我々は、博士に感謝する。 35S用のスティーブマウントと小寧張：：GFP pGlowbug構造とHokensen博士フェローシップCH研究にZ. L&#39;の研究室では、米国国立科学財団（IOB0616096とMCB0744752）によってサポートされています。 ZLは部分的にメリーランド州農業試験場の大学によってサポートされています。

I.プラスミド調製砲撃のために使用されるプラスミドDNAは高純度と500ng/μl以上の濃度ででなければなりません。 BiFCは2つのプラスミドコンストラクトを含むために、各プラスミド25μgのが必要です。言い換えれば、2つのプラスミドの1:1のモル比は、カートリッジの準備のために50μgのプラスミドDNAの総を生じさせるために混合されるべきである。 50μgのより多くのDNAを追加すると金粒子の凝集を引き起こす可能性があり、避けるべきであることに留意してください。市販のプラスミドDNA抽出キットは、プラスミドDNAを単離するために推奨されています。 プラスミドベクターは、pUC19のようなサイズが比較的小さいはずです。我々は、それぞれ3、pUC19を- SPYNE及びpUC19 - SPYCEにSEUとLUH cDNAをクローニングした。 アグロバクテリウムによる形質転換用バイナリーベクターには大きすぎると爆撃には不向きです。 II。カートリッジの準備カートリッジの準備は、プラスミドDNAと続いて遺伝子銃のカートリッジホルダーにロードすることができる半インチ長い断片に切断されているプラ​​スチック製のチューブにそれらをロードするとコーティングの金粒子を含む。カートリッジの準備は別々のJoveの記事4に詳しく説明されていますので、ここでは説明されていません。タマネギの細胞の爆撃のために、我々は、1μgのDNA/0.25 MGゴールド/カートリッジで50カートリッジに約をもたらす準備あたりの金粒子、12.5 mgのプラスミドDNA50μgのを混合することをお勧めします。各カートリッジには、ワンショット用です。金粒子は、0.6μm以下または直径が1.0μmの（;バイオラッドカタログ番号1652262またはCat＃1652263）のいずれかになります。我々はまた、カートリッジの準備のためには0.5 mg / mlのPVP溶液を使用することをお勧めします。 BiFCの場合は、同じカートリッジの準備の各推定相互作用のパートナーの2つのプラスミドDNAを結合する。 カートリッジの準備の後、ペトリ皿の周りにラップされている正方形のパラフィルムに150から200 psiの間にヘリウム圧力で新たに作られたカートリッジを焼成してカートリッジをテストすることが重要です。金粒子は、カートリッジから効率的に推進することができればこれがテストされます。あ​​なたは、パラフィルム上でかすかな金粒子が表示されるはずです。これにより、各ショットがカバーする領域のアイデアを提供します。あなたが別のヘリウム圧力（150-200 psiの範囲にある）で、パラフィルムの上に推進さの金粒子の量が異なることがあります。有意差がない場合は、爆撃のためのより低い圧力を選択してください。 III。タマネギの組織の準備撮影の日に、大規模な黄色のタマネギから外側の皮膚が剥離してしまいます。クリーンで鋭いカミソリの刃を使用して、約2 × 8 cmの深さの矩形領域4から5層をカット。 、長方形のタマネギの組織を取り出し、外側の2つの層を捨てる、2X1.5 cm程度の小片にタマネギの残りの層をカット。ろ紙（ワットマン3MMペーパーに円にカット）を含むペトリ皿にタマネギの部分を配置するには、滅菌水で湿らせた。ペトリ皿をカバーし、彼らが行って準備ができている。 IV。砲撃<ol><li>白い丸いカートリッジホルダーにカートリッジをロードする。別のプラスミドコンストラクトを含むカートリッジは、別のカートリッジホルダーにロードする必要があります。各カートリッジホルダーは12枚で12カートリッジを収容できます。 </li><li>ヘリオス遺伝子銃にバッテリーと新鮮なバレルのライナーを挿入します。バレルライナーと銃の両方が接続されたそれぞれのO -リングを持っていることを確認してください。 </li><li>最初に、銃の上部が直面しているカートリッジホルダーのマーク＃12で、遺伝子銃に空のカートリッジホルダーを挿入する。アドバンスカートリッジホルダーは、一度か二度、それが正しく挿入されていることを確認する。 </li><li>ヘリウムタンクに銃を取り付け、150から200 psiの間の圧力を調整する。 </li><li>銃のチャンバーを一掃すると圧力が安定していることを確認するために、空のカートリッジホルダーに耳の保護と火災の銃を数回着用してください。 </li><li>空のカートリッジホルダーを取り外し、ロードされたカートリッジホルダーを挿入します。あなたが解雇するカートリッジはカートリッジホルダーの底部（6時位置）に配置されるように、カートリッジホルダーを進める。ここでタマネギの部分を撮影するとバックグラウンド蛍光の陰性コントロールのフォームが用意されています。 </li><li>上向きにタマネギの最も内側の層を持つ空のペトリ皿の中央にタマネギのピースを置きます。ペトリ皿上に遺伝子銃の銃身のライナーを置き、トリガーを引きながらサイドボタンを押したままにして拳銃を発射する。湿った3MM濾紙を含むペトリ皿に砲撃タマネギを転送する。 </li><li>次のカートリッジに進み、別のタマネギの部分を発生させます。玉ねぎ4〜5枚が撮影されるまで、この手順を繰り返します。各タマネギの部分は一度撮影されています。 </li><li>別のプラスミドまたは異なるプラスミドの組み合わせを含むカートリッジを搭載した別のカートリッジホルダーに変更。バレルライナーを変更してくださいsはよく汚れを防止する。四から五タマネギの部分を撮影。 </li><li>爆撃の後、perti皿にすべての玉ねぎを返します。蓋つきペトリ皿をカバーしています。乾燥を防ぐためパラフィルムでそれらをラップします。 16〜48時間、暗所で室温でタマネギの部分をインキュベートする。 </li><li>ヘリウムタンクから遺伝子銃をデタッチする前にガスと放出圧力をオフにします。ネジを外しバレルライナー、およびカートリッジのホルダーと（または未使用）使用済みカートリッジを取り外します。 </li><li>せっけん水とビーカーにそれらを沈めることによってカートリッジホルダーとバレルライナーのクリーニング。風呂のソニケーターにビーカーを置き、20分間超音波処理。その後、すべての石鹸の残留物を除去するために水ですすいでください。時間を70％エタノールでそれらを浸し、その後、ペーパータオルの上に乾燥させる。 </li></ol> V.観測<ol><li>室温で16〜20時間砲撃タマネギの部分をインキュベートした後、我々は本研究で使用されているようなツァイスAxioはObserver.z1として蛍光顕微鏡を用いてGFPまたはYFPの蛍光を観察することができます。 </li><li>タマネギの内側の表皮（直接砲撃中に銃を向く層）から単一細胞層皮をゆっくりと平らな端部と鉗子を使用してください。スライド上の水滴の上に皮を置きます。カバースリップを追加しますが、気泡を最小限に抑えるように注意してください。 </li><li>顕微鏡の明視野の下、最初の細胞が生きていることを確認するために細胞質流動を確認してください。そのためには、色素の移動を探してからタマネギの組織をウォームアップする数分間明るい場光にスライドを公開して。細胞質流動は、常に参照することは容易ではない、ので、何も表示されない場合落胆されません。 </li><li>蛍光検出の場合は、GFPまたはYFPのために適切な励起および検出フィルタを使用してください。このような非蛍光性プラスミドで撮影タマネギピースなどのネガティブコントロールを含めることは重要である。かすかな黄色の信号が傷ついた細胞、気泡、または破片から表示されることがあります。ポジティブコントロールを含めることも重要です。このような35Sのようなプラスミドを含む恒常的に発現蛍光レポーター：：GFPは、優秀なポジティブコントロールです。タマネギ表皮細胞（図1A、D）から見えるGFPシグナルは、カートリッジ、タマネギの組織、および遺伝子銃の発砲が適切に準備され、実行されていることが示された。 ：SEU - pSPYNEと35S：：：LUH - pSPYCEのDNAはその後、我々は、35Sの混合物を含むカートリッジが殺到タマネギの部分でSEU - pSPYNEとLUH - pSPYCE間の相互作用を観察した。かすかなYFPの蛍光が核内に一緒に分割YFPの断片をもたらしたSEUとLUH間の直接的な物理的相互作用を示し、（図1のB、E）のみ核内に観察された。 ：GFP：BiFCからYFPシグナルは35SからGFPの信号よりもはるかに弱いことに注意してください。 </li></ol>代表的な結果我々の研究では35S、ここで報告：：GFP陽性対照はプラスミド核と細胞質（図1A、D）の両方を含むセル全体を塗りつぶし、強い蛍光を発します。 GFPタンパク質は核局在化シグナルなしに核内に拡散するのに十分小さいです。対照的に、SEUとLUHは、以前に酵母two - hybridアッセイ2に相互作用するように、2つのシロイヌナズナの転写因子です。 SEU - pSPYNE（SEUはYFPのN末端 ​​フラグメントに融合）とLUH - pSPYCE（SEUはYFPのN末端 ​​フラグメントに融合）、核内に拡散するには大きすぎるの両方、核局在化シグナル2,5が含まれています。タマネギの細胞核（図1 B、E）で検出されたYFP蛍光シグナルは、SEU - pSPYNEとLUH - pSPYCEはタマネギの核で対話できることを示します。いいえ蛍光シグナルがYFPとLUH - pSPYCE（図1C、F）のN末端フラグメントを含有するベクタープラスミドpSPYNEのプラスミド混合が殺到玉ねぎに検出されない。 BiFC介したYFPの蛍光は35SからGFPを介した蛍光よりもかなり弱いです：：GFPプラスミド。私たちの研究では、彼らはまた、（Bと図1Aと比較）異なる細胞内局在性を示した。両方のパートナーのプラスミドが正常に入力すると、同じタマネ​​ギの細胞で発現しているときにBiFCのみ動作としてさらに、蛍光細胞の数は、BiFC著しく低いのが特色です。 <img src="/files/ftp_upload/1963/1963fig1.jpg" alt="図1" /> 図1蛍光（A、B、C）と明視野（D、E、F）タマネギの細胞のイメージが異なるプラスミドコンストラクトが殺到。 （A）と（D）、タマネギの細胞は、35Sが殺到：：GFP。 GFPは細胞質と核外を通して拡散する。 （B）と（E）、タマネギの細胞は、35Sの等モルミックスが殺到：：SEU - pSPYNE（SEUはYFPのN末端フラグメントに融合）し、35S：：LUH - pSPYCE（LUHは、C -末端断片に融合）プラスミドDNA。 SEU - pSPYNEとLUH - pSPYCE間の相互作用を蛍光核によって示されています。 （C）と（F）、ベクターpUC19 - SPYNEとLUH - pSPYCE plasmiのミックスが殺到タマネギの細胞を示す陰性対照DS。いいえ蛍光信号が検出されていません。

