に長い神経突起を拡張します。 </li></ol> 6。代表的な結果 図1Aは、プロトコルの概要を示します。ステップ1では、MESの細胞がPMEFで栽培されており、自発的な分化を防止するためにLIFを添加した。一般に、未分化のMESコロニーは円形、コンパクトであり、明らかにエッジを定義しています。コロニーは互いに接触していない。典型的には、MESの細胞は、1:4の比毎に2〜3日で分割する必要があります。しかし、個々の細胞株は、異なる速度で成長し、スプリット比は、経験的に決定する必要があります。 図1Bの矢印は3日間PMEFフィーダー層上で培養後、MES細胞の典型的な外観を示しています。これらのコロニーは大きく（直径50〜100μmの）まだラウンドと定義された優位性を維持だ。この段階ではコロニーは、分化や継代培養するための準備が整いました。 図1Bの矢印は、通常、めっき後24時間を見つけること小さなMESのコロニーを示しています。めっき後の4日間は、MESの細胞が生い茂っになります。彼らは差別化し始めていることを示し、平坦な外観と定義された境界の損失を示しています。このような細胞は、神経細胞への分化に適していません。 運動ニューロンにMESの細胞を区別するには、MESの細胞はEBの形成を可能にするためにサスペンションの条件で栽培する必要があります。ステップ2では、ES細胞はEBの形成を促進するためのフィーダー層なしで培養表面に転写されています。このステップでは、彼らは神経系統に直接細胞への2日間ノギン、bFGFを、とFGF-8を添加した神経分化培地中でインキュベートされる。小さなEBは、分化の1日目で顕微鏡下で観察することができます。彼らは、培地中に浮遊する必要があります。キャリーPMEFも1日目で見つけることができます分化、削除する必要があります。これらの細胞は、EBSが新しい細菌の皿に継代されたときように排除される細菌の料理に準拠しています。従って、分化の2日目で、ほとんどまたはまったくPMEFは、培養皿の中で見られるべきである。ステップ3では、新しい料理にEBの継続的な転送が残っているPMEFの除去を確認する必要があります。 EBは運動ニューロンに細胞を区別するために5日間のRAとSAGを添加した運動ニューロンへの分化（MND）培地中で培養されています。培養中に、EBのサイズが成長し続けると分化3日目〜4で肉眼で見ることができます。 図1Cは、分化7日目のEBの微視的な外観を示しています。未分化細胞とは異なり、EBは、GFPの発現に起因する強い蛍光を示しています。これらのEBは最適に区別され、解離のために準備が整いました。フローサイトメトリーは、51％±解離EBからの細胞の0.8％が細胞に5を発現している GFPに分化したことを示した。ステップ5番目の文化の中でGDNF、CNTF、BDNF、長い軸索突起の延長でNT3結果の存在下でESE運動ニューロンは、 図1Dは、2日間解離EBのめっき後の分化した細胞の外観を示す。メッキ細胞の細胞体から伸びる長い突起に注意してください。免疫蛍光染色は、GFP +細胞は汎神経マーカー（ニューロフィラメント中規模チェーン）と二つの運動ニューロン特異的マーカー、（膵島-1およびコリンアセチルトランスフェラーゼは、 図2）を発現することを示しています。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/3813/3813fig1.jpg" /> 図1：運動ニューロン（写真はWu らから変更しました。5）にMES細胞の分化。 MESの細胞から運動ニューロンへの分化プロトコルのA）スキーム。 B）未分化MES細胞は線維芽細胞フィーダー層の上に円形コロニーを形成します。彼らは弱いGFP発現しています。 C）MESの細胞はフィーダー層とcultuから分離されたEBを形成する低添付皿に赤い。分化過程の最初の2日間、細胞を50 ng / mlのノギン、20 ng / mlのbFGFを、20 ng / mlのFGF-8にさらされた。その後、彼らは1μMレチノイン酸と5日に1μMソニックザヘッジホッグアゴニストSAGと区別するために誘導した。分化したMESの細胞は強いGFPの蛍光を表明した。 D）7日間分化した後、EBはpoly-DL-ornithine/lamininコーティングプレート上で分離し、播種した。分化した細胞は、培養2日後に長い神経突起を伸ばし。スケールバー= 200μmである。 MN =運動ニューロン。 A、B、CおよびDは、明視野像であり、B &#39;、C&#39;とD &#39;は、対応する蛍光画像である。 <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/3813/3813fig2.jpg" /> 図2。MES細胞由来の運動ニューロンのキャラクタリゼーション。フィラメント媒体チェーン（NF-M、赤）、チャット（赤）、および膵島-1（赤）の免疫蛍光染色は、GFP（緑色）がexprと一致したession。 DAPI（青色）が核を識別するために使用されていました。スケールバー=50μmである。

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利害の衝突が宣言されません。

MES細胞の質が運動ニューロンの効率的な生成のための最も重要なパラメータです。 MESの細胞は、自発的な分化を防止するためにPMEFで栽培する必要があります。 LIFの添加により、未分化状態のMES細胞を維持するのに役立ちます。 MESの細胞はすべての12から15時間を分割するので、培地は急速に枯渇し、毎日交換する必要がありますとなります。 ソニックヘッジホッグ経?...

