この研究は、国立精神衛生研究所(R00MH103531およびR01MH116901からJ.A.への)、国立一般医学研究所(T32GM007635からS.R.への)の博士後期研修グラント、およびリダヒルギリアム高等研究フェローシップ(GT11021からS.R.)によって支えられました。ケビン・ウールフリー博士の顕微鏡の助け、Kウルリッヒ・バイエル博士の蛍光顕微鏡の使用、LRRTM2プラスミドのトーマス・スードホフ(スタンフォード大学)に感謝します。

1. 細胞培養とトランスフェクション
<ol><li>DMEM、1x(ダルベッコのイーグル培地の修飾)4.5 g /Lグルコース、L-グルタミン&ピルビン酸ナトリウムおよび10%FBSでHEK細胞培地を作ります。滅菌フィルター。</li>
	<li>凝集アッセイに適したリガンドおよび受容体を事前に決定する。 注:Neurexin3α SS4+-および既知のリガンドの1つであるLRRTM2がこの研究で使用されました。目的のリガンドおよび受容体は、pcDNA3.1においてcDNAから発現した。ギブソンアセンブリを使用して、ノイレクシン3αをpcDNA3.112に挿入しました。ノイレクシン3α F/R: TTTAAACTTAAGクトラッヒガクククチャクトクコッチョッチョッチョクGCカッカガクタットッタクテクトカックトクチュククチュク/ ガッCGGCCGGCTGGATCTGCAGAATTTタカタアタクトクトクト</li>
	<li>HEK293T細胞を準備します。<ol>
<li>HEK293T細胞を1つのT-75フラスコで合流させます。</li>
		<li>コンフルエントになったら、2 mLのトリプシンを使用し、37°Cインキュベーターに2分間置きます。フラスコに6mLのHEK培地を加え、細胞を再懸濁し、8 mLすべてを15 mLの円錐管に移します。</li>
		<li>500 x g で 5 分間ペレットを 5 分間、HEK 細胞培地で合計 8 mL の再懸濁液を使用します。</li>
		<li>細胞を数え、6ウェルプレートの各ウェルに735,000個の細胞を追加します。HEKセルメディアを使用して、各ウェルの最終体積を2mLに調整します。</li>
		<li>37°Cインキュベーターに入れ、細胞が一晩、または50〜60%の合流に達するまで増殖させます。</li>
	</ol></li>
	<li>リン酸カルシウム法13を用いたHEK293T細胞のトランスフェクト<ol>
<li>3 μgの目的タンパク質を有するトランスフェクトウェル1、1 μgの蛍光タンパク質(3 μgのpcDNA3.1-Neurexin3αWT SS4-および1 μgのmCherry)を共トランスフェクトします。</li>
		<li>ステップ1.4.1のようにトランスフェクトウェル2。しかし、目的の変異タンパク質(pcDNA3.1-ノイレクシン3αA687T SS4-)を有する。</li>
		<li>3 μgのリガンドを対象とし、別の蛍光タンパク質の1 μg(3 μgのpcDNA3.1 LRRTM2およびGFP 1 μg)を用いてトランスフェクトウェル3。</li>
		<li>負のコントロールとして機能するトランスフェクトウェル4とウェル5:GFPの1 μgでウェル4、mCherryの1 μgで井戸5。</li>
		<li>追加の条件またはコントロール(Neurexin3αWT/A687T SS4+)を必要とする場合は、別のプレート(ステップ1.4.1-1.4.4)を準備します。 注:トランスフェクション効率は、蛍光顕微鏡下でトランスフェクション後24時間分析し、トランスフェクションした蛍光タンパク質を発現する細胞数として定量します。より合理化されたアプローチには、蛍光タンパク質と目的のリガンドをコードする二重体性ベクターを持つHEK細胞のトランスフェクションが含まれ、上記の共同トランスフェクションが推奨されます。本研究の場合、αノイレクシンは約4.3kb、低蛍光強度は、共トランスフェクションを必要とする二酸化システムを用いて観察された。</li>
	</ol></li>
	<li>トランスフェクションの48時間後、細胞を集積させる。<ol>
<li>PBSで2回よく洗います。</li>
		<li>PBSに10 mM EDTAの1mLを各ウェルに加え、細胞間相互作用を穏やかに解約し、37°Cでプレートを5分間インキュベートします。 注:トリプシンは、研究における接着分子の潜在的なタンパク質分解切断のためにステップ1.5.2のために推奨されていません。さらに、EDTA の追加後、セルが環境条件にさらされるため、プロトコルは完了するまで停止されない場合があります。</li>
		<li>プレートを軽くタップして細胞を取り外し、各ウェルを別々の15 mL円錐形チューブに収穫します。</li>
		<li>500 x g の遠心円錐管と 5 分間室温。</li>
	</ol></li>
	<li>細胞がペレット化されている間、各条件で各マイクロ遠心管の上部にラベルを付けて6インキュベーションチューブを調製する。 注: GFP と mCherry 条件の各順列は、すべての実験条件と適切な制御を包含するために使用されるべきです。例えば:1.GFP/mCherry、2.mCherry/LRRTM2-GFP 3。GFP/ノイレクシン3αWT SS4-mCherry, 4.GFP/ノイレクシン3αA687T SS4- –mCherry, 5.ノイレクシン3αWT SS4-mCherry/LRRTM2—GFP, 6.ノイレクシン3αA687T SS4- –mCherry/LRRTM2—GFP.さらなる条件やコントロールに対応するために、追加のチューブを作ります。</li>
	<li>上清を取り除き、10 mM CaCl2 と10 mMMgCl2 を37°Cに温めたHEK培地500μLの細胞を再懸濁します。 注:CaCl 2とMgCl2を追加すると、接着分子が結合を再確立することができ、問題の細胞間相互作用パートナーが接着のために二価カチオンを必要とする場合にのみ必要です。</li>
	<li>ヘモサイトメーターとアリコート200,000細胞を使用して各15 mLの円錐管の細胞を、ステップ1.6.1から適切なチューブに数え、合計体積500μLで1:1ミックスします。 注:それは数とアリコートの量に条件ごとに5分かかります。</li>
	<li>低速チューブ回転器で室温でチューブをインキュベートします。</li>
</ol>2. 画像の取得
<ol><li>特定のサンプルの顕微鏡取得パラメータを最適化します。この例では、広視野顕微鏡で画像を撮影した。5x 空気の目的を使用します (NA: 0.15;WD:20000 μm)、分析に十分な大きさのフィールドを取得します。</li>
	<li>ステップ1.8でHEK細胞の2つの条件を混合した直後にベースライン凝集を評価する。これらは現在、「タイムゼロ」画像です。<ol>
<li>各サンプル混合物のピペット40 μLは、488および561チャネルの両方の蛍光下で荷電顕微鏡スライドおよび画像上に置いた。</li>
		<li>サンプルドロップごとに1つのフォーカス面で3つの異なる視野を取得します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>「時間60」画像として60分で最終画像を取得します。<ol>
<li>60分インキュベーション後の混合物の「時間60」画像を得るために、各条件の別の40 μLサンプルを回転管およびピペットから各サンプルを荷電スライドに取り出します。ステップ 2.2.2 のイメージ。 メモ:飽和が発生するまで、セルの集計は 15 分ごとにチェックする必要があります。凝集のタイミングは、試験されるタンパク質に依存します。</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. 画像J/フィジー分析
<ol><li>フィジー/ImageJ を使用して集計の範囲を定量化するには、解析ファイルを保存します。<ol>
<li>提供された補足コーディングファイルをコンピュータの imageJ マクロフォルダに保存します。</li>
		<li>提供された集計マクロをインストールします (プラグイン、マクロ、インストール、および「AggregationAssay.txt」ファイルを選択します)。</li>
	</ol>
</li>
	<li>しきい値を決定します。<ol>
<li>'time 0' .tifファイルを imageJ にロードし、チャンネルを分割します (イメージ|カラー|チャンネルの分割 注: 「時間ゼロ」画像は、実験全体のしきい値と最小のパンクタサイズを決定するために使用されます。</li>