<ol>
	<li>Hu, C. D., Chinenov, Y., Kerppola, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+interactions+among+bZIP+and+Rel+family+proteins+in+living+cells+using+bimolecular+fluorescence+complementation.">Visualization of interactions among bZIP and Rel family proteins in living cells using bimolecular fluorescence complementation.</a> Mol Cell. 9 (4), 789-789 (2002).</li><li>Sitaraman, J., Bui, M., Liu, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LEUNIG_HOMOLOG+and+LEUNIG+perform+partially+redundant+functions+during+Arabidopsis+embryo+and+floral+development.">LEUNIG_HOMOLOG and LEUNIG perform partially redundant functions during Arabidopsis embryo and floral development.</a> Plant Physiol. 147 (2), 672-672 (2008).</li><li>Walter, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+protein+interactions+in+living+plant+cells+using+bimolecular+fluorescence+complementation.">Visualization of protein interactions in living plant cells using bimolecular fluorescence complementation.</a> Plant J. 40 (3), 428-428 (2004).</li><li>Woods, G., Zito, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+gene+gun+bullets+and+biolistic+transfection+of+neurons+in+slice+culture.">Preparation of gene gun bullets and biolistic transfection of neurons in slice culture.</a> J Vis Exp. , (2008).</li><li>Azhakanandam, S., Nole-Wilson, S., Bao, F., Franks, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SEUSS+and+AINTEGUMENTA+mediate+patterning+and+ovule+initiation+during+gynoecium+medial+domain+development.">SEUSS and AINTEGUMENTA mediate patterning and ovule initiation during gynoecium medial domain development.</a> Plant Physiol. 146 (3), 1165-1165 (2008).</li><li>Zhang, X. N., Mount, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+alternatively+spliced+isoforms+of+the+Arabidopsis+SR45+protein+have+distinct+roles+during+normal+plant+development.">Two alternatively spliced isoforms of the Arabidopsis SR45 protein have distinct roles during normal plant development.</a> Plant Physiol. 150 (3), 1450-1450 (2009).</li></ol>

