この作品は、保健研究のカナダの研究所によってサポートされていました。 CSCは、自然科学とカナダの工学研究評議会からのポスドクによって賄われていた。 FDはティアIIカナダリサーチチェアです。

<html>全体の再構築プロセス再構成プロセスは、洗剤で可溶化したリン脂質の存在下で精製MalFGK 2複合体と膜骨格タンパク質（MSP）を混合することによって開始されます。ステップは、Bio-ビーズまたはアンバーライト（ 図1）と呼ばれるポリスチレン系吸着材による洗剤の遅い除去のあとに続いています。自動組立工程が原因疎水性リン脂質、MalFGK 2錯体とMSP両親媒性タンパク質の表面との間の非極性相互作用の可能性が高くなります。最終製品はMalFGK 2錯体を包み込むMSPの2分子からなる円盤状の粒子である。粒子は、超遠心分離および分析用サイズ排除クロマトグラフィーにより付加物および凝集体から分離される。粒子はネイティブゲル電気泳動および動的光散乱分光法によって特徴付けられる。 膜足場タンパク質、MSPのタイトル &quot;&gt; 1。準備<ol><li> hisタグMSPは、（バージョンMSP1D1 1） 大腸菌におけるプラスミドpMSP1D1から生産され大腸菌 BL21（DE3）OD 600に誘起〜0.5mMのイソプロピル-β-D-1-チオガラクトピラノシドを37℃で3時間℃で0.5 </li><li>細胞は4℃で10分間5000×gで℃で遠心分離により回収し、100μMフェニルメタンスルホニルフッ化物を含むTSG10バッファーに再懸濁する。 </li><li>セルが8000 psiでフレンチプレス（3×）で溶解させ、不溶物を4℃で10分間5000 xgで遠心分離により除去されるMSPを含む可溶性画分を45分間125000×gで超遠心分離によって分離されています。 </li><li> MSPは、ニッケルキレートクロマトグラフィーTSG10バッファに〜1.5ミリリットルNiセファロースHPを用いて精製する。汚染物質を、50mMイミダゾールを含むTSG10バッファーで洗い流される。 MSPは600 mMを含むTSG10緩衝液で溶出されイミダゾール。精製したタンパク質はTSG10バッファに透析し、10月15日〜mg / mlのタンパク質濃度で-70℃に保存されています。 </li></ol> 2。 MalFGK 2複合体の調製<ol><li> MalFGK 2複合体は、MalKのC末端にHisタグ、 大腸菌におけるプラスミドpBAD22-FGKから発現される大腸菌 BL21（DE3）およびOD 600に誘起〜37℃で3時間で0.2％のL-アラビノース℃で0.5 </li><li>ステップ1.3のように、細胞溶解及び遠心分離後、膜ペレットを5 mg / mlの最終濃度でTSG20バッファーに再懸濁する。材料は、穏やかに振盪しながら4℃で3時間1％w / vのn-ドデシル-β-マルトピラノシド（DDM）℃で可溶化する。 </li><li>不溶性物質は、ステップ1.3および可溶化を含む上清のように超遠心分離により除去される MalFGK 2複合体を回収し、精製工程1.4のように、しかし、透析せずにされています。 </li><li> Furtherの浄化をSuperdex 200 HR 10 / 0.5ml /分の流速で300カラムでTSGDバッファーでゲルろ過クロマトグラフィーによって達成される。 </li></ol> 3。リン脂質の調製<ol><li> E.クロロホルムに溶解させた大腸菌総脂質抽出物は、スクリューキャップマイクロチューブは1,000 nmolのアリコートに分けられます。溶媒を窒素気流下で蒸発させ、真空デシケーター中でさらに一晩乾燥させる。 </li><li>脂質膜は、5 nMの最終濃度でTSバッファに溶解し、激しくボルテックスや超音波処理する。溶解した脂質が原因で水性TSバッファにおける彼らの一般的な不溶性に若干不透明に見えるでしょうが、彼らは、懸濁液のままにしてください。 DDMは、溶液が透明になる時0.5％（〜10mm）の最終濃度に添加される。 </li><li>脂質混合物を約5秒間5回超音波処理し、水浴及びパルスに配置されます。脂質混合物を1おしっこの最大4℃で保存されているK。 </li></ol> 4。バイオビーズの調製<ol><li>約10〜15ミリリットル（乾燥体積）バイオビーズを50mlチューブに入れています。 </li><li>ビーズを順次100％メタノール、95％エタノール、ミリQ H 2 O、および最終的にTSバッファ（二回）50mlで洗浄されています。 </li><li>洗浄したビーズは、4℃で保存するC〜10ミリリットルTSバッファインチ</li></ol> 5。 Nanodisc再構成<ol><li> MSPは〜7 mg / mlの（〜0.3 mM）の最終濃度でTSGD緩衝液中で希釈されています。 </li><li> MSP：TSGDバッファ内1:3:60または1:3:400の脂質比精製MalFGK 2複合体の約2 nmolのはタンパク質で混合される。最終濃度は6μmMalFGK 2、18μMのMSPおよび360μMの脂質（1:3:60）または2.4 mMの脂質（1:3:400）です。最終容量は300μlです。最終DDMの濃度は0.08％（〜1.6 mm）です。グリセロールの最終濃度は脂質の量に依存する追加されましたが、周りに5から10パーセントV / Vのまま</lI&gt; <li> 〜バイオビーズ懸濁液50μlをチューブに添加し、混合物を4℃で揺動テーブルの上に一晩インキュベートする。 </li><li>ビーズは、重力により沈降し、溶液を、できるだけ多くのバイオビーズを避けるために、狭い先端から分注される。 </li><li>沈殿大は20分間100,000×gで超遠心分離により除去される。ディスクはTSG10バッファ内のステップ2.4​​のようにゲルろ過クロマトグラフィーにより精製される。ディスクを含む画分をプールし、アリコート製剤の安定性をテストするために、同じゲル濾過カラムに再注入する必要があります。 </li><li>精製されたディスクは、長時間にわたって-70℃で保存することができます。氷の上で解凍後、ディスクは潜在的な沈殿物を除去するために、ステップ5.5のように、超遠心分離を行うべきである。アリコートは有意な凝集や沈殿が解凍時に発生しなかったことを確認するためにゲルろ過クロマトグラフィーで分析する必要がありますプロセス。 </li></ol> 6。ネイティブゲル電気泳動<ol><li> nanodiscsの1μM（〜0.2㎎/ ml）を再構成する（ 図3A）の品質を評価するためのネイティブPAGE 6,7（トリス-HCl pH 8.8、4-12％）によって分析される。 </li><li> 2複雑なMalFGKに男性の結合（1μM）はnanodiscsで再構成はまた、未変性PAGE（ 図3A）により評価される。 </li><li>泳動後、ゲルを10分間クマシーブルーで染色されており、約1時間脱色した。 </li></ol> 7。動的光散乱（DLS） <ol><li> Nanodiscsを​​Superdex 200 HR 10 / 0.1ml /分の流速で300カラムを用いてTSG10バッファ内のステップ2.4​​のように、ゲルろ過クロマトグラフィーにより精製される。 nanodiscsを​​含む画分をプールし、アミコン遠心フィルターで〜10 mg / mlに集中している。 </li><li>サンプルは使用DLSによって分析前（0.22μmフィルター）2回濾過さ1μlの内部体積石英キュベットでDynaPro nanostar楽器（ワイアットテクノロジー）。データは直径、粒子の分子量を推定するためにDynamicsソフトウェア（ワイアット·テクノロジー）を使用して装着されている。 </li></ol> 8。 ATPase活性測定<ol><li> MalFGK 2 -再構成nanodiscsのATPase活性は比色分析8を用いて決定される。 </li><li>精製されたディスクと1mMのATP1μMのは20分間、男性と37℃での増加量と一緒に混合されています。無機リン酸塩の放出は660 nmで測定する。 </li><li>解放リン酸の量は、リン標準溶液を用いて作成した標準曲線と比較されます。 </li></ol> 9。代表的な結果 nanodiscsは、ゲルろ過クロマトグラフィー（ 図2A、左 ）によって精製される。クロマトグラムを示し、その再構成されたdの過半数ISCS（黒のトレース）の単一ピークとして溶出し、一方、過剰な脂質（赤いトレース）ボイドボリュームに溶出して、広範な一連のピークとして作らディスク。 nanodiscsの質はさらに、ネイティブゲル電気泳動および動的光散乱法（DLS）によって分析されます。脂質の過剰の存在下で再構成されたものはスミア（ 図2A、右 ）のように移行するのに対し、適切に再構成されたディスクには、ゲル上の鋭いバンドとして移行されます。 DLSによる分析は、ディスクの人口は11.4 nmの（ 図2B）の平均粒径が均一であることを示しています。再構成されたディスクはDLS近似に基づいた215 kDaの見かけの分子量を有する。過剰な脂質の存在下で再構成したサンプルは、非均質な試料のために典型的である100nmであり、周囲に広く分布している半径を表示します。 MalFGK 2複合体の質がATPアーゼによるネイティブ·ゲル電気泳動し、その活性によって評価される測定結果（ 図3）。マルトース結合タンパク質の男性はMalFGK 2輸送9,10への高親和性で結合する。非変性ゲル電気泳動を使用して、それは男性とMalFGK 2（ 図3A）との複合体を検出することが可能である。男性がMalK 2 ATPase活性の刺激は、 図3Bに示されている。 <img src="/files/ftp_upload/3910/3910fig1.jpg" alt="図1"/> 図1。再構成プロトコルのための典型的なフローチャート。 <img src="/files/ftp_upload/3910/3910fig2.jpg" alt="図2"/> 図2。 nanodisc準備。Aの品質管理または高脂質比（1/3/400、赤いトレース）; nanodiscsのゲル濾過分析（スーパーデックス200 HR 10/300カラム）は、低脂質比（黒トレース1/3/60）で再構成した。同じディスクの準備のネイティブゲル電気泳動。モルkDaでecular量マーカーが表示されている。同じディスクの準備B.動的光散乱分析。 <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/3910/3910fig2large.jpg" target="_blank">拡大図を表示するには、ここをクリックしてください</a> 。 <img src="/files/ftp_upload/3910/3910fig3.jpg" alt="図3"/> 図3。 MalFGK 2 nanodisc粒子の分析。A. MalFGK 2 nanodisc粒子の量が増加するとともにインキュベート男性のゲルシフト解析。男性の濃度の関数としてMalFGK 2 nanodisc粒子BのATPase活性。