		<li>各チャネルをマスクする (プラグイン|マクロ|AggregationAssay_MakeMask)。[イメージからマスクを作成]ウィンドウが表示されます。[イメージのしきい値を決定する] および [ヒストグラムからクラスタ パラメータを決定する] の横にあるチェック ボックスをオンにし、[OK]をクリックします。</li>
		<li>スライド バーを使用してイメージのしきい値を決定し、スライド バーの右側の数値を記録して [OK]をクリックします。</li>
		<li>クラスター サイズのヒストグラムが表示されます。実験に適したクラスター サイズをヒストグラムから選択し、[最小クラスタ サイズ]ボックスにこの数値を入力して、[OK]をクリックします。このサイズより低いクラスタは解析されません。</li>
	</ol>
</li>
	<li>解析を実行します。<ol>
<li>imageJ で条件 1 の 'time 60' イメージを開き、ステップ 3.2.1 のようにチャンネルを分割します。</li>
		<li>各チャンネル(プラグイン、マクロ、AggregationAssay_MakeMask)をマスクします。ステップ 3.2.3 およびステップ 3.2.4 で決定したのと同じしきい値とサイズを使用します。[ イメージのしきい値を決定する ] ボックスと [ ヒストグラムからクラスタ パラメータを決定する] の横にあるチェック ボックスをオフにし、サイズとしきい値を適切なフィールドに手動で入力して [OK]をクリックします。</li>
		<li>集計インデックスを計算する (プラグイン|マクロ|AggregationAssay_CalculateOverlap)。比較するマスクされたチャンネルと、結果のファイルが保存されるディレクトリを選択します。</li>
		<li>すべての条件で「時間60」画像ごとにステップ3.3.1~3.3.3を繰り返します。 注: 集約インデックスは、2 つのチャネル領域からオーバーラップ領域に 100 を掛けた合計で割ったオーバーラップ領域の合計として定義されます (集約インデックス = チャネル 1 の領域 + チャネル 2 の領域 - オーバーラップ領域] x 100)。この正規化は、いずれかのマスクの合計ピクセルを表す 2 つのマスクチャネル間の「OR」操作です。</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>S&#252;dhof, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroligins+and+neurexins+link+synaptic+function+to+cognitive+disease.">Neuroligins and neurexins link synaptic function to cognitive disease.</a> Nature. 455 (7215), 903-911 (2008).</li><li>Lakey, J. H., Raggett, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+protein-protein+interactions.">Measuring protein-protein interactions.</a> Current Opinion in Structural Biology. 8 (1), 119-123 (1998).</li><li>Aoto, J., Martinelli, D. C., Malenka, R. C., Tabuchi, K., S&#252;dhof, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Presynaptic+neurexin-3+alternative+splicing+trans-synaptically+controls+postsynaptic+AMPA+receptor+trafficking.">Presynaptic neurexin-3 alternative splicing trans-synaptically controls postsynaptic AMPA receptor trafficking.</a> Cell. 154 (1), 75-88 (2013).</li><li>Aoto, J., F&#246;ldy, C., Ilcus, S. M. C., Tabuchi, K., S&#252;dhof, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+circuit-dependent+functions+of+presynaptic+neurexin-3+at+GABAergic+and+glutamatergic+synapses.">Distinct circuit-dependent functions of presynaptic neurexin-3 at GABAergic and glutamatergic synapses.</a> Nature Neuroscience. 18 (7), 997-1007 (2015).</li><li>S&#252;dhof, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+Neurexin+Complexes:+A+Molecular+Code+for+the+Logic+of+Neural+Circuits.">Synaptic Neurexin Complexes: A Molecular Code for the Logic of Neural Circuits.</a> Cell. 171 (4), 745-769 (2017).</li><li>Dai, J., Aoto, J., S&#252;dhof, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alternative+Splicing+of+Presynaptic+Neurexins+Differentially+Controls+Postsynaptic+NMDA+and+AMPA+Receptor+Responses.">Alternative Splicing of Presynaptic Neurexins Differentially Controls Postsynaptic NMDA and AMPA Receptor Responses.</a> Neuron. 102 (5), 993-1008 (2019).</li><li>Restrepo, S., Langer, N. J., Nelson, K. A., Aoto, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+a+Neurexin-3&#945;+Human+Mutation+in+Mouse+Neurons+Identifies+a+Novel+Role+in+the+Regulation+of+Transsynaptic+Signaling+and+Neurotransmitter+Release+at+Excitatory+Synapses.">Modeling a Neurexin-3&#945; Human Mutation in Mouse Neurons Identifies a Novel Role in the Regulation of Transsynaptic Signaling and Neurotransmitter Release at Excitatory Synapses.</a> The Journal of Neuroscience. 39 (46), 9065-9082 (2019).</li><li>Ko, J., Fuccillo, M. V., Malenka, R. C., S&#252;dhof, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LRRTM2+Functions+as+a+Neurexin+Ligand+in+Promoting+Excitatory+Synapse+Formation.">LRRTM2 Functions as a Neurexin Ligand in Promoting Excitatory Synapse Formation.</a> Neuron. 64 (6), 791-798 (2009).