この作品は、ヘルスリサーチのためのカナダ研究所（CIHR）（MOP-97774）と自然科学とカナダの工学研究評議会（：480619 NSERC、助成金NR）によって賄われていた。 KSはKRESCENT新奨励賞（カナダ、カナダの腎臓学会と健康研究のカナダ研究所の腎臓財団の共同受賞）と、研究とイノベーションのオンタリオ州省か​​らの早期研究者賞を受賞しています。 FWは李嘉誠の奨学金によってサポートされています。

1。 E.の変容をpGEX-RhoAの（G17A）を構築した大腸菌 <ol><li> 100ミリリットルのdH 2 Oで2.5グラムのLBと1.5 gの寒天を溶解させたLB-寒天培地を準備します。オートクレーブと親指のルールとして、フラスコを快適に保持することができるときであると推定50から55°Cに冷却する。 </li><li>のdH 2 Oで50 mg / mlに溶解することによりアンピシリン（Amp）の在庫を準備するシリンジフィルターを、未使用のアリコートを凍結します。 1.1からLB-寒天培地にアンプの株式を100μl（最終濃度50μg/ mlの）を追加します。ミックスと10cmの細菌皿（15〜20ミリリットル/皿）に注ぐように渦。それが固化（15-30分）と2〜3週間は4で反転使用されていないプレート℃で保存することができます。 </li><li> E.を変換するには大腸菌は 、すぐに氷浴中でDH5αコンピテント細胞のアリコートを解凍します。 25から50 ng /μlにまで希釈しpGEXRhoA（G17A）DNA 1μlを追加します。氷上で30分間混合し、インキュベートするチューブをフリックします。 42℃の熱ショック℃で45秒間、C、2分間氷上に戻って置きます。 900＆ムーを追加します。、L SOC培地、振とうしながら37℃で1時間成長します。 </li><li>曲がった滅菌パスツールピペットを用いてLB-寒天-Ampのプレート上で形質転換した細菌の50〜100μlを広げる。 5分間、37℃のインキュベーター内でプレートの右側をインキュベートし、その後反転し、一晩成長します。 </li><li>単一のコロニーは、GST-タグタンパク質（ステップ2.1）を調製するためのプレートから取得されます。将来の使用のために、ラップや店舗プレートは約3週間、4℃で反転します。さらに、細菌株は、振とうしながら37°Cで一晩2ミリリットル滅菌LB-Ampのに成長して個々のコロニーで、より長期保管のために準備することができます。 -80 1:1の比率と凍結の滅菌80％グリセロール℃でアリコートを混ぜる</li></ol> 2。 GST-RhoAの（G17A）ビーズの調製<ol><li> 1 LのdH 2 0〜25 gのLBを追加し、オートクレーブでLBを準備します。ときにクール、株式から50 mlのLB（50μg/ mlの最終濃度）に50μlのアンプを追加します。よく隔離されたCOLを接種する形質転換した細菌のONYと攪拌しながら37℃で一晩成長します。ときに完全な密度（OD 600&gt; 1.0）450ミリリットルLB-Ampので希釈し、37℃でさらに30分間成長℃で</li><li> 10ミリリットルのdH 2 Oで0.238グラムを溶解することにより、イソプロピルBD-ガラクトピラノシド（IPTG）の100 mMのストック溶液を調製-20℃でアリコートでストア細菌は、500 mlの培養液にIPTGを500μlの100mM（最終濃度100μM）を添加することによりRhoタンパク質を生成するために誘導する。 22から24℃に温度を下げると〜16時間の時間成長します。 </li><li> 4℃で10分間、3600グラムで培養を回転させる必要に応じて、500 mlの培養液を遠心分離のための50 mlチューブに分けることができます。 -80℃で少なくとも1時間（好ましくは一晩）のペレット（s）を凍結℃、 </li><li> 200ミリリットルの溶解20mM HEPESを含む緩衝液（0.95グラム）/ pHが7.5を準備し、150mMのNaCl（1.75グラム）、5 mMのMgCl 2（0.203グラム）1パーセントTX-100（2ミリリットル）。 1M DTT（10ミリリットルのdH 2 O中の1.542グラムのストック溶液を調製）、100 mMのPMSF（0.174 g/10分ミリリットルエタノール）。溶解バッファー+を準備するには、1mMのDTT（ストックの10μL）および1mM PMSF（株式の100μl）を1つの完全なミニプロテアーゼインヒビタータブレットを10ミリリットルを補足するものです。 </li><li>氷の上で作業し、10 mlの溶解バッファーを追加する+ペレットに、ステップ2.3から。穏やかなボルテックスとピペッティングにより完全に再懸濁します。発泡は避けてください。 50％のパルスを4に設定で1分間、氷上で超音波洗浄します。 4℃で15分間15,000〜20,000 gで超音波処理したライセートをスピンし、滅菌キャップを15 mlのチューブに明らかに超音波処理し（上清）を取り外します。 </li><li>穏やかに15 mlのチューブに75％のスラリーと転送335μlを含むオリジナルのチューブとを混合することによってグルタチオンセファロースを準備します。ビーズをピペッティングするために広い口径の先端を使用しています。 10ミリリットルの冷PBSを追加し、4℃で5分間、500グラムのスピン℃に1mlの溶解緩衝液を追加する+ビーズとスピンに、前の洗浄の場合と同様に、上清を捨てる。上清およびadd溶解バッファーを捨てる+ 50％のスラリーを作るために。 </li><li> equil 250μlを加えステップ2.5から上清をビーズスラリーをibrated。 45分間、4℃で回転させます。 </li><li> 20mMのHEPES（2.38グラム）を含む500ミリリットルHBS / pH7.5お ​​よびのdH 2 O中150mMのNaCl（4.38グラム）を準備1MのMgCl 2（10ミリリットルのdH 2 Oで0.952グラム）と1M DTT（10ミリリットルのdH 2 Oで1.542グラム）のストック溶液を準備します。 HBS +を準備するには、わずか5 mMのMgCl 2（ストックから50μL）および1 mM DTT（ストックから100μl）を一緒に使用する前に、100ミリリットルを補足するものです。 </li><li> 4℃で5分間、500gで、ステップ2.7からビーズを回転させる10 mlの溶解バッファー+と2倍の上清と洗浄ビーズを破棄し、10ミリリットルHBS +で2倍。最終洗浄後、HBSでビーズを再懸濁することにより50％のスラリーを作る+ BDバキュロプロテアーゼ阻害剤（50倍BDバキュロ/ mlの20μl）を補充した。 </li><li> β-メルカプトエタノールを含む2×Laemmliサンプルバッファーで最終的なビーズの調製10μlを希釈する。ウシ血清アルブミン（BSA）の基準を作成します。 2 mg / mlのストックを（1のBSAの0.02グラム使用0ミリリットルのdH 2 O）。のdH 2 O及び10μlのLaemmliの（最後の10μg）を5μlの株式の5μl;と7.5μlのdH 2 Oで10μlのLaemmli緩衝と2.5μlの株式10μlのLaemmliの（最後の20μg）をして株式の10μlを混ぜて（最終5μg）を。すべてのサンプルを（5分）ゆでる。ビーズサンプルを回転させ、10％SDS-ポリアクリルアミドゲル上でBSAの標準と分子量マーカーで上清を実行します。 </li><li>染色Comassieブルー（10ミリリットルの酢酸で0.1グラム、40 mlのメタノールおよび50 mlのdH 2 O）と脱色液（500ミリリットルのdH 2 O、400mlのメタノールと100ミリリットルの酢酸）を準備します。