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬の名前 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td><td> 最終濃度 </td></tr><tr><td> PMEF </td><td>ミリポア</td><td> PMEF-H </td><td> NA </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> PMEF培地 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> DMEM </td><td>インビトロジェン</td><td> 11965-118 </td><td> NA </td></tr><tr><td> FBS </td><td>インビトロジェン</td><td> 16140-071 </td><td> 10パーセント</td></tr><tr><td> L-グルタミン酸</td><td>インビトロジェン</td><td> 25030-081 </td><td>一パーセント</td></tr><tr><td>ペニシリン/ストレプトマイシン</td><td>インビトロジェン</td><td> 15240-063 </td><td>一パーセント</td></tr><tr><td></td><td></TD&gt; <td></td><td></td></tr><tr><td> MES培地 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> DMEM </td><td> StemCellテクノロジーズ</td><td> 36250 </td><td> NA </td></tr><tr><td> ES細胞修飾FBS </td><td>インビトロジェン</td><td> 16141-079 </td><td> 15パーセント</td></tr><tr><td>グルタミン-I </td><td>インビトロジェン</td><td> 35050-061 </td><td>一パーセント</td></tr><tr><td>非必須アミノ酸</td><td>インビトロジェン</td><td> 11140-050 </td><td>一パーセント</td></tr><tr><td>ヌクレオシド</td><td>ミリポア</td><td> ES-008-D </td><td>一パーセント</td></tr><tr><td> β-メルカプトエタノール</td><td>ミリポア</td><td> ES-007-E </td><td> 0.1mMの</td></tr><tr><td>ペニシリン/ストレプトマイシン</td><td>ミリポア</td><td> TMS-AB2-C </td><td>一パーセント</td></tr><tr><td> LIF </td><td>ミリポア</td><td&gt; LIF2010 </td><td> 10 ng / mlの</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 神経分化培地 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> DMEM </td><td> StemCellテクノロジーズ</td><td> 36250 </td><td> NA </td></tr><tr><td> ESカルトFBS </td><td> StemCellテクノロジーズ</td><td> 06905 </td><td> 15パーセント</td></tr><tr><td>非必須アミノ酸</td><td>インビトロジェン</td><td> 11140-050 </td><td>一パーセント</td></tr><tr><td>モノチオグリセロール</td><td> Sigma-Aldrich社</td><td> M-6145 </td><td> 1mMの</td></tr><tr><td>頭</td><td>インビトロジェン</td><td> PHC1506 </td><td> 50 ng / mlの</td></tr><tr><td> FGF-8 </td><td>インビトロジェン</td><td> PHG0274 </td><td> 20 ng / mlの</td></tr><tr><td> bFGFの</td><td>インビトロジェン</td><td> PHG0024 </td><td> 20 ng / mlの</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> MND培地（分化） </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> ES-カルト基礎中期</td><td> StemCellテクノロジーズ</td><td> 5801 </td><td> NA </td></tr><tr><td>ノックアウト血清代替物</td><td>インビトロジェン</td><td> 10828-028 </td><td> 10パーセント</td></tr><tr><td> N-2サプリメント</td><td>インビトロジェン</td><td> 17502-048 </td><td>一パーセント</td></tr><tr><td> ITSサプリメント-B </td><td> StemCellテクノロジーズ</td><td> 07155 </td><td>一パーセント</td></tr><tr><td>アスコルビン酸</td><td> StemCellテクノロジーズ</td><td> 07157 </td><td>一パーセント</td></tr><tr><td>ペニシリン/ストレプトマイシン</td><td>ミリポア</td><td> TMS-AB2-C </td><td>一パーセント</td></tr><tr><td>グルタミン-I </td><td>インビトロジェン</td><td> 35050-061 </td><td>一パーセント</td></tr><tr><td> D-グルコース</td><td> Sigma-Aldrich社</td><td> G-8270 </td><td> D 2 H 2 Oで0.15パーセント</td></tr><tr><td>フィブロネクチン</td><td> StemCellテクノロジーズ</td><td> 07159 </td><td> 5μg/ mlの</td></tr><tr><td>ヘパリン</td><td> Sigma-Aldrich社</td><td> H3149 </td><td> d 2は 20μg/ mlのH 2 O </td></tr><tr><td> β-メルカプトエタノール</td><td>ミリポア</td><td> ES-007-E </td><td> 0.1mMの</td></tr><tr><td>レチノイン酸</td><td> Sigma-Aldrich社</td><td> R-2625 </td><td> 1μM </td></tr><tr><td>サグ</td><td> EMDケミカルズ</td><td> 566660 </td><td> 1μM </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> MND媒体（運動ニューロン培養） </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> ES-カルト基礎中期</td><td> StemCellテクノロジーズ</td><td> 5801 </td><td> NA </td></tr><tr><td>ノックアウト血清代替物</td><td>インビトロジェン</td><td> 10828-028 </td><td> 10パーセント</td></tr><tr><td> N-2サプリメント</td><td>インビトロジェン</td><td> 17502-048 </td><td>一パーセント</td></tr><tr><td> ITSサプリメント-B </td><td> StemCellテクノロジーズ</td><td> 07155 </td><td>一パーセント</td></tr><tr><td>アスコルビン酸</td><td> StemCellテクノロジーズ</td><td> 07157 </td><td>一パーセント</td></tr><tr><td>ペニシリン/ストレプトマイシン</td><td>ミリポア</td><td> TMS-AB2-C </td><td>一パーセント</td></tr><tr><td>グルタミン-I </td><td>インビトロジェン</td><td> 35050-061 </td><td>一パーセント</td></tr><tr><td> D-グルコース</td><td> Sigma-Aldrich社</td><td> G-8270 </td><td> D 2 H 2 Oで0.15パーセント</td></tr><tr><td>フィブロネクチン</td><td> StemCエル·テクノロジーズ</td><td> 07159 </td><td> 5μg/ mlの</td></tr><tr><td>ヘパリン</td><td> Sigma-Aldrich社</td><td> H3149 </td><td> d 2は 20μg/ mlのH 2 O </td></tr><tr><td> β-メルカプトエタノール</td><td>ミリポア</td><td> ES-007-E </td><td> 0.1mMの</td></tr><tr><td> BDNF </td><td> R＆Dシステムズ</td><td> 248-BD-005/CF </td><td> 10 ng / mlの</td></tr><tr><td> CNTF </td><td> R＆Dシステムズ</td><td> 257-NY-010/CF </td><td> 10 ng / mlの</td></tr><tr><td> GDNF </td><td> R＆Dシステムズ</td><td> 212-GD-010/CF </td><td> 10 ng / mlの</td></tr><tr><td> NT-3 </td><td> R＆Dシステムズ</td><td> 267-N3-005/CF </td><td> 10 ng / mlの</td></tr></tbody></table> NA =非適用される。 表1。MESの細胞培養や分化のPMEFとメディア。 <table border="1"><tbody><tr><td> &lt;試薬の強力な&gt;名前</td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td><td> 最終濃度 </td></tr><tr><td> 0.1％ゼラチン</td><td> StemCellテクノロジーズ</td><td> 07903 </td><td> NA </td></tr><tr><td>ポリ-DL-オルニチン</td><td> Sigma-Aldrich社</td><td> P0421 </td><td> dには0.1 mg / mlの2 H 2 O </td></tr><tr><td>マウスラミニン</td><td>ミリポア</td><td> CC095 </td><td> 2、PBS中のμg/ mlの</td></tr><tr><td> 0.25％トリプシン/ EDTA </td><td> StemCellテクノロジーズ</td><td> 07901 </td><td> NA </td></tr><tr><td>アキュマックス</td><td>ミリポア</td><td> SCR006 </td><td> NA </td></tr></tbody></table> NA =非適用される。 表2コーティングと解離用試薬。