利害の衝突は宣言されません。

<ol><li> ：GFPまたは35S：：：GUS、初めてユーザーのために、我々は、35Sのような単一のプラスミド構成レポーターで、カートリッジの準備から観察するために、全体の手順を練習することをお勧めします。我々は、35Sを使用：：プラスミドGFPは、博士から入手。スティーブ山と小寧張6（図1A、D）。 RioRad（猫165〜2244）で販売して遺伝子のショットコントロールのカートリッジは、植物には適していませ?...

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		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Yellow onion</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Any supermarket</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Helios Gene Gun</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BioRad</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Fluorescent microscope with appropriate filters for GFP or YFP</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Zeiss, Nikon, Olympus</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

bimolecular fluorescence complementation (bifc) assay for protein-protein interaction in onion cells using the helios gene gun

多様な生物の遺伝子機能の調査では、遺伝子産物が正常な細胞環境の相互作用についての知識に依存しています。二分子蛍光相補（BiFC）アッセイ<sup&gt; 1</sup&gt;研究者は生きた細胞におけるタンパク質間相互作用を可視化することを可能にし、不可欠な研究ツールとなっています。このアッセイは、それぞれの潜在的な相互作用タンパク質のパートナーに融合されている蛍光タンパク質（GFP）の2つのフラグメントの促進関連に基づいています。二つのタンパク質パートナーの相互作用は、蛍光につながる、N末端とGFPのC末端フラグメントの関連付けを容易にするだろう。植物研究者のために、タマネギ表皮細胞が原因タマネギの組織を取得し、準備の容易さと最小のバックグラウンド蛍光と蛍光の直接可視化のBiFCアッセイを実施するための理想的な実験系です。ヘリオス遺伝子銃（バイオラッド）は、一般的にタマネギの細胞にプラスミドDNAを砲撃するために使用されます。私たちは、の使用は対話する2つの用プラスミドコンストラクトを導入する遺伝子銃をヘリオス示す<em&gt;シロイヌナズナ</em&gt;転写因子、スース（SEU）とLEUNIGホモログ（LUH）<sup&gt; 2</sup&gt;とタマネギ表皮細胞でBiFCによって媒介それらの相互作用の可視化。

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Bimolecular Fluorescence Complementation BiFC Assay for Protein-Protein Interaction in Onion Cells Using the Helios Gene Gun

この記事では、タマネギ表皮細胞にプラスミドDNAを導入する遺伝子銃をヘリオス適切にBioRad社製を使用する方法を示して、どのように二分子蛍光相補性の原理（BiFC）に基づいて、タマネギの細胞におけるタンパク質間相互作用をテストする

ヘリオス遺伝子銃を用いたタマネギの細胞における蛋白質 - 蛋白質相互作用のための二分子蛍光相補（BiFC）アッセイ

Investigation of gene function in diverse organisms relies on knowledge of how the gene products interact with each other in their normal cellular ...

bimolecular-fluorescence-complementation-bifc-assay-for-protein

Research

JoVE Journal

Biology

Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) Assay for Protein-Protein Interaction in Onion Cells Using the Helios Gene Gun

19.5K ビュー.  University of Maryland. この記事では、タマネギ表皮細胞にプラスミドDNAを導入する遺伝子銃をヘリオス適切にBioRad社製を使用する方法を示して、どのように二分子蛍光相補性の原理（BiFC）に基づいて、タマネギの細胞におけるタンパク質間相互作用をテストする

ビデオ: Bimolecular Fluorescence Complementation BiFC Assay for Protein-Protein Interaction in Onion Cells Using the Helios Gene Gun

Gene-gun Transfection of Hippocampal Neurons

海馬ニューロンの遺伝子郡のトランスフェクション

生物学

Preparation of Gene Gun Bullets and Biolistic Transfection of Neurons in Slice Culture

Biolistic transfection is a physical means of transfecting cells by bombarding tissue with high velocity DNA coated particles. We provide a detailed protocol for biolistic transfection of rat hippocampal slices, from the initial preparation of DNA coated bullets to the final shooting of the organotypic slice cultures using a gene gun. Gene gun transfection is an efficient and easy means of transfecting neurons and is especially useful for fluorescently labeling a small subset of cells in tissue slice. In this video, we first outline the steps required to coat gold particles with DNA. We next demonstrate how to line the inside of plastic tubing with the gold/DNA bullets, and how to cut this tubing to obtain the plastic cartridges for loading into the gene gun. Finally, we perform biolistic transfection of rat hippocampal slice cultures, demonstrating handling of the Bio-Rad Helios gene gun, and offering trouble shooting advice to obtain healthy and optimally transfected tissue slices.  