</li><li>de Wit, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LRRTM2+Interacts+with+Neurexin1+and+Regulates+Excitatory+Synapse+Formation.">LRRTM2 Interacts with Neurexin1 and Regulates Excitatory Synapse Formation.</a> Neuron. 64 (6), 799-806 (2009).</li><li>Linhoff, M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Unbiased+Expression+Screen+for+Synaptogenic+Proteins+Identifies+the+LRRTM+Protein+Family+as+Synaptic+Organizers.">An Unbiased Expression Screen for Synaptogenic Proteins Identifies the LRRTM Protein Family as Synaptic Organizers.</a> Neuron. 61 (5), 734-749 (2009).</li><li>Siddiqui, T. J., Pancaroglu, R., Kang, Y., Rooyakkers, A., Craig, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LRRTMs+and+Neuroligins+Bind+Neurexins+with+a+Differential+Code+to+Cooperate+in+Glutamate+Synapse+Development.">LRRTMs and Neuroligins Bind Neurexins with a Differential Code to Cooperate in Glutamate Synapse Development.</a> Journal of Neuroscience. 30 (22), 7495-7506 (2010).</li><li>Gibson, D. G., Young, L., Chuang, R. -. Y., Venter, J. C., Hutchison, C. A., Smith, H. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzymatic+assembly+of+DNA+molecules+up+to+several+hundred+kilobases.">Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases.</a> Nature Methods. 6 (5), 343-345 (2009).</li><li>Bacchetti, S., Graham, F. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transfer+of+the+gene+for+thymidine+kinase+to+thymidine+kinase-deficient+human+cells+by+purified+herpes+simplex+viral+DNA.">Transfer of the gene for thymidine kinase to thymidine kinase-deficient human cells by purified herpes simplex viral DNA.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 74 (4), 1590-1594 (1977).</li><li>Cerchiari, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+strategy+for+tissue+self-organization+that+is+robust+to+cellular+heterogeneity+and+plasticity.">A strategy for tissue self-organization that is robust to cellular heterogeneity and plasticity.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (7), 2287-2292 (2015).</li><li>Burdick, M. M., McCarty, O. J. T., Jadhav, S., Konstantopoulos, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-cell+interactions+in+inflammation+and+cancer+metastasis.">Cell-cell interactions in inflammation and cancer metastasis.</a> IEEE Engineering in Medicine and Biology Magazine. 20 (3), 86-91 (2001).</li><li>Fox, D. A., Gizinski, A., Morgan, R., Lundy, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-cell+interactions+in+rheumatoid+arthritis+synovium.">Cell-cell interactions in rheumatoid arthritis synovium.</a> Rheumatic Diseases Clinics of North America. 36 (2), 311-323 (2010).</li><li>Yamagata, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+insights+into+modulation+and+selectivity+of+transsynaptic+neurexin-LRRTM+interaction.">Structural insights into modulation and selectivity of transsynaptic neurexin-LRRTM interaction.</a> Nature Communications. 9 (1), 3964 (2018).</li><li>Nguyen, T., S&#252;dhof, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Binding+properties+of+neuroligin+1+and+neurexin+1beta+reveal+function+as+heterophilic+cell+adhesion+molecules.">Binding properties of neuroligin 1 and neurexin 1beta reveal function as heterophilic cell adhesion molecules.</a> The Journal of Biological Chemistry. 272 (41), 26032-26039 (1997).</li><li>Boucard, A. A., Ko, J., S&#252;dhof, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+Affinity+Neurexin+Binding+to+Cell+Adhesion+G-protein-coupled+Receptor+CIRL1/Latrophilin-1+Produces+an+Intercellular+Adhesion+Complex.">High Affinity Neurexin Binding to Cell Adhesion G-protein-coupled Receptor CIRL1/Latrophilin-1 Produces an Intercellular Adhesion Complex.</a> Journal of Biological Chemistry. 287 (12), 9399-9413 (2012).</li></ol>

