Name: co-translational insertion of membrane proteins into preformed nanodiscs
Uploaded: 2020-11-19T14:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 24 s
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ドイツ科学研究センター(DFG)助成金BE1911/8-1、ロエベプロジェクトGLUE、および膜を越えた輸送と通信共同研究センター(SFB807)の財政支援に感謝します。

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CF発現とナノディスクへの機能性MPの共翻訳挿入を最適化するためのセットアップと戦略について説明します。必要な機器は、バイオリアクター、フレンチプレス装置など、UV/VISおよび蛍光リーダー、2コンパートメント構成のセットアップに適したCF反応容器、および温度制御されたインキュベーターで構成されます。さらに標準的な装置は、大腸菌細胞を回収するための遠心分離機と...

膜タンパク質(MP)は、水性環境に不溶であるため、タンパク質生産研究において困難な標的です。従来のMP生産プラットフォームは、 大腸菌、酵母、真核細胞などの細胞ベースのシステムで構成されています。合成された組換えMPは、細胞膜から抽出されるか、封入体1からリフォールディングされます。界面活性剤の可溶化後、MPは、確立されたin vitro再構成プロトコルによって適切な膜環境に移すことができます。小胞およびリポソームに加えて、MPはナノディスク2 またはサリプロ3 粒子の形態の平面膜に再構成され、最近では日常的な技術となっている。ただし、これらの戦略はすべて、MPとの界面活性剤の接触を意味し、不安定化、オリゴマーの解離、さらにはタンパク質の構造と活性の喪失を引き起こす可能性があります4。したがって、最適な洗剤の可溶化および再構成条件のスクリーニングは、面倒で時間がかかる場合があります5。
無細胞(CF)系の開放性により、発現反応は、定義された脂質組成を有する予め形成された膜で直接供給される。この脂質ベースの発現モード(L-CF)では、合成されたMPは、提供された二重層6,7に共翻訳的に挿入する機会を有する(図1)。平面脂質二重層ディスク8を取り囲む膜足場タンパク質(MSP)からなるナノディスクは、この戦略に特に適していると思われる9、10。ナノディスクは、さまざまな脂質を使用してin vitroで日常的に組み立てることができ、非常に安定しており、ストックは最大1 mMまで濃縮できます。しかしながら、大腸菌におけるMSP発現およびその精製は必要である。代替戦略として、MSPは、リポソーム11、12、13と共に供給されるCF反応において標的MPと共に共発現され得る。MSPとMPの両方のDNAテンプレートが反応に添加され、発現時にMP/ナノディスクが形成されます。MSP産生は回避されますが、共発現戦略では最終的なDNAテンプレート濃度の慎重な微調整が必要であり、サンプル産生効率のより高い変動が予想されます。
予め形成されたナノディスクの膜へのMPの共翻訳挿入は、トランスロコン機構およびシグナル配列から独立した非生理学的でまだほとんど知られていないメカニズムである13,14,15,16。挿入効率の主な決定要因は、膜タンパク質の種類と提供された膜の脂質組成であり、負に帯電した脂質が頻繁に好まれます15,17。ナノディスク膜はサイズが比較的限られているため、MP挿入時にかなりの量の脂質が放出されます18。ナノディスクサイズの変動は、より高いオリゴマーMP複合体の挿入および調整を可能にする15,18。とりわけ、ホモオリゴマー複合体の正しい集合は、イオンチャネルKcsA、イオンポンププロテオロドプシン(PR)、および多剤トランスポーターEmrE15,18について示されました。MPは、対称ナノディスク膜に両側から比較的等しい周波数で入る可能性があります。したがって、1つのナノディスクに挿入された異なるモノマーまたはオリゴマーは、反対の配向を有する可能性があることを考慮する必要があります。しかし、配向の偏りは、PR六量体およびKcsA四量体の形成について報告されているように、協同的な挿入機構によって引き起こされる可能性があります18。MP配向のさらなるバイアスは、おそらくナノディスク膜の縁に挿入されたMPの配向スイッチに起因する可能性があります。
大腸菌株からのCFライセートの製造は、信頼できるルーチン技術であり、ほぼすべての生化学実験室で実施することができる19,20。ジスルフィド架橋形成に加えて、MPが大腸菌溶解物を用いて合成される場合、他のほとんどの翻訳後修飾は存在しないと考えられるべきである。これにより、構造研究のためにより均質なサンプルが生成される可能性がありますが、個々のMPターゲットの機能に対する潜在的な影響を排除する必要がある場合があります。しかし、大腸菌CFライセート中のGタンパク質共役受容体(GPCR)14,21,22、真核生物トランスポーター23、または大型ヘテロマーアセンブリ24の高品質サンプルを効率的に生産することは、複雑な標的にも適していることを示しています。サンプルの分取スケール量(≈ 1 mg/mL)は、反応混合物(RM)と供給混合物(FM)コンパートメントで構成される2コンパートメント連続交換セルフリー(CECF)構成で得ることができます。FM体積はRM体積を15〜20倍超え、低分子量エネルギー化合物および前駆体19のリザーバを提供する。したがって、発現反応は数時間延長され、MPターゲットの最終収率が増加します。RMコンパートメントとFMコンパートメントは、10〜14 kDaのカットオフを備えた透析膜によって分離されています。2つのコンパートメントには、CECF反応容器の特別な設計が必要です(図1)。FMを保持するテーラードプレキシガラス容器と組み合わせたRM容器としての市販の透析カセットが好適な例である。MP収量は、RM:FM比を変更するか、一定期間のインキュベーション後にFMを交換することによってさらに操作できます。
