我々は議論や原稿の重要な読書のためにミラーラボのメンバーに感謝。この作品は、DLMとDLMの健康賞R00 AG030550の国立研究所に老化の基礎生物学の優秀なネイサンショックセンターからの新しい奨励賞によってサポートされていました。

1。環境チャンバーの建設<ol><li>プロジェクトのスコープのために必要な室の中で最小の合理的なボリュームを選択します。チャンバーは、ガス（O 2）不浸透性材料で作られている必要があります。パイレックスの結晶皿、Anaeropackボックス、または大規模なキャストアクリルボックス（Ellardインスツルメンテーション）は、使用することができます。我々は、9 50 mmプレートは100×50 Kimex結晶皿に収まることを発見した。ガラス板は、パイレックスの結晶皿の蓋として使用することができます。 </li><li>選択されたチャンバ内に穴を開けるとホースバーブフィッティング（コールパーマー）にルアープラスチック男性と合う。継手は、管継手、またはエポキシ樹脂で固定することができます。ガス室からの流れとすることを可能にするために容器の反対側に同様のフィッティングをインストールします。可能であれば、乱流混合を高めるために穴をオフセット。 </li><li> O 2、COのための標準を認定されて定義されているO 2濃度（N 2とのバランス）を使って圧縮ガスタンクを取得します。ntentまたは、酸素欠乏状態のために、（&lt;10 ppmのO 2）2 N純粋。チャンバ内の酸素濃度を中断することを避けるために自動スイッチオーバーの長期的研究のためのレギュレータを使用してください。 </li><li>低酸素に生物体の応答は温度依存性15であることが示されている。インキュベーターに室を配置することによって、様々な温度を維持することができる。インキュベータ内の温度が不均一となどかもしれないが、それは常にチャンバー内の温度を測定する温度データロガーを利用することが賢明です。 </li></ol> 2。環境室にガスを接続する<ol><li>すべての接続の場合は、スナップコネクタまたは圧縮継手のどちらかによって接続さ8分の1インチの外径のチューブを使用しています。チューブは、フッ素化エチレンプロピレン（FEP）またはナイロン（コールパーマー）として、O 2の不浸透性及び非反応性でなければなりません。完了したセットアップの概略については、 図1を参照してください。 </li><li> COMを接続するこのような質量流量コントローラ（シエラ·インスツルメンツ）またはロタメーター（オールボ​​ー）として、流量制御装置へのガスのタンクを押した。タンクから上流圧力、フローデバイスの範囲とホースバーブ継手内にあることを確認してください。二段階のレギュレータは、一般的に所望の圧力に設定して第二段階で使用され、[適切な流量を選択するためのセクション3を見る] </li><li> （ 図1を参照）の排気のためのオープン第2嵌合を残して、その後ガスを使用して蒸留水を介してバブリングによるガスフリットシリンダーでボトルを洗浄し、環境室の継手のうちのいずれかに直接水和物。短期試験では、ガスの水和は、プレートdessicationに対する保護が、湿度のモニタリングは、長期的な研究のために必要となる場合があります。 </li><li>ダウコーニングの真空用グリースは、チャンバを密閉するために使用することができます。気密シールを確保するため、チャンバーの蓋に重みを置きます。密封し、適切な流量を確認するには、yの手のひらに少量の水のプールを保持する私たちの手袋をしたチャンバーでアウトフィッティングに手や気泡を確認してください。 </li></ol> 3。フローレートを選択する<ol><li>完全混合を仮定し、気体の大気の90％のガス交換するたびに、チャンバの容積が（フィックの法則）に置き換えられますがあります。たとえば、100 cc /分の流量で100ccのチャンバー内に、チャンバー内の元の家の空気は、1分後に所望のガスの90％に置き換えられますし、漸近的に90パーセント分ごとにすることで、完全な交換に近づきますその後。 </li><li>高流量と小型コンテナは、より迅速に、ご希望の酸素濃度に到達します。 100×50 Kimexコンテナ（400 cc）で、120 cc /分の流量は10分（3取引所）で99.9％の交換に到達します。この流量は、ほとんどの酸素条件に適しています。我々の知識にO 2濃度の変化率は、Cの応答をどのように影響するかを系統的に調査がされていませんエレガンス 。 </li></ol><ol><li>低酸素状態にさらされたワームは、一般に寒天プレートの表面をエスケープします。これを防ぐために、プレートの縁の周りにパルミチン酸（エタノールでは10 mg / ml）のリングを配置します。パルミチン酸は、物理的なバリアを形成し、エタノールを蒸発させた溶液から出てくるでしょう。パルミチン酸の障壁は 、C言語の産卵率、産卵数や寿命に影響を与えません虫 16,17。穴掘りは、低酸素条件下でより頻繁に発生しないので、追加の予防措置は、一般的に必要ありません。 </li><li><ol><li>非シード線虫の成長培地（NGM）プレート18上にアルカリ性漂白溶液の小滴に妊娠大人の漂白によって同期集団を生成します。標準的な大規模バッチの次亜塩素酸漂白プロトコルとは対照的に、NGMプレートの表面に漂白剤溶液の液滴で1から100の動物を選択し、漂白剤溶液をプレートに吸収することができます<suP&gt; 18。少なくとも12時間後に、ライブOP50細菌を接種したプレートに同期したL1幼虫を転送します。また、1は、同期の開発または混合集団からL4幼虫を選ぶでしょうワームのグループを生成するために妊娠大人が2-3時間プレート上に卵を産むようにすることができます。 </li><li>これは生存率13を減らすことができるように、低酸素に漂白された胚を露出させることは避けてください。若い胚（2-4セル）を収集するために、妊娠、大人の酸素への後続の露出のために口のピペットでプレートに移動したかみそりの刃と胚の水の少量のみじん切りにすることができます。 </li></ol></li><li>環境チャンバー内でプレートをシールします。対照動物は、治療のワームと同じ温度で正常酸素（空気の家）に保持する必要があります。家の空気中に放置サンプルと家の空気がその上を流れると同一の​​チャンバー内に維持、それらの間に観察可能な違いはありません。ガスフローを開始し、希望の時間のために露出を維持しています。ランプの均一性を確保するため、必ず曝露前のガス洗浄瓶に水を交換してください。 </li><li>胚のアッセイの生存に、ワームは、室内の空気に復帰した後48時間開発することができ、彼らは1つ大人4段目の幼虫/日でなければなりませんその時点で。生存、検閲を占めていることはできませんいずれかのワームのスコア。 </li><li> 、低酸素に暴露した動物を視覚化する22ミリメートル2カバースリップ上でM9のドロップにワームを移動し、M9 18に、2％アガロースのパッド上に反転します。必要な場合は、レバミゾール（25 mm）またはアジ化ナトリウム（10 mM）を麻酔薬として使用することができます。アジ化ナトリウムとレバミゾールは、毒性のためにいくつかの観測を混乱させる可能性があり、慎重に19を使用する必要があります。 </li></ol> 5。低酸素に暴露されたワームの急速な収穫（例：HIF-1ウェスタン分析用サンプルの調製） 多くの低酸素誘導効果はすぐに卵の生産12、有糸分裂エピトープのリン酸化の再開など、室内の空気に戻った時に逆になっている胚13とHIF-1タンパク質の分解9,20インチ低酸素状態にさらされる動物の急速な分離は、これらの条件で再現性の効果を得るために必要とされています。 2分未満で、このセットアップでは、動物を収穫することができ、液体窒素で凍結。グローブボックスの低酸素室は無酸素条件下での試料の操作を可能にする一方で、無酸素以外の条件のために、コストと実用性は、その有用性を制限します。 <ol><li>ワームの大半は18歳妊娠成人になるまで4〜10センチの高成長（HG）プレート上にブリストルN2ワームを育てています。ワームは5分9以上ではなく、溶解し始めるまで回転で1:5アルカリ性漂白溶液とインキュベートを含む15 mLコニカルチューブにワームを洗ってください。ブレーキなしで各洗浄の間に1500 xgでスピンダウンし、M9とワームを3回洗浄します。 </li><li> 8 150 mmのNGMプレート上にプレートを漂白した胚およびL4幼虫（22時ブリストルN2の〜48時間°C）に発展することができます。環境チャンバーにプレートを移動し、4時間の低酸素（1,000 ppmで、5,000 ppm）と酸素（N2）の条件に公開します。露光時間は、実験デザインに応じて異なります。低酸素への曝露が産卵率に直接的な影響を持っていますが、2細胞期胚では、暴露12の16から18時間後に死亡しています。この低酸素室での設定は、曝露の下限は平衡に達するために必要な雰囲気の為替レートによって制限されます。 </li><li>ラベル1 1.5mlマイクロチューブと各実験サンプルの1つの15 mLコニカルチューブ。低酸素状態にさらされたワームは、収穫時のチューブの側面に付着する可能性が高くなります。これを防ぐために、場所ごとに15 mLのコニカルチューブに1％のドデシル硫酸ナトリウム（SDS）の100μL。 SDSは、下流のアプリケーションを阻害する場合、（BSA）ウシ血清アルブミンは、付着を防止するために使用することができます。 SDSまたはBSAの日常的な使用が明らかに違いを持っ​​ていないようです。 2倍のタンパク質をローディング色素（4％SDS、10％2 - メルカプトエタノールと50μlを加える1.5mlマイクロチューブに30％グリセロール（w / v）の）のブロモフェノールブルーのトレース。液体窒素デュワーの準備ができている。 </li><li>低酸素症およびレコードからワームを除去した後、時間ステップを。 、低酸素室に蓋を取り外しつのサンプルプレートを取得し、チャンバーを封印。 15 mLのコニカルチューブに注ぎ、次にナイロンフィルター上にワームを洗浄し、蒸留水を使用しています。ブレーキ付15〜20秒の場合は1500×gで遠心分離し、デスクトップにワームをスピンダウンします。 </li><li>手付かずのワームペレットを残して、チューブから上清の大部分を削除するには、真空を使用しています。 </li><li>ピペットを用いて、1.5mlマイクロチューブに50μLのワームペレットを移動します。液体窒素中でチューブと浸漬をシールします。 </li><li>すべてのサンプルが分離されているまで繰り返します。一貫性を保つために家の空気のコントロールサンプルのためにこれらの手順に従ってください。サンプルは-20℃で保存することができます</li></ol> 6。代表的な結果低酸素症の生物体の効果を見ることができますCの成人に可能性を調べることによって、 線虫 （ 図2）。野生型ブリストル（N2）とHIF-1（ia04）の欠失変異体によって築かれた胚は、すべての家エアO 2濃度（210,000 ppmのO 2）の中で生き残るされています。 HIF-1胚が実行可能ではないながら、N 2のワームは、5,000 ppmのO 2の成人に適応し、生き残ることができます。これは、HIF-1は、環境10で利用可能な酸素レベルの変化に適応するために不可欠であることを示している。いずれもN2もHIF-1の動物は、1,000 ppmのO 2への暴露に耐えることができます。 低酸素に直接ワームを視覚化することは解剖の範囲と透明容器（ 図3）の使用で可能である。直接解剖スコープの低酸素室を配置することによって、生物体の反応を観察するために低酸素状態からワームを削除する必要はありません。範囲は（ 図3のように蛍光illumationを取り付けることができます。 </stronG&gt;）、さらに可能な低酸素状態の観測値の型を拡張する。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/4088/4088fig1.jpg" /> 図1。低酸素室の一例。ガス流の方向が矢印で示されています。ガスが定義されているO 2濃度（1）と2つの段階のレギュレータに圧縮ガスタンクに格納されている（2）接続されています。ガスは、適切な流量でトップを終了し、フローチューブの底に（3）に入ります。ガスは、ガス（気泡を観察することによって、バブルフラスコの正しい接続を確保するため）水和、バブルフラスコ（4）に流れ込みます。和ガスは、低酸素症にサンプルを公開し、流入弁（5）で低酸素室に渡します。チャンバー内で掘削し、排気孔を介して部屋にガスがようやく口。 <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/4088/4088fig2.jpg" /> 図2。 1,000 ppmのO 2にさらされた胚の生存率、5,000 ppmのO <sub&gt; 2と正常酸素（〜210,000 ppmのO 2）。胚は連続フロー酸素室で24時間の胚のように各酸素状態にさらされた。 ワームは、正常酸素条件に移動し48時間大人に開発することができ、その後成人期への生存率を評価した。 N&gt; 50、N = 5。 <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/4088/4088fig3.jpg" /> 図3。 C.の可視化顕微鏡による低酸素状態でエレガンス 。ワームは、概説の方法を用いて低酸素状態にさらされています。透明な環境室（パイレックス結晶皿とガラス板で構成）解剖範囲のステージ上に直接配置されています。 2つのビューは、全体のガスの流れを含むいずれかの顕微鏡のステージ上だけチャンバと、他のを設定し、表示されます。