<ol>
	<li>Denisov, I. G., Ginkova, Y. V., Lazarides, A. A., Sligar, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+self-assembly+of+monodisperse+phospholipid+bilayer+Nanodiscs+with+controlled+size.">Directed self-assembly of monodisperse phospholipid bilayer Nanodiscs with controlled size.</a> J. Am. Chem. Soc. 126, 3477-3487 (2004).</li><li>Boldog, T., Grimme, S., Li, M., Sligar, S. G., Hazelbauer, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanodiscs+separate+chemoreceptor+oligomeric+states+and+reveal+their+signaling+properties.">Nanodiscs separate chemoreceptor oligomeric states and reveal their signaling properties.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 103, 11509-11514 (2006).</li><li>Bass, B. J., Denisov, I. G., Sligar, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Homotropic+cooperativity+of+monomeric+cytochrome+P450+3A4+in+a+nanoscale+native+bilayer+environment.">Homotropic cooperativity of monomeric cytochrome P450 3A4 in a nanoscale native bilayer environment.</a> J. Biol. Chem. 282, 7066-7076 (2007).</li><li>Alami, M., Dalal, K., Lelj-Garolla, B., Sligar, S. G., Duong, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanodiscs+unravel+the+interaction+between+the+SecYEG+channel+and+its+cytosolic+partner+SecA.">Nanodiscs unravel the interaction between the SecYEG channel and its cytosolic partner SecA.</a> EMBO J. 26, 1995-2004 (2007).</li><li>Mi, L. -. Z., Grey, M. J., Nishida, N., Walz, T., Lu, C., Springer, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+and+structural+stability+of+the+epidermal+growth+factor+receptor+in+detergent+micelles+and+phospholipid+nanodiscs.">Functional and structural stability of the epidermal growth factor receptor in detergent micelles and phospholipid nanodiscs.</a> Biochemistry. 47, 10314-10323 (2008).</li><li>Sch&#228;gger, H., Cramer, W. A., von Jagow, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+molecular+masses+and+oligomeric+states+of+protein+complexes+by+blue+native+electrophoresis+and+isolation+of+membrane+protein+complexes+by+two-dimensional+native+electrophoresis.">Analysis of molecular masses and oligomeric states of protein complexes by blue native electrophoresis and isolation of membrane protein complexes by two-dimensional native electrophoresis.</a> Anal. Biochem. 217, 220-230 (1994).</li><li>Dalal, K., Duong, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstitution+of+the+SecY+translocon+in+Nanodiscs.">Reconstitution of the SecY translocon in Nanodiscs.</a> Methods Mol. Biol. 619, 145-156 (2010).</li><li>Lanzetta, P. A., Alvarez, L. J., Reinach, P. S., Candia, O. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+assay+for+nanomole+amounts+of+inorganic+phosphate.">An improved assay for nanomole amounts of inorganic phosphate.</a> Anal. Biochem. 100, 95-97 (1979).</li><li>Davidson, A. L., Dassa, E., Orelle, C., Chen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure,+function+and+evolution+of+bacterial+ATP-binding+cassette+systems.">Structure, function and evolution of bacterial ATP-binding cassette systems.</a> Microbiol. Mol. Biol. Rev. 72, 317-364 (2008).</li><li>Bordignon, E., Grote, M., Schneider, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+maltose+ATP-binding+cassette+transporter+in+the+21st+century-towards+a+structural+dynamic+perspective+on+its+mode+of+action.">The maltose ATP-binding cassette transporter in the 21st century-towards a structural dynamic perspective on its mode of action.</a> Mol. Microbiol. 77, 1354-1366 (2010).</li><li>Alvarez, F. J., Orelle, C., Davidson, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+reconstitution+of+an+ABC+transporter+for+use+in+electron+paramagnetic+resonance+spectroscopy.">Functional reconstitution of an ABC transporter for use in electron paramagnetic resonance spectroscopy.</a> J. Am. Chem. Soc. 132, 9513-9515 (2010).</li><li>Ritchie, T. K., Grinkova, Y. V., Bayburt, T. H., Denisov, I. G., Zolnerciks, J. K., Atkins, W. M., Sligar, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstitution+of+membrane+proteins+in+phospholipid+bilayer+Nanodiscs.">Reconstitution of membrane proteins in phospholipid bilayer Nanodiscs.</a> Methods Enzymol. 464, 211-231 (2009).</li><li>Gl&#252;ck, J. M., Koenig, B. W., Willbold, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanodiscs+allow+the+use+of+integral+membrane+proteins+as+analytes+in+surface+plasmon+resonance+studies.">Nanodiscs allow the use of integral membrane proteins as analytes in surface plasmon resonance studies.</a> Anal. Biochem. 408, 46-52 (2011).</li><li>Wan, C. -. P. L., Chiu, M. H., Wu, X., Lee, S. K., Prenner, E. J., Weers, P. M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apolipoprotein-induced+conversion+of+phosphatidylcholine+bilayer+vesicles+into+nanodisks.">Apolipoprotein-induced conversion of phosphatidylcholine bilayer vesicles into nanodisks.</a> Biochim. Biophys. Acta (BBA). 1808, 606-613 (2011).</li><li>Nath, A., Trexler, A. J., Koo, P. K., Miranker, A. D., Atkins, W. M., Rhoades, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+fluorescence+spectroscopy+using+phospholipid+bilayer+Nanodiscs.">Single-molecule fluorescence spectroscopy using phospholipid bilayer Nanodiscs.</a> Methods Enzymol. 472, 89-117 (2010).</li><li>Denisov, I. G., Sligar, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytochromes+P450+in+Nanodiscs.">Cytochromes P450 in Nanodiscs.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1814, 223-229 (2011).</li><li>Zhang, X. X., Chan, C. S., Bao, H., Fang, Y., Foster, L. J., Duong, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanodiscs+and+SILAC-based+mass+spectrometry+to+identify+a+membrane+protein+interactome.">Nanodiscs and SILAC-based mass spectrometry to identify a membrane protein interactome.</a> J. Proteome Res. , (2011).</li></ol>

