この粒子ではミトコンドリア内膜の脂質環境を模倣したインビトロ再構成プラットフォームを紹介する。ミトコンドリア内膜融合の分子機構を調べるのに使用できます。この技術の主な利点は、ほぼネイティブ環境での一体性膜タンパク質および膜関連タンパク質の定量的な調査を可能にすることです。
まず、原稿の方向に従って溶液AとBを混合し、次いで、計算された貯蔵溶液の量をガラスシリンジでアンバーバイアルに加えて脂質混合物を生成する。バイアルに余分なクロロホルムを追加することにより、最終的なボリュームを一致させます。顕微鏡カバーグラスは摂氏520度で30分間焼きます。
焼いた後、室温まで冷やします。約10グラムの水酸化ナトリウムを500ミリリットルのメタノールに加え、攪拌しながら添加します。2時間かき混ぜ、沈殿が現れるまで水酸化ナトリウムを溶液に加え続ける。
ガラススライドを10%ドデシル硫酸ナトリウム溶液、水酸化ナトリウムで飽和したメタノール、および50ミリモル塩酸で洗浄し、各条件下でスライドを30分間順次超音波処理します。各条件の間に10分間、超純水でガラススライドをきれいにします。洗浄したカバーグラスを塩酸溶液に密封して2週間まで保管し、良好な二層品質を確保します。
クロロホルムと超純水を使用して、ラングミュア・ブロジェットの浸漬システムのポリテトラフルオロエチレントラフを洗浄して、濡れが見られないまで洗浄します。トラフ表面にクロロホルムをスプレーし、セルロースワイプで3回徹底的に拭き取り、超純水で3回洗い流し、吸引して水を取り除きます。完成したら、きれいな超純水でトラフの表面を覆います。
洗浄液から表面処理カバーグラスを2枚取り、約30秒間超純水で洗い流します。基板クランプを使用して、カバーグラスをバックツーバックにして、ガラススライドを保持します。Langmuir制御システム上で手動でディッパーをクリックして、水面の下にガラススライドを浸します。
フィルムバランスをゼロにし、空気水界面でドロップして溶液Bを慎重に広げます。脂質が空気水界面でのみ広がっており、クロロホルムや脂質滴がポリテトラフルオロエチレン表面の底に沈み、脂質チャネルが形成され、単層形成を防ぐことができます。フィルムバランスの読み出しが1メートル当たり約15〜20ミリニュートンである場合は、脂質の追加を停止します。
10 ~ 15 分待ってから、[実験開始] をクリックして、バリア コントローラを起動して、サーフェス領域を変更します。フィルムバランスの読み出しが1メートルあたり37ミリニュートンに増加するまで待ち、約20〜30分間圧力を保ちます。1メートルあたり37ミリニュートンで表面張力を維持しながら、1分間に22ミリメートルの速度でカバーグラスを上げます。
ポリマーテザリングを有する脂質単層は、ブロジェット浸漬プロセスを介してエアウォーター界面からカバーグラスの表面に移され、脂質二層の底面リーフレットを形成する。吸引によって空気水の界面をきれいにし、超純水でトラフを洗い流す。クロロホルム、エタノール、超純水で片めのガラススライドを洗浄した後、水層の下のトラフにセットします。
ウェルが空気水界面に向かっていることを確認し、ガラススライドが完全に覆われるまで新鮮な超純水を注ぎ、前述のようにガラススライドを水面下に浸します。シリコン吸引カップを使用して、脂質単層でカバーグラスを保持し、穏やかに空気水界面に脂質単層を押し込みます。カバー・グラスをインターフェースで2~3秒間押し続け、スライドに押し付けます。
カバーグラスでスライドを取り出します。カバーグラスと二層を蛍光顕微鏡に持って行き、テキスト原稿の指示に従って脂質二層を画像化します。超純水を含む結晶化皿を準備し、皿の下にきれいな顕微鏡画像リングを置きます。
このスライドと水の下に脂質二重層を含むカバーグラスを浸します。スライドとカバーグラスをそっと分離し、カバーグラススライドを底面から保持し、カバーグラスを画像リングに移します。イメージリングの超純水をビストリス塩化ナトリウムバッファーに置き換え、脂質二層が気泡にさらされないようにします。