著者らは開示するものは何もない。

細胞接着中にトランスで起こるタンパク質とタンパク質の相互作用を解剖することは、成熟およびリモデリング中のシナプスの形成、機能および維持を含む基本的な細胞プロセスの基礎となる分子メカニズムをよりよく理解することにつながる可能性がある。細胞間相互作用の意味は神経生物学を超えて広がり、シグナル伝達、細胞遊び、組織発達における広範な役割を有する1...

シナプス接着分子によって促進されるシナプス相互作用は、シナプスの開発、組織、仕様、維持および機能およびニューラルネットワークの生成の基礎となる。これらのシナプス細胞接着分子の同定は急速に増加しています。したがって、結合パートナーを同定し、これらの新しい接着分子が互いにどのように相互作用するかを理解することが根本的に重要です。さらに、ゲノムシーケンシングは、多くの神経発達、神経精神、および中毒障害に一般的にリンクされているこれらの接着分子の多くの突然変異を同定した1。シナプス細胞接着分子をコードする遺伝子の突然変異は、トランス相互作用を有害に変化させ、シナプス形成および維持における病態生理学的変化に寄与する可能性がある。
等温熱熱量測定、円形二色、表面プラズモン共鳴2 などのタンパク質とタンパク質の相互作用を定量的に評価するために複数のアッセイが存在し、本質的には定量的には、いくつかの制限があります。第一に、それらは組換えタンパク質を必要とし、時には長く、退屈な精製ステップを要求する。第二に、彼らは洗練された専門機器と技術的な専門知識を必要とします。第三に、生体内の膜に自然につながれているタンパク質間のシスとトランスの相互作用の両方を可能にするので、結合の程度を過大評価することができます。ここでは、トランス相互作用を排他的にテストする、単純で比較的迅速なアッセイを提案する。
精製タンパク質アッセイに関連する合併症の多くを回避するために、我々は還元異種細胞系におけるトランス相互作用を再現する細胞ベースのタンパク質相互作用アッセイを最適化した。このアッセイは、細胞間相互作用を研究するために、これまで様々な形で使用されてきました。このアプローチでは、候補細胞接着分子がHEK293T細胞にトランスフェクションされる。生理的条件では、HEK293T細胞は自己凝集を示さないため、このアッセイの模範的なモデルとなっています。しかし、受容体とリガンドを発現するHEK細胞の個体集団が結合されると、受容体とリガンドの結合が生じるようにHEK細胞の凝集が生じる。この凝集はトランス相互作用によって排他的に媒介され、通常は数十分で観察可能である。この方法ではタンパク質精製のステップは必要なく、この方法の効率は、同結合性分子を発現するHEK細胞の集団が結合され、その後数十分後に画像化されるというパラダイムに依存している。さらに、抗体も高価な機器も必要とされないので、この方法は比較的安価です。データの取得に必要な装置は、標準蛍光顕微鏡のみです。この細胞ベースのアッセイに対するさらなる利点は、疾患関連点突然変異がトランス相互作用に及ぼす影響を迅速にスクリーニングする能力である。これは、目的とするタンパク質の変異変異体変異体のcDNAsを有するHEK細胞をトランスフェクトすることによって行うことができる。
本プロトコルでは、深い知的障害とてんかんと診断された患者において同定されたNeurexin3α(Neurexin3αA687T)におけるミスセンス突然変異が、ロイシンリッチリピート膜貫通タンパク質2(LRRTM2)との相互作用を変化させるかどうかを調べる例を提示する。Neurexin3αは、シナプス前細胞接着分子の進化的に保存されたファミリーの一員であり、最近の研究ではシナプス3、4、5、6、7で複数の役割を同定していますが、この分子とノイレクシンファミリーのすべてのメンバーのシナプス理解は不完全なままです。LRRTM2は、シナプス形成および維持8、9、10に関与する興奮性ポストナプティック細胞接着タンパク質である。重要なことに、LRRTM2はスプライスサイト4代替エキソン(SS4-)を欠いているが、スプライスサイト4代替エキソン(SS4+)を含むノイレクシンアイソフォームとは異なっているノイレクシンアイソフォームと排他的に相互作用する。Neurexin3αで同定されたヒトミスセンス変異(A687T)は、進化的に保存され、全てのαニューレクシン7の間で保存されている未研究の細胞外領域に位置する。これら2つの分子間の相互作用が確立されたので、私たちは、Neurexin3α SS4-LRRTM2への結合能力がA687T点突然変異によって変化しているのかという疑問を提起しました。このアッセイは、A687T点突然変異がNeurexin3αのLRRTM2への凝集を予期せず増強したことを明らかにし、その点突然変異が位置する細胞外領域が、シナプス間相互作用を媒介する役割を果たしていることを示唆した。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:788px;" width="787">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:339px;">1.5 mL disposable microtubes with snap caps</td>
			<td style="width:121px;">VWR</td>
			<td style="width:161px;">89000-028</td>
			<td style="width:167px;">Incubation of mixed population of HEK cells</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:339px;">1000 mL Rapid&#8212;Flow Filter Unit, 0.2 um aPES membrane</td>
			<td style="width:121px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:161px;">567-0020</td>
			<td style="width:167px;">Sterilization of HEK media</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:339px;">15 mL SpectraTube centrifuge tubes</td>
			<td style="width:121px;">Ward&#8217;s Science</td>
			<td style="width:161px;">470224-998</td>
			<td style="width:167px;">Harvesting HEK cells</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:339px;">6 well sterile tissue culture plates</td>
			<td style="width:121px;">VWR</td>
			<td style="width:161px;">100062-892</td>
			<td style="width:167px;">culturing HEK cells</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:339px;">Calcium Chloride</td>
			<td style="width:121px;">Sigma</td>
			<td style="width:161px;">223506-500G</td>
			<td style="width:167px;">Calcium phosphate transfection, HEK cell resuspension</td>
		</tr>
		<tr height="44">
			<td height="44" style="height:45px;width:339px;">Centrifuge- Sorvall Legend RT</td>
			<td style="width:121px;">Kendro Laboratory Products</td>
			<td align="right" style="width:161px;">75004377</td>
			<td style="width:167px;">Harvesting HEK cells</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:22px;width:339px;">CO2 cell incubator</td>
			<td style="width:121px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:161px;">HERACELL 150i</td>
			<td style="width:167px;">Incubation of HEK cells during growth</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:339px;">DMEM, 1x (Dulbecco&#39;s Modification of Eagle&#39;s Medium) with 4.5 g/L glucose, L-glutamine &#38; sodium pyruvate</td>
			<td style="width:121px;">Corning</td>
			<td style="width:161px;">10-013-CV</td>
			<td style="width:167px;">HEK cell maintenance</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:43px;width:339px;">Dulbecco&#8217;s Phosphate Buffered Saline PBS (1X)</td>
			<td style="width:121px;">Gibco</td>
			<td style="width:161px;">14190-144</td>
			<td style="width:167px;">Passaging/harvesting HEK cell</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:339px;">Ethylenediaminetetraacetic acid</td>
			<td style="width:121px;">Sigma</td>
			<td style="width:161px;">ED-500G</td>
			<td style="width:167px;">Harvesting HEK cells</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:339px;">Falcon Vented culture flasks, 75cm2 growth area</td>
			<td style="width:121px;">Corning</td>
			<td style="width:161px;">9381M26</td>
			<td style="width:167px;">Culturing HEK cells</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:43px;width:339px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td style="width:121px;">Sigma</td>
			<td style="width:161px;">17L184</td>
			<td style="width:167px;">HEK cell maintenance</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:43px;width:339px;">HEK293T cells</td>
			<td style="width:121px;">ATCC</td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td style="width:167px;">Model system</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:339px;">ImageJ</td>
			<td style="width:121px;">NIH</td>
			<td style="width:161px;">V: 2.0.0-rc-69/1.52p</td>
			<td style="width:167px;">Image analysis</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:43px;width:339px;">Magnesium Chloride hexahydrate</td>
			<td style="width:121px;">Sigma</td>
			<td style="width:161px;">M9272-500G</td>
			<td style="width:167px;">HEK cell resuspension</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:339px;">Sodium phosphate dibasic anhydrous</td>
			<td style="width:121px;">Fisher BioReagents</td>
			<td style="width:161px;">BP332-500</td>
			<td style="width:167px;">Calcium phosphate transfection</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:339px;">Trypsin 0.25% (1X) Solution</td>
			<td style="width:121px;">GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td style="width:161px;">SH30042.01</td>
			<td style="width:167px;">Passaging HEK cells</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:339px;">Tube rotator</td>
			<td style="width:121px;"></td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td style="width:167px;">Incubation of mixed population of HEK cells</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:339px;">UltraClear Microscope slides. White Frosted, Positive Charged</td>
			<td style="width:121px;">Denville Scientific Inc.</td>
			<td style="width:161px;">M1021</td>
			<td style="width:167px;">Image acquisition</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:339px;">Wide-field microscope</td>
			<td style="width:121px;">Zeiss</td>
			<td style="width:161px;">Axio Vert 200M</td>
			<td style="width:167px;">Image acquisition</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measuring transcellular interactions through protein aggregation in a heterologous cell system