特別な利害関係は宣言されません。

我々はnanodiscsにマルトーストランスポーターの再構成のための簡単​​な手順を説明します。トランスポーターは、ATPアーゼ活性であり、水溶性の結合パートナーの男性との相互作用が（ 図3）再現することができます。 nanodiscsにトランスポーターの成功した再構成には、追加の生物物理学的および生化学的解析のための道を開く。特に興味深いのは、体系的な分析洗剤、リポ?...

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬の名称 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td><td> 注釈 </td></tr><tr><td>アミコンウルトラ-4 50K遠心フィルター</td><td>ミリポア</td><td> UFC805008 </td><td>適切な使用については、製造元のプロトコルに従ってください</td></tr><tr><td>バイオビーズSM-2吸着剤</td><td>バイオ·ラッド</td><td> 152-3920 </td><td></td></tr><tr><td> 大腸菌総脂質</td><td>アヴァンティ極性脂質</td><td> 100500C </td><td>クロロホルムに溶解し、有機溶剤に応じて扱う</td></tr><tr><td> NiセファロースHPの樹脂</td><td> GEヘルスケア</td><td> 17-5268-01 </td><td></td></tr><tr><td>リン標準溶液</td><td>シグマアルドリッチ</td><td> P3869 </td><td></td></tr><tr><td> pMSP1D1 </td><td> Addgene </td><td> 20061 </td><td></td></tr><tr><td>たSuperdex 200 HR 300分の10 </td><td> GEヘルスケア</td><td> 17-5172-01 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> 表Iに特異的な試薬。 </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td><table border="1"><tbody><tr><td> 名前 </td><td> 構図 </td><td> 注釈 </td></tr><tr><td> DDMの株式</td><td>の10％w / vのDDM </td><td> -20℃でミリQ水とストアに再懸濁</td></tr><tr><td> MalFGK 2株式</td><td> 1から2 mg / mlの 50mMトリス-HCl、pH7.9 100mMのNaCl 10％v / vのグリセロール 0.03パーセントw / vのDDM </td><td> -70℃で保存精製後</td></tr><tr><td> MSPの株式</td><td> 10から15 mg / mlの 50mMトリス-HCl、pH7.9 100mMのNaCl 10％v / vのグリセロール</td><td> -70℃で保存&lt;1mlのアリコートで精製後や過度の凍結/融解サイクルを避ける</td></tr><tr><td>リン脂質株式</td><td> 5nMのE.大腸菌総脂質 0.5パーセントw / vの（10mM）を、DDM 50mMのトリス-HCl、pH 7.9 50mMのNaCl </td><td> 1週間に4℃で保存</td></tr><tr><td> TSバッファ</td><td> 50mMのトリス-HCl、pH 7.9 50mMのNaCl </td><td> 4℃で保存</td></tr><tr><td> TSG10バッファ</td><td> 50mMトリス-HCl、pH7.9 100mMのNaCl 10％v / vのグリセロール</td><td> 4℃で保存</td></tr><tr><td> TSG20バッファ</td><td> 50mMトリス-HCl、PH8 100mMのNaCl 20パーセントv / vグリセロール</td><td> 4℃で保存</td></tr><tr><td> TSGDバッファ</td><td> 50mMトリス-HCl、pH7.9 100mMのNaCl 10％v / vのグリセロール 0.03パーセントw / vのDDM </td><td> 4℃で保存し、使用直前にDDMを追加</td></tr><tr><td colspan="3"> 表II。ソリューションレシピ。 </td></tr></tbody></table></td></tr></tbody></table>

a step-by-step method for the reconstitution of an abc transporter into nanodisc lipid particles

nanodiscは、円盤状の粒子（〜10月12日NM大）リン脂質二重層の小さなパッチにトラップ膜タンパク質ということです。 nanodiscは特にリガンド - 受容体相互作用の文脈では、膜タンパク質を研究するために特に魅力的な選択肢である。 Sligarらによって開拓方法はアポリポタンパク質A1由来組み換え高ヘリカル足場タンパク質の両親媒性の性質に基づいている。極地は、水性環境に直面し、一方足場タンパク質の疎水性面は、脂質二重層の脂肪アシル側鎖と相互作用する。粒子が小さく、均質かつ水溶性であるためnanodiscsにおける膜タンパク質の解析がリポソーム上の重要な利点を持っています。また、通常は水溶性タンパク質に予約生化学的および生物物理学的手法を適用し、膜のいずれかの側からすることができます。この視覚的なプロトコルでは、我々はよく特性のステップ·バイ·ステップの再構成を提示terized細菌のABCトランスポーター、男性MalFGK 2複合体。ディスクの形成は、洗剤の進歩的な除去の際に行われている疎水性相互作用に依存して自己組織化プロセスである。私たちは本質的な手順を説明し、私たちは集合体と大きい多分散リポソーム状粒子の形成を制限するために、正しいタンパク質対脂質比を選択することの重要性を強調。単純な品質は、そのようなディスクが正しく再構成されていることを確認し、ゲル濾過クロマトグラフィー、天然ゲル電気泳動および動的光散乱分光法として制御します。

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A Step-by-step Method for the Reconstitution of an ABC Transporter into Nanodisc Lipid Particles

Nanodiscsはリン脂質二重層の小さなパッチに膜タンパク質を組み込んだ小さな円盤状の粒子である。我々は、ディスクへのMalFGK2ポーターのステップ·バイ·ステップの取り込みを示し視覚プロトコルを提供します。

Nanodisc脂質粒子にABCトランスポーターの再構成のためのステップ·バイ·ステップ方式

The nanodisc is a discoidal particle (~ 10-12 nm large) that trap membrane proteins into a small patch of phospholipid bilayer. The nanodisc is a ...