室温で保管してください。 20〜30分間ゲルを染色し、染料を除去する（それが複数回再利用することができます）と二回脱色液ですすいでください。バンドがはっきりと見えるようになるまで数時間穏やかに振盪しながら脱色し続けています。 </li><li>リファレンス（ 図2）としてBSA標準を使用してビーズに結合されたGST-RhoAの（G17A）の濃度を推定する。 Aliquoトン1.5 mlマイクロ遠心チューブに10月15日〜μgのタンパク質を含むビーズの等量。お店のビーズは4℃で日以内に使用します。 -80℃で凍結°HBSのC数日以内に使用するために3:1の比率で+ /グリセロール。 </li></ol> 3。ヌクレオチドフリーRhoAの（G17A）ビーズとGEFプルダウンアッセイ<ol><li>合流点から10cm皿で細胞を成長させる。血清は、少なくとも3時間を奪うと、必要に応じて扱う。 </li><li>溶解バッファーを準備します。+ステップ2.4​​のように。十分に700μL/ディッシュに加え、ピペッティングの誤差を考慮して、いくつかの余分な量の溶解バッファーを準備します。使用直前にプロテアーゼ阻害剤を追加します。 </li><li>氷の上で作業し、皿から培地を除去し、氷冷HBSで洗浄する。すべてのHBSを削除し、700μlの溶解バッファーを追加する+各ディッシュに。すべての分野をカバーするためにスワールプレートは、こすり、番号を1.5 mlのチューブに溶解液を収集します。 4℃で1分、15,000 gで遠心上清をアッセイに使用されます。 </li><li>あなたの携帯番号は、すべて同等である場合料理は、あなたがタンパク質アッセイを行っ省略、および3.5のステップに移動することができますテストされている。そうでなければBio-Rad社のクイックタンパク質アッセイを用いて各上清のタンパク質濃度を測定し、体積と濃度の上清を均等化。総蛋白量（LLC-PK1細胞に対する一般的に1から1.5 mgのタンパク質）を用い、細胞の種類に依存しています。 </li><li>各上清30μlを削除し、Laemmliサンプルバッファーを減らす30μlの2倍と混合し、沸騰し、ステップ3.7のために脇に置きます。ステップ2.12からGST-RhoAの（G17A）ビーズのアリコートを、残りの上清を追加します。 4℃で45分間回転させる</li><li> 4℃で10秒間6800グラムで、ビーズを回転させる上清を捨て、洗浄の間に同じ方法で紡績、溶解緩衝液で3倍のビーズを洗浄する。完全に30 Gの針を備えた1ccのシリンジを用いて、最終的な洗浄を削除し、Laemmliサンプルバッファーを減らす20μlの2倍を追加します。 5分間沸騰させる。ペレットビーズにスピンして、すぐに上清を実行する（推奨）、またはそれを格納するトン-80°C、後で分析するため。 </li><li>あなたが勉強しているGEFのサイズに適した割合SDS-ポリアクリルアミドゲル上で20μlの全細胞溶解液と沈殿したタンパク質サンプルのすべてを実行します。ウエスタン特異的抗体を用いたブロッティングにより選択したGEFを検出します。 </li></ol> 4。代表的な結果プロトコルのパート1と2はGSH-セファロースビーズとSDS-PAGEによるそのテスト（ 図1上のプロトコルの概要を参照）に結合されたGST-RhoAの（G17A）の調製を説明しています。典型的なクマシー染色したゲルは、 図2に示されています。溶出したタンパク質を含むサンプルは、約50 kDaの（ 図2、レーン6）で単一のバンドを含んでいる必要があります。タンパク質の濃度は、BSAのリファレンスサンプルを用いて推定することができます。 図2の例では、RhoAの（G17A）の濃度は15μg/10μLであると推定される。したがって、10μL/チューブのアリコートを作製した。典型的な収率<html>私たちの手に10ミリリットル細菌の溶菌15から20μgのタンパク質である。プロトコルの第3部では、親和性の沈殿アッセイ（ 図1の概要を参照）について説明します。交換因子GEF-H1の活性化を検出することに成功しGEFアッセイは、 図3に示されています。 RhoAの（G17A）タンパク質は、GEF-H1は、基底活性を有することを示唆し、コントロール（未処理）細胞溶解物からいくつかのGEF-H1を捕獲した。量は、TNF-αは、GEF-H1 5,7を活性化するという概念と一致して、しかし、炎症性サイトカインの腫瘍壊死因子-α（TNF-α）で処理した細胞の増加を沈殿させた。重要なのは、全細胞溶解物は、治療は、GEF-H1のレベルを変化させなかったことを示唆し、制御と処理サンプル中のGEF-H1同様の量を示し、アッセイで使用する入力が等しくなります。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/3932/3932fig1.jpg" /> 図1：プロトコルの概要。 ove_content &quot;&gt; <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/3932/3932fig2.jpg" /> 図2ビーズの調製プロトコルの代表的な結果です。成功したGST-RhoAの（G17A）ビーズの調製とクマシー染色したゲルが表示されます。ビーズサンプルおよびBSAタンパク質標準は、10％アクリルアミドゲルを用いてSDS-PAGEにより分離した。ビーズをテストするには、GST-RhoAの（G17A）を含む最終的なビーズスラリー10μlの5分間Laemmliサンプルバッファーと煮を減らすことで1:1に希釈されています。ビーズは簡単にスピンし、上清をゲル上にロードされていました。次のサンプルがロードされた：レーン1：分子量マーカー（MW）（FroggaBio BLUeyeは、タンパク質ラダーをジウム）、レーン2-4：5、10および20μg（BSA）ウシ血清アルブミン、レーン5は空です。レーン6：10新たに調製したRhoAの（G17A）ビーズμlの。分離が完了した後、ゲルをクマシーブルーを用いて染色し、続いてタンパク質を明らかにするために脱色されています。 GST-RhoAの（G17A）タンパク質の分子量は約50です。<html> 48 kDaのマーカーのレベルのまわりでkDaおよび実行されます。この特定のサンプルではGST-Rhoタンパク質の濃度はμg/10約15μLスラリーと推定されています。 <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/3932/3932fig3.jpg" /> GEF-H1のTNF-α誘導活性を示す図3代表的なGEF活性化アッセイ。コンフルエントLLC-PK1細胞は、5分間10 ng / mlのTNF-αで処理した。治療後の細胞を溶解し、アクティブなGEFををGST-RhoAの（G17A）バインドされたビーズを用いて捕獲された。沈殿したタンパク質（上ブロット）および全細胞ライセート試料（底ブロット）でGEF-H1の存在は、西洋抗GEF-H1抗体（セルシグナリング）でブロッティングを用いて検出した。成功した結果を示す同等の入力、相対非処理細胞と比べTNF-α処理で沈殿したGEF-H1の増加量に注意してください。 3932/3932fig4.jpg &quot;/&gt; 図4： &quot;悪い結果&quot;。ここに示されているGEFのプルダウンアッセイはビーズによってキャプチャされたいくつかのGEF-H1の結果が、制御およびTNF-αで処理した細胞から析出量​​は同じです。したがって、TNF-α、このケースでは、GEF-H1のノウハウ活性剤は、活性化を誘導しなかった。この特定の実験、その後のトラブルシューティングに使用されるTNF-αが十分に新鮮な、おそらく分解されなかったことを示唆している。