MPの収率と品質には、反応パラメータの徹底的な最適化が求められることがよくあります。CF発現の重要な利点は、MPの個々の要件に応じてほぼすべての化合物を修正および微調整できることです。簡単な戦略は、最初に基本的な生産プロトコルを確立してMPの歩留まりを向上させることに焦点を当て、次に反応と折り畳み条件を微調整することによってMPの品質を最適化することです。CFライセートに生理学的プロセスがなく、複雑さが軽減されているため、MP25の効率的な生産の成功率が高くなっています。DNAテンプレートの設計およびMg2+イオン濃度の最適化に関する日常的な考慮事項は、ほとんどの場合、満足のいく収率を得るのに十分である26。発現モードによっては、より多様なパラメータをスクリーニングする必要があるため、MP品質の最適化に時間がかかる場合があります14、17、22。
記載されたCF発現プラットフォームを確立するには、 大腸菌 CFライセート(i)、T7 RNAポリメラーゼ(ii)、ナノディスク(iii)、および塩基性CECF反応化合物(iv)の生産にプロトコルが必要です(図1)。 大腸菌 K12株A1927 またはBL21誘導体は、効率的なS30(30,000 x gでの遠心分離)溶解物の調製に頻繁に使用されます。S30溶解物に加えて、他の g力で遠心分離された対応する溶解物(例えばS12)が使用され得る。ライセートは、発現効率とプロテオームの複雑さが異なります。記載されたプロトコルによって調製されたS30ライセートのプロテオームは、詳細に研究されている28。S30プロテオームには、イオンチャネルの発現および分析時にバックグラウンドの問題を引き起こす可能性のある残留外膜タンパク質がまだ含まれています。このようなターゲットには、S80-S100ライセートの使用が推奨されます。ライセート調製中の貴重な変更は、細胞の対数増殖期半ばでの熱ショックとエタノール供給の組み合わせによるSOS応答の誘導です。得られたHS30ライセートはシャペロンに富んでおり、MPフォールディングを改善するためにS30ライセートとのブレンドで使用することができる22。 大腸菌 ライセートにおけるCF発現は、T7 RNAポリメラーゼ(T7RNAP)によって制御されるプロモーターを含むDNAテンプレートとの共役転写/翻訳プロセスとして操作されます。この酵素は、pAR1219プラスミド29を保有するBL21(DE3)スター細胞で効率的に生産することができます。
MSP1E3D1の2つのコピーは、直径10〜12nmの1つのナノディスクに集合するが、以下に説明するプロトコルは、他のMSP誘導体に対しても機能する可能性がある。ただし、MSP1E3D1で形成されたナノディスクよりも大きいナノディスクは安定性が低下する傾向があり、MSP1などのMSP誘導体で形成された小さなナノディスクは、より大きなMPまたはMP複合体に対応できない可能性があります。MSP1E3D1ナノディスクは、多種多様な異なる脂質または脂質混合物を用いてin vitroで組み立てることができます。予め形成されたナノディスクは通常、-80°Cで>1年間安定ですが、安定性は脂質成分によって異なる場合があります。MPの折り畳みと安定性に対する脂質効果のスクリーニングのためには、代表的な種類の脂質/脂質混合物で組み立てられたナノディスクの包括的なセットを準備する必要があります。1,2-ジミリストイル-sn-グリセロ-3-ホスホ-(1'-rac-グリセロール)(DMPG)、1,2-ジミリストイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(DMPC)、1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホ-rac-(1-グリセロール)(DOPG)、1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(DOPC)、1-パルミトイル-2-オレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホ-(1'-rac-グリセロール)(POPG)および1-パルミトイル-2-オレオイル-グリセロ-3-ホスホコリン(POPC)。
3 mL CECF反応を調製するためのプロトコルについて説明します。1:1の比率でさらに拡大または縮小することが可能です。2コンパートメントCECF構成の場合、すべての化合物を含むRMと低分子量化合物のみを含むFMを準備する必要があります。10〜14 kDa MWCOの市販の3 mL透析装置はRM容器として使用でき、RM容器はFMを保持するカスタムメイドのプレキシガラス容器に入れられます(図1D)30。RM:FMの比率は1:20であるため、3 mL RMに対して60 mLのFMを準備する必要があります。 いくつかの成分の品質、濃度、または種類は、合成されたMPの最終的な収率および/または品質にとって重要な場合があります(表1)。DNAテンプレートは、公表されたガイドラインに従って調製されるべきであり、ターゲットのリーディングフレームのコドン最適化は、生成物収率をさらに有意に改善することができる26。分取スケールCECF反応について、PRの産生のための確立されたプロトコルが記載されている。新しいMPの発現プロトコルを確立するには、通常、収率と品質を向上させるために、特定の化合物の最適化スクリーニングを実行する必要があります(表1)。Mg2+ イオンについては、異なるDNAテンプレートに対して有意な変動を頻繁に示す、焦点を絞った最適な濃度が存在する。T7RNAPまたはS30ライセートの新しいバッチなどの他のCF反応化合物は、最適なMg2+ 濃度をさらにシフトさせる可能性があります。一例として、14〜24mMの濃度の範囲内でかつ2mMのステップで典型的なMg2+ スクリーンが説明される。各濃度は、二重および分析スケールのCECF反応でスクリーニングされます。CECF反応容器として、RMを保持するカスタムメイドのMini−CECFプレキシグラス容器30 が、FMを保持する標準的な24ウェルマイクロプレートと組み合わせて使用される(図1B)。あるいは、96深さウェルマイクロプレートまたは他の市販の透析装置と組み合わせた市販の透析カートリッジを適切なセットアップで使用してもよい(図1C)。