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Research

JoVE Journal

Biology

25.4K ビュー.  University of British Columbia. Nanodiscsはリン脂質二重層の小さなパッチに膜タンパク質を組み込んだ小さな円盤状の粒子である。我々は、ディスクへのMalFGK2ポーターのステップ·バイ·ステップの取り込みを示し視覚プロトコルを提供します。

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Method to Visualize and Analyze Membrane Interacting Proteins by Transmission Electron Microscopy

Monotopic proteins exert their function when attached to a membrane surface, and such interactions depend on the specific lipid composition and on the availability of enough area to perform the function. Nanodiscs are used to provide a membrane surface of controlled size and lipid content. In the absence of bound extrinsic proteins, sodium phosphotungstate-stained nanodiscs appear as stacks of coins when viewed from the side by transmission electron microscopy (TEM). This protocol is therefore designed to intentionally promote stacking; consequently, the prevention of stacking can be interpreted as the binding of the membrane-binding protein to the nanodisc. In a further step, the TEM images of the protein-nanodisc complexes can be processed with standard single-particle methods to yield low-resolution structures as a basis for higher resolution cryoEM work. Furthermore, the nanodiscs provide samples suitable for either TEM or non-denaturing gel electrophoresis. To illustrate the method, Ca2+-induced binding of 5-lipoxygenase on nanodiscs is presented.

Many proteins perform their function when attached to membrane surfaces. The binding of extrinsic proteins on nanodisc membranes can be indirectly imaged by transmission electron microscopy. We show that the characteristic stacking (rouleau) of nanodiscs induced by the negative stain sodium phosphotungstate is prevented by the binding of extrinsic protein.

透過型電子顕微鏡により膜相互作用タンパク質を視覚化し、分析するための方法

Monotopic proteins exert their function when attached to a membrane surface, and such interactions depend on the specific lipid composition and on the ...

生化学

A Model Membrane Platform for Reconstituting Mitochondrial Membrane Dynamics

Mitochondrial dynamics is essential for the organelle&#8217;s diverse functions and cellular responses. The crowded, spatially complex, mitochondrial membrane is a challenging environment to distinguish regulatory factors. Experimental control of protein and lipid components can help answer specific questions of regulation. Yet, quantitative manipulation of these factors is challenging in cellular assays. To investigate the molecular mechanism of mitochondria inner-membrane fusion, we introduced an in vitro reconstitution platform that mimics the lipid environment of the mitochondrial inner-membrane. Here we describe detailed steps for preparing lipid bilayers and reconstituting mitochondrial membrane proteins. The platform allowed analysis of intermediates in mitochondrial inner-membrane fusion, and the kinetics for individual transitions, in a quantitative manner. This protocol describes the fabrication of bilayers with asymmetric lipid composition and describes general considerations for reconstituting transmembrane proteins into a cushioned bilayer. The method may be applied to study other membrane systems.

Mitochondrial fusion is an important homeostatic reaction underlying mitochondrial dynamics. Described here is an in vitro reconstitution system to study mitochondrial inner-membrane fusion that can resolve membrane tethering, docking, hemifusion, and pore opening. The versatility of this approach in exploring cell membrane systems is discussed.

ミトコンドリア膜動態を再構成するためのモデル膜プラットフォーム

Mitochondrial dynamics is essential for the organelle&#8217;s diverse functions and cellular responses. The crowded, spatially complex, mitochondrial ...

Co-Translational Insertion of Membrane Proteins into Preformed Nanodiscs

Cell-free expression systems allow the tailored design of reaction environments to support the functional folding of even complex proteins such as membrane proteins. The experimental procedures for the co-translational insertion and folding of membrane proteins into preformed and defined membranes supplied as nanodiscs are demonstrated. The protocol is completely detergent-free and can generate milligrams of purified samples within one day. The resulting membrane protein/nanodisc samples can be used for a variety of functional studies and structural applications such as crystallization, nuclear magnetic resonance, or electron microscopy. The preparation of basic key components such as cell-free lysates, nanodiscs with designed membranes, critical stock solutions as well as the assembly of two-compartment cell-free expression reactions is described. Since folding requirements of membrane proteins can be highly diverse, a major focus of this protocol is the modulation of parameters and reaction steps important for sample quality such as critical basic reaction compounds, membrane composition of nanodiscs, redox and chaperone environment, or DNA template design. The whole process is demonstrated with the synthesis of proteorhodopsin and a G-protein coupled receptor.