efficient differentiation of mouse embryonic stem cells into motor neurons

機能的な運動ニューロンへの胚性幹（ES）細胞の直接分化は、病気のメカニズムを研究するための新しい薬剤化合物をスクリーニングするために、このような脊髄性筋萎縮症（SMA）および筋萎縮性側索硬化症などの運動ニューロン疾患の新しい治療法を開発するための有望なリソースを表します（ ALS）。現在の多くのプロトコルは、運動ニューロン1月4日に、マウス胚性幹（MES）の細胞を区別するために、レチノイン酸（RA）とソニックヘッジホッグ（Shh）の組み合わせを使用します。しかし、運動ニューロンへのMES細胞の分化効率は中程度の成功を収めている。我々は大幅に現在確立されているプロトコルと比べて分化効率を向上させる二段階の分化プロトコル5を開発しました。最初のステップは、ノギンと線維芽細胞増殖因子（FGFの）を追加することによって、神経誘導プロセスを強化することです。ノギンは骨形成タンパク質（BMP）のアンタゴニストであると神経誘導に関与している前方神経パターニング6の形成におけるニューロン新生と結果のデフォルトのモデルにccording。 FGFシグナリングは、後部神経アイデンティティ7-9を促進することにより、神経組織の形成を誘導するノギンと相乗的に作用する。このステップでは、MESの細胞は、神経系統に向かって分化を促進するために二日間ノギン、bFGFを、とFGF-8でプライミングされた。第二段階では、運動ニューロンの仕様を誘導することである。ノギン/ FGFの露出したMESの細胞が運動ニューロンの生成を容易にするために、別の5日間、RAとShhのアゴニスト、Smoothenedのアゴニスト（SAG）とインキュベートした。運動ニューロンへの混乱の分化をモニターするために、我々は運動ニューロン特異的プロモーターHb9 1の制御下でEGFPを発現するトランスジェニックマウス由来のES細胞株を使用していました。この堅牢なプロトコルを使用して、我々は±分化効率の0.8％の51を達成した（n = 3、P &lt;0.01、スチューデントの t検定）5。免疫からの結果染色は、GFP +細胞は運動ニューロン特異的マーカー、膵島-1およびコリンアセチルトランスフェラーゼ（ChATの）を発現することを示した。私たちの二段階分化プロトコルは、脊髄運動ニューロンにMESの細胞を区別するための効率的な方法を提供します。

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Efficient Differentiation of Mouse Embryonic Stem Cells into Motor Neurons

我々は運動ニューロンにマウス胚性幹細胞のインビトロ分化の効率を改善するための新しいプロトコルを開発しました。として免疫組織化学的手法を用いてニューロンと運動ニューロンマーカーの発現によって証明機能を分化したES細胞は運動ニューロンを取得しました。

運動ニューロンにマウス胚性幹細胞の効率的な分化

Direct differentiation of embryonic stem (ES) cells into functional  motor neurons represents a promising resource to study disease mechanisms, to  screen ...

efficient-differentiation-mouse-embryonic-stem-cells-into-motor

Research

JoVE Journal

Biology

22.1K ビュー.  Alfred I. duPont Hospital for Children. 我々は運動ニューロンにマウス胚性幹細胞のインビトロ分化の効率を改善するための新しいプロトコルを開発しました。として免疫組織化学的手法を用いてニューロンと運動ニューロンマーカーの発現によって証明機能を分化したES細胞は運動ニューロンを取得しました。

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Derivation of Hematopoietic Stem Cells from Murine Embryonic Stem Cells

A stem cell is defined as a cell with the capacity to both self-renew and generate multiple differentiated progeny.  Embryonic stem cells (ESC) are derived from the blastocyst of the early embryo and are pluripotent in differentiative ability.  Their vast differentiative potential has made them the focus of much research centered on deducing how to coax them to generate clinically useful cell types.  The successful derivation of hematopoietic stem cells (HSC) from mouse ESC has recently been accomplished and can be visualized in this video protocol.  HSC, arguably the most clinically exploited cell population, are used to treat a myriad of hematopoietic malignancies and disorders.  However, many patients that might benefit from HSC therapy lack access to suitable donors.  ESC could provide an alternative source of HSC for these patients.  The following protocol establishes a baseline from which ESC-HSC can be studied and inform efforts to isolate HSC from human ESC.  In this protocol, ESC are differentiated as embryoid bodies (EBs) for 6 days in commercially available serum pre-screened for optimal hematopoietic differentiation.  EBs are then dissociated and infected with retroviral HoxB4.  Infected EB-derived cells are plated on OP9 stroma, a bone marrow stromal cell line derived from the calvaria of  M-CSF-/- mice, and co-cultured in the presence of hematopoiesis promoting cytokines for ten days.  During this co-culture, the infected cells expand greatly, resulting in the generation a heterogeneous pool of 100s of millions of cells.  These cells can then be used to rescue and reconstitute lethally irradiated mice.

This protocol details the derivation of transplantable hematopoietic stem cells from mouse embryonic stem cells (ESC) and their subsequent injection into lethally irradiated recipient mice. Briefly, ESC are differentiated as embryoid bodies, which are then infected with retroviral HoxB4 and co-cultured with OP9 stromal cells and hematopoietic cytokines.

マウス胚性幹細胞から造血幹細胞の導出

A stem cell is defined as a cell with the capacity to both self-renew and generate multiple differentiated progeny.  Embryonic stem cells (ESC) are ...