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利害の衝突が宣言されません。

このメソッドは、実験室で維持される酸素の正確な濃度の環境を可能にする低酸素環境を構築するための戦略を提示します。これらのチャンバは、O 2、特定の低濃度に生物を暴露し、分子および生理学の出力を監視するための簡単な方法を提供しています。説明した環境室は、ラボの代わりに市販品を購入することによって作成されたため、実験のニーズに合わせて変更することが?...

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬の名前 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td></tr><tr><td>チューブ（FEPとPTFE） </td><td>コー​​ルパーマー タイゴン</td><td> YO-95821から00（1/8 &quot;FEP） 06605から27（1/16×1/8 &quot;PTFE） &#39;R-3603 </td></tr><tr><td>コンプレッション·フィッティング</td><td>シアトル流体システム</td><td> 06363から58（Mカプラー1/16 &quot;） 06363から62（F.カプラ1/16 &quot;） 06363から60（Mカプラー1/8 &quot;） 06363から61（F.カプラ1/8 &quot;） </td></tr><tr><td>流管</td><td>オールボルグ</td><td> PMR3-010073（3出力） PMR1-013520（1出力） </td></tr><tr><td>マスフローコントローラ</td><td>シエラ·インスツルメンツ</td><td> 810S-L-DR-2-OV1-SK1-V1-S1（マスTrakの） C100L-DD-2-OV1-SV1-PV2-V1-SO-C10（スマートTrakの2） </td></tr><tr><td>圧縮ガスタンク</td><td> Airgasの</td><td>オーダーメイド&lt;/ TD&gt; </tr><tr><td>ホースバーブフィッティングにルアープラスチック男性</td><td>コー​​ルパーマー</td><td> 45505から41（500シリーズ1/16 &quot;） </td></tr><tr><td>アクリルボックスをキャスト</td><td> Ellard装</td><td>オーダーメイド</td></tr><tr><td>管継手（黄銅またはステンレス鋼） </td><td>シアトル流体システム</td><td> B-402-1（1/4 &quot;ナット） B-200-3（1/8 &quot;ユニオンティー） B-400セット（1/4 &quot;フェルール） B-QM2-B1-200（QMボディQC） B-200-1-2（1/8×1/8 &quot;オスCONN） </td></tr><tr><td>ダウコーニングの真空用グリース</td><td> Sigma-Aldrich社</td><td> Z273554 </td></tr><tr><td> AnaeroPackボックス</td><td> Misubishiガス·ケミカル·カンパニー</td><td> R684004（0.4リットル） R685025（2.5リットル） R685070（7.0リットル） </td></tr><tr><td>パイレックスガス洗浄瓶</td><td> Sigma-Aldrich社</td><td> CLS31770500C（500 mL）を CLS31770250C（250 mL）を CLS31770125C（125 mL）を&lt;/ TD&gt; </tr><tr><td>パルミチン酸</td><td> Sigma-Aldrich社</td><td> P0500 </td></tr><tr><td>ヤギ抗マウスIgG-西洋ワサビペルオキシダーゼ</td><td>サザンバイオテクノロジーアソシエイツ</td><td> 1032年から1005年</td></tr><tr><td> SuperSignal西ピコChemiluminsecent基板</td><td>ピアスケミカル</td><td> 34077 </td></tr><tr><td> 100×50ガラスの結晶皿</td><td> Kimaxキンブル</td><td> 23000 </td></tr></tbody></table>

