以前に公開された RiboTag メソッドを改善し、背景を大幅に削減しました。これにより、解析の観点から、変異系のような複雑なモデルへの適用が簡単になり、コストも大幅に低下します。実験動物の生成とは別に、RiboTag法はリボソーム関連mRNAを分析する他の方法よりもかなり簡単で簡単です。
すべてのRNA実験と同様に、厳格なRNaseフリー条件は成功の基本です。RNAの経験が限られている場合は、最初に基本的なRNA抽出を行い、次に進んで状態を確認してください。この手順をデモンストレーションするのは、私の研究室の大学院生であるローレン・チュクララです。
均質化バッファーを調製するには、pH 7.4で1モルトリス2.5ミリリットル、塩化モルカリウム1個5ミリリットル、塩化モルマグネシウム1個600マイクロリットル、500マイクロリットルのMP40を50ミリリットルのチューブに加えます。ダイチルパイロカーボネート処理水をチューブに加え、体積を50ミリリットルにし、すべての成分が組み込まれるまで混ぜます。高塩洗浄バッファーを調製するには、pH 7.4で1モルトリス2.5ミリリットル、塩化モルカリウム1個15ミリリットル、塩化塩化モルマグネシウム1個600マイクロリットル、50ミリリットルのMP40を50ミリリットルのチューブに加えます。
ジエチルパイロカーボネート処理水中の50ミリリットルの体積にそれを持って来て、すべての成分が組み込まれるまで混ぜます。すべてのサンプルチューブを予め計量し、重量を記録し、液体窒素で予冷します。ドライアイス上の前冷無菌モルタル、害虫、およびヘラの重量を量る。
次にドライアイスで、事前に冷却された無菌モルタルと害虫を使用して、フラッシュ冷凍組織サンプルを大きな部分に分解し、ゆっくりと細かい粉末に粉砕します。あらかじめ冷却されたヘラを使用して、可能な限りドライアイスに保つように注意して、モルタルから事前に冷却されたコレクションチューブに粉末を削ります。組織粉末でチューブの重量を量る。
サンプルを含むチューブの重量からチューブの初期重量を減算することによって、組織の質量を計算します。この値を記録して、後で lysis バッファーのボリュームを計算します。10ミリリットルの均質化バッファージチオスライトール、RNase阻害剤、シクロヘキシミド、ヘパリン、および1つのプロテアーゼ阻害剤錠剤を添加して、リシスバッファーを調製する。
すべての成分が組み込まれるまで混ぜ、使用するまで氷の上に保管します。サンプルの100ミリグラムごとに、1ミリリットルのリシスバッファーを追加します。リシスバッファーを追加するために使用されるのと同じピペットで、得られたリゼートを上下に慎重にピペットして細胞を断片化し、混合する。
サンプルが粘性がなくなるまで、一般的に25〜30ストロークのピペット処理を続けます。氷の上にサンプルを10分間セットしてlyseします。その後、予冷した遠心分離機でサンプルを4°Cで10,000倍のgで10分間回転させます。
チューブの下部に大きな緩い曇りのペレットが形成されます。ペレットを乱さないよう注意し、新しいチューブにライセートを集め、各サンプルの体積を記録します。サンプルの劣化を防ぐために、氷上または可能な限り摂氏4度で保存される残りのプロトコル全体でサンプルが冷却されていることを確認してください。
さて、適切な抗体結合タンパク質に結合された磁気ビーズの必要量を計算し、タンパク質G.1ミリリットルのライセートに対して、375マイクロリットルのタンパク質Gビーズを使用して1ミリリットルあたり30ミリグラムに達する。ビーズ溶液を磁気チューブラックの1.7ミリリットルチューブに入れ。ビーズの溶媒を取り除き、ビーズに新鮮な溶解バッファーの等しい量を追加します。
ベンチトップチューブの回転器で、摂氏4度で20 RPMに設定し、チューブを5分間回転させて洗います。チューブを磁気チューブラックに置き、洗浄バッファーを取り外します。洗浄を2回繰り返した後、元のボリュームにリシスバッファーを加えてビーズを平衡化します。