We describe a method for preparing DNA coated gold bullets and demonstrate the use of such bullets to biolistically transfect neurons in cultured hippocampal slices.

遺伝子銃の箇条書きとスライス培養における神経細胞の微粒子銃トランスフェクションの準備

Biolistic transfection is a physical means of transfecting cells by bombarding tissue with high velocity DNA coated particles. We provide a detailed ...

Bimolecular Fluorescence Complementation

Defining the subcellular distribution of signaling complexes is imperative to understanding the output from that complex. Conventional methods such as immunoprecipitation do not provide information on the spatial localization of complexes. In contrast, BiFC monitors the interaction and subcellular compartmentalization of protein complexes. In this method, a fluororescent protein is split into amino- and carboxy-terminal non-fluorescent fragments which are then fused to two proteins of interest. Interaction of the proteins results in reconstitution of the fluorophore (Figure 1)1,2. A limitation of BiFC is that once the fragmented fluorophore is reconstituted the complex is irreversible3. This limitation is advantageous in detecting transient or weak interactions, but precludes a kinetic analysis of complex dynamics. An additional caveat is that the reconstituted flourophore requires 30min to mature and fluoresce, again precluding the observation of real time interactions4. BiFC is a specific example of the protein fragment complementation assay (PCA) which employs reporter proteins such as green fluorescent protein variants (BiFC), dihydrofolate reductase, b-lactamase, and luciferase to measure protein:protein interactions5,6. Alternative methods to study protein:protein interactions in cells include fluorescence co-localization and F&ouml;rster resonance energy transfer (FRET)7. For co-localization, two proteins are individually tagged either directly with a fluorophore or by indirect immunofluorescence. However, this approach leads to high background of non-interacting proteins making it difficult to interpret co-localization data. In addition, due to the limits of resolution of confocal microscopy, two proteins may appear co-localized without necessarily interacting. With BiFC, fluorescence is only observed when the two proteins of interest interact. FRET is another excellent method for studying protein:protein interactions, but can be technically challenging. FRET experiments require the donor and acceptor to be of similar brightness and stoichiometry in the cell. In addition, one must account for bleed through of the donor into the acceptor channel and vice versa. Unlike FRET, BiFC has little background fluorescence, little post processing of image data, does not require high overexpression, and can detect weak or transient interactions. Bioluminescence resonance energy transfer (BRET) is a method similar to FRET except the donor is an enzyme (e.g. luciferase) that catalyzes a substrate to become bioluminescent thereby exciting an acceptor. BRET lacks the technical problems of bleed through and high background fluorescence but lacks the ability to provide spatial information due to the lack of substrate localization to specific compartments8. Overall, BiFC is an excellent method for visualizing subcellular localization of protein complexes to gain insight into compartmentalized signaling.

The subcellular localization of proteins is important in determining the spatio-temporal regulation of cell signaling. Here, we describe bimolecular fluorescence complementation (BiFC) as a straightforward method for monitoring the spatial interactions of proteins in the cell.

二分子蛍光相補

Defining the subcellular distribution of signaling complexes is imperative to understanding the output from that complex. Conventional methods such as ...

Detection of Protein Interactions in Plant using a Gateway Compatible Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) System

We have developed a BiFC technique to test the interaction between two proteins in vivo. This is accomplished by splitting a yellow fluorescent protein (YFP) into two non-overlapping fragments. Each fragment is cloned in-frame to a gene of interest. These constructs can then be co-transformed into Nicotiana benthamiana via Agrobacterium mediated transformation, allowing the transit expression of fusion proteins. The reconstitution of YFP signal only occurs when the inquest proteins interact 1-7. To test and validate the protein-protein interactions, BiFC can be used together with yeast two hybrid (Y2H) assay. This may detect indirect interactions which can be overlooked in the Y2H. Gateway technology is a universal platform that enables researchers to shuttle the gene of interest (GOI) into as many expression and functional analysis systems as possible8,9. Both the orientation and reading frame can be maintained without using restriction enzymes or ligation to make expression-ready clones. As a result, one can eliminate all the re-sequencing steps to ensure consistent results throughout the experiments. We have created a series of Gateway compatible BiFC and Y2H vectors which provide researchers with easy-to-use tools to perform both BiFC and Y2H assays10. Here, we demonstrate the ease of using our BiFC system to test protein-protein interactions in N. benthamiana plants.