creating defined gaseous environments to study the effects of hypoxia on c. elegans

酸素は、既知の例外の1つ1で、すべての後生動物が生き残るために不可欠である。減少したO 2可用性（低酸素）は、環境条件2-5の病気、通常の開発や変更の状態の間に発生する可能性があります。低酸素への応答に関与する細胞内シグナル伝達経路を理解することが脳卒中からがんまで、多様な人間の病態の治療戦略に新たな洞察を提供することができます。この目標は、遺伝的影響を受けやすいモデル生物で制御された低酸素曝露に伴う技術的困難により、少なくとも部分的に妨げられてきた。 線虫 Caenorhabditis elegans は、理想的にはそれが文 ​​化に容易であり、遺伝的操作として、低酸素応答の研究のためのモデル生物として適しています。また、C.以降の交絡影響を及ぼすことなく特定の酸素O 2濃度に対する細胞応答を研究することが可能ですelegansは O 2を得る（容易に呼吸器系6とは対照的に、拡散による）ガスや他の。低酸素に対する応答に関与することが知られている要因は、Cで保存されているエレガンス 。低酸素状態への実際の応答が可能ですO 2の特定の濃度に依存する。 C.でelegansは 、低酸素症を緩和するための露出がHIF-1によって主として媒介転写応答を誘発する、高度に保存され低酸素誘導転写因子6-9。C。elegansの初期胚では、O 2 7,10 5,000-20,000 ppmで生き残るためにはHIF-1を必要とする。低酸素状態は&quot;通常のO 2未満&quot;のための一般的な用語です。正常酸素（通常のO 2）も定義することが困難な場合があります。我々は一般的に正常酸素であることが21万ppmのO 2であり、室内の空気を、検討してください。しかし、それは示されているC. elegansは 5から12パーセントからO 2濃度（50,000-120,000 ppmのO 2）11の行動の優先順位を持っています。 lのarvaeと大人、5,000 ppmのO 2 12に低酸素誘導休眠を防止するために、HIF-1として機能します。しかし、HIF-1は、O 2の低濃度（酸素欠乏、操作的定義&lt;10 ppmのO 2）13に対応して役割を果たしていない。無酸素症、Cの虫はすべて微視的に観察活動が10を停止した仮死状態の可逆的な状態に入る。異なる生理的応答は、さまざまな条件で発生するという事実は、O 2の酸素濃度以上の実験的なコントロールを持つことの重要性を強調しています。 ここでは、O 2の濃度と定義された信頼性と再現性の低酸素状態を作り出す環境槽の建設と実施のための手法を提案する。継続的なフロー法は、チャンバーの急速な平衡を保証し、システムの安定性を向上させます。さらに、透明性とチャンバーのアクセシビリティは、低酸素状態にさらされる動物の直接可視化を可能にします。我々はさらにCを収穫する効果的な方法を実証虫のサンプル急速に低酸素に曝露した後、これは低酸素症10,14で発生し、急速に逆の変化の多くを観察する必要があります。このメソッドは、簡単に別のモデルシステムとガスの多様など、個々の研究室のニーズに合わせて修正することができる基本的な基盤を提供します。

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Creating Defined Gaseous Environments to Study the Effects of Hypoxia on C. elegans

Oの定義された濃度の雰囲気を生成するために、連続フロー酸素チャンバーを使用する方法を本論文の詳細<sub&gt; 2</sub&gt;生物学的応答を理解するためにOを減少する<sub&gt; 2</sub&gt;。このシステムは、セットアップと保守が容易で、Oの広い範囲に合わせて十分な柔軟性があり<sub&gt; 2</sub&gt;濃度とモデルシステム