脂質二層に1.1ナノモルn-オチルβ-グルコピーラノシドを加え、精製されたL-OPA1の1.2ナノモルDDMと1.3ピコモールの混合物を画像リングにすぐに加えます。サンプルを低速でベンチトップシェーカーに2時間インキュベートします。30 ミリグラム SM-2 樹脂ビーズを 3 ミリリットルのビストリス バッファーに分配し、振ります。
プラスチックピペットを使用して、画像リングに5~10マイクロリットルのSM-2樹脂ビーズを加え、10分間インキュベートしてから、樹脂ビーズをすすいでください。イメージリングのバッファーの最終ボリュームは 1.5 ミリリットルでなければなりません。クロロホルム溶液中の脂質混合物Aの1ミリグラムを調製し、窒素流下で20分間クロロホルムを蒸発させる。
脂質膜を形成するために一晩真空下で混合物を保ちます。50ミリモルのカルシウム含有バッファーを50ミリリットルの1.5モル水酸化ナトリウム溶液に50ミリリットルに溶解して調製します。カルセインが完全に溶解するまで室温で混合物をかき混ぜます。
500ミリリットルの最終体積に12.5ミリモルビストリと超純水を加え、pHを7.5に調整します。脂質フィルムをカルセイン含有緩衝液中に分配し、その後、20分間摂氏65度で懸濁液を加熱して脂質を完全に水和する。ポリカーボネート膜を用いた押出を介して200ナノメートルのリポソームを形成する。
0.5マイクロモルDDMに2マイクログラムのL-OPA1を加え、2.2ミリグラムのリポソームを加え、摂氏4度で1.5時間インキュベートします。25ミリモルビストリ、150ミリモル塩化ナトリウム、50ミリモルカルシウムバッファーに対して3.5キロダルトン透析カセットを使用して透析によって界面活性剤を取り除き、一晩で摂氏4度でカルシウムバッファーを50ミリモルにし、バッファーを2回変更します。PD10脱塩カラムを使用して余分なカルセインを除去し、次にテキスト原稿に記載されているようにイメージングとデータ分析を進める。
脂質二重層およびその脂質流動性の蛍光顕微鏡画像をここに示す。脂質分布は、写真の漂白の前後に示され、均質性は再構成の前後に示される。L-OPA1再構成及び脂質二層は、蛍光相関分光法またはFCSによって検証された。
FCS曲線は、L-OPA1の75%が脂質二層に再構成されたことを示し、L-OPA1が機能的複合体に自己集合する可能性を有するポリマーテザリング脂質二重層に自由に拡散することを示唆した。蛍光ステップ漂白は、L-OPA1の平均2〜3コピーが所定のリポソームで再構成されたことを示した。L-OPA1再構成プロテオリポソームのサイズ分布をDLSを用いた再構成後に試験し、FCSで検証した。
膜テザリングは、TIRF顕微鏡を用いて脂質二層の表面上のテキサスレッドのシグナルを観察することによって監視した。膜脂質脱混合または半血滴は、リポソームマーカーが脂質二層に拡散する中、テキサスレッドを介して監視した。カルセイン脱焼結は、完全融合細孔形成と脂質脱混合のみを区別するのに役立ち、粒子がヘミフュージョンで失速する条件と完全融合に進む粒子との比較を可能にした。
膜テザリングはリポソームからの安定な脂質シグナルによって示され、放出シグナルはカルセイン信号に脱消を特徴としなかったが、テキサスレッド信号の急速な崩壊は、脂質二層への染料の拡散を示した。完全な融合は、脂質崩壊とコンテンツ放出の両方を特色にしました。この粒子を試みるとき、高品質の二重層が製造されるようにカバーグラスとラングミュアトラフの両方を徹底的に清掃することを忘れないでください。
二重層の欠陥を防ぐためにも、良好な空気の質が重要です。この技術は、ミトコンドリア膜のダイナミクスと組織の新しい疑問を探求する道を開きます。エキサイティングな将来の実験には、ミトコンドリア内膜ダイナミクスにおける二層アサイメトリー、膜電位、および疾患関連変異体の影響を探るが含まれる。