使用するまで摂氏4度または氷の上に保管してください。平衡ビーズを1ミリリットルごとに50マイクロリットル加え、摂氏4度で1時間回転させます。その後、マグネットラックにチューブを置き、新鮮なチューブにライセートを収集します。
使用するビーズを破棄します。ライセートに、1ミリリットルごとに平衡ビーズの25マイクロリットルを加え、摂氏4度で1時間回転させます。残りの平衡化されたプロテインGビーズを摂氏4度で一晩保管してください。
朝、マグネットラックにチューブを置き、ライセートを新鮮なチューブに集める。使用するビーズを破棄します。クリアされたライセートから、サンプル入力制御として50マイクロリットルを保持します。
マイナス80度で保管してください。クリアしたライセートの1ミリリットルごとに、5マイクログラムの抗HA抗体を加える。サンプル損失を防ぐために、チューブキャップを実験室のフィルムで密封し、サンプルを摂氏4度で16~18時間回転させます。
クリアしたライセートの1ミリリットルごとに、300マイクロリットルのプロテインGビーズを加える。チューブキャップを実験室のフィルムで再シールし、摂氏4度で2時間回転させます。サンプルチューブをマグネットラックに置き、ビーズをIPedのライセートから分離できるようにします。
ピペットオフフロースルーライゼートと廃棄し、ビーズを保持します。800マイクロリットルの高塩洗浄バッファーをビーズに加えます。チューブを回転器に10分間摂氏4度で置きます。
サンプルチューブをマグネットラックに置き、ビーズを洗浄から分離します。洗い物を取り除き、捨てます。さらに800マイクロリットルの高塩洗浄バッファーをビーズに加えます。
チューブを閉じ、摂氏4度で5分間回転させます。サンプルチューブをマグネットラックに置き、ビーズを洗浄から分離します。洗い物を取り除き、捨てます。
もう一度洗い流しを繰り返します。洗浄後、3.5マイクロリットルの14.2モルβ-メルカプトエタノールをビーズに加え、15秒間渦を混ぜて混ぜます。メーカーの指示に従って、市販のRNA精製キットを使用してRNAを抽出します。
RNaseフリーウォーターの30マイクロリットルでサンプルを溶出します。サンプルをマイナス80°Cで保存します。本研究では、CREまたはRpl22HAのいずれかを欠いたサンプルから非常に少ないRNAが単離され、IPバックグラウンドを低減し、本物のHAタグ付きリボソームRNAを分離するこのプロトコルの有効性を実証した。
RNA分離プロトコルの一連の抗体をCreおよびRpl22HA陽性サンプルで試験した。これらの結果は、試薬の選択がIP効率に大きな影響を与える可能性があることを実証しています。リボソーム関連RNAを単離するリボタグ系の有効性を調べた。
野生型入力とIP遺伝子型の両方について、入力濃度は入力サンプルに多くのRNAがあることを示すIP濃度よりも有意に高かった。RNAプール全体では、RNAの完全性の数値は10近くになると予想され、RINは高い推定サンプルの完全性と品質と相関していました。IPサンプルは入力よりも低いRINを持っていましたが、RINはまだ許容範囲内にあり、サンプル遺伝子型に依存しませんでした。
RNaseの自由な状態を繁殖し維持することとは別に、研究者は、彼らが各提案されたサンプルを収集し、維持することを確認する必要があります。入力RNAは、特に複数のタイプのダウンストリーム分析の鍵となります。当研究室では、免疫沈降後にRNAシーケンシングを行います。
これにより、トランスクリプトドーム全体に対してリボソーム関連を照会することができます。代替手段としては、マイクロアレイ解析または定量的RT-PCRが含まれます。私たちにとって、このシステムは、特定のRNA結合タンパク質の突然変異を伴うリボソーム関連RNAの変化を同定することを可能にします。