細胞インターフェースでのタンパク質相互作用は、組織の発達やがんの進行からシナプスの形成と維持に至るまで、多くの生物学的結果を決定します。これらの基本的相互作用の多くは、トランスで起こり、典型的には、膜アンカー結合対を発現する細胞間の異種または同種の相互作用によって誘発される。疾患関連の突然変異がこれらの基本的なタンパク質相互作用をどのように混乱させるかを解明することで、無数の細胞生物学分野への洞察を得ることができます。多くのタンパク質とタンパク質の相互作用アッセイは、通常、シスとトランス相互作用の間のあいまいさを解消せず、生体内で発生している結合の程度を過大評価し、タンパク質および/または特殊なモニタリング装置の労働集約的な精製を伴う可能性があります。ここでは、長いタンパク質精製や特殊な装置を必要とせずにトランス相互作用のみを観察し定量化できる、最適化されたシンプルなプロトコルを提示します。HEK細胞凝集アッセイは、HEK細胞の2つの独立集団の混合を含み、それぞれが膜結合同系リガンドを発現する。短いインキュベーション期間の後、サンプルを画像化し、結果の凝集体を定量化します。

A687T突然変異は、ノイレクシン3α SS4-LRRTM2 7に結合する増加 知的障害とてんかん患者に見られる点変異の導入によって、2つの既知のシナプスタンパク質の細胞間相互作用がどのように影響を受けるかを調べるため、上記のHEK細胞凝集アッセイを用いた(図1)。細胞はセクション1に従ってトランスフェクトされ、プロトコルのセクション1および2に従?...

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Measuring Transcellular Interactions through Protein Aggregation in a Heterologous Cell System

ここでは、蛍光顕微鏡を用いた異種細胞系におけるトランスにおけるリガンド-受容体相互作用を迅速かつ半定量的に測定するための最適化されたプロトコルを提示する。

異種細胞系におけるタンパク質凝集による細胞間相互作用の測定

Protein interactions at cellular interfaces dictate a multitude of biological outcomes ranging from tissue development and cancer progression to synapse ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

3.4K ビュー.  University of Colorado Denver School of Medicine. ここでは、蛍光顕微鏡を用いた異種細胞系におけるトランスにおけるリガンド-受容体相互作用を迅速かつ半定量的に測定するための最適化されたプロトコルを提示する。

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Assaying Surface Expression of Chemosensory Receptors in Heterologous Cells

The vivid world of odors is recognized by the sense of olfaction. Olfaction in mice is mediated by a repertoire of about 1200 G Protein Coupled Receptors (GPCRs) 1 that are postulated to bind volatile odorant molecules and converting the extracellular signal into an intracellular signal by coupling with G protein G&alpha;olf. Binding of the odorants to the receptors is thought to follow a combinatorial rule, that is, one odorant may bind several receptors and one receptor may bind several odorants to varying degrees 2. Biochemical, signaling and ligand binding studies have been conveniently carried out for most GPCRs using heterologous cells. However use of heterologous cells for study of odorant receptors, was precluded for a long time since on transfection they failed to export to the surface. Saito et al have demonstrated single membrane pass Receptor Transporting Protein (RTP) family chaperones show enhanced expression in the olfactory sensory neurons and act as chaperones to traffic odorant receptors to the surface in heterologous cells, when co transfected together 3. To carry out biochemical assays for receptors using heterologous cells, one must first determine if the receptor shows robust surface expression in the cell line. This can be assayed by overexpressing the receptors with the chaperone RTP1S followed by live cell staining to fluorescently label the extracellular domain or a tag in the extracellular domain exclusively. Here we demonstrate a protocol to carry out live cell staining that can be used to detect odorant receptors on the surface of HEK293T cells conveniently. In addition, it may also be used to assay for surface expression of other chemosensory receptors or GPCRs.

Here we demonstrate a protocol to carry out live cell staining that can be used to detect odorant receptors on the surface of HEK293T cells conveniently. In addition, it may also be used to assay for surface expression of other chemosensory receptors or GPCRs.