生物学

In vitro Differentiation of Mouse Embryonic Stem (mES) Cells Using the Hanging Drop Method

Stem cells have the remarkable potential to develop into many different cell types. When a stem cell divides, each new cell has the potential to either remain a stem cell or become another type of cell with a more specialized function, This promising of science is leading scientists to investigate the possibility of cell-based therapies to treat disease.

When culture in suspension without antidifferentiation factors, embryonic stem cells spontaneously differentiate and form three-dimensional multicellular aggregates. These cell aggregates are called embryoid bodies(EB). Hanging drop culture is a widely used EB formation induction method. The rounded bottom of hanging drop allows the aggregation of ES cells which can provide mES cells a good environment for forming EBs. The number of ES cells aggregatied in a hanging drop can be controlled by varying the number of cells in the initial cell suspension to be hung as a drop from the lid of Petri dish. Using this method we can reproducibly form homogeneous EBs from a predetermined number of ES cells. 

In vitro Differentiation of Mouse Embryonic Stem mES Cells Using the Hanging Drop Method

This video demonstrates how to conduct in vitro differentiation of mouse embryonic stem cells to embryoid bodies using the hanging drop method.

ハンギングドロップ法を用いたマウス胚性幹（MES）細胞のin vitroにおける分化

Stem cells have the remarkable potential to develop into many different cell types. When a stem cell divides, each new cell has the potential to either ...

Isolation and Derivation of Mouse Embryonic Germinal Cells

The ability of embryonic germinal cells (EG) to differentiate into primordial germinal cells (PGCs) and later into gametes during early developmental stages is a perfect model to address our hypothesis about cancer and infertility. This protocol shows how to isolate primordial germinal cells from developing gonads in 10.5-11.5 days post coitum (dpc) mouse embryos.  Developing gonadal ridges from mouse embryos (C57BL6J) were dissociated by mechanical disruption with collagenase, then plated in a mouse embryo fibroblast feeder layer (MEF-CF1) that was previously mitotically inactivated with mitomycin C in the presence of knockout media and supplemented with Leukemia Inhibitor Factor (LIF), basic Fibroblast Growth Factor (bFGF), and Stem Cell Factor (SCF).  Using these optimized methods for PCG identification, isolation, and establishment of culture conditions permits long term cultures of EG cells for more than 40 days.  The embryonic germinal cell lines showed embryonic phenotype and expression of common used markers of the pluripotent state.  Isolation and derivation of germinal cells in culture provide a tool to understand their development in vitro and offer the opportunity to monitor cumulative damage at genetic and epigenetic levels after exposure to oxidative stress.

The ability of embryonic germinal cells to differentiate into primordial germinal cells during early development stages is a perfect model to address our hypothesis about cancer and infertility. This protocol shows how to isolate primordial germinal cells from developing gonads in 10.5-11.5 days post coitum mouse embryos.

マウスES胚細胞の単離と導出

The ability of embryonic germinal cells (EG) to differentiate into primordial germinal cells (PGCs) and later into gametes during early developmental ...

Differentiation of Embryonic Stem Cells into Oligodendrocyte Precursors

Oligodendrocytes are the myelinating cells of the central nervous system. For regenerative cell therapy in demyelinating diseases, there is significant interest in deriving a pure population of lineage-committed oligodendrocyte precursor cells (OPCs) for transplantation. OPCs are characterized by the activity of the transcription factor Olig2 and surface expression of a proteoglycan NG2. Using the GFP-Olig2 (G-Olig2) mouse embryonic stem cell (mESC) reporter line, we optimized conditions for the differentiation of mESCs into GFP+Olig2+NG2+ OPCs. In our protocol, we first describe the generation of embryoid bodies (EBs) from mESCs. Second, we describe treatment of mESC-derived EBs with small molecules: (1) retinoic acid (RA) and (2) a sonic hedgehog (Shh) agonist purmorphamine (Pur) under defined culture conditions to direct EB differentiation into the oligodendroglial lineage. By this approach, OPCs can be obtained with high efficiency (&gt;80%) in a time period of 30 days. Cells derived from mESCs in this protocol are phenotypically similar to OPCs derived from primary tissue culture. The mESC-derived OPCs do not show the spiking property described for a subpopulation of brain OPCs in situ. To study this electrophysiological property, we describe the generation of spiking mESC-derived OPCs by ectopically expressing NaV1.2 subunit. The spiking and nonspiking cells obtained from this protocol will help advance functional studies on the two subpopulations of OPCs.

We describe a small molecule-based protocol for differentiation of mouse embryonic stem cells into oligodendrocyte precursor cells (OPCs). This protocol generates Olig2+NG2+ OPCs with high efficiency by 30 days of differentiation. We also describe a method to generate "spiking" OPCs that can fire action potentials.