<table><tbody><tr><td>1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phospho-(1&#039;-rac-glycerol) (sodium salt) (DMPG)</td><td>Avanti Polar Lipids (USA)</td><td>840445P</td><td></td></tr><tr><td>1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DMPC)</td><td>Avanti Polar Lipids (USA)</td><td>850345C</td><td></td></tr><tr><td>1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (sodium salt) (DOPC)</td><td>Avanti Polar Lipids (USA)</td><td>850375C</td><td></td></tr><tr><td>1,2 dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-rac-(1-glycerol) (sodium salt) (DOPG)</td><td>Avanti Polar Lipids (USA)</td><td>840475C</td><td></td></tr><tr><td>1-palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-phosphocholine (POPC)</td><td>Avanti Polar Lipids (USA)</td><td>850457C</td><td></td></tr><tr><td>1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phospho-(1&#039;-rac-glycerol) (sodium salt) (POPG)</td><td>Avanti Polar Lipids (USA)</td><td>840034C</td><td></td></tr><tr><td>2-Amino-2-(hydroxymethyl)-propan-1,3-diol (Tris)</td><td>Carl Roth (Germany)</td><td>4855</td><td></td></tr><tr><td>2-Mercaptoethanol</td><td>Carl Roth (Germany)</td><td>4227</td><td></td></tr><tr><td>2-Propanol</td><td>Carl Roth (Germany)</td><td>9781</td><td></td></tr><tr><td>[&lt;sup&gt;3&lt;/sup&gt;H]-dihydroalprenolol Hydrochloride</td><td>American Radiolabeled Chemicals (USA)</td><td>ART0134</td><td></td></tr><tr><td>Acetyl phosphate lithium potassium salt (ACP)</td><td>Merck (Germany)</td><td>1409</td><td></td></tr><tr><td>Adenosine 5&amp;rsquo;-triphosphate (ATP)</td><td>Sigma Aldrich (Germany)</td><td>A9251</td><td></td></tr><tr><td>Alprenolol hydrochloride</td><td>Merck (Germany)</td><td>A0360000</td><td></td></tr><tr><td>Anion exchange chromatography column material: Q-sepharose&amp;reg;</td><td>Sigma-Aldrich (Germany)</td><td>Q1126</td><td></td></tr><tr><td>Autoclave Type GE 446EC-1</td><td>Gettinge (Germany)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bioreactor Type 884 124/1</td><td>B.Braun (Germany)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>Sorvall RC12BP+; Thermo Scientific (Germany); Sorvall RC-5C; Thermo Scientific (Germany); Mikro 22 R; Hettich (Germany)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cholic acid</td><td>Carl Roth (Germany)</td><td>8137</td><td></td></tr><tr><td>Coomassie Brilliant Blue R250</td><td>Carl Roth (Germany)</td><td>3862</td><td></td></tr><tr><td>Culture flasks 500 ml baffled flasks, 2 l baffled flasks</td><td>Schott Duran (Germany)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cytidine 5&#039;-triphosphate disodium salt</td><td>Sigma-Aldrich (Germany)</td><td>C1506</td><td></td></tr><tr><td>D-glucose monohydrate</td><td>Carl Roth (Germany)</td><td>6780</td><td></td></tr><tr><td>Di-potassiumhydrogen phosphate trihydrate</td><td>Carl Roth (Germany)</td><td>6878</td><td></td></tr><tr><td>Dialysis tubing Spectrum&lt;sup&gt;TM&lt;/sup&gt; Labs Spectra/Por&lt;sup&gt;TM&lt;/sup&gt; 12-14 kD MWCO Standard RC tubing</td><td>Fisher Scientific (Germany)</td><td>8700152</td><td></td></tr><tr><td>Dithiothreit</td><td>Carl Roth (Germany)</td><td>6908</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Carl Roth (Germany)</td><td>K928</td><td></td></tr><tr><td>Folinic acid calcium salt hydrate</td><td>Sigma-Aldrich (Germany)</td><td>47612</td><td></td></tr><tr><td>French pressure cell disruptor</td><td>SLM; Amico Instruments (USA)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Carl Roth (Germany)</td><td>3783</td><td></td></tr><tr><td>Guanosine 5&#039;-triphosphate di-sodium salt (GTP)</td><td>Sigma-Aldrich (Germany)</td><td>G8877</td><td></td></tr><tr><td>Hydrochloric Acid</td><td>Carl Roth (Germany)</td><td>K025</td><td></td></tr><tr><td>IMAC column: HiTrap IMAC HP 5 mL</td><td>GE Life Sciences (Germany)</td><td>GE17-5248</td><td></td></tr><tr><td>Imidazole</td><td>Carl Roth (Germany)</td><td>3899</td><td></td></tr><tr><td>Isopropyl-&amp;beta;-D-thiogalactopyranosid (IPTG)</td><td>Carl Roth (Germany)</td><td>2316</td><td></td></tr><tr><td>Kanamycin</td><td>Carl