Detection of Protein Interactions in Plant using a Gateway Compatible Bimolecular Fluorescence Complementation BiFC System

We have developed a technique to test protein-protein interactions in plant. A yellow fluorescent protein (YFP) is split into two non-overlapping fragments. Each fragment is cloned in-frame to a gene of interest via Gateway system, enabling expression of fusion proteins. Reconstitution of YFP signal only occurs when the inquest proteins interact.

ゲートウェイ互換二分子蛍光相補（BiFC）システムを使用してプラントにおけるタンパク質相互作用の検出

We have developed a BiFC technique to test the interaction between two proteins in vivo. This is accomplished by splitting a yellow fluorescent protein ...

A Liquid Phase Affinity Capture Assay Using Magnetic Beads to Study Protein-Protein Interaction: The Poliovirus-Nanobody Example

In this article, a simple, quantitative, liquid phase affinity capture assay is presented. Provided that one protein can be tagged and another protein labeled, this method can be implemented for the investigation of protein-protein interactions. It is based on one hand on the recognition of the tagged protein by cobalt coated magnetic beads and on the other hand on the interaction between the tagged protein and a second specific protein that is labeled. First, the labeled and tagged proteins are mixed and incubated at room temperature. The magnetic beads, that recognize the tag, are added and the bound fraction of labeled protein is separated from the unbound fraction using magnets. The amount of labeled protein that is captured can be determined in an indirect way by measuring the signal of the labeled protein remained in the unbound fraction. The described liquid phase affinity assay is extremely useful when conformational conversion sensitive proteins are assayed. The development and application of the assay is demonstrated for the interaction between poliovirus and poliovirus recognizing nanobodies1. Since poliovirus is sensitive to conformational conversion2 when attached to a solid surface (unpublished results), the use of ELISA is limited and a liquid phase based system should therefore be preferred. An example of a liquid phase based system often used in polioresearch3,4 is the micro protein A-immunoprecipitation test5. Even though this test has proven its applicability, it requires an Fc-structure, which is absent in the nanobodies6,7. However, as another opportunity, these interesting and stable single-domain antibodies8 can be easily engineered with different tags. The widely used (His)6-tag shows affinity for bivalent ions such as nickel or cobalt, which can on their turn be easily coated on magnetic beads. We therefore developed this simple quantitative affinity capture assay based on cobalt coated magnetic beads. Poliovirus was labeled with 35S to enable unhindered interaction with the nanobodies and to make a quantitative detection feasible. The method is easy to perform and can be established with a low cost, which is further supported by the possibility of effectively regenerating the magnetic beads.

In this article, a simple, quantitative, liquid phase affinity capture assay is presented. It is a reliable technique based on the interaction between magnetic beads and tagged proteins (e.g. nanobodies) on one hand and the affinity between the tagged protein and a second, labeled protein (e.g. poliovirus) on the other.

タンパク質 - タンパク質相互作用を研究するために磁気ビーズを用いて液相アフィニティキャプチャーアッセイ：ポリオ-nanobodyの例

In this article, a simple, quantitative, liquid phase affinity capture assay is presented. Provided that one protein can be tagged and another protein ...