に低酸素の影響を検討するために定義され気体環境を作成する<em&gt; C.エレガンス</em

Oxygen is essential for all metazoans to survive, with one known exception1. Decreased O2 availability (hypoxia) can arise during states of disease, ...

creating-defined-gaseous-environments-to-study-effects-hypoxia-on-c

Research

JoVE Journal

Biology

Creating Defined Gaseous Environments to Study the Effects of Hypoxia on C. elegans

12.0K ビュー.  University of Washington. Oの定義された濃度の雰囲気を生成するために、連続フロー酸素チャンバーを使用する方法を本論文の詳細 2生物学的応答を理解するためにOを減少する 2。このシステムは、セットアップと保守が容易で、Oの広い範囲に合わせて十分な柔軟性があり 2濃度とモデルシステム

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Testing Visual Sensitivity to the Speed and Direction of Motion in Lizards

Testing visual sensitivity in any species provides basic information regarding behaviour, evolution, and ecology. However, testing specific features of the visual system provide more empirical evidence for functional applications. Investigation into the sensory system provides information about the sensory capacity, learning and memory ability, and establishes known baseline behaviour in which to gauge deviations (Burghardt, 1977). However, unlike mammalian or avian systems, testing for learning and memory in a reptile species is difficult. Furthermore, using an operant paradigm as a psychophysical measure of sensory ability is likewise as difficult. Historically, reptilian species have responded poorly to conditioning trials because of issues related to motivation, physiology, metabolism, and basic biological characteristics. Here, I demonstrate an operant paradigm used a novel model lizard species, the Jacky dragon (Amphibolurus muricatus) and describe how to test peripheral sensitivity to salient speed and motion characteristics. This method uses an innovative approach to assessing learning and sensory capacity in lizards. I employ the use of random-dot kinematograms (RDKs) to measure sensitivity to speed, and manipulate the level of signal strength by changing the proportion of dots moving in a coherent direction. RDKs do not represent a biologically meaningful stimulus, engages the visual system, and is a classic psychophysical tool used to measure sensitivity in humans and other animals. Here, RDKs are displayed to lizards using three video playback systems. Lizards are to select the direction (left or right) in which they perceive dots to be moving. Selection of the appropriate direction is reinforced by biologically important prey stimuli, simulated by computer-animated invertebrates.

Testing visual sensitivity in lizards using an operant conditioning paradigm that employs video playback of random-dot kinematograms and computer-generated invertebrates.

トカゲの運動の速度と方向の視覚感度のテスト

Testing visual sensitivity in any species provides basic information regarding behaviour, evolution, and ecology. However, testing specific features of ...

生物学

MALDI Sample Preparation: the Ultra Thin Layer Method

This video demonstrates the preparation of an ultra-thin matrix/analyte layer for analyzing peptides and proteins by Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization Mass Spectrometry (MALDI-MS) 1,2. The ultra-thin layer method involves the production of a substrate layer of matrix crystals (alpha-cyano-4-hydroxycinnamic acid) on the sample plate, which serves as a seeding ground for subsequent crystallization of a matrix/analyte mixture. Advantages of the ultra-thin layer method over other sample deposition approaches (e.g. dried droplet) are that it provides (i) greater tolerance to impurities such as salts and detergents, (ii) better resolution, and (iii) higher spatial uniformity. This method is especially useful for the accurate mass determination of proteins. The protocol was initially developed and optimized for the analysis of membrane proteins and used to successfully analyze ion channels, metabolite transporters, and receptors, containing between 2 and 12 transmembrane domains 2. Since the original publication, it has also shown to be equally useful for the analysis of soluble proteins. Indeed, we have used it for a large number of proteins having a wide range of properties, including those with molecular masses as high as 380 kDa 3. It is currently our method of choice for the molecular mass analysis of all proteins. The described procedure consistently produces high-quality spectra, and it is sensitive, robust, and easy to implement.

This video demonstrates the preparation of an ultra-thin matrix/analyte layer for analyzing peptides and proteins by Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization Mass Spectrometry (MALDI-MS).

MALDIサンプル調製：超薄層法

This video demonstrates the preparation of an ultra-thin matrix/analyte layer for analyzing peptides and proteins by Matrix-Assisted Laser Desorption ...

Generation of Stable Transgenic C. elegans Using Microinjection

Transgenic Caenorhabditis elegans can be readily created via microinjection of a DNA plasmid solution into the gonad 1. The plasmid DNA rearranges to form extrachromosomal concatamers that are stably inherited, though not with the same efficiency as actual chromosomes 2. A gene of interest is co-injected with an obvious phenotypic marker, such as rol-6 or GFP, to allow selection of transgenic animals under a dissecting microscope. The exogenous gene may be expressed from its native promoter for cellular localization studies. Alternatively, the transgene can be driven by a different tissue-specific promoter to assess the role of the gene product in that particular cell or tissue. This technique efficiently drives gene expression in all tissues of C. elegans except for the germline or early embryo 3. Creation of transgenic animals is widely utilized for a range of experimental paradigms. This video demonstrates the microinjection procedure to generate transgenic worms. Furthermore, selection and maintenance of stable transgenic C. elegans lines is described.