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	<li>Jaffe, A. B., Hall, A. R. h. o. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GTPases:+biochemistry+and+biology.">GTPases: biochemistry and biology.</a> Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 21, 247-269 (2005).</li><li>Rossman, K. L., Der, C. J., Sondek, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GEF+means+go:+turning+on+RHO+GTPases+with+guanine+nucleotide-exchange+factors.">GEF means go: turning on RHO GTPases with guanine nucleotide-exchange factors.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 6, 167-180 (2005).</li><li>Arthur, W. T., Ellerbroek, S. M., Der, C. J., Burridge, K., Wennerberg, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=XPLN,+a+guanine+nucleotide+exchange+factor+for+RhoA+and+RhoB,+but+not+RhoC.">XPLN, a guanine nucleotide exchange factor for RhoA and RhoB, but not RhoC.</a> J. Biol. Chem. 277, 42964-42972 (2002).</li><li>Garcia-Mata, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+activated+GAPs+and+GEFs+in+cell+lysates.">Analysis of activated GAPs and GEFs in cell lysates.</a> Methods Enzymol. 406, 425-437 (2006).</li><li>Kakiashvili, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GEF-H1+Mediates+Tumor+Necrosis+Factor-{alpha}-induced+Rho+Activation+and+Myosin+Phosphorylation:+role+in+the+regulation+of+tubular+paracellular+permeability.">GEF-H1 Mediates Tumor Necrosis Factor-{alpha}-induced Rho Activation and Myosin Phosphorylation: role in the regulation of tubular paracellular permeability.</a> J. Biol. Chem. 284, 11454-11466 (2009).</li><li>Waheed, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+signal+regulated+kinase+and+GEF-H1+mediate+depolarization-induced+Rho+activation+and+paracellular+permeability+increase.">Extracellular signal regulated kinase and GEF-H1 mediate depolarization-induced Rho activation and paracellular permeability increase.</a> Am. J. Physiol. Cell Physiol. , (2010).</li><li>Kakiashvili, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+epidermal+growth+factor+receptor+mediates+tumor+necrosis+factor-alpha-induced+activation+of+the+ERK/GEF-H1/RhoA+pathway+in+tubular+epithelium.">The epidermal growth factor receptor mediates tumor necrosis factor-alpha-induced activation of the ERK/GEF-H1/RhoA pathway in tubular epithelium.</a> J. Biol. Chem. 286, 9268-9279 (2011).</li><li>Garcia-Mata, R., Burridge, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Catching+a+GEF+by+its+tail.">Catching a GEF by its tail.</a> Trends Cell Biol. 17, 36-43 (2007).</li><li>Dubash, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+small+GTPase+RhoA+localizes+to+the+nucleus+and+is+activated+by+Net1+and+DNA+damage+signals.">The small GTPase RhoA localizes to the nucleus and is activated by Net1 and DNA damage signals.</a> PLoS One. 6, e17380-e17380 (2011).</li><li>Guilluy, G., Dubash, A. D., Garc&#237;a-Mata, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+RhoA+and+Rho+GEF+activity+in+whole+cells+and+the+cell+nucleus.">Analysis of RhoA and Rho GEF activity in whole cells and the cell nucleus.</a> Nature Protocols. , (2011).</li><li>Guilluy, C., Swaminathan, V., Garcia-Mata, R., O'Brien, E. T., Superfine, R., Burridge, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Rho+GEFs+LARG+and+GEF-H1+regulate+the+mechanical+response+to+force+on+integrins.">The Rho GEFs LARG and GEF-H1 regulate the mechanical response to force on integrins.</a> Nature Cell Biology. 13, 722-727 (2011).</li><li>Dubash, A. D., Wennerberg, K., Garcia-Mata, R., Menold, M. M., Arthur, W. T., Burridge, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+role+for+Lsc/p115+RhoGEF+and+LARG+in+regulating+RhoA+activity+downstream+of+adhesion+to+fibronectin.">A novel role for Lsc/p115 RhoGEF and LARG in regulating RhoA activity downstream of adhesion to fibronectin.</a> J. Cell Sci. 120, 3989-3998 (2007).</li><li>Arthur, W. T., Ellerbroek, S. M., Der, C. J., Burridge, K., Wennerberg, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=XPLN,+a+guanine+nucleotide+exchange+factor+for+RhoA+and+RhoB,+but+not+RhoC.">XPLN, a guanine nucleotide exchange factor for RhoA and RhoB, but not RhoC.</a> J. Biol. Chem. 277, 42964-42972 (2002).</li></ol>