Co-translational insertion into pre-formed nanodiscs makes it possible to study cell-free synthesized membrane proteins in defined lipid environments without contact with detergents. This protocol describes the preparation of essential system components and the critical parameters for improving expression efficiency and sample quality.

予め形成されたナノディスクへの膜タンパク質の共翻訳挿入

Cell-free expression systems allow the tailored design of reaction environments to support the functional folding of even complex proteins such as ...

Selection of Transporter-Targeted Inhibitory Nanobodies by Solid-Supported-Membrane (SSM)-Based Electrophysiology

Single domain antibodies (nanobodies) have been extensively used in mechanistic and structural studies of proteins and they pose an enormous potential as tools for developing clinical therapies, many of which depend on the inhibition of membrane proteins such as transporters. However, most of the methods used to determine the inhibition of transport activity are difficult to perform in high-throughput routines and depend on labeled substrates availability thereby complicating the screening of large nanobody libraries. Solid-supported membrane (SSM) electrophysiology is a high-throughput method, used for characterizing electrogenic transporters and measuring their transport kinetics and inhibition. Here we show the implementation of SSM-based electrophysiology to select inhibitory and non-inhibitory nanobodies targeting an electrogenic secondary transporter and to calculate nanobodies inhibitory constants. This technique may be especially useful for selecting inhibitory nanobodies targeting transporters for which labeled substrates are not available.

Selection of Transporter-Targeted Inhibitory Nanobodies by Solid-Supported-Membrane SSM-Based Electrophysiology

Nanobodies are important tools in structural biology and pose a great potential for the development of therapies. However, the selection of nanobodies with inhibitory properties can be challenging. Here we demonstrate the use of solid-supported-membrane (SSM)-based electrophysiology for the classification of inhibitory and non-inhibitory nanobodies targeting electrogenic membrane transporters.

固体支持膜(SSM)ベースの電気生理学によるトランスポーター標的阻害ナノボディの選択

Single domain antibodies (nanobodies) have been extensively used in mechanistic and structural studies of proteins and they pose an enormous potential as ...

Formulation and Characterization of Bioactive Agent Containing Nanodisks

The term nanodisk refers to a discrete type of nanoparticle comprised of a bilayer forming lipid, a scaffold protein, and an integrated bioactive agent. Nanodisks are organized as a disk-shaped lipid bilayer whose perimeter is circumscribed by the scaffold protein, usually a member of the exchangeable apolipoprotein family. Numerous hydrophobic bioactive agents have been efficiently solubilized in nanodisks by their integration into the hydrophobic milieu of the particle&#39;s lipid bilayer, yielding a largely homogenous population of particles in the range of 10-20 nm in diameter. The formulation of nanodisks requires a precise ratio of individual components, an appropriate sequential addition of each component, followed by bath sonication of the formulation mixture. The amphipathic scaffold protein spontaneously contacts and reorganizes the dispersed bilayer forming lipid/bioactive agent mixture to form a discrete, homogeneous population of nanodisk&#160;particles. During this process, the reaction mixture transitions from an opaque, turbid appearance to a clarified sample that, when fully optimized, yields no precipitate upon centrifugation. Characterization studies involve the determination of bioactive agent solubilization efficiency, electron microscopy, gel filtration chromatography, ultraviolet visible (UV/Vis) absorbance spectroscopy, and/or fluorescence spectroscopy. This is normally followed by an investigation of biological activity using cultured cells or mice. In the case of nanodisks harboring an antibiotic (i.e., the macrolide polyene antibiotic amphotericin B), their ability to inhibit the growth of yeast or fungi as a function of concentration or time can be measured. The relative ease of formulation, versatility with respect to component parts, nanoscale particle size, inherent stability, and aqueous solubility permits myriad in vitro and in vivo applications of nanodisk technology. In the present article, we describe a general methodology to formulate and characterize nanodisks containing amphotericin&#160;B as the hydrophobic bioactive agent.

Here, we describe the production and characterization of bioactive agents containing nanodisks. Amphotericin B nanodisks are taken as an example to describe the protocol in a stepwise manner.

ナノディスクを含む生理活性物質の製剤化とキャラクタリゼーション

The term nanodisk refers to a discrete type of nanoparticle comprised of a bilayer forming lipid, a scaffold protein, and an integrated bioactive agent. ...