This video demonstrates the technique of microinjection into the gonad of C. elegans to create transgenic animals.

マイクロインジェクションを使用して安定したトランスジェニック線虫の世代

Transgenic Caenorhabditis elegans can be readily created via microinjection of a DNA plasmid solution into the gonad 1.  The plasmid DNA rearranges to ...

Dissecting and Recording from The C. Elegans Neuromuscular Junction

Neurotransmission is the process by which neurons transfer information via chemical signals to their post-synaptic targets, on a rapid time scale. This complex process requires the coordinated activity of many pre- and post-synaptic proteins to ensure appropriate synaptic connectivity, conduction of electrical signals, targeting and priming of secretory vesicles, calcium sensing, vesicle fusion, localization and function of postsynaptic receptors and finally, recycling mechanisms. As neuroscientists it is our goal to elucidate which proteins function in each of these steps and understand their mechanisms of action. Electrophysiological recordings from synapses provide a quantifiable read out of the underlying electrical events that occur during synaptic transmission. By combining this technique with the powerful array of molecular and genetic tools available to manipulate synaptic proteins in C. elegans, we can analyze the resulting functional changes in synaptic transmission. 
The C. elegans NMJs formed between motor neurons and body wall muscles control locomotion, therefore, mutants with uncoordinated locomotory phenotypes (known as unc s) often perturb synaptic transmission at these synapses 1. Since unc mutants are maintained on a rich supply of a bacterial food source, they remain viable as long as they retain some pharyngeal pumping ability to ingest food. This, together with the fact that C. elegans exist as hermaphrodites, allows them to pass on mutant progeny without the need for elaborate mating behaviors. These attributes, coupled with our recent ability to record from the worms NMJs 2,3,7 make this an excellent model organism in which to address precisely how unc mutants impact neurotransmission. 
The dissection method involves immobilizing adult worms using a cyanoacrylic glue in order to make an incision in the worm cuticle exposing the NMJs. Since C. elegans adults are only 1 mm in length the dissection is performed with the use of a dissecting microscope and requires excellent hand-eye coordination. NMJ recordings are made by whole-cell voltage clamping individual body wall muscle cells and neurotransmitter release can be evoked using a variety of stimulation protocols including electrical stimulation, light-activated channel-rhodopsin-mediated depolarization 4 and hyperosmotic saline, all of which will be briefly described.

Application of electrophysiology to accessible synapses provides a quantifiable measure of synaptic activity, useful in analyzing synaptic mutants. This article describes a dissection method used to expose the neuromuscular junctions (NMJ) of Caenorhabditis elegans (C. elegans) and briefly discusses some of the uses to which this preparation can be applied.

解離性とC. elegansの神経筋接合部から録音する

Neurotransmission is the process by which neurons transfer information via chemical signals to their post-synaptic targets, on a rapid time scale.   This ...

Hi-C: A Method to Study the Three-dimensional Architecture of Genomes.

The three-dimensional folding of chromosomes compartmentalizes the genome and and can bring distant functional elements, such as promoters and enhancers, into close spatial proximity 2-6. Deciphering the relationship between chromosome organization and genome activity will aid in understanding genomic processes, like transcription and replication. However, little is known about how chromosomes fold. Microscopy is unable to distinguish large numbers of loci simultaneously or at high resolution. To date, the detection of chromosomal interactions using chromosome conformation capture (3C) and its subsequent adaptations required the choice of a set of target loci, making genome-wide studies impossible 7-10.
We developed Hi-C, an extension of 3C that is capable of identifying long range interactions in an unbiased, genome-wide fashion. In Hi-C, cells are fixed with formaldehyde, causing interacting loci to be bound to one another by means of covalent DNA-protein cross-links. When the DNA is subsequently fragmented with a restriction enzyme, these loci remain linked. A biotinylated residue is incorporated as the 5' overhangs are filled in. Next, blunt-end ligation is performed under dilute conditions that favor ligation events between cross-linked DNA fragments. This results in a genome-wide library of ligation products, corresponding to pairs of fragments that were originally in close proximity to each other in the nucleus. Each ligation product is marked with biotin at the site of the junction. The library is sheared, and the junctions are pulled-down with streptavidin beads. The purified junctions can subsequently be analyzed using a high-throughput sequencer, resulting in a catalog of interacting fragments.
Direct analysis of the resulting contact matrix reveals numerous features of genomic organization, such as the presence of chromosome territories and the preferential association of small gene-rich chromosomes. Correlation analysis can be applied to the contact matrix, demonstrating that the human genome is segregated into two compartments: a less densely packed compartment containing open, accessible, and active chromatin and a more dense compartment containing closed, inaccessible, and inactive chromatin regions. Finally, ensemble analysis of the contact matrix, coupled with theoretical derivations and computational simulations, revealed that at the megabase scale Hi-C reveals features consistent with a fractal globule conformation.