Roth (Germany)</td><td>T832</td><td></td></tr><tr><td>L-Alanine</td><td>Carl Roth (Germany)</td><td>3076.1</td><td></td></tr><tr><td>L-Arginine</td><td>Carl Roth (Germany)</td><td>6908</td><td></td></tr><tr><td>L-Asparagine</td><td>Carl Roth (Germany)</td><td>HN23</td><td></td></tr><tr><td>L-Aspartic Acid</td><td>Carl Roth (Germany)</td><td>T202</td><td></td></tr><tr><td>L-Cysteine</td><td>Carl Roth (Germany)</td><td>T203</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamic Acid</td><td>Carl Roth (Germany)</td><td>3774</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamine</td><td>Carl Roth (Germany)</td><td>3772</td><td></td></tr><tr><td>L-Glycine</td><td>Carl Roth (Germany)</td><td>3187</td><td></td></tr><tr><td>L-Histidine</td><td>Carl Roth (Germany)</td><td>3852</td><td></td></tr><tr><td>L-Isoleucine</td><td>Carl Roth (Germany)</td><td>3922</td><td></td></tr><tr><td>L-Leucine</td><td>Carl Roth (Germany)</td><td>1699</td><td></td></tr><tr><td>L-Lysine</td><td>Carl Roth (Germany)</td><td>4207</td><td></td></tr><tr><td>L-Methionine</td><td>Carl Roth (Germany)</td><td>9359</td><td></td></tr><tr><td>L-Proline</td><td>Carl Roth (Germany)</td><td>1713</td><td></td></tr><tr><td>L-Phenylalanine</td><td>Carl Roth (Germany)</td><td>1709</td><td></td></tr><tr><td>L-Serine</td><td>Carl Roth (Germany)</td><td>4682</td><td></td></tr><tr><td>L-Threonine</td><td>Carl Roth (Germany)</td><td>1738</td><td></td></tr><tr><td>L-Tryptophane</td><td>Carl Roth (Germany)</td><td>7700</td><td></td></tr><tr><td>L-Tyrosine</td><td>Carl Roth (Germany)</td><td>T207</td><td></td></tr><tr><td>MD100 dialysis units</td><td>Scienova (Germany)</td><td>40077</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;N-2&lt;/em&gt;-Hydroxyethylpiperazine-&lt;em&gt;N&#039;-2&lt;/em&gt;-ethansulfonic acid (HEPES)</td><td>Carl Roth (Germany)</td><td>6763</td><td></td></tr><tr><td>n-dodecylphosphocholine</td><td>Antrace (USA)</td><td>F308S</td><td></td></tr><tr><td>PAGE chamber: Mini-Protean Tetra Cell</td><td>Biorad (Germany)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PAGE gel casting system: Mini Protean Handcast systems</td><td>Biorad (Germany)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PAGE gel power supply: Power Pac 3000</td><td>Biorad (Germany)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tryptone/peptone from caseine</td><td>Carl Roth (Germany)</td><td>6681</td><td></td></tr><tr><td>Peristaltic pump: ip-12</td><td>Ismatec (Germany)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Phosphoenol pyruvate monopotassium salt</td><td>Sigma Aldrich (Germany)</td><td>860077</td><td></td></tr><tr><td>Potassium dihydrogen phosphate</td><td>Carl Roth (Germany)</td><td>P018</td><td></td></tr><tr><td>Potassium acetate</td><td>Carl Roth (Germany)</td><td>4986</td><td></td></tr><tr><td>Potassium chloride</td><td>Carl Roth (Germany)</td><td>6781</td><td></td></tr><tr><td>Pyruvate Kinase</td><td>Roche (Germany)</td><td>10109045001</td><td></td></tr><tr><td>Scintillation counter: Hidex 300 SL</td><td>Hidex (Finland)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SDS pellets</td><td>Carl Roth (Germany)</td><td>8029</td><td></td></tr><tr><td>Sodium azide</td><td>Sigma-Aldrich (Germany)</td><td>K305</td><td></td></tr><tr><td>Sodium chloride</td><td>Carl Roth (Germany)</td><td>P029</td><td></td></tr><tr><td>Spectrophotometer Nanodrop</td><td>Peqlab (Germany)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Spectrophotometer/fluorescence reader Spark&amp;reg;</td><td>Tecan (Switzerland)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>tRNA (E. coli)</td><td>Roche (Germany)</td><td>10109550001</td><td></td></tr><tr><td>Ultra sonificator</td><td>Labsonic U, B. Braun (Germany)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Uridine 5&amp;rsquo;-triphosphate tri-sodium salt (UTP)</td><td>Sigma-Aldrich (Germany)</td><td>U6625</td><td></td></tr><tr><td>Y-30 antifoam</td><td>Sigma-Aldrich (Germany)</td><td>A6457</td><td></td></tr><tr><td>Yeast extract</td><td>Carl Roth (Germany)</td><td>2904</td><td></td></tr></tbody></table>