Using SecM Arrest Sequence as a Tool to Isolate Ribosome Bound Polypeptides

Extensive research has provided ample evidences suggesting that protein folding in the cell is a co-translational process1-5. However, the exact pathway that polypeptide chain follows during co-translational folding to achieve its functional form is still an enigma. In order to understand this process and to determine the exact conformation of the co-translational folding intermediates, it is essential to develop techniques that allow the isolation of RNCs carrying nascent chains of predetermined sizes to allow their further structural analysis.
SecM (secretion monitor) is a 170 amino acid E. coli protein that regulates expression of the downstream SecA (secretion driving) ATPase in the secM-secA operon6. Nakatogawa and Ito originally found that a 17 amino acid long sequence (150-FSTPVWISQAQGIRAGP-166) in the C-terminal region of the SecM protein is sufficient and necessary to cause stalling of SecM elongation at Gly165, thereby producing peptidyl-glycyl-tRNA stably bound to the ribosomal P-site7-9. More importantly, it was found that this 17 amino acid long sequence can be fused to the C-terminus of virtually any full-length and/or truncated protein thus allowing the production of RNCs carrying nascent chains of predetermined sizes7. Thus, when fused or inserted into the target protein, SecM stalling sequence produces arrest of the polypeptide chain elongation and generates stable RNCs both in vivo in E. coli cells and in vitro in a cell-free system. Sucrose gradient centrifugation is further utilized to isolate RNCs.
The isolated RNCs can be used to analyze structural and functional features of the co-translational folding intermediates. Recently, this technique has been successfully used to gain insights into the structure of several ribosome bound nascent chains10,11. Here we describe the isolation of bovine Gamma-B Crystallin RNCs fused to SecM and generated in an in vitro translation system.

We describe here a technique that is now routinely used to isolate stably bound ribosome nascent chain complexes (RNCs). This technique takes advantage of the discovery that a 17 amino acid long SecM "arrest sequence" can halt translation elongation in a prokaryotic (E. coli) system, when inserted into (or fused to the C-terminus) of virtually any protein.

リボソーム結合したポリペプチドを単離するためのツールと​​してSECM逮捕シーケンスを使用して、

Extensive research has provided ample evidences suggesting that protein folding in the cell is a co-translational process1-5. However, the exact pathway ...

Flow Cytometric Analysis of Bimolecular Fluorescence Complementation: A High Throughput Quantitative Method to Study Protein-protein Interaction

Among methods to study protein-protein interaction inside cells, Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) is relatively simple and sensitive. BiFC is based on the production of fluorescence using two non-fluorescent fragments of a fluorescent protein (Venus, a Yellow Fluorescent Protein variant, is used here). Non-fluorescent Venus fragments (VN and VC) are fused to two interacting proteins (in this case, AKAP-Lbc and PDE4D3), yielding fluorescence due to VN-AKAP-Lbc-VC-PDE4D3 interaction and the formation of a functional fluorescent protein inside cells.
BiFC provides information on the subcellular localization of protein complexes and the strength of protein interactions based on fluorescence intensity. However, BiFC analysis using microscopy to quantify the strength of protein-protein interaction is time-consuming and somewhat subjective due to heterogeneity in protein expression and interaction. By coupling flow cytometric analysis with BiFC methodology, the fluorescent BiFC protein-protein interaction signal can be accurately measured for a large quantity of cells in a short time. Here, we demonstrate an application of this methodology to map regions in PDE4D3 that are required for the interaction with AKAP-Lbc. This high throughput methodology can be applied to screening factors that regulate protein-protein interaction.

Flow cytometric analysis of Bimolecular Fluorescence Complementation provides a high throughput quantitative method to study protein-protein interaction. This methodology can be applied to mapping protein binding sites and for screening factors that regulate protein-protein interaction.

二分子蛍光相補のフローサイトメトリー分析：タンパク質 - タンパク質相互作用を研究するためのハイスループット定量法

Among methods to study protein-protein interaction inside cells, Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) is relatively simple and sensitive. BiFC ...

Protein-protein Interactions Visualized by Bimolecular Fluorescence Complementation in Tobacco Protoplasts and Leaves

Many proteins interact transiently with other proteins or are integrated into multi-protein complexes to perform their biological function. Bimolecular fluorescence complementation (BiFC) is an in vivo method to monitor such interactions in plant cells. In the presented protocol the investigated candidate proteins are fused to complementary halves of fluorescent proteins and the respective constructs are introduced into plant cells via agrobacterium-mediated transformation. Subsequently, the proteins are transiently expressed in tobacco leaves and the restored fluorescent signals can be detected with a confocal laser scanning microscope in the intact cells. This allows not only visualization of the interaction itself, but also the subcellular localization of the protein complexes can be determined. For this purpose, marker genes containing a fluorescent tag can be coexpressed along with the BiFC constructs, thus visualizing cellular structures such as the endoplasmic reticulum, mitochondria, the Golgi apparatus or the plasma membrane. The fluorescent signal can be monitored either directly in epidermal leaf cells or in single protoplasts, which can be easily isolated from the transformed tobacco leaves. BiFC is ideally suited to study protein-protein interactions in their natural surroundings within the living cell. However, it has to be considered that the expression has to be driven by strong promoters and that the interaction partners are modified due to fusion of the relatively large fluorescence tags, which might interfere with the interaction mechanism. Nevertheless, BiFC is an excellent complementary approach to other commonly applied methods investigating protein-protein interactions, such as coimmunoprecipitation, in vitro pull-down assays or yeast-two-hybrid experiments.