脂質バイセルにおけるABCトランスポーター膜タンパク質の結晶化

ABCG5/G8 Crystallization in a Lipidic Bicelle Environment for X-Ray Crystallography

ATP-binding cassette (ABC) transporters constitute lipid-embedded membrane proteins. Extracting these membrane proteins from the lipid bilayer to an aqueous environment is typically achieved by employing detergents. These detergents disintegrate the lipid bilayer and solubilize the proteins. The intrinsic habitat of membrane proteins within the lipid bilayer poses a challenge in maintaining their stability and uniformity in solution for structural characterization. Bicelles, which comprise a blend of long and short-chain phospholipids and detergents, replicate the natural lipid structure. The utilization of lipid bicelles and detergents serves as a suitable model system for obtaining high-quality diffraction crystals, specifically to determine the high-resolution structure of membrane proteins. Through these synthetic microenvironments, membrane proteins preserve their native conformation and functionality, facilitating the formation of three-dimensional crystals. In this approach, the detergent-solubilized heterodimeric ABCG5/G8 was reintegrated into DMPC/CHAPSO bicelles, supplemented with cholesterol. This setup was employed in the vapor diffusion experimental procedure for protein crystallization.

著者スポットライト:医薬品開発を進めるためのABCトランスポーター膜タンパク質のバイセル結晶化セットアップ 

This protocol describes a setup for the crystallization of the sterol transporter ABCG5/G8. ABCG5/G8 is reconstituted into bicelles for hanging-drop crystallization. The protocol does not require specialized materials or substrates, making it accessible and easy to adapt in any laboratory for determining the protein structure through X-ray crystallography.

脂質バイセル環境下でのABCG5/G8結晶化によるX線結晶構造解析

ATP-binding cassette (ABC) transporters constitute lipid-embedded membrane proteins. Extracting these membrane proteins from the lipid bilayer to an ...

複雑な蛋白質ネットワークのための脂質小胞のカプセル化のプロトコール

Construction of Out&#45;of&#45;Equilibrium Metabolic Networks in Nano&#45; and Micrometer&#45;Sized Vesicles

We present a method to incorporate into vesicles complex protein networks, involving integral membrane proteins, enzymes, and fluorescence-based sensors, using purified components. This method is relevant for the design and construction of bioreactors and the study of complex out-of-equilibrium metabolic reaction networks. We start by reconstituting (multiple) membrane proteins into large unilamellar vesicles (LUVs) according to a previously developed protocol. We then encapsulate a mixture of purified enzymes, metabolites, and fluorescence-based sensors (fluorescent proteins or dyes) via freeze-thaw-extrusion and remove non-incorporated components by centrifugation and/or size-exclusion chromatography. The performance of the metabolic networks is measured in real time by monitoring the ATP/ADP ratio, metabolite concentration, internal pH, or other parameters by fluorescence readout. Our membrane protein-containing vesicles of 100-400 nm diameter can be converted into giant-unilamellar vesicles (GUVs), using existing but optimized procedures. The approach enables the inclusion of soluble components (enzymes, metabolites, sensors) into micrometer-size vesicles, thus upscaling the volume of the bioreactors by orders of magnitude. The metabolic network containing GUVs are&#160;trapped in microfluidic devices for analysis by optical microscopy.

著者スポットライト:合成細胞工学における課題への取り組み

We present a protocol for reconstituting membrane proteins and encapsulating enzymes and other water-soluble components in lipid vesicles of sub-micrometer and micrometer size.

ナノ・マイクロメートル小胞における非平衡代謝ネットワークの構築

We present a method to incorporate into vesicles complex protein networks, involving integral membrane proteins, enzymes, and fluorescence-based sensors, ...

Nanodisc脂質粒子にABCトランスポーターの再構成のためのステップ·バイ·ステップ方式

要約

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透過型電子顕微鏡により膜相互作用タンパク質を視覚化し、分析するための方法

ミトコンドリア膜動態を再構成するためのモデル膜プラットフォーム

予め形成されたナノディスクへの膜タンパク質の共翻訳挿入

固体支持膜(SSM)ベースの電気生理学によるトランスポーター標的阻害ナノボディの選択

ナノディスクを含む生理活性物質の製剤化とキャラクタリゼーション

脂質バイセル環境下でのABCG5/G8結晶化によるX線結晶構造解析

脂質バイセル環境下でのABCG5/G8結晶化によるX線結晶構造解析

脂質バイセル環境下でのABCG5/G8結晶化によるX線結晶構造解析

ナノ・マイクロメートル小胞における非平衡代謝ネットワークの構築

ナノ・マイクロメートル小胞における非平衡代謝ネットワークの構築