co-translational insertion of membrane proteins into preformed nanodiscs

無細胞発現システムにより、膜タンパク質などの複雑なタンパク質の機能的フォールディングをサポートするために、反応環境を調整して設計することができます。ナノディスクとして供給される事前に形成され定義された膜への膜タンパク質の共翻訳挿入および折り畳みの実験手順が実証されています。このプロトコルは完全に洗剤を含まず、1日以内にミリグラムの精製サンプルを生成できます。得られた膜タンパク質/ナノディスクサンプルは、結晶化、核磁気共鳴、電子顕微鏡などのさまざまな機能研究や構造応用に使用できます。無細胞溶解物、設計されたメンブレンを備えたナノディスク、重要なストック溶液、および2コンパートメント無細胞発現反応の組み立てなどの基本的な主要コンポーネントの調製について説明します。膜タンパク質のフォールディング要件は非常に多様であるため、このプロトコルの主な焦点は、重要な塩基性反応化合物、ナノディスクの膜組成、酸化還元およびシャペロン環境、DNAテンプレート設計など、サンプル品質にとって重要なパラメーターと反応ステップの調節です。全過程は、プロテオロドプシンおよびGタンパク質共役受容体の合成によって実証される。

合成されたMPの最終的な収率または品質に対する微調整反応化合物の影響が例示されます。頻繁に日常的なアプローチは、システム効率の便利なモニターとして、緑色蛍光タンパク質(GFP)の発現によってCF反応における最適なMg2+濃度を調整することです。一例として、GFPはpET-21a(+)ベクターから14〜24 mMのMg2+濃度で合成されました(図2)。SDS-PAGE分析により、...

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Co-Translational Insertion of Membrane Proteins into Preformed Nanodiscs

予め形成されたナノディスクへの共翻訳挿入により、界面活性剤と接触することなく、定義された脂質環境で無細胞合成膜タンパク質を研究することが可能になります。このプロトコルでは、必須のシステムコンポーネントの調製と、発現効率とサンプル品質を改善するための重要なパラメーターについて説明します。

予め形成されたナノディスクへの膜タンパク質の共翻訳挿入

Cell-free expression systems allow the tailored design of reaction environments to support the functional folding of even complex proteins such as ...

co-translational-insertion-membrane-proteins-into-preformed

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Biochemistry

3.3K ビュー.  Goethe University Frankfurt. 予め形成されたナノディスクへの共翻訳挿入により、界面活性剤と接触することなく、定義された脂質環境で無細胞合成膜タンパク質を研究することが可能になります。このプロトコルでは、必須のシステムコンポーネントの調製と、発現効率とサンプル品質を改善するための重要なパラメーターについて説明します。

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Method to Visualize and Analyze Membrane Interacting Proteins by Transmission Electron Microscopy

Monotopic proteins exert their function when attached to a membrane surface, and such interactions depend on the specific lipid composition and on the availability of enough area to perform the function. Nanodiscs are used to provide a membrane surface of controlled size and lipid content. In the absence of bound extrinsic proteins, sodium phosphotungstate-stained nanodiscs appear as stacks of coins when viewed from the side by transmission electron microscopy (TEM). This protocol is therefore designed to intentionally promote stacking; consequently, the prevention of stacking can be interpreted as the binding of the membrane-binding protein to the nanodisc. In a further step, the TEM images of the protein-nanodisc complexes can be processed with standard single-particle methods to yield low-resolution structures as a basis for higher resolution cryoEM work. Furthermore, the nanodiscs provide samples suitable for either TEM or non-denaturing gel electrophoresis. To illustrate the method, Ca2+-induced binding of 5-lipoxygenase on nanodiscs is presented.