オリゴデンドロサイト前駆体に胚性幹細胞の分化

Oligodendrocytes are the myelinating cells of the central nervous system. For regenerative cell therapy in demyelinating diseases, there is significant ...

Efficient Derivation of Human Cardiac Precursors and Cardiomyocytes from Pluripotent Human Embryonic Stem Cells with Small Molecule Induction

To date, the lack of a suitable human cardiac cell source has been the major setback in regenerating the human myocardium, either by cell-based transplantation or by cardiac tissue engineering1-3. Cardiomyocytes become terminally-differentiated soon after birth and lose their ability to proliferate. There is no evidence that stem/progenitor cells derived from other sources, such as the bone marrow or the cord blood, are able to give rise to the contractile heart muscle cells following transplantation into the heart1-3. The need to regenerate or repair the damaged heart muscle has not been met by adult stem cell therapy, either endogenous or via cell delivery1-3. The genetically stable human embryonic stem cells (hESCs) have unlimited expansion ability and unrestricted plasticity, proffering a pluripotent reservoir for in vitro derivation of large supplies of human somatic cells that are restricted to the lineage in need of repair and regeneration4,5. Due to the prevalence of cardiovascular disease worldwide and acute shortage of donor organs, there is intense interest in developing hESC-based therapies as an alternative approach. However, how to channel the wide differentiation potential of pluripotent hESCs efficiently and predictably to a desired phenotype has been a major challenge for both developmental study and clinical translation. Conventional approaches rely on multi-lineage inclination of pluripotent cells through spontaneous germ layer differentiation, resulting in inefficient and uncontrollable lineage-commitment that is often followed by phenotypic heterogeneity and instability, hence, a high risk of tumorigenicity6-8 (see a schematic in Fig. 1A). In addition, undefined foreign/animal biological supplements and/or feeders that have typically been used for the isolation, expansion, and differentiation of hESCs may make direct use of such cell-specialized grafts in patients problematic9-11. To overcome these obstacles, we have resolved the elements of a defined culture system necessary and sufficient for sustaining the epiblast pluripotence of hESCs, serving as a platform for de novo derivation of clinically-suitable hESCs and effectively directing such hESCs uniformly towards clinically-relevant lineages by small molecules12 (see a schematic in Fig. 1B). After screening a variety of small molecules and growth factors, we found that such defined conditions rendered nicotinamide (NAM) sufficient to induce the specification of cardiomesoderm direct from pluripotent hESCs that further progressed to cardioblasts that generated human beating cardiomyocytes with high efficiency (Fig. 2). We defined conditions for induction of cardioblasts direct from pluripotent hESCs without an intervening multi-lineage embryoid body stage, enabling well-controlled efficient derivation of a large supply of human cardiac cells across the spectrum of developmental stages for cell-based therapeutics.

We have established a protocol for induction of cardioblasts direct from pluripotent human embryonic stem cells maintained under defined conditions with small molecules, which enables derivation of a large supply of human cardiac progenitors and functional cardiomyocytes for cardiovascular repair.

小分子の誘導と多能性ヒト胚性幹細胞からヒト心筋前駆体と心筋細胞の効率的な導出

To date, the lack of a suitable human cardiac cell source has been the major setback in regenerating the human myocardium, either by cell-based ...

Preparation of Mouse Embryonic Fibroblast Cells Suitable for Culturing Human Embryonic and Induced Pluripotent Stem Cells

In general, human embryonic stem cells (hESCs) and human induced pluripotent stem cells (hiPSCs)1 can be cultured under variable conditions. However, it is not easy to establish an effective system for culturing these cells. Since the culture conditions can influence gene expression that confers pluripotency in hESCs and hiPSCs, the optimization and standardization of the culture method is crucial.
The establishment of hESC lines was first described by using MEFs as feeder cells and fetal bovine serum (FBS)-containing culture medium2. Next, FBS was replaced with knockout serum replacement (KSR) and FGF2, which enhances proliferation of hESCs3. Finally, feeder-free culture systems enable culturing cells on Matrigel-coated plates in KSR-containing conditioned medium (medium conditioned by MEFs)4. Subsequently, hESCs culture conditions have moved towards feeder-free culture in chemically defined conditions5-7. Moreover, to avoid the potential contamination by pathogens and animal proteins culture methods using xeno-free components have been established8.
To obtain improved conditions mouse feeder cells have been replaced with human cell lines (e.g. fetal muscle and skin cells9, adult skin cells10, foreskin fibroblasts11-12, amniotic mesenchymal cells13). However, the efficiency of maintaining undifferentiated hESCs using human foreskin fibroblast-derived feeder layers is not as high as that from mouse feeder cells due to the lower level of secretion of Activin A14. Obviously, there is an evident difference in growth factor production by mouse and human feeder cells.
Analyses of the transcriptomes of mouse and human feeder cells revealed significant differences between supportive and non-supportive cells. Exogenous FGF2 is crucial for maintaining self-renewal of hESCs and hiPSCs, and has been identified as a key factor regulating the expression of Tgf&beta;1, Activin A and Gremlin (a BMP antagonist) in feeder cells. Activin A has been shown to induce the expression of OCT4, SOX2, and NANOG in hESCs15-16.
For long-term culture, hESCs and hiPSCs can be grown on mitotically inactivated MEFs or under feeder-free conditions in MEF-CM (MEF-Conditioned Medium) on Matrigel-coated plates to maintain their undifferentiated state. Success of both culture conditions fully depends on the quality of the feeder cells, since they directly affect the growth of hESCs.
Here, we present an optimized method for the isolation and culture of mouse embryonic fibroblasts (MEFs), preparation of conditioned medium (CM) and enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) to assess the levels of Activin A within the media.