著者らは、開示することは何もありません。

ここで紹介する方法は、細胞内でGEFのアクティブなプールに従うことができますGEFをのためにのみ利用可能な非放射性活性化アッセイである。アッセイは、以下の低分子量GTPaseの活性化などのRacおよびCdc42に対するGEFを使用される降水量アッセイに似ています。これらのアッセイは異なるGSTタグ融合タンパク質を使用して、ここで説明したものから若干の違いがある、しかし、基本的な手順は同じです。したがって、このプロトコルは、簡単に他の低分子量GTPaseとGEF活性化アッセイのために適合させることができます。 提示GEFアッセイは最近、核分画9,10用のアプリケーションのために変更されました。さらに変更を加えるだけで、他の細胞内コンパートメントでのGEF活性化のテストも可能かもしれません。 我々は、上皮細胞株の5,6,7のGEFの活性化を研究するための提示方法を使用します。いくつかの最適化では、このアッセイは、任意のセルラインからGEFを検出するのに十分でなければなりません。時adapti特定の細胞型にNG（ウェスタンブロッティングに適した抗体が重要である）テストされるGEFに最適な細胞数を、溶解バッファー量、検出方法を見つける。アッセイの初期セットアップのためには、関心のあるGEFを活性化することが知られて刺激を使用することをお勧めします。未知の刺激を使用する場合は、常にあなたのアッセイが動作していることを確認するために陽性対照を使用しています。このアッセイは、ウェスタンブロッティングによって知られているGEFの活性化を検出するために使用することができます。しかし、それは未知のGEFをを識別するためにも十分です。このため、制御と刺激サンプルからキャプチャされたGEFを、クマシー染色ゲル上で分析する必要があります。唯一の刺激のサンプルに表示されるバンドは、活性化されたGEFをが含まれている可能性があり、質量分析法（例えば、5）で識別するために送信することができます。 最後に、注意事項に注意してください。アッセイは、アクティブなGEFをレンダリングを翻訳後修飾は、細胞溶解後に保存されているという前提に基づいています。確かに、これは明らかにCAですGEFの数のSEと、その施設から、このアッセイは、GEF-H1、p115RhoGEFとXPLN（例えば5,11,12,13）を含むさまざまなGEFを、の活性化を検出するために様々なグループによって使用されています。アクティブ状態の保存は、しかし、すべてのGEFの場合には起こらないかもしれません、したがって、それは、このアッセイは、すべてのGEFをのために動作しないことが考えられる。また、多くのGEFを、複数の低分子量GTPaseに向かって活性を発揮することに留意する必要があります。したがって、特定のGEFが検討されている場合、それは他の低分子量GTPaseと同様に、あるRhoA、Rac1とCdc42の機能を調べる研究のためのGEF沈殿アッセイと、このアッセイを補完することをお勧めします。 プロトコルの重要なステップ： 形質転換細菌のコロニーは、アンプ、優れた伸長と収量によって適切な選択を確保するため、新鮮な、適切に準備、プレートから選択する必要があります。他のソースから得られたコンピテントセルの形質転換条件は変わる場合がありますと相談する必要があります。 </p&gt; タンパク質調製プロトコル（手順2.3から）とアッセイ（ステップ3.2から）のすべてのステップは、°C冷却ソリューションや遠心分離機で4で実行する必要があります。 細菌の溶解（ステップ2.5）均質な懸濁液を得るために徹底的かつ完全でなければなりません。細菌、渦を溶解し、4°Cでそれを維持しながら、交互にライセートをピペットと超音波処理はタンパク質を変性防止するために氷の上で行われていることを確認します。超音波の異なるモデルを使用している場合、条件を調整する必要があります。ビーズと超音波処理のインキュベーションは、常に十分な結合を確保するために回転子に4°Cで行われるべきであり、ケアはタイミングの一貫性を保つために注意するべきです。 GST-Rhoの変異体は、細菌で発現されたときやや不安定なので、すぐにまたは数日以内に準備されたビーズを使用することをお勧めします。 降水量の測定法（その3）時間と温度に敏感であり、のアクティブ·GEFをを容易に細胞ライセートから失われる可能性がありますので、手順は、可能な限り迅速に実行する必要があります。 次のセクションでは、いくつかのトラブルシューティングのヒントが含まれています。 最後のビーズ準備中変異体Rhoタンパク質のない、または非常に低い金額ません：これは非効率的な誘導は、細菌の溶解が不十分、または準備プロセスまたは貯蔵中のタンパク質の損失によって引き起こされることがあります。これらの可能性のいくつかのトラブルシューティングに役立つように、バクテリアのサンプルは、誘導前と後に分析することができます。タンパク質の貧しい人々の誘導がある場合は、新たに画線播種したプレートから、または再形質転換コンピテント細胞からコロニーを使用してプロセスを繰り返します。別のIPTG濃度と誘導時間もテストする必要があります。溶解が不十分な場合（すなわち、タンパク質ではなく、上清中のペレットのままで）溶解緩衝液中で塩と洗剤の濃度を変化させることを試みることができます。代替の超音波処理時間と設定が考慮されるべきであり、超音波処理前後のサンプルは溶解の効率を決定するために顕微鏡で確認することができます。 いいえGST-タンパク質がビーズ上に存在するにもかかわらず、GEFを沈殿させない：これは、降水量アッセイ中に技術的な問題に起因する、または適用された刺激を用いて検討GEFの活性化の本当の有無によって可能性があります。常にあなたのアッセイが動作していることを確認するために、ポジティブコントロールとして知られている刺激を使用しています。数日以内に準備されたビーズを使用しています。沈殿アッセイはすべての条件で検討GEFの検出不可能な量をキャプチャした場合は、あなたのGEFが存在し、分析（ステップ3.3）に使用される遠心分離後の上清中にも検出可能であることを確認します。すべてのバッファおよびプロテアーゼ阻害剤は新鮮であり、できるだけ早く氷の上のすべての手順を実行していることを確認してください。入力蛋白質（2プレート/サンプルからライセートを使用してなど）の量を増やします。沈殿アッセイは基底析出が表示されている場合あなたのGEFのtationが、有意差は、制御と刺激のサンプル（ 図4）の間に見られない、適用された刺激は、他の既知の影響を（他のシグナル伝達経路の活性化を検出することにより、例えば）を使用して、働いていることを確認することによってトラブルシューティングを開始します。処理条件および/または濃度を変えることを検討してください。あなたの刺激はおそらく時間と濃度を予測するRhoまたは他のシグナル伝達を活性化する方法、文献報告からのデータに依存しています。 GEFの活性化はよく検出可能なRhoの活性化に先立っての時点で最高の検出可能かもしれないとして、処理時間を最適化する場合、両方の短期および長期の時間ポイントを使用します。最後に、同じ刺激​​が継代数による細胞応答の変化による活性化の可変度、細胞密度などの原因となり