Formation of protein complexes in vivo can be visualized by bimolecular fluorescence complementation. Interaction partners are fused to complementary parts of fluorescent tags and transiently expressed in tobacco leaves, resulting in a reconstituted fluorescent signal upon close proximity of the two proteins.

タバコプロトプラストと葉で二分子蛍光相補性によって可視化し、タンパク質間相互作用

Many proteins interact transiently with other proteins or are integrated into multi-protein complexes to perform their biological function. Bimolecular ...

Investigating Protein-protein Interactions in Live Cells Using Bioluminescence Resonance Energy Transfer

Assays based on Bioluminescence Resonance Energy Transfer (BRET) provide a sensitive and reliable means to monitor protein-protein interactions in live cells. BRET is the non-radiative transfer of energy from a 'donor' luciferase enzyme to an 'acceptor' fluorescent protein. In the most common configuration of this assay, the donor is Renilla reniformis luciferase and the acceptor is Yellow Fluorescent Protein (YFP). Because the efficiency of energy transfer is strongly distance-dependent, observation of the BRET phenomenon requires that the donor and acceptor be in close proximity. To test for an interaction between two proteins of interest in cultured mammalian cells, one protein is expressed as a fusion with luciferase and the second as a fusion with YFP. An interaction between the two proteins of interest may bring the donor and acceptor sufficiently close for energy transfer to occur. Compared to other techniques for investigating protein-protein interactions, the BRET assay is sensitive, requires little hands-on time and few reagents, and is able to detect interactions which are weak, transient, or dependent on the biochemical environment found within a live cell. It is therefore an ideal approach for confirming putative interactions suggested by yeast two-hybrid or mass spectrometry proteomics studies, and in addition it is well-suited for mapping interacting regions, assessing the effect of post-translational modifications on protein-protein interactions, and evaluating the impact of mutations identified in patient DNA.

Interactions between proteins are fundamental to all cellular processes. Using Bioluminescence Resonance Energy Transfer, the interaction between a pair of proteins can be monitored in live cells and in real time. Furthermore, the effects of potentially pathogenic mutations can be assessed.

生物発光共鳴エネルギー転移を用いて生細胞中のタンパク質 - タンパク質相互作用を調査する

Assays based on Bioluminescence Resonance Energy Transfer (BRET) provide a sensitive and reliable means to monitor protein-protein interactions in live ...

Fluorescence Imaging with One-nanometer Accuracy (FIONA)

Fluorescence imaging with one-nanometer accuracy (FIONA) is a simple but useful technique for localizing single fluorophores with nanometer precision in the x-y plane. Here a summary of the FIONA technique is reported and examples of research that have been performed using FIONA are briefly described. First, how to set up the required equipment for FIONA experiments, i.e., a total internal reflection fluorescence microscopy (TIRFM), with details on aligning the optics, is described. Then how to carry out a simple FIONA experiment on localizing immobilized Cy3-DNA single molecules using appropriate protocols, followed by the use of FIONA to measure the 36 nm step size of a single truncated myosin Va motor labeled with a quantum dot, is illustrated. Lastly, recent effort to extend the application of FIONA to thick samples is reported. It is shown that, using a water immersion objective and quantum dots soaked deep in sol-gels and rabbit eye corneas (&#62;200 &#181;m), localization precision of 2-3 nm can be achieved.

Fluorescence Imaging with One-nanometer Accuracy FIONA

Single fluorophores can be localized with nanometer precision using FIONA. Here a summary of the FIONA technique is reported, and how to carry out FIONA experiments is described.

ワンナノメートルの精度で蛍光イメージング（FIONA）

Fluorescence imaging with one-nanometer accuracy (FIONA) is a simple but useful technique for localizing single fluorophores with nanometer precision in ...