The quality of mouse embryonic fibroblasts (MEFs) is dictated by the right strain of mouse such as CF-1. Pluripotency-supportive MEFs and conditioned media (CM) obtained from these should contain optimal concentrations of Activin A, Gremlin and Tgf&beta;1 needed for the Activin/Nodal and FGF pathways to co-operatively maintain self-renewal and pluripotency.

培養ヒト胚および誘導多能性幹細胞に適したマウス胚性線維芽細胞の調製

In general, human embryonic stem cells (hESCs) and human induced pluripotent stem cells (hiPSCs)1 can be cultured under variable conditions. However, it ...

Generation of Mice Derived from Induced Pluripotent Stem Cells

The production of induced pluripotent stem cells (iPSCs) from somatic cells provides a means to create valuable tools for basic research and may also produce a source of patient-matched cells for regenerative therapies. iPSCs may be generated using multiple protocols and derived from multiple cell sources. Once generated, iPSCs are tested using a variety of assays including immunostaining for pluripotency markers, generation of three germ layers in embryoid bodies and teratomas, comparisons of gene expression with embryonic stem cells (ESCs) and production of chimeric mice with or without germline contribution2. Importantly, iPSC lines that pass these tests still vary in their capacity to produce different differentiated cell types2. This has made it difficult to establish which iPSC derivation protocols, donor cell sources or selection methods are most useful for different applications.
The most stringent test of whether a stem cell line has sufficient developmental potential to generate all tissues required for survival of an organism (termed full pluripotency) is tetraploid embryo complementation (TEC)3-5. Technically, TEC involves electrofusion of two-cell embryos to generate tetraploid (4n) one-cell embryos that can be cultured in vitro to the blastocyst stage6. Diploid (2n) pluripotent stem cells (e.g. ESCs or iPSCs) are then injected into the blastocoel cavity of the tetraploid blastocyst and transferred to a recipient female for gestation (see Figure 1). The tetraploid component of the complemented embryo contributes almost exclusively to the extraembryonic tissues (placenta, yolk sac), whereas the diploid cells constitute the embryo proper, resulting in a fetus derived entirely from the injected stem cell line.
Recently, we reported the derivation of iPSC lines that reproducibly generate adult mice via TEC1. These iPSC lines give rise to viable pups with efficiencies of 5-13%, which is comparable to ESCs3,4,7 and higher than that reported for most other iPSC lines8-12. These reports show that direct reprogramming can produce fully pluripotent iPSCs that match ESCs in their developmental potential and efficiency of generating pups in TEC tests. At present, it is not clear what distinguishes between fully pluripotent iPSCs and less potent lines13-15. Nor is it clear which reprogramming methods will produce these lines with the highest efficiency. Here we describe one method that produces fully pluripotent iPSCs and "all- iPSC" mice, which may be helpful for investigators wishing to compare the pluripotency of iPSC lines or establish the equivalence of different reprogramming methods.

Generating induced pluripotent stem cell (iPSC) lines produces lines of differing developmental potential even when they pass standard tests for pluripotency. Here we describe a protocol to produce mice derived entirely from iPSCs, which defines the iPSC lines as possessing full pluripotency1.

人工多能性幹細胞に由来するマウスの作製

The production of induced pluripotent stem cells (iPSCs) from somatic cells provides a means to create valuable tools for basic research and may also ...

