他の固体培養方法も存在しますが、これは、個々の動物の生命と健康寿命の縦断的追跡と蛍光バイオマーカーの縦方向イメージングを1つのシステムで自動的に可能にする最初の固体培養システムです。このプロトコルは、固体NGMに関する標準的なC.elegans実験に匹敵する結果を提供し、嫌悪的介入と直接ライブ蛍光イメージングの両方と互換性があります。このシステムは、特に環境ストレス要因への長期暴露や遺伝子やタンパク質の動態の長期観察など、老化研究にとって非常に貴重です。
汚染の回避とウェル全体で一貫した乾燥を得ることは、どちらも困難です。これらの問題を最小限に抑えるために、書面によるプロトコルの重要なポイントを強調しました。はじめに、乳鉢と乳棒で500ミリグラムの固形パルミチン酸を挽きます。
50ミリリットルの円錐バイアルに入った15ミリリットルのTWEEN 20と混ぜ合わせ、ボルテックスで混合して結晶を溶解します。17.5ミリリットルの100%エタノールを加え、溶液をボルテックスしてできるだけ多くのパルミチン酸を溶解します。次に、17.5ミリリットルの超純水を加え、激しく渦巻きます。
パルミチン酸が完全に溶解するまで、摂氏80度のビーズバスで溶液を静かに加熱します。ビーズバスを摂氏80度に再加熱します。使用直前に、マイクロトレイあたり1ミリリットルのパルミチン酸作業溶液を別の滅菌容器に分注し、加熱する前にパルミチン酸溶液1ミリリットルあたり4マイクロリットルのナイスタチンを加えます。
次に、マイクロトレイの内側と外側にエタノールを飽和状態になるまでスプレーし、余分なエタノールを振り落とします。マイクロトレイを滅菌するには、プレートと蓋をUV架橋剤に別々に配置します。20分後、プレートと蓋を裏返します。
次に、パルミチン酸作業溶液を含む15ミリリットルの円錐形バイアルをビーズ浴に入れ、目に見える結晶を完全に溶解させてから使用します。マイクロトレイをビーズバスを囲む棚に2分間蓋をして温めます。マイクロトレイの蓋を外し、マイクロトレイの後壁に200マイクロリットルのパルミチン酸作動溶液をゆっくりと加えます。
蓋を元に戻し、マイクロトレイをビーズバスに2〜3分間置いて、パルミチン酸溶液がマイクロトレイの底部に沈殿するようにします。マイクロトレイを180度回転させ、前に示したようにパルミチン酸作業溶液を追加します。原稿に記載されているコンポーネントを追加してlmNGMを準備します。
次に、20マイクロリットルのlmNGMをベンチに置かれた各マイクロトレイにピペットで入れます。汚染を最小限に抑えるために、ピペットを補充するときは必ずマイクロトレイを覆ってください。マイクロトレイウェルにバクテリアフードを播種するには、3, 500 Gで一晩増殖させた培養物を20分間遠心分離します。
上清を除去し、85ミリモル塩化ナトリウム溶液で10倍の濃度で菌培養物を再懸濁した。次に、5マイクロリットルの10倍濃縮細菌培養物を各ウェルのlmNGMの表面に注意深くピペッティングします。バクテリア培養物を井戸の側面を越えてパルミチン酸に流すことは避けてください、これはワームを引き付けて井戸を離れるからです。
滅菌3Dプリントインサートを滅菌シングルウェルプレートに入れます。マイクロトレイをシングルウェルプレートの3Dプリントアダプターに入れます。マイクロトレイの外側ウェルとシングルウェルプレートの内壁の間の3Dプリントインサートの上に水結晶を自由に分配します。
ワームがすぐに追加されない場合は、翌日使用するためにマイクロトレイを密封します。トレイの蓋を閉め、1枚のパラフィルムを使用して4つの側面すべてを包み、マイクロトレイを密封します。3層に対して、パラフィルムでシールステップをさらに2回繰り返します。
目的のライフステージに達したら、ウェルごとに1つのワームを追加します。シングルウェルプレートの蓋に40マイクロリットルの洗剤溶液を加え、タスクワイプを使用して蓋を均一にコーティングします。追加のタスクワイプを使用して、蓋からの視界が歪まなくなるまで洗剤溶液を広げます。
パラフィルムの最初の部分を少し伸ばして、トレイの両側を覆います。トレイの上部をタスクワイプで拭き、70%エタノールで湿らせて指紋を取り除きます。プレートの側面または上部を軽くたたくか、プレートに明るい青色の光を当てて、各動物を観察して寿命を測定します。
数秒以内に動かない場合は、動物を死に至らしめます。すべてのワームが死ぬまで、1〜3日ごとにこのタスクを繰り返します。単一ウェルで蛍光イメージングを実行します。
硫酸銅とジチオスレイトールへの曝露は、ワームの寿命と健康寿命を大幅に短縮しました。対照的に、硫酸銅は健康で過ごす人生の割合を減らしましたが、ジチオスレイトールは減少しませんでした。硫酸銅は、すべての年齢でジチオスレイトールよりも集団内の個人全体の平均活性を大幅に低下させました。.
生涯活動曲線下の個々の動物面積の集団平均は、硫酸銅またはジチオスレイトールによって実質的に損なわれる。10日目までの個々の動物の累積活動は、ジチオスレイトールに挑戦した動物の寿命と相関しますが、未処理の対照または硫酸銅に挑戦した動物の寿命と相関しません。.KYNU-1発現の劇的な増加は、成人期の3日目から8日目の間に観察され、その後は年齢とともに徐々に低下します。
成人期14日目までの累積KYNU-1 mScarlet発現は、動物の寿命と相関しています。KYNU-1の発現は生涯を通じて動的であるため、個々の動物のさまざまな年齢でのKYNU-1の発現を全生存期間と比較しました。単一の時点で、KYNU-1発現が生存と有意に相関していませんでした。
この手順を試みる場合、最も重要なステップは、パルミチン酸の添加、寒天のピペッティング、およびワームの導入です。この技術により、寿命と健康寿命の縦断的追跡、およびNGMアッセイに直接匹敵する方法で個々のワームの蛍光バイオマーカーが可能になります。