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬の名前 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td><td> コメント（オプション） </td></tr><tr><td>をpGEX-RhoAの（G17A） </td><td> Addgene </td><td>すぐに利用できるようになります</td><td>博士キースBurridge（ノースカロライナ大学）（参照3）の研究室で生成された</td></tr><tr><td> DH5α </td><td>インビトロジェン</td><td> 18258-012 </td><td>店舗-80°C </td></tr><tr><td> SOC培地</td><td> BioShop </td><td> SOC001.10 </td><td></td></tr><tr><td> LB </td><td> BioShop </td><td> LBL407.1 </td><td>無菌に保つ</td></tr><tr><td>グリセロール</td><td> BioShop </td><td> GLY002.1 </td><td></td></tr><tr><td>アンピシリン</td><td> BioShop </td><td> AMP201.25 </td><td> -20℃で保存する株式</td></tr><tr><td>寒天</td><td> BioShop </td><td> AGR001.500 </td><td></td></tr><tr><td> IPTG（ISOプロピルBD-thiogalacto-ピラノシド） </td><td> Calbio-CHEM </td><td> 420322 </td><td> -20℃で保存するストック溶液</td></tr><tr><td>グルタチオンセファロースビーズ</td><td> GEヘルスケア</td><td> 17-0756-01 </td><td></td></tr><tr><td> 10倍PBS </td><td> SIGMA </td><td> D1408 </td><td></td></tr><tr><td> HEPES </td><td> SIGMA </td><td> H4034 </td><td></td></tr><tr><td> NaClを</td><td> BioShop </td><td> SOD001.10 </td><td></td></tr><tr><td> MgCl 2を </td><td> SIGMA </td><td> M-9272 </td><td>使用直前に追加します</td></tr><tr><td> TX-100 </td><td>シグマアルドリッチ</td><td> X100 </td><td></td></tr><tr><td> DTT </td><td> OmniPur EMD </td><td> 3860 </td><td>使用直前に追加します</td></tr><tr><td> PMSF </td><td> SIGMA </td><td> P-7626 </td><td>使用直前に追加します</td></tr><tr><td>プロテアーゼ阻害剤50倍</td><td> BDバキュロ·ゴールド</td><td> 51-21426Z </td><td>使用直前に追加します</td></tr><tr&gt; <td> 10倍の完全なミニ、EDTA-フリー</td><td>ロシュ社</td><td> 11 836 170 001 </td><td>使用直前に追加します</td></tr><tr><td>レムリサンプルバッファー×2 </td><td>バイオ·ラッド</td><td> 161-0737 </td><td></td></tr><tr><td> β-メルカプトエタノール</td><td> SIGMA </td><td> M7154 </td><td>使用直前に追加します</td></tr><tr><td>クマシーブリリアントブルー</td><td>バイオ·ラッド</td><td> R-250 </td><td></td></tr><tr><td>酢酸</td><td>カレドン</td><td> 1000から1 </td><td></td></tr><tr><td>メタノール</td><td>カレドン</td><td> 6701から7 </td><td></td></tr><tr><td>バイオ·ラッドプロテインアッセイ</td><td>バイオ·ラッド</td><td> 500-0114 </td><td></td></tr><tr><td> BLUeyeラダー</td><td> FroggaBio </td><td> PM008-0500 </td><td></td></tr></tbody></table> 表1使用する試薬。 <table border="1"><tbody><tr><td> 機器の名前 </td><td> 会社 </td&gt; <td> カタログ番号 </td><td> コメント（オプション） </td></tr><tr><td> RC-5B遠心分離</td><td>ソーバル</td><td> SS-34ローター</td><td> 4℃で使用°C </td></tr><tr><td>遠心分離</td><td>ソーバル、サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td> ST-16R </td><td> 4℃で使用°C </td></tr><tr><td>マイクロ遠心機</td><td>エッペンドルフ</td><td> 5417R </td><td> 4℃で使用°C </td></tr><tr><td>細菌のシェーカー</td><td> INFORS HT Ecotron </td><td> AG CH-1403 Bottmingen </td><td> 37℃または22℃使用°C </td></tr><tr><td>超音波</td><td>ブランソン</td><td>超音波処理-450 </td><td> RTで使用</td></tr><tr><td>回転子</td><td> GLAS-COL </td><td> 099A CR4012 </td><td> 4℃で使用°C </td></tr></tbody></table> 表2。使用される特定の装置。

affinity precipitation of active rho-gefs using a gst-tagged mutant rho protein (gst-rhoa(g17a)) from epithelial cell lysates

低分子量GTPaseのRhoファミリーのタンパク質は細胞骨格の中心的調節因子であり、細胞遊走、遺伝子発現、細胞周期進行と細胞接着1を含む細胞プロセスの多種多様を制御します。のRhoタンパク質はGDP結合状態のGTP結合型と非アクティブで活躍している分子スイッチである。それらの活性化は、グアニンヌクレオチド交換因子（GEF）タンパク質のファミリーによって媒介される。 ρ-GEFが特異性2をオーバーラップして、大家族を構成します。進歩の多くは特定のシグナルによって活性化さGEFをを識別するのに行われているが、これらのタンパク質の経路固有の規制に関する残りの多くの質問がまだあります。ロー-GEFの数は70を超えており、各セルは、複数のGEFタンパク質を発現する。さらに、これらのタンパク質の多くは、制御ネットワークの複雑さに一層貢献し、ローが、家族の他のメンバーだけでなく、アクティブにします。重要なのは、探索どのようにGEFをが規制されていると、様々な刺激によって活性化され、細胞内の個々のGEFのアクティブなプールに従う方法を必要とします。ここでは、親和性の沈殿アッセイを使用して、使用可能なアクティブロー固有のGEFをを評価し、定量化するために使用される方法のためのステップバイステップのプロトコルを提供しています。このアッセイは、Burridge研究室3,4で数年前に開発され、我々は、腎尿細管細胞ライン5,6,7にそれを使用しています。アッセイは、GEFをアクティブに高い親和性を持つ、 &quot;ヌクレオチドフリー&quot;変異型RhoAのを利用しています。変異（G17A）はGDPまたはGTPを結合することができない蛋白質をレンダリングし、この状態は、GEFにバインドされている中間状態を模倣しています。この変異体タンパク質のGSTタグ付きバージョンは、Eから発現させ、精製された大腸菌 、グルタチオンセファロースビーズに結合し、未処理と刺激した細胞の溶解物から沈殿アクティブGEFをするために使用。ほとんどのGEFを、阻害バインディングから翻訳後修飾やリリース、彼らのアクティブ状態を介して活性化される細胞ライセートに保存され、それらはこのアッセイ8で検出することができます。捕捉されたタンパク質は、ウェスタンブロッティング、または特定の刺激により活性化未知のGEFをを識別するために質量分析を使用して、特定の抗体で検出することで知られているGEFををプローブすることができます。

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Affinity Precipitation of Active Rho-GEFs Using a GST-tagged Mutant Rho Protein GST-RhoAG17A from Epithelial Cell Lysates

ここで紹介する方法が有効にGEFをするための高い親和性を有する変異体RhoAのGST融合タンパク質を利用することにより、培養細胞におけるRhoAの特定のGDP / GTP交換因子（GEF）の活性化に従うアッセイを説明しています。 GEFを、ウエスタンブロット法とデンシトメトリーにより定量によって検出された細胞溶解液から沈殿させる。

上皮細胞ライセートからのGSTタグ付き突然変異体のRhoタンパク質（GST-RhoAは（G17A））を使用してアクティブロー-GEFの親和性降水

Proteins of the Rho family of small GTPases are central regulators of the cytoskeleton, and control a large variety of cellular processes, including cell ...

affinity-precipitation-active-rho-gefs-using-gst-tagged-mutant-rho

Research

JoVE Journal

Biology

Affinity Precipitation of Active Rho-GEFs Using a GST-tagged Mutant Rho Protein (GST-RhoA(G17A)) from Epithelial Cell Lysates