Rapid and Efficient Generation of Neurons from Human Pluripotent Stem Cells in a Multititre Plate Format

Existing protocols for the generation of neurons from human pluripotent stem cells (hPSCs) are often tedious in that they are multistep procedures involving the isolation and expansion of neural precursor cells, prior to terminal differentiation. In comparison to these time-consuming approaches, we have recently found that combined inhibition of three signaling pathways, TGF&beta;/SMAD2, BMP/SMAD1, and FGF/ERK, promotes rapid induction of neuroectoderm from hPSCs, followed by immediate differentiation into functional neurons. Here, we have adapted our procedure to a novel multititre plate format, to further enhance its reproducibility and to make it compatible with mid-throughput applications. It comprises four days of neuroectoderm formation in floating spheres (embryoid bodies), followed by a further four days of differentiation into neurons under adherent conditions. Most cells obtained with this protocol appear to be bipolar sensory neurons. Moreover, the procedure is highly efficient, does not require particular expert skills, and is based on a simple chemically defined medium with cost-efficient small molecules. Due to these features, the procedure may serve as a useful platform for further functional investigation as well as for cell-based screening approaches requiring human sensory neurons or neurons of any type.

Protocols for neuronal differentiation of pluripotent human stem cells (hPSCs) are often time-consuming and require substantial cell culture skills. Here, we have adapted a small molecule-based differentiation procedure to a multititre plate format, allowing simple, rapid, and efficient generation of human neurons in a controlled manner.

Multititreプレートフォーマットでヒト多能性幹細胞から神経細胞の迅速かつ効率的な生成

Existing protocols for the generation of neurons from human pluripotent stem cells (hPSCs) are often tedious in that they are  multistep procedures ...

Differentiation of Newborn Mouse Skin Derived Stem Cells into Germ-like Cells In vitro

Studying germ cell formation and differentiation has traditionally been very difficult due to low cell numbers and their location deep within developing embryos. The availability of a "closed" in vitro based system could prove invaluable for our understanding of gametogenesis. The formation of oocyte-like cells (OLCs) from somatic stem cells, isolated from newborn mouse skin, has been demonstrated and can be visualized in this video protocol. The resulting OLCs express various markers consistent with oocytes such as Oct4 , Vasa , Bmp15, and Scp3. However, they remain unable to undergo maturation or fertilization due to a failure to complete meiosis. This protocol will provide a system that is useful for studying the early stage formation and differentiation of germ cells into more mature gametes. During early differentiation the number of cells expressing Oct4 (potential germ-like cells) reaches ~5%, however currently the formation of OLCs remains relatively inefficient. The protocol is relatively straight forward though special care should be taken to ensure the starting cell population is healthy and at an early passage.

Differentiation of Newborn Mouse Skin Derived Stem Cells into Germ-like Cells In vitro

In recent years the formation of germ cells using in vitro culture methods has been demonstrated using several different types of somatic stem cells. This article will visually present the differentiation of newborn mouse derived stem cells to early oocyte-like cells.

生殖様細胞に新生マウス皮膚由来幹細胞の分化<em&gt;インビトロ</em

Studying  germ cell formation and differentiation has traditionally been very difficult  due to low cell numbers and their location deep within developing ...

Retroviral Infection of Murine Embryonic Stem Cell Derived Embryoid Body Cells for Analysis of Hematopoietic Differentiation

Embryonic stem cells (ESCs) are an outstanding model for elucidating the molecular mechanisms of cellular differentiation. They are especially useful for investigating the development of early hematopoietic progenitor cells (HPCs). Gene expression in ESCs can be manipulated by several techniques that allow the role for individual molecules in development to be determined. One difficulty is that expression of specific genes often has different phenotypic effects dependent on their temporal expression. This problem can be circumvented by the generation of ESCs that inducibly express a gene of interest using technology such as the doxycycline-inducible transgene system. However, generation of these inducible cell lines is costly and time consuming. Described here is a method for disaggregating ESC-derived embryoid bodies (EBs) into single cell suspensions, retrovirally infecting the cell suspensions, and then reforming the EBs by hanging drop. Downstream differentiation is then evaluated by flow cytometry. Using this protocol, it was demonstrated that exogenous expression of a microRNA gene at the beginning of ESC differentiation blocks HPC generation. However, when expressed in EB derived cells after nascent mesoderm is produced, the microRNA gene enhances hematopoietic differentiation. This method is useful for investigating the role of genes after specific germ layer tissue is derived.

Manipulating temporal gene expression in differentiating embryonic stem cells (ESCs) can be achieved using inducible gene systems. However, generation of these cell lines is costly and time consuming. This protocol achieves rapid expression of a transgene in differentiating ES-derived cells and subsequent analysis of downstream hematopoietic differentiation.

マウス胚のレトロウイルス感染は、造血分化の解析のための細胞由来の胚様体幹細胞

Embryonic stem cells (ESCs) are an outstanding model for elucidating the molecular mechanisms of cellular differentiation. They are especially useful for ...