Many proteins perform their function when attached to membrane surfaces. The binding of extrinsic proteins on nanodisc membranes can be indirectly imaged by transmission electron microscopy. We show that the characteristic stacking (rouleau) of nanodiscs induced by the negative stain sodium phosphotungstate is prevented by the binding of extrinsic protein.

透過型電子顕微鏡により膜相互作用タンパク質を視覚化し、分析するための方法

Monotopic proteins exert their function when attached to a membrane surface, and such interactions depend on the specific lipid composition and on the ...

生化学

Analysis of Endocytic Uptake and Retrograde Transport to the Trans-Golgi Network Using Functionalized Nanobodies in Cultured Cells

Transport of proteins and membranes from the cell surface to the Golgi and beyond is essential for homeostasis, organelle identity and physiology. To study retrograde protein traffic, we have recently developed a versatile nanobody-based toolkit to analyze transport from the cell surface to the Golgi complex, either by fixed and live cell imaging, by electron microscopy, or biochemically. We engineered functionalized anti-green fluorescent protein (GFP) nanobodies &#8212; small, monomeric, high-affinity protein binders &#8212; that can be applied to cell lines expressing membrane proteins of interest with an extracellular GFP moiety. Derivatized nanobodies bound to the GFP reporters are specifically internalized and transported piggyback along the reporters&#39; sorting routes. Nanobodies were functionalized with fluorophores to follow retrograde transport by fluorescence microscopy and live imaging, with ascorbate peroxidase 2 (APEX2) to investigate the ultrastructural localization of reporter-nanobody complexes by electron microscopy, and with tyrosine sulfation (TS) motifs to assess kinetics of trans-Golgi network (TGN) arrival. In this methodological article, we outline the general procedure to bacterially express and purify functionalized nanobodies. We illustrate the powerful use of our tool using the mCherry- and TS-modified nanobodies to analyze endocytic uptake and TGN arrival of cargo proteins.

Retrograde transport of proteins from the cell surface to the Golgi is essential to maintain membrane homeostasis. Here, we describe a method to biochemically analyze cell surface-to-Golgi transport of recombinant proteins using functionalized nanobodies in HeLa cells.

取り込みと培養細胞における機能性 Nanobodies を用いたトランスゴルジ ネットワークへの逆行性輸送の解析

Transport of proteins and membranes from the cell surface to the Golgi and beyond is essential for homeostasis, organelle identity and physiology. To ...

Native Cell Membrane Nanoparticles System for Membrane Protein-Protein Interaction Analysis

Protein-protein interactions in cell membrane systems play crucial roles in a wide range of biological processes- from cell-to-cell interactions to signal transduction; from sensing environmental signals to biological response; from metabolic regulation to developmental control. Accurate structural information of protein-protein interactions is crucial for understanding the molecular mechanisms of membrane protein complexes and for the design of highly specific molecules to modulate these proteins. Many in vivo and in vitro approaches have been developed for the detection and analysis of protein-protein interactions. Among them the structural biology approach is unique in that it can provide direct structural information of protein-protein interactions at the atomic level. However, current membrane protein structural biology is still largely limited to detergent-based methods. The major drawback of detergent-based methods is that they often dissociate or denature membrane protein complexes once their native lipid bilayer environment is removed by detergent molecules. We have been developing a&#160;native cell membrane nanoparticle system for membrane protein structural biology. Here, we demonstrate the use of this system in the analysis of protein-protein interactions on the cell membrane with a case study of the oligomeric state of AcrB.

Presented here is a protocol for the determination of oligomeric state of membrane proteins that utilizes a native cell membrane nanoparticle system in conjunction with electron microscopy.

膜蛋白質相互作用解析用のネイティブ細胞膜ナノ粒子システム

Protein-protein interactions in cell membrane systems play crucial roles in a wide range of biological processes- from cell-to-cell interactions to signal ...