16.5K ビュー.  St. Michael's Hospital. ここで紹介する方法が有効にGEFをするための高い親和性を有する変異体RhoAのGST融合タンパク質を利用することにより、培養細胞におけるRhoAの特定のGDP / GTP交換因子（GEF）の活性化に従うアッセイを説明しています。 GEFを、ウエスタンブロット法とデンシトメトリーにより定量によって検出された細胞溶解液から沈殿させる。

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Isolation of Labile Multi-protein Complexes by in vivo Controlled Cellular Cross-Linking and Immuno-magnetic Affinity Chromatography

The dynamic nature of cellular machineries is frequently built on transient and/or weak protein associations. These low affinity interactions preclude stringent methods for the isolation and identification of protein networks around a protein of interest. The use of chemical crosslinkers allows the selective stabilization of labile interactions, thus bypassing biochemical limitations for purification. Here we present a protocol amenable for cells in culture that uses a homobifunctional crosslinker with a spacer arm of 12 &Aring;, dithiobis-(succinimidyl proprionate) (DSP). DSP is cleaved by reduction of a disulphide bond present in the molecule. Cross-linking combined with immunoaffinity chromatography of proteins of interest with magnetic beads allows the isolation of protein complexes that otherwise would not withstand purification. This protocol is compatible with regular western blot techniques and it can be scaled up for protein identification by mass spectrometry1.
Stephanie A. Zlatic and Pearl V. Ryder contributed equally to this work.

Isolation of Labile Multi-protein Complexes by in vivo Controlled Cellular Cross-Linking and Immuno-magnetic Affinity Chromatography

The cell permeable crosslinker DSP [dithiobis-(succinimidyl propionate)] stabilizes transient and labile interactions in vivo, which allows their isolation using stringent protein complex purification techniques. Here we present a technique for crosslinking cells grown in culture followed by isolation of protein complexes by immunoprecipitation.

不安定な多タンパク質複合体の単離で in vivoで制御セルラー架橋及び免疫磁気アフィニティークロマトグラフィー

The dynamic nature of cellular machineries is frequently built on transient and/or weak protein associations. These low affinity interactions preclude ...

生物学

Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) Assay for Protein-Protein Interaction in Onion Cells Using the Helios Gene Gun

Investigation of gene function in diverse organisms relies on knowledge of how the gene products interact with each other in their normal cellular environment. The Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) Assay1 allows researchers to visualize protein-protein interactions in living cells and has become an essential research tool. This assay is based on the facilitated association of two fragments of a fluorescent protein (GFP) that are each fused to a potential interacting protein partner. The interaction of the two protein partners would facilitate the association of the N-terminal and C-terminal fragment of GFP, leading to fluorescence. For plant researchers, onion epidermal cells are an ideal experimental system for conducting the BiFC assay because of the ease in obtaining and preparing onion tissues and the direct visualization of fluorescence with minimal background fluorescence. The Helios Gene Gun (BioRad) is commonly used for bombarding plasmid DNA into onion cells. We demonstrate the use of Helios Gene Gun to introduce plasmid constructs for two interacting Arabidopsis thaliana transcription factors, SEUSS (SEU) and LEUNIG HOMOLOG (LUH)2 and the visualization of their interactions mediated by BiFC in onion epidermal cells.

Bimolecular Fluorescence Complementation BiFC Assay for Protein-Protein Interaction in Onion Cells Using the Helios Gene Gun

This article illustrates how to properly use the BioRad Helios Gene Gun to introduce plasmid DNA into onion epidermal cells and how to test for protein-protein interactions in onion cells based on the principle of Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC)

ヘリオス遺伝子銃を用いたタマネギの細胞における蛋白質 - 蛋白質相互作用のための二分子蛍光相補（BiFC）アッセイ

Investigation of gene function in diverse organisms relies on knowledge of how the gene products interact with each other in their normal cellular ...

Blue Native Polyacrylamide Gel Electrophoresis (BN-PAGE) for Analysis of Multiprotein Complexes from Cellular Lysates

Multiprotein complexes (MPCs) play a crucial role in cell signalling, since most proteins can be found in functional or regulatory complexes with other proteins (Sali, Glaeser et al. 2003). Thus, the study of protein-protein interaction networks requires the detailed characterization of MPCs to gain an integrative understanding of protein function and regulation. For identification and analysis, MPCs must be separated under native conditions. In this video, we describe the analysis of MPCs by blue native polyacrylamide gel electrophoresis (BN-PAGE). BN-PAGE is a technique that allows separation of MPCs in a native conformation with a higher resolution than offered by gel filtration or sucrose density ultracentrifugation, and is therefore useful to determine MPC size, composition, and relative abundance (Sch&auml;gger and von Jagow 1991); (Sch&auml;gger, Cramer et al. 1994). By this method, proteins are separated according to their hydrodynamic size and shape in a polyacrylamide matrix. Here, we demonstrate the analysis of MPCs of total cellular lysates, pointing out that lysate dialysis is the crucial step to make BN-PAGE applicable to these biological samples. Using a combination of first dimension BN- and second dimension SDS-PAGE, we show that MPCs separated by BN-PAGE can be further subdivided into their individual constituents by SDS-PAGE. Visualization of the MPC components upon gel separation is performed by standard immunoblotting. As an example for MPC analysis by BN-PAGE, we chose the well-characterized eukaryotic 19S, 20S, and 26S proteasomes.

Blue Native Polyacrylamide Gel Electrophoresis BN-PAGE for Analysis of Multiprotein Complexes from Cellular Lysates

In this video, we describe the characterization of multiprotein complexes (MPCs) by blue native polyacrylamide gel electrophoresis (BN-PAGE). In a first dimension, dialyzed cellular lysates are separated by BN-PAGE to identify individual MPCs. In a second dimension SDS-PAGE, MPCs of interest are further subdivided to analyze their constituents by immunoblotting.

細胞溶解物からの多タンパク質複合体の解析のための青いネイティブポリアクリルアミドゲル電気泳動（BN - PAGE）

Multiprotein complexes (MPCs) play a crucial role in cell signalling, since most proteins can be found in functional or regulatory complexes with other ...