異種細胞での化学感覚受容体の表面発現をアッセイ

The vivid world of odors is recognized by the sense of olfaction. Olfaction in mice is mediated by a repertoire of about 1200 G Protein Coupled Receptors ...

神経科学

Efficient Derivation of Human Neuronal Progenitors and Neurons from Pluripotent Human Embryonic Stem Cells with Small Molecule Induction

There is a large unfulfilled need for a clinically-suitable human neuronal cell source for repair or regeneration of the damaged central nervous system (CNS) structure and circuitry in today's healthcare industry. Cell-based therapies hold great promise to restore the lost nerve tissue and function for CNS disorders. However, cell therapies based on CNS-derived neural stem cells have encountered supply restriction and difficulty to use in the clinical setting due to their limited expansion ability in culture and failing plasticity after extensive passaging1-3. Despite some beneficial outcomes, the CNS-derived human neural stem cells (hNSCs) appear to exert their therapeutic effects primarily by their non-neuronal progenies through producing trophic and neuroprotective molecules to rescue the endogenous cells1-3. Alternatively, pluripotent human embryonic stem cells (hESCs) proffer cures for a wide range of neurological disorders by supplying the diversity of human neuronal cell types in the developing CNS for regeneration1,4-7. However, how to channel the wide differentiation potential of pluripotent hESCs efficiently and predictably to a desired phenotype has been a major challenge for both developmental study and clinical translation. Conventional approaches rely on multi-lineage inclination of pluripotent cells through spontaneous germ layer differentiation, resulting in inefficient and uncontrollable lineage-commitment that is often followed by phenotypic heterogeneity and instability, hence, a high risk of tumorigenicity7-10. In addition, undefined foreign/animal biological supplements and/or feeders that have typically been used for the isolation, expansion, and differentiation of hESCs may make direct use of such cell-specialized grafts in patients problematic11-13. To overcome these obstacles, we have resolved the elements of a defined culture system necessary and sufficient for sustaining the epiblast pluripotence of hESCs, serving as a platform for de novo derivation of clinically-suitable hESCs and effectively directing such hESCs uniformly towards clinically-relevant lineages by small molecules14 (please see a schematic in Fig. 1). Retinoic acid (RA) does not induce neuronal differentiation of undifferentiated hESCs maintained on feeders1, 14. And unlike mouse ESCs, treating hESC-differentiated embryoid bodies (EBs) only slightly increases the low yield of neurons1, 14, 15. However, after screening a variety of small molecules and growth factors, we found that such defined conditions rendered retinoic acid (RA) sufficient to induce the specification of neuroectoderm direct from pluripotent hESCs that further progressed to neuroblasts that generated human neuronal progenitors and neurons in the developing CNS with high efficiency (Fig. 2). We defined conditions for induction of neuroblasts direct from pluripotent hESCs without an intervening multi-lineage embryoid body stage, enabling well-controlled efficient derivation of a large supply of human neuronal cells across the spectrum of developmental stages for cell-based therapeutics.

We have established a protocol for induction of neuroblasts direct from pluripotent human embryonic stem cells maintained under defined conditions with small molecules, which enables derivation of a large supply of human neuronal progenitors and neuronal cell types in the developing CNS for neural repair.

小分子の誘導と多能性ヒト胚性幹細胞からヒト神経前駆細胞と神経細胞の効率的な導出

There is a large unfulfilled need for a clinically-suitable human neuronal cell source for repair or regeneration of the damaged central nervous system ...

Peering into the Dynamics of Social Interactions: Measuring Play Fighting in Rats

Play fighting in the rat involves attack and defense of the nape of the neck, which if contacted, is gently nuzzled with the snout. Because the movements of one animal are countered by the actions of its partner, play fighting is a complex, dynamic interaction. This dynamic complexity raises methodological problems about what to score for experimental studies. We present a scoring schema that is sensitive to the correlated nature of the actions performed. The frequency of play fighting can be measured by counting the number of playful nape attacks occurring per unit time. However, playful defense, as it can only occur in response to attack, is necessarily a contingent measure that is best measured as a percentage (#attacks defended/total # attacks X 100%). How a particular attack is defended against can involve one of several tactics, and these are contingent on defense having taken place; consequently, the type of defense is also best expressed contingently as a percentage. Two experiments illustrate how these measurements can be used to detect the effect of brain damage on play fighting even when there is no effect on overall playfulness. That is, the schema presented here is designed to detect and evaluate changes in the content of play following an experimental treatment.

Play fighting in the rat involves attack and defense of the nape of the neck, which if contacted, is gently nuzzled with the snout. Because the movements of one animal are countered by the actions of its partner, play fighting is a complex, dynamic interaction. This dynamic complexity raises methodological problems about what to score for experimental studies. We present a scoring schema that is sensitive to the correlated nature of the actions performed. Two experiments illustrate how these measurements can be used to detect the effect of brain damage on play fighting even when there is no effect on overall playfulness. That is, the schema presented here is designed to detect and evaluate changes in the content of play following an experimental treatment.

社会的相互作用のダイナミクスにピアリング：ラットでの戦闘を再生し測定

Play fighting in the rat involves attack and defense of the nape of the neck, which if contacted, is gently nuzzled with the snout. Because the movements ...

Dual Electrophysiological Recordings of Synaptically-evoked Astroglial and Neuronal Responses in Acute Hippocampal Slices

Astrocytes form together with neurons tripartite synapses, where they integrate and modulate neuronal activity. Indeed, astrocytes sense neuronal inputs through activation of their ion channels and neurotransmitter receptors, and process information in part through activity-dependent release of gliotransmitters. Furthermore, astrocytes constitute the main uptake system for glutamate, contribute to potassium spatial buffering, as well as to GABA clearance. These cells therefore constantly monitor synaptic activity, and are thereby sensitive indicators for alterations in synaptically-released glutamate, GABA and extracellular potassium levels. Additionally, alterations in astroglial uptake activity or buffering capacity can have severe effects on neuronal functions, and might be overlooked when characterizing physiopathological situations or knockout mice. Dual recording of neuronal and astroglial activities is therefore an important method to study alterations in synaptic strength associated to concomitant changes in astroglial uptake and buffering capacities. Here we describe how to prepare hippocampal slices, how to identify stratum radiatum astrocytes, and how to record simultaneously neuronal and astroglial electrophysiological responses. Furthermore, we describe how to isolate pharmacologically the synaptically-evoked astroglial currents.