Formulation and Characterization of Bioactive Agent Containing Nanodisks

The term nanodisk refers to a discrete type of nanoparticle comprised of a bilayer forming lipid, a scaffold protein, and an integrated bioactive agent. Nanodisks are organized as a disk-shaped lipid bilayer whose perimeter is circumscribed by the scaffold protein, usually a member of the exchangeable apolipoprotein family. Numerous hydrophobic bioactive agents have been efficiently solubilized in nanodisks by their integration into the hydrophobic milieu of the particle&#39;s lipid bilayer, yielding a largely homogenous population of particles in the range of 10-20 nm in diameter. The formulation of nanodisks requires a precise ratio of individual components, an appropriate sequential addition of each component, followed by bath sonication of the formulation mixture. The amphipathic scaffold protein spontaneously contacts and reorganizes the dispersed bilayer forming lipid/bioactive agent mixture to form a discrete, homogeneous population of nanodisk&#160;particles. During this process, the reaction mixture transitions from an opaque, turbid appearance to a clarified sample that, when fully optimized, yields no precipitate upon centrifugation. Characterization studies involve the determination of bioactive agent solubilization efficiency, electron microscopy, gel filtration chromatography, ultraviolet visible (UV/Vis) absorbance spectroscopy, and/or fluorescence spectroscopy. This is normally followed by an investigation of biological activity using cultured cells or mice. In the case of nanodisks harboring an antibiotic (i.e., the macrolide polyene antibiotic amphotericin B), their ability to inhibit the growth of yeast or fungi as a function of concentration or time can be measured. The relative ease of formulation, versatility with respect to component parts, nanoscale particle size, inherent stability, and aqueous solubility permits myriad in vitro and in vivo applications of nanodisk technology. In the present article, we describe a general methodology to formulate and characterize nanodisks containing amphotericin&#160;B as the hydrophobic bioactive agent.

Here, we describe the production and characterization of bioactive agents containing nanodisks. Amphotericin B nanodisks are taken as an example to describe the protocol in a stepwise manner.

ナノディスクを含む生理活性物質の製剤化とキャラクタリゼーション

The term nanodisk refers to a discrete type of nanoparticle comprised of a bilayer forming lipid, a scaffold protein, and an integrated bioactive agent. ...

A Step-by-step Method for the Reconstitution of an ABC Transporter into Nanodisc Lipid Particles

The nanodisc is a discoidal particle (~ 10-12 nm large) that trap membrane proteins into a small patch of phospholipid bilayer. The nanodisc is a particularly attractive option for studying membrane proteins, especially in the context of ligand-receptor interactions. The method pioneered by Sligar and colleagues is based on the amphipathic properties of an engineered highly a-helical scaffold protein derived from the apolipoprotein A1. The hydrophobic faces of the scaffold protein interact with the fatty acyl side-chains of the lipid bilayer whereas the polar regions face the aqueous environment. Analyses of membrane proteins in nanodiscs have significant advantages over liposome because the particles are small, homogeneous and water-soluble. In addition, biochemical and biophysical methods normally reserved to soluble proteins can be applied, and from either side of the membrane. In this visual protocol, we present a step-by-step reconstitution of a well characterized bacterial ABC transporter, the MalE-MalFGK2 complex. The formation of the disc is a self-assembly process that depends on hydrophobic interactions taking place during the progressive removal of the detergent. We describe the essential steps and we highlight the importance of choosing a correct protein-to-lipid ratio in order to limit the formation of aggregates and larger polydisperse liposome-like particles. Simple quality controls such as gel filtration chromatography, native gel electrophoresis and dynamic light scattering spectroscopy ensure that the discs have been properly reconstituted.

Nanodiscs are small discoid particles that incorporate membrane proteins into a small patch of phospholipid bilayer. We provide a visual protocol that shows the step-by-step incorporation of the MalFGK2 transporter into a disc.

Nanodisc脂質粒子にABCトランスポーターの再構成のためのステップ·バイ·ステップ方式

The nanodisc is a discoidal particle (~ 10-12 nm large) that trap membrane proteins into a small patch of phospholipid bilayer. The nanodisc is a ...

生物学

脂質膜上の光制御可逆的タンパク質パターニング

Dynamic Light-Induced Protein Patterns at Model Membranes

The precise localization and activation of proteins at the cell membrane at a certain time gives rise to many cellular processes, including cell polarization, migration, and division. Thus, methods to recruit proteins to model membranes with subcellular resolution and high temporal control are essential when reproducing and controlling such processes in synthetic cells. Here, a method is described for fabricating light-regulated reversible protein patterns at lipid membranes with high spatiotemporal precision. For this purpose, we immobilize the photoswitchable protein iLID (improved light-inducible dimer) on supported lipid bilayers (SLBs) and on the outer membrane of giant unilamellar vesicles (GUVs). Upon local blue light illumination, iLID binds to its partner Nano (wild-type SspB) and allows the recruitment of any protein of interest (POI) fused to Nano from the solution to the illuminated area on the membrane. This binding is reversible in the dark, which provides dynamic binding and release of the POI. Overall, this is a flexible and versatile method for regulating the localization of proteins with high precision in space and time using blue light.

著者スポットライト:人工細胞システムにおける可逆的パターニングのための写真切り替え可能なタンパク質リクルートメント

Here, a protocol is described for generating light-regulated and reversible protein patterns with high spatiotemporal precision at artificial lipid membranes. The method consists of the localized photoactivation of the protein iLID (improved light-inducible dimer) immobilized on model membranes that, under blue light, binds to its partner protein Nano (wild-type SspB).

モデルメンブレンにおける動的光誘起タンパク質パターン

The precise localization and activation of proteins at the cell membrane at a certain time gives rise to many cellular processes, including cell ...