Lipid Vesicle-mediated Affinity Chromatography using Magnetic Activated Cell Sorting (LIMACS): a Novel Method to Analyze Protein-lipid Interaction

The analysis of lipid protein interaction is difficult because lipids are embedded in cell membranes and therefore, inaccessible to most purification procedures. As an alternative, lipids can be coated on flat surfaces as used for lipid ELISA and Plasmon resonance spectroscopy. However, surface coating lipids do not form microdomain structures, which may be important for the lipid binding properties. Further, these methods do not allow for the purification of larger amounts of proteins binding to their target lipids.
 To overcome these limitations of testing lipid protein interaction and to purify lipid binding proteins we developed a novel method termed lipid vesicle-mediated affinity chromatography using magnetic-activated cell sorting (LIMACS). In this method, lipid vesicles are prepared with the target lipid and phosphatidylserine as the anchor lipid for Annexin V MACS. Phosphatidylserine is a ubiquitous cell membrane phospholipid that shows high affinity to the protein Annexin V. Using magnetic beads conjugated to Annexin V the phosphatidylserine-containing lipid vesicles will bind to the magnetic beads. When the lipid vesicles are incubated with a cell lysate the protein binding to the target lipid will also be bound to the beads and can be co-purified using MACS. This method can also be used to test if recombinant proteins reconstitute a protein complex binding to the target lipid. 
 We have used this method to show the interaction of atypical PKC (aPKC) with the sphingolipid ceramide and to co-purify prostate apoptosis response 4 (PAR-4), a protein binding to ceramide-associated aPKC. We have also used this method for the reconstitution of a ceramide-associated complex of recombinant aPKC with the cell polarity-related proteins Par6 and Cdc42. Since lipid vesicles can be prepared with a variety of sphingo- or phospholipids, LIMACS offers a versatile test for lipid-protein interaction in a lipid environment that resembles closely that of the cell membrane. Additional lipid protein complexes can be identified using proteomics analysis of lipid binding protein co-purified with the lipid vesicles.

Lipid Vesicle-mediated Affinity Chromatography using Magnetic Activated Cell Sorting LIMACS: a Novel Method to Analyze Protein-lipid Interaction

To test the interaction of a protein with its target lipid we used MACS and Annexin V-conjugated magnetic beads and lipid vesicles synthesized from the target lipid and Annexin V-binding phosphatidylserine. Proteins bound to the target lipid are co-purified and analyzed after elution from the beads.

磁気活性化細胞選別（LIMACS）を使用して、脂質小胞を介したアフィニティクロマトグラフィー：タンパク質脂質相互作用を解析する新手法

The analysis of lipid protein interaction is difficult because lipids are embedded in cell membranes and therefore, inaccessible to most purification ...

Chromatographic Purification of Highly Active Yeast Ribosomes

Eukaryotic ribosomes are much more labile as compared to their eubacterial and archael counterparts, thus posing a significant challenge to researchers. Particularly troublesome is the fact that lysis of cells releases a large number of proteases and nucleases which can degrade ribosomes. Thus, it is important to separate ribosomes from these enzymes as quickly as possible. Unfortunately, conventional differential ultracentrifugation methods leaves ribosomes exposed to these enzymes for unacceptably long periods of time, impacting their structural integrity and functionality. To address this problem, we utilize a chromatographic method using a cysteine charged Sulfolink resin. This simple and rapid application significantly reduces co-purifying proteolytic and nucleolytic activities, producing high yields of intact, highly biochemically active yeast ribosomes. We suggest that this method should also be applicable to mammalian ribosomes. The simplicity of the method, and the enhanced purity and activity of chromatographically purified ribosome represents a significant technical advancement for the study of eukaryotic ribosomes.

Contamination of preparations of eukaryotic ribosomes purified by traditional methods by co-purifying nucleases and proteases negatively impacts on downstream biochemical and structural analyses. A rapid and simple chromatographic purification method is used to solve this problem using yeast ribosomes as a model system.

高活性酵母のリボソームのクロマトグラフィー精製

Eukaryotic ribosomes are much more labile as compared to their eubacterial and archael counterparts, thus posing a significant challenge to researchers.  ...

Orthogonal Protein Purification Facilitated by a Small Bispecific Affinity Tag

Due to the high costs associated with purification of recombinant proteins the protocols need to be rationalized. For high-throughput efforts there is a demand for general methods that do not require target protein specific optimization1 . To achieve this, purification tags that genetically can be fused to the gene of interest are commonly used2 . The most widely used affinity handle is the hexa-histidine tag, which is suitable for purification under both native and denaturing conditions3 . The metabolic burden for producing the tag is low, but it does not provide as high specificity as competing affinity chromatography based strategies1,2.
Here, a bispecific purification tag with two different binding sites on a 46 amino acid, small protein domain has been developed. The albumin-binding domain is derived from Streptococcal protein G and has a strong inherent affinity to human serum albumin (HSA). Eleven surface-exposed amino acids, not involved in albumin-binding4 , were genetically randomized to produce a combinatorial library. The protein library with the novel randomly arranged binding surface (Figure 1) was expressed on phage particles to facilitate selection of binders by phage display technology. Through several rounds of biopanning against a dimeric Z-domain derived from Staphylococcal protein A5, a small, bispecific molecule with affinity for both HSA and the novel target was identified6 .
The novel protein domain, referred to as ABDz1, was evaluated as a purification tag for a selection of target proteins with different molecular weight, solubility and isoelectric point. Three target proteins were expressed in Escherishia coli with the novel tag fused to their N-termini and thereafter affinity purified. Initial purification on either a column with immobilized HSA or Z-domain resulted in relatively pure products. Two-step affinity purification with the bispecific tag resulted in substantial improvement of protein purity. Chromatographic media with the Z-domain immobilized, for example MabSelect SuRe, are readily available for purification of antibodies and HSA can easily be chemically coupled to media to provide the second matrix.
This method is especially advantageous when there is a high demand on purity of the recovered target protein. The bifunctionality of the tag allows two different chromatographic steps to be used while the metabolic burden on the expression host is limited due to the small size of the tag. It provides a competitive alternative to so called combinatorial tagging where multiple tags are used in combination1,7.

A novel and highly efficient two-step affinity chromatography protocol has been developed and is described in detail. The method is based on a small purification tag with two inherent affinities and is applicable to a wide range of target proteins with different properties.

小型二重特異性アフィニティタグによって容易に直交するタンパク質の精製

Due to the high costs associated with purification of recombinant proteins the protocols need to be rationalized. For high-throughput efforts there is a ...

Identification of Protein Interacting Partners Using Tandem Affinity Purification

A critical and often limiting step in understanding the function of host and viral proteins is the identification of interacting cellular or viral protein partners. There are many approaches that allow the identification of interacting partners, including the yeast two hybrid system, as well as pull down assays using recombinant proteins and immunoprecipitation of endogenous proteins followed by mass spectrometry identification1. Recent studies have highlighted the utility of double-affinity tag mediated purification, coupled with two specific elution steps in the identification of interacting proteins. This approach, termed Tandem Affinity Purification (TAP), was initially used in yeast2,3 but more recently has been adapted to use in mammalian cells4-8.
As proof-of-concept we have established a tandem affinity purification (TAP) method using the well-characterized eukaryotic translation initiation factor eIF4E9,10.The cellular translation factor eIF4E is a critical component of the cellular eIF4F complex involved in cap-dependent translation initiation10. The TAP tag used in the current study is composed of two Protein G units and a streptavidin binding peptide separated by a Tobacco Etch Virus (TEV) protease cleavage sequence. The TAP tag used in the current study is composed of two Protein G units and a streptavidin binding peptide separated by a Tobacco Etch Virus (TEV) protease cleavage sequence8. To forgo the need for the generation of clonal cell lines, we developed a rapid system that relies on the expression of the TAP-tagged bait protein from an episomally maintained plasmid based on pMEP4 (Invitrogen). Expression of tagged murine eIF4E from this plasmid was controlled using the cadmium chloride inducible metallothionein promoter.
Lysis of the expressing cells and subsequent affinity purification via binding to rabbit IgG agarose, TEV protease cleavage, binding to streptavidin linked agarose and subsequent biotin elution identified numerous proteins apparently specific to the eIF4E pull-down (when compared to control cell lines expressing the TAP tag alone). The identities of the proteins were obtained by excision of the bands from 1D SDS-PAGE and subsequent tandem mass spectrometry. The identified components included the known eIF4E binding proteins eIF4G and 4EBP-1. In addition, other components of the eIF4F complex, of which eIF4E is a component were identified, namely eIF4A and Poly-A binding protein. The ability to identify not only known direct binding partners as well as secondary interacting proteins, further highlights the utility of this approach in the characterization of proteins of unknown function.