The Hi-C method allows unbiased, genome-wide identification of chromatin interactions (1). Hi-C couples proximity ligation and massively parallel sequencing. The resulting data can be used to study genomic architecture at multiple scales: initial results identified features such as chromosome territories, segregation of open and closed chromatin, and chromatin structure at the megabase scale.

ハイC：ゲノムの三次元構造を研究する方法。

The three-dimensional folding of chromosomes compartmentalizes the genome and and can bring distant functional elements, such as promoters and enhancers, ...

The Production of C. elegans Transgenes via Recombineering with the galK Selectable Marker

The creation of transgenic animals is widely utilized in C. elegans research including the use of GFP fusion proteins to study the regulation and expression pattern of genes of interest or generation of tandem affinity purification (TAP) tagged versions of specific genes to facilitate their purification. Typically transgenes are generated by placing a promoter upstream of a GFP reporter gene or cDNA of interest, and this often produces a representative expression pattern. However, critical elements of gene regulation, such as control elements in the 3' untranslated region or alternative promoters, could be missed by this approach. Further only a single splice variant can be usually studied by this means. In contrast, the use of worm genomic DNA carried by fosmid DNA clones likely includes most if not all elements involved in gene regulation in vivo which permits the greater ability to capture the genuine expression pattern and timing. To facilitate the generation of transgenes using fosmid DNA, we describe an E. coli based recombineering procedure to insert GFP, a TAP-tag, or other sequences of interest into any location in the gene. The procedure uses the galK gene as the selection marker for both the positive and negative selection steps in recombineering which results in obtaining the desired modification with high efficiency. Further, plasmids containing the galK gene flanked by homology arms to commonly used GFP and TAP fusion genes are available which reduce the cost of oligos by 50% when generating a GFP or TAP fusion protein. These plasmids use the R6K replication origin which precludes the need for extensive PCR product purification. Finally, we also demonstrate a technique to integrate the unc-119 marker on to the fosmid backbone which allows the fosmid to be directly injected or bombarded into worms to generate transgenic animals. This video demonstrates the procedures involved in generating a transgene via recombineering using this method.

The Production of C. elegans Transgenes via Recombineering with the galK Selectable Marker

The ability to produce transgenes for Caenorhabditis elegans using genomic DNA carried by fosmids is particularly attractive as all of the native regulatory elements are retained. Described is a simple and robust procedure for the production of transgenes via recombineering with the galK selectable marker.

の生産 C.エレガンス</emとRecombineering経由>トランスジーン galK選択可能なマーカー

The creation of transgenic animals is widely utilized in C. elegans research including the use of GFP fusion proteins to study the regulation and ...

RNAi Screening to Identify Postembryonic Phenotypes in C. elegans

C. elegans has proven to be a valuable model system for the discovery and functional characterization of many genes and gene pathways1. More sophisticated tools and resources for studies in this system are facilitating continued discovery of genes with more subtle phenotypes or roles. 
Here we present a generalized protocol we adapted for identifying C. elegans genes with postembryonic phenotypes of interest using RNAi2. This procedure is easily modified to assay the phenotype of choice, whether by light or fluorescence optics on a dissecting or compound microscope. This screening protocol capitalizes on the physical assets of the organism and molecular tools the C. elegans research community has produced. As an example, we demonstrate the use of an integrated transgene that expresses a fluorescent product in an RNAi screen to identify genes required for the normal localization of this product in late stage larvae and adults. First, we used a commercially available genomic RNAi library with full-length cDNA inserts. This library facilitates the rapid identification of multiple candidates by RNAi reduction of the candidate gene product. Second, we generated an integrated transgene that expresses our fluorecently tagged protein of interest in an RNAi-sensitive background. Third, by exposing hatched animals to RNAi, this screen permits identification of gene products that have a vital embryonic role that would otherwise mask a post-embryonic role in regulating the protein of interest. Lastly, this screen uses a compound microscope equipped for single cell resolution.

RNAi Screening to Identify Postembryonic Phenotypes in C. elegans

We describe a sensitized method to identify postembryonic regulators of protein expression and localization in C. elegans using an RNAi-based genomic screen and an integrated transgene that expresses a functional, fluorescently tagged protein.

の後胚表現型を識別するためのRNAiスクリーニング C.エレガンス</em

C. elegans has proven to be a valuable model system for the discovery and functional characterization of many genes and gene pathways1. More sophisticated ...