The preparation of acute brain slices from isolated hippocampi, as well as the simultaneous electrophysiological recordings of astrocytes and neurons in stratum radiatum during stimulation of schaffer collaterals is described. The pharmacological isolation of astroglial potassium and glutamate transporter currents is demonstrated.

急性海馬スライスにおけるシナプス誘発アストログリアとニューロン活動の二重の電気生理学的記録

Astrocytes form together with neurons tripartite synapses, where they integrate and modulate neuronal activity. Indeed, astrocytes sense neuronal inputs ...

A Lightweight, Headphones-based System for Manipulating Auditory Feedback in Songbirds

Experimental manipulations of sensory feedback during complex behavior have provided valuable insights into the computations underlying motor control and sensorimotor plasticity1. Consistent sensory perturbations result in compensatory changes in motor output, reflecting changes in feedforward motor control that reduce the experienced feedback error. By quantifying how different sensory feedback errors affect human behavior, prior studies have explored how visual signals are used to recalibrate arm movements2,3 and auditory feedback is used to modify speech production4-7. The strength of this approach rests on the ability to mimic naturalistic errors in behavior, allowing the experimenter to observe how experienced errors in production are used to recalibrate motor output.
Songbirds provide an excellent animal model for investigating the neural basis of sensorimotor control and plasticity8,9. The songbird brain provides a well-defined circuit in which the areas necessary for song learning are spatially separated from those required for song production, and neural recording and lesion studies have made significant advances in understanding how different brain areas contribute to vocal behavior9-12. However, the lack of a naturalistic error-correction paradigm - in which a known acoustic parameter is perturbed by the experimenter and then corrected by the songbird - has made it difficult to understand the computations underlying vocal learning or how different elements of the neural circuit contribute to the correction of vocal errors13.
The technique described here gives the experimenter precise control over auditory feedback errors in singing birds, allowing the introduction of arbitrary sensory errors that can be used to drive vocal learning. Online sound-processing equipment is used to introduce a known perturbation to the acoustics of song, and a miniaturized headphones apparatus is used to replace a songbird's natural auditory feedback with the perturbed signal in real time. We have used this paradigm to perturb the fundamental frequency (pitch) of auditory feedback in adult songbirds, providing the first demonstration that adult birds maintain vocal performance using error correction14. The present protocol can be used to implement a wide range of sensory feedback perturbations (including but not limited to pitch shifts) to investigate the computational and neurophysiological basis of vocal learning.

We describe the design and assembly of miniaturized headphones suitable for replacing a songbird&#x2019;s natural auditory feedback with a manipulated acoustic signal. Online sound processing hardware is used to manipulate song output, introduce real-time errors in auditory feedback via the headphones, and drive vocal motor learning.

鳴禽類には聴覚フィードバックを操作するための軽量、ヘッドフォンベースのシステム

Experimental manipulations of sensory feedback during complex behavior have provided valuable insights into the computations underlying motor control and ...

Genetic Manipulation of the Mouse Developing Hypothalamus through In utero Electroporation

Genetic modification of specific regions of the developing mammalian brain is a very powerful experimental approach. However, generating novel mouse mutants is often frustratingly slow. It has been shown that access to the mouse brain developing in utero with reasonable post-operatory survival is possible. Still, results with this procedure have been reported almost exclusively for the most superficial and easily accessible part of the developing brain, i.e. the cortex. The thalamus, a narrower and more medial region, has proven more difficult to target. Transfection into deeper nuclei, especially those of the hypothalamus, is perhaps the most challenging and therefore very few results have been reported. Here we demonstrate a procedure to target the entire hypothalamic neuroepithelium or part of it (hypothalamic regions) for transfection through electroporation. The keys to our approach are longer narcosis times, injection in the third ventricle, and appropriate kind and positioning of the electrodes. Additionally, we show results of targeting and subsequent histological analysis of the most recessed hypothalamic nucleus, the mammillary body.

Genetic Manipulation of the Mouse Developing Hypothalamus through In utero Electroporation

Despite the functional and medical importance of the hypothalamus, in utero genetic manipulation of its development has rarely been attempted. We show a detailed procedure for in utero electroporation into the mouse hypothalamus and show representative results of total and partial (regional) hypothalamic transfection.

マウスの遺伝子操作は、視床下部を介して開発<em&gt;子宮内</em&gt;エレクトロポレーション

Genetic  modification of specific regions of the developing mammalian brain is a very  powerful experimental approach. However, generating novel mouse ...

A Caenorhabditis elegans Model System for Amylopathy Study

Amylopathy is a term that describes abnormal synthesis and accumulation of amyloid beta (A&beta;) in tissues with time. A&beta; is a hallmark of Alzheimer's disease (AD) and is found in Lewy body dementia, inclusion body myositis and cerebral amyloid angiopathy 1-4. Amylopathies progressively develop with time. For this reason simple organisms with short lifespans may help to elucidate molecular aspects of these conditions. Here, we describe experimental protocols to study A&beta;-mediated neurodegeneration using the worm Caenorhabditis elegans. Thus, we construct transgenic worms by injecting DNA encoding human A&beta;42 into the syncytial gonads of adult hermaphrodites. Transformant lines are stabilized by a mutagenesis-induced integration. Nematodes are age synchronized by collecting and seeding their eggs. The function of neurons expressing A&beta;42 is tested in opportune behavioral assays (chemotaxis assays). Primary neuronal cultures obtained from embryos are used to complement behavioral data and to test the neuroprotective effects of anti-apoptotic compounds.