Tandem affinity purification is a robust approach for the identification of protein binding partners. As proof of concept, this methodology was applied to the well-characterized translation initiation factor eIF4E to co-precipitate the host cell factors involved in translation initiation. This method is easily adapted to any cellular or viral protein.

タンデムアフィニティー精製を用いたタンパク質相互作用するパートナーの識別

A critical and often limiting step in understanding the function of host and viral proteins is the identification of interacting cellular or viral protein ...

A Liquid Phase Affinity Capture Assay Using Magnetic Beads to Study Protein-Protein Interaction: The Poliovirus-Nanobody Example

In this article, a simple, quantitative, liquid phase affinity capture assay is presented. Provided that one protein can be tagged and another protein labeled, this method can be implemented for the investigation of protein-protein interactions. It is based on one hand on the recognition of the tagged protein by cobalt coated magnetic beads and on the other hand on the interaction between the tagged protein and a second specific protein that is labeled. First, the labeled and tagged proteins are mixed and incubated at room temperature. The magnetic beads, that recognize the tag, are added and the bound fraction of labeled protein is separated from the unbound fraction using magnets. The amount of labeled protein that is captured can be determined in an indirect way by measuring the signal of the labeled protein remained in the unbound fraction. The described liquid phase affinity assay is extremely useful when conformational conversion sensitive proteins are assayed. The development and application of the assay is demonstrated for the interaction between poliovirus and poliovirus recognizing nanobodies1. Since poliovirus is sensitive to conformational conversion2 when attached to a solid surface (unpublished results), the use of ELISA is limited and a liquid phase based system should therefore be preferred. An example of a liquid phase based system often used in polioresearch3,4 is the micro protein A-immunoprecipitation test5. Even though this test has proven its applicability, it requires an Fc-structure, which is absent in the nanobodies6,7. However, as another opportunity, these interesting and stable single-domain antibodies8 can be easily engineered with different tags. The widely used (His)6-tag shows affinity for bivalent ions such as nickel or cobalt, which can on their turn be easily coated on magnetic beads. We therefore developed this simple quantitative affinity capture assay based on cobalt coated magnetic beads. Poliovirus was labeled with 35S to enable unhindered interaction with the nanobodies and to make a quantitative detection feasible. The method is easy to perform and can be established with a low cost, which is further supported by the possibility of effectively regenerating the magnetic beads.

In this article, a simple, quantitative, liquid phase affinity capture assay is presented. It is a reliable technique based on the interaction between magnetic beads and tagged proteins (e.g. nanobodies) on one hand and the affinity between the tagged protein and a second, labeled protein (e.g. poliovirus) on the other.

タンパク質 - タンパク質相互作用を研究するために磁気ビーズを用いて液相アフィニティキャプチャーアッセイ：ポリオ-nanobodyの例

In this article, a simple, quantitative, liquid phase affinity capture assay is presented. Provided that one protein can be tagged and another protein ...

A Protocol for Phage Display and Affinity Selection Using Recombinant Protein Baits

Using recombinant phage as a scaffold to present various protein portions encoded by a directionally cloned cDNA library to immobilized bait molecules is an efficient means to discover interactions. The technique has largely been used to discover protein-protein interactions but the bait molecule to be challenged need not be restricted to proteins. The protocol presented here has been optimized to allow a modest number of baits to be screened in replicates to maximize the identification of independent clones presenting the same protein. This permits greater confidence that interacting proteins identified are legitimate interactors of the bait molecule. Monitoring the phage titer after each affinity selection round provides information on how the affinity selection is progressing as well as on the efficacy of negative controls. One means of titering the phage, and how and what to prepare in advance to allow this process to progress as efficiently as possible, is presented. Attributes of amplicons retrieved following isolation of independent plaque are highlighted that can be used to ascertain how well the affinity selection has progressed. Trouble shooting techniques to minimize false positives or to bypass persistently recovered phage are explained. Means of reducing viral contamination flare up are discussed.

Phage display is a powerful technique to capture proteins or protein moieties that interact with an immobilized molecule of interest. Once a decision of the type of phage cDNA library to create and screen has been made, the protocol described here permits efficient affinity selection leading to identification of interactors.

組換えタンパク質ベイトを用いてファージディスプレイおよび親和性選択のためのプロトコル

Using  recombinant phage as a scaffold to present various protein portions encoded by  a directionally cloned cDNA library to immobilized bait molecules ...

Transgenic Rodent Assay for Quantifying Male Germ Cell Mutant Frequency

De novo mutations arise mostly in the male germline and may contribute to adverse health outcomes in subsequent generations. Traditional methods for assessing the induction of germ cell mutations require the use of large numbers of animals, making them impractical. As such, germ cell mutagenicity is rarely assessed during chemical testing and risk assessment. Herein, we describe an in vivo male germ cell mutation assay using a transgenic rodent model that is based on a recently approved Organisation for Economic Co-operation and Development (OECD) test guideline. This method uses an in vitro positive selection assay to measure in vivo mutations induced in a transgenic &#955;gt10 vector bearing a reporter gene directly in the germ cells of exposed males. We further describe how the detection of mutations in the transgene recovered from germ cells can be used to characterize the stage-specific sensitivity of the various spermatogenic cell types to mutagen exposure by controlling three experimental parameters: the duration of exposure (administration time), the time between exposure and sample collection (sampling time), and the cell population collected for analysis. Because a large number of germ cells can be assayed from a single male, this method has superior sensitivity compared with traditional methods, requires fewer animals and therefore much less time and resources.

De novo mutations in the male germline may contribute to adverse health outcomes in subsequent generations. Here we describe a protocol for the use of a transgenic rodent model for quantifying mutations in male germ cells induced by environmental agents.

トランスジェニック齧歯類アッセイ男性生殖細胞変異頻度を定量化するための

De novo mutations arise mostly in the male germline and may contribute to adverse health outcomes in subsequent generations. Traditional methods for ...