生物工学

Protein Translocation Machinery on the ER Membrane

The translocon complex situated on the ER membrane is the main gateway for the protein secretory pathway. It facilitates the transport of nascent peptides into the ER lumen and their insertion into the ER membrane.
Sec61 protein conducting channel
In eukaryotes, the translocon complex comprises a core heterotrimeric translocator channel called the Sec61 complex. This channel includes three transmembrane proteins, Sec61&#945;, Sec61&#946;, and Sec61&#947;, and is the largest subunit of the translocon complex. In higher eukaryotes, such as mammals, the channel is capped in its resting state to prevent the leakage of ions like calcium into the cytosol.
Accessory protein complexes associated with the Sec61 channel
Sec62 and Sec63 are integral transmembrane proteins associated with the Sec61 complex. They are primarily involved in the functioning of the Sec61 channel&#39;s lateral gate and aid in the exit of the signal sequence and transmembrane domains into the lipid bilayer.
The translocon-associated protein or TRAP complex is a hetero-tetrameric constitutive subunit of the translocon complex, present behind the Sec61 channel. It assists in the binding of signal peptides having low hydrophobicity to the Sec61 channel. The oligosaccharyltransferase (OST) complex is another closely associated complex, which transfers pre-assembled glycans to select asparagine residues.
Some proteins, like the signal peptidase complex, associate with the translocon complex under specific conditions. For instance, the signal recognition particle receptor (SR) only interacts with the Sec61 channel to hand over the ribosome-nascent peptide complex during active translocation. Other proteins like lectin chaperones (calnexin and malectin) and sensor molecules (IRE1) associate with the translocon to correctly fold the incoming polypeptide or signal misfolded proteins.

ERメンブレン上のタンパク質転座機構

The translocon complex situated on the ER membrane is the main gateway for the protein secretory pathway. It facilitates the transport of nascent peptides ...

Education

JoVE Core

細胞生物学

ユニット １

小胞体とペルオキシソームにおける膜貫通輸送

KEY TERMS AND CONCEPTS

Cotranslational Protein Translocation

Translocation of proteins across membranes is an ancient process that occurs even in bacteria and archaebacteria. In fact, the components of the translocation machinery are still conserved between prokaryotes and eukaryotes.
Sec61 channel partners for cotranslational translocation
During cotranslational translocation, the Sec61 channel partners with the signal recognition particle (SRP), the signal recognition particle receptor (SR), and the ribosomes to transport the nascent polypeptide chain into the lumen.
SRP mediates ribosome attachment to the Sec61 complex via the polypeptide exit tunnel of the large ribosomal subunit. The GTPase domains on both SRP and SR carry out GTP hydrolysis, which supports the transfer of the target polypeptide to the Sec61 channel. Subsequently, the ribosomes act as primary translocation motors and push the protein towards the ER lumen. Except for the GTPs spent during peptide chain elongation, no additional energy is expended for the protein to descend through the channel.&#160;
Accessory translocon complex proteins involved in cotranslational translocation
The translocating chain-associating membrane (TRAM) protein and translocon-associated protein (TRAP) complex are auxiliary components associated with the Sec61 channel during SRP-mediated translocation. The TRAP complex is a substrate-specific complex essential for secure anchoring of the signal sequences having low hydrophobicity. Its proteins directly interact with Sec61 and keep the channel in open confirmation to compensate for the weak interaction with the signal sequence.
On the other hand, TRAM is a membrane protein that acts as a chaperone. It assists in folding and membrane integration of cotranslationally translocating proteins.

予め形成されたナノディスクへの膜タンパク質の共翻訳挿入

要約

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透過型電子顕微鏡により膜相互作用タンパク質を視覚化し、分析するための方法

取り込みと培養細胞における機能性 Nanobodies を用いたトランスゴルジネットワークへの逆行性輸送の解析

膜蛋白質相互作用解析用のネイティブ細胞膜ナノ粒子システム

ナノディスクを含む生理活性物質の製剤化とキャラクタリゼーション

Nanodisc脂質粒子にABCトランスポーターの再構成のためのステップ·バイ·ステップ方式

モデルメンブレンにおける動的光誘起タンパク質パターン

モデルメンブレンにおける動的光誘起タンパク質パターン

モデルメンブレンにおける動的光誘起タンパク質パターン

ERメンブレン上のタンパク質転座機構

共翻訳タンパク質転座

予め形成されたナノディスクへの膜タンパク質の共翻訳挿入

要約

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モデルメンブレンにおける動的光誘起タンパク質パターン

モデルメンブレンにおける動的光誘起タンパク質パターン

モデルメンブレンにおける動的光誘起タンパク質パターン

ERメンブレン上のタンパク質転座機構

共翻訳タンパク質転座

取り込みと培養細胞における機能性 Nanobodies を用いたトランスゴルジネットワークへの逆行性輸送の解析