A Caenorhabditis elegans Model System for Amylopathy Study

We describe methods to study aspects of amylopathies in the worm C. elegans. We show how to construct worms expressing human A&beta;42 in neurons and how to test their function in behavioral assays. We further show how to obtain primary neuronal cultures that can be used for pharmacological testing.

A<em&gt;線虫（Caenorhabditis elegans）</emAmylopathyの研究のための&gt;モデルシステム

Amylopathy is a term that describes abnormal synthesis and accumulation of amyloid beta (A&beta;) in tissues with time. A&beta; is a hallmark of ...

Use of a Caspase Multiplexing Assay to Determine Apoptosis in a Hypothalamic Cell Model

The ability to multiplex assays in studies of complex cellular mechanisms eliminates the need for repetitive experiments, provides internal controls, and decreases waste in costs and reagents. Here we describe optimization of a multiplex assay to assess apoptosis following a palmitic acid (PA) challenge in an in vitro hypothalamic model, using both fluorescent and luminescent based assays to measure viable cell counts and caspase-3/7 activity in a 96-well microtiter plate format. Following PA challenge, viable cells were determined by a resazurin-based fluorescent assay. Caspase-3/7 activity was then determined using a luminogenic substrate, DEVD, and normalized to cell number. This multiplexing assay is a useful technique for determining change in caspase activity following an apoptotic stimulus, such as saturated fatty acid challenge. The saturated fatty acid PA can increase hypothalamic oxidative stress and apoptosis, indicating the potential importance of assays such as that described here in studying the relationship between saturated fatty acids and neuronal function.

Multiplex assays can provide beneficial information for basic cellular mechanisms&#160;and eliminate waste of reagents and unnecessary repetitive experiments. We describe here a multiplex caspase-3/7 activity assay, using fluorescent- and luminescent-based methods, to determine cell viability in an in vitro hypothalamic model following oxidative challenge with palmitic acid.

視床下部細胞モデルでアポトーシスを決定するために、カスパーゼの多重化アッセイの使用

The ability to multiplex assays in studies of complex cellular mechanisms eliminates the need for repetitive experiments, provides internal controls, and ...

Inducing Plasticity of Astrocytic Receptors by Manipulation of Neuronal Firing Rates

Close to two decades of research has established that astrocytes in situ and in vivo express numerous G protein-coupled receptors (GPCRs) that can be stimulated by neuronally-released transmitter. However, the ability of astrocytic receptors to exhibit plasticity in response to changes in neuronal activity has received little attention. Here we describe a model system that can be used to globally scale up or down astrocytic group I metabotropic glutamate receptors (mGluRs) in acute brain slices. Included are methods on how to prepare parasagittal hippocampal slices, construct chambers suitable for long-term slice incubation, bidirectionally manipulate neuronal action potential frequency, load astrocytes and astrocyte processes with fluorescent Ca2+ indicator, and measure changes in astrocytic Gq GPCR activity by recording spontaneous and evoked astrocyte Ca2+ events using confocal microscopy. In essence, a &#8220;calcium roadmap&#8221; is provided for how to measure plasticity of astrocytic Gq GPCRs. Applications of the technique for study of astrocytes are discussed. Having an understanding of how astrocytic receptor signaling is affected by changes in neuronal activity has important implications for both normal synaptic function as well as processes underlying neurological disorders and neurodegenerative disease.

Here we describe an adaptation of protocols used to induce homeostatic plasticity in neurons for the study of plasticity of astrocytic G protein-coupled receptors. Recently used to examine changes in astrocytic group I mGluRs in juvenile mice, the method can be applied to measure scaling of various astrocytic GPCRs, in tissue from adult mice in situ and in vivo, and to gain a better appreciation of the sensitivity of astrocytic receptors to changes in neuronal activity.

神経発火率を操作することによってアストロサイト受容体の可塑性を誘導すること

Close to two decades of research has established that astrocytes in situ and in vivo express numerous G protein-coupled receptors (GPCRs) that can be ...

Quantitative Cell Biology of Neurodegeneration in Drosophila Through Unbiased Analysis of Fluorescently Tagged Proteins Using ImageJ

With the rising prevalence of neurodegenerative diseases, it is increasingly important to understand the underlying pathophysiology that leads to neuronal dysfunction and loss. Fluorescence-based imaging tools and technologies enable unprecedented analysis of subcellular neurobiological processes, yet there is still a need for unbiased, reproducible, and accessible approaches for extracting quantifiable data from imaging studies. We have developed a simple and adaptable workflow to extract quantitative data from fluorescence-based imaging studies using Drosophila models of neurodegeneration. Specifically, we describe an easy-to-follow, semi-automated approach using Fiji/ImageJ to analyze two cellular processes: first, we quantify protein aggregate content and profile in the Drosophila optic lobe using fluorescent-tagged mutant huntingtin proteins; and second, we assess autophagy-lysosome flux in the Drosophila visual system with ratiometric-based quantification of a tandem fluorescent reporter of autophagy. Importantly, the protocol outlined here includes a semi-automated segmentation step to ensure all fluorescent structures are analyzed to minimize selection bias and to increase resolution of subtle comparisons. This approach can be extended for the analysis of other cell biological structures and processes implicated in neurodegeneration, such as proteinaceous puncta (stress granules and synaptic complexes), as well as membrane-bound compartments (mitochondria and membrane trafficking vesicles). This method provides a standardized, yet adaptable reference point for image analysis and quantification, and could facilitate reliability and reproducibility across the field, and ultimately enhance mechanistic understanding of neurodegeneration.

Quantitative Cell Biology of Neurodegeneration in Drosophila Through Unbiased Analysis of Fluorescently Tagged Proteins Using ImageJ

We have developed a simple and adaptable workflow to extract quantitative data from fluorescence-imaging-based cell biological studies of protein aggregation and autophagic flux in the central nervous system of Drosophila models of neurodegeneration.

ImageJ を用いた蛍光タグ付きタンパク質の公平な分析によるショウジョウバエの神経変性の定量細胞生物学

With the rising prevalence of neurodegenerative diseases, it is increasingly important to understand the underlying pathophysiology that leads to neuronal ...