Using RNA-mediated Interference Feeding Strategy to Screen for Genes Involved in Body Size Regulation in the Nematode C. elegans

Double-strand RNA-mediated interference (RNAi) is an effective strategy to knock down target gene expression1-3. It has been applied to many model systems including plants, invertebrates and vertebrates. There are various methods to achieve RNAi in vivo4,5. For example, the target gene may be transformed into an RNAi vector, and then either permanently or transiently transformed into cell lines or primary cells to achieve gene knockdown effects; alternatively synthesized double-strand oligonucleotides from specific target genes (RNAi oligos) may be transiently transformed into cell lines or primary cells to silence target genes; or synthesized double-strand RNA molecules may be microinjected into an organism. Since the nematode C. elegans uses bacteria as a food source, feeding the animals with bacteria expressing double-strand RNA against target genes provides a viable strategy6. Here we present an RNAi feeding method to score body size phenotype. Body size in C. elegans is regulated primarily by the TGF- &beta; - like ligand DBL-1, so this assay is appropriate for identification of TGF-&beta; signaling components7. We used different strains including two RNAi hypersensitive strains to repeat the RNAi feeding experiments. Our results showed that rrf-3 strain gave us the best expected RNAi phenotype. The method is easy to perform, reproducible, and easily quantified. Furthermore, our protocol minimizes the use of specialized equipment, so it is suitable for smaller laboratories or those at predominantly undergraduate institutions.

Using RNA-mediated Interference Feeding Strategy to Screen for Genes Involved in Body Size Regulation in the Nematode C. elegans

We demonstrate how to use the RNAi feeding technique to knock down target genes and score body size phenotype in C. elegans. This method could be used for a large scale screen to identify potential genetic components of interest, such as those involved in body size regulation by DBL-1/TGF-&beta; signaling.

線虫における身体サイズ調節に関与する遺伝子をスクリーニングするための戦略を給餌RNA媒介干渉を用いた<em&gt; Cエレガンス</em

Double-strand RNA-mediated interference (RNAi) is an effective strategy to knock down target gene expression1-3. It has been applied to many model systems ...

C. elegans Chemotaxis Assay

Many organisms use chemotaxis to seek out food sources, avoid noxious substances, and find mates. Caenorhabditis elegans has impressive chemotaxis behavior.
 The premise behind testing the response of the worms to an odorant is to place them in an area and observe the movement evoked in response to an odorant. Even with the many available assays, optimizing worm starting location relative to both the control and test areas, while minimizing the interaction of worms with each other, while maintaining a significant sample size remains a work in progress 1-10. The method described here aims to address these issues by modifying the assay developed by Bargmann et al.1. A Petri dish is divided into four quadrants, two opposite quadrants marked "Test" and two are designated "Control". Anesthetic is placed in all test and control sites. The worms are placed in the center of the plate with a circle marked around the origin to ensure that non-motile worms will be ignored. Utilizing a four-quadrant system rather than one 2 or two 1 eliminates bias in the movement of the worms, as they are equidistant from test and control samples, regardless of which side of the origin they began. This circumvents the problem of worms being forced to travel through a cluster of other worms to respond to an odorant, which can delay worms or force them to take a more circuitous route, yielding an incorrect interpretation of their intended path. This method also shows practical advantages by having a larger sample size and allowing the researcher to run the assay unattended and score the worms once the allotted time has expired.

C. elegans Chemotaxis Assay

A method of quantitatively evaluating the chemotactic response of Caenorhabditis elegans is described. A chemotactic index (CI) was employed as a way to precisely evaluate the response of worms to certain targets, and serve as a platform of comparison between strains and compounds of interest.

C. elegansの走化性アッセイ

Many organisms use chemotaxis to seek out food sources, avoid noxious substances, and find mates.  Caenorhabditis elegans has impressive chemotaxis ...

Measuring the Effects of Bacteria on C. Elegans Behavior Using an Egg Retention Assay

C. elegans egg-laying behavior is affected by environmental cues such as osmolarity1 and vibration2. In the total absence of food C. elegans also cease egg-laying and retain fertilized eggs in their uterus3. However, the effect of different sources of food, especially pathogenic bacteria and particularly Enterococcus faecalis, on egg-laying
	behavior is not well characterized. The egg-in-worm (EIW) assay is a useful tool to quantify the effects of different types of bacteria, in this case E. faecalis, on egg- laying behavior.
	
	EIW assays involve counting the number of eggs retained in the uterus of C. elegans4. The EIW assay involves bleaching staged, gravid adult C. elegans to remove the cuticle and separate the retained eggs from the animal. Prior to bleaching, worms are exposed to bacteria (or any type of environmental cue) for a fixed period of time. After bleaching, one is very easily able to count the number of eggs retained inside the uterus of the worms. In this assay, a quantifiable increase in egg retention after E. faecalis exposure can be easily measured. The EIW assay is a behavioral assay that may be used to screen for potentially pathogenic bacteria or the presence of environmental toxins. In addition, the EIW assay may be a tool to screen for drugs that affect neurotransmitter signaling since egg-laying behavior is modulated by neurotransmitters such as serotonin and acetylcholine5-9.

Measuring the Effects of Bacteria on C. Elegans Behavior Using an Egg Retention Assay

An egg-in-worm (EIW) assay is a useful method to quantify egg-laying behavior. Alterations in egg laying can be a behavioral response of the model organism Caenorhabditis elegans to potentially harmful environmental substances such as those produced by pathogenic bacteria.

上の細菌の影響を測定する<em&gt; C.エレガンス</em卵保持アッセイを用いて&gt;行動

C. elegans egg-laying behavior is  affected by environmental cues such as osmolarity1 and  vibration2. In the total absence of food C. elegans also cease ...