デュッセルドルフ大学医学部のForschungskommissionの助成金によってサポートされていますCKVBに、この作品は、CKとJPH、DFG（GRK1033コ1679/3-1）にニューロンERANET DISCOVER（BMBF 01EW1003）によって賄われていた。

1。 Aggresomeドナー細胞の調製モノマー赤色蛍光タンパク質（MRFP）または強化緑色蛍光タンパク質（EGFP）タグ付きヒト完全長（FL）のDISC1のトランスフェクション<ol><li>シード1.5×10 6/10センチメートルディッシュヒト神経芽細胞腫のNLF（NLF、フィラデルフィアの小児病院、フィラデルフィア、ペンシルバニア州）10 10cmディッシュ内の細胞と一晩増殖。 NLFの細胞は、L-グルタミン、ペニシリン/ Strepomycin、10％FBSを添加したRPMI-1640培地で培養される。翌日、細胞は70〜80％コンフルエントになっているはずです。 </li><li>一時的に15μgのプラスミドDNAとMetafecteneトランスフェクション試薬（Biontex、Martinsried、Germany）でそれぞれ10cmディッシュをトランスフェクション。簡単に説明すると、10cm皿に、15μgのプラスミドDNAと30μlのMetafecteneは、750μlののOpti-MEMに添加し、混合し、室温で20分間インキュベートした。 5皿をpcDNA3.1 mRFPを/ EGFPプラスミド単独でのeGFPタグ付きヒト（フロリダ州）のDISC1と5皿でトランスフェクトした。 </li></ol> 2。 Aggresomeトランスフェクトされたドナー細胞からの精製ここで説明されたプロトコルは、脳組織13と大きな凝集体とアグレソーム14を単離するためのプロトコルからレヴィー·ボディを浄化するための方法を組み合わせたものです。すでに既存の方法は、洗剤の使用量に基づいているので、細胞浸潤アッセイのアプリケーションのための界面活性剤を含まないタンパク質の分離は非常に重要です。 <ol><li>トランスフェクションの48時間後には、eGFPおよびmRFP/eGFP-DISC1の発現をモニターし、蛍光顕微鏡（ 図1）に基づくアグレソームの形成を確認します。 </li><li> 1Xプロテアーゼ阻害剤カクテルを追加（ロシュ、インディアナポリス、インディアナ州）とPrecellys24ホモジナイザー（ベルタン技術、フランス）を用いて細胞を破壊し、PBS pHは7.4、400μlのPBSそれぞれとスクレープで細胞を洗浄します。簡単に言えば、2 mlの溶解チューブに1 mlの細胞懸濁液を加え、10セラミックビーズを追加します。 3×60秒パルスで細胞を溶解します。プロセスの機械的な力かもしれない37前述のサンプル内の温度を上げる℃のような注意が溶解処理後のサンプルを氷上に寒さに注意する必要があります。 </li><li>氷の上のセルを冷却し、37℃で60分間、10mMのMgCl 2、40 U / mlのDNaseとインキュベートを追加°C </li><li> 80％、50％、PBSのpHは7.4（各10ml）中の20％スクロース（w / v）の溶液を調製する。 </li><li> 50パーセントと20パーセント、続いて2ミリリットル80％スクロースを皮切りに、15mlファルコンチューブにショ糖勾配を準備します。徐々に勾配を注ぎ、既に注ぎ層を乱さないように注意してください。 4℃で1000×gで15分間、遠心勾配の上の層消化ライセートを℃に</li><li>慎重に、PBS pH7.4の5倍量とピペットとミックスで50〜80％のショ糖層との間​​の相間を収集します。 4℃、1000×gで15分間遠心さらに2回洗浄を繰り返します。この中間期では、アグレソームは蛍光であり、紫外線下で顕微鏡で可視化することができる。 </li><li>上清を捨て、250から500μLのPBS（pH7.4）中でペレットを再懸濁します。このペレットは、精製アグレソーム（ 図2）が含まれています。 </li></ol> 3。 mRFP/eGFP-DISC1アグレソームと受信者のSH-SY5Y細胞の治療<ol><li>シード5×10 4個の受信者のSH-SY5Yヒト神経芽腫細胞恒常的に24ウェルプレートの各ウェル中の滅菌カバーグラス上のGFP-DISC1（598から854）を発現する。 SH-SY5Y細胞は、ペニシリン/ストレプトマイシン、非必須アミノ酸（NEAA）および10％FBSを添加したDMEM/F-12培地で培養される。 </li><li> 24時間後、各ウェルに10μlを加えると48〜72時間インキュベートする。 </li><li> PBSのpHは3×7.4細胞を洗浄し、5分間は0.04％トリパンブルーで細胞外の蛍光を消光する。 </li><li>氷上で10分間PBS pH7.4中4％PFAで細胞を固定し、DAPIマウント培地（Invitrogen、米国）とゴールドを長引かせると滅菌H 2 Oで1回洗浄し、ガラススライド上にカバースリップをマウントします。 </li><li> /取り込みを確認するZスタック画像に受容細胞によって発現募集タンパク質との共局在化によって外因的に適用アグレソームの侵攻。 </li></ol>まだ、外因性タンパク質の取り込み/侵入は基本的に宿主細胞タンパク質の募集と並行して検出されないことがあります。私たちの例では、mRFPをタグ付きDISC1アグレソームリクルート可溶性GFPタグDISC1（598から854）は、宿主細胞（ 図3を参照）によって発現されたタンパク質を。写真はツァイスLSM 510共焦点またはツァイスAxioVisionのApotome2顕微鏡で撮影した。 4。組換えDISC1の世代（598から785） 前の刊行物では、自己会合ドメインの存在に基づいて、自己の対話への様々なDISC1タンパク質断片の能力を分析した。最強多量性向4（ 図4）表示されているすべてのタンパク質の中でテストした人間のDISC1（598から785）を断片化します。従って、ヒトDISC1（598から785）は、（いいえpET15bにクローニングした大腸菌で発現し、N末端​​6 -ヒスチジンタグを含むvagen、マディソン、ウィスコンシン州）、 大腸菌 BL21-（lDE3）はロゼッタ（Novagen社製、米国）、および4に記載されているように 8モル/ l尿素で変性条件下で精製した。要するに、プロトコルは以下の通りです。 <ol><li> BL21-（IDE3）ロゼッタE.大腸菌を OD 600に5mMの5 MM-アルギニン塩酸、硫酸マグネシウム、100μg/ mlのcarbencillin、35μg/ mlのクロラムフェニコールを含む2×500ミリリットル2YTで増殖させた：0.6から0.8とDISC1（598から785）の発現を誘導した1mMのIPTGで。 </li><li> DISC1（598から785）を37℃で4時間発現させ、発現は、遠心分離により菌体を収穫によって終了されました。 </li><li>細菌ペレットを50mlのTE緩衝液（50mMのトリス-HCl pH 8.0、5mMのEDTA）と2mMのPMSF、1％TX-100、250μg/ mlのリゾチーム、20mMのMgCl 2および400 U/50 mlに再懸濁した完全な溶解を確実にするためにDNアーゼIは、反応が穏やかに攪拌しながら室温で30分間インキュベートした。 </li><li> 10mMのβ-mercaptを追加さらに30分間oethanol（ME）と500mMのNaClとインキュベートする。 </li><li> 4℃で30分間20.000グラムで細菌封入体をスピンダウン</li><li> 50mMのトリスpH8.0、5mMイミダゾール、500mMのNaCl、8M尿素および10mMのβ-MEを含む、4℃で30分間20.000グラムで遠心分離して破片を除去し、50mlの抽​​出バッファーでペレットを再懸濁し℃、 </li><li>抽出バッファーでNi-NTAアガロースマトリックスを洗う。室温で2時間、Ni-NTAマトリックスを用いて再懸濁し、preclearedタンパク質抽出物をインキュベートする。 </li><li> 12mMのイミダゾールを含有する抽出バッファーでNi-NTAマトリックスを洗う。 </li><li> 50mMトリス、500mMのNaCl、300 mMイミダゾール、8M尿素、1mMのPMSF、5mMのEDTAおよび10mMのβ-MEを含む15mlの溶出緩衝液でゆっくりタンパク質を溶出する。 </li><li> 10mMのβ-MEを含むPBS pH7.4に段階的にタンパク質を透析する。 </li></ol> 1リットルの細菌培養液から始まるそれは、組換えDISC1（598から785）protの50 mgまで単離することが可能であるEIN。 α-シヌクレインのリフォールディング α-シヌクレインを用いた実験のために、組換えタンパク質500μgの（Sigma-Aldrich社製、米国）を1 mg / mlの濃度でPBSに溶解した。オリゴマーを得るためには、フォールディング℃で、前の出版物10で説明した37℃で一晩行った。 5。 DyLight594有する組換えDISC1（598から785）のラベリング<ol><li>前に後続のラベリング処理、DISC1（598から785）タンパク質が、β-MEから解放されました。したがって、タンパク質は1:2,000の希釈で、PBS pH7.4に3回透析する。 </li><li>ラベル1、製造業者の使用説明書に従ってDyLight 594マレイミド（サーモサイエンティフィック社、米国）とMG DISC1（598から785）。短期では、PBS（pH7.4）に1 mg / mlのタンパク質を分解し、遊離チオール基を回収するの5mM TCEPを追加します。室温で2時間反応し、インキュベートをDMF溶解染料の20μlを添加する。 </li><li> PBSのpHにタンパク質3 xを透析2時間ごとに1:2000の割合で7.4。 </li></ol>実行されたNi-NTAカラムでアフィニティー精製の​​His 6 -タグベースの標識タンパク質の純度を一層高めるために。 <ol start="4"><li> 10mlのPBS pH7.4で1ミリリットルNi-NTAマトリックス（Qiagen、ドイツ）を洗浄します。 </li><li>列に標識し、透析タンパク質を適用し、それが徐々に列の上に走らせた。 </li><li> 3×20 mlのPBS pH7.4でタンパク質を洗う</li><li>溶出液量を減らすために、Ni-NTAカラムに色のバンドを監視しながら、PBS pH7.4の500mMイミダゾール滴下してタンパク質を溶出する。 </li><li> 2時間ごとに1:2000の希釈の10mM NAPI pH7.4に溶出液3 xを透析する。 </li><li>溶出液は、液体窒素中で5×100μlのサンプルとスナップ凍結でアリコートをフィルタ処理するためのフィルタ滅菌0.45μmのシリンジを使用しています。各100μlアリコートで1μg/ mlの - タンパク質の総量は0.5であるべきです。 </li></ol> オプションconcentrationステップ<ol start="10"><li> stereotacticalラットの注射のために、タンパク質は、速度-VAC（エッペンドルフコンセントレータ5301）で10倍に濃縮した。最終バッファ条件は100mMのNAPIだった。 </li></ol> α-シヌクレインのラベリング組換えα-シヌクレインのラベリングと精製は、ニッケル（Ni-NTAカラム）DISC1（598から785）に平行して行われました。合計出発材料は、500μgの代わりにDISC1（598から785）は1 mgであった。 6。ラベル付けされた組換えDISC1（598から785）タンパク質と受信者のSH-SY5Y細胞の治療<ol><li>シード5×4受信側のSH-SY5Yヒト神経芽腫細胞は恒常的に24ウェルプレートの各ウェル中の滅菌カバーグラス上のGFP-DISC1（598から854）を発現する。 </li><li> 5から10μg/ mlの濃度で細胞培養培地に標識タンパク質を追加し、48〜72時間インキュベートする。 </li><li> PBSのpHは3×7.4細胞を洗浄し、抽出が渇きを5分では0.04％トリパンブルーでellular蛍光。 </li><li>氷上で10分間PBS pH7.4中4％PFAで細胞を固定し、DAPIマウント培地（Invitrogen、米国）とゴールドを長引かせると滅菌H 2 Oで1回洗浄し、ガラススライド上にカバースリップをマウントします。 </li><li>レーザー共焦点顕微鏡を走査することによって生成されたZスタック画像に受容細胞によって発現募集タンパク質と共局在して外因的に適用組換えタンパク質の取り込み/侵攻を確認します。しかし、内因性のタンパク質の募集は基本的に宿主細胞タンパク質の侵攻と並行して検出されないことがあり、Zスタック画像はまだタンパク質の侵襲的な性質を確認することができます。 </li></ol>私たちの例のRECに。 DISC1（598から785）*少なくとも一部の新兵に可溶性DISC1（598から854）は、宿主細胞（ 図5Aを参照）によって発現されたタンパク質をGFPタグ付き。組換えα-シヌクレインの侵略が、ノー募集のため（ 図5B）が示されている。写真を撮ったツァイスLSM 510共焦点上またはツァイスAxioVisionのApotome2顕微鏡。 濃縮の注射でさえ動物の灌流後に検出することができる注射部位の周りにタンパク質の拡散でMPFC結果にDISC1（598から785）*を標識した（2.5μg/μLのの約4μl）を、ローダミンのfiltersetを含むPBS pH7.4中4％PFA。今回の例ではDISC1（598から785）はニューロンの異なる数によって巻き取られると、Zスタック画像（ 図6）を使って監視できます。 一般的には、他のタンパク質の注射は、次にここで使用されているものは、必ずしも細胞浸潤につながらない。侵入イベントがタンパク質の性質上基本的に依存している、それにもかかわらず、きれいな精製は、さらなる分析のための前提条件です。 7。代表的な結果 NLFの細胞から精製された組換えフロリダDISC1-EGFPから成るアグレソームは、受取人、SH-SY5Y CEを侵略共焦点顕微鏡（ 図3）との共局在化によって見られるように、低効率でLLS（約0.3％5）。既報の通り、DISC1（598から785）が発現し、 大腸菌から精製4多量に形成された大腸菌は、ポジティブコントロール（ 図5B）のように並列で使用されていたα-シヌクレインと同様の約20％5（ 図5A）の効率で均等に細胞侵襲的であった。標識された組換えDISC1（598から785）、Eから発現させ、精製し多量体タンパク質は、定位的にラットの内側前頭前野（; PUM、ベイダー、ヒューストン、Korth、未発表の図6）に注入したときに大腸菌は in vivo においてもニューロンに細胞侵襲的であった。 <img src="/files/ftp_upload/4132/4132fig1.jpg" alt="図1" /> 図1のNLF神経芽細胞は一過性のFP-DISC1（赤色）を発現する。赤色蛍光アグレソームはdeteすることができます細胞内CTED。 <img src="/files/ftp_upload/4132/4132fig2.jpg" alt="図2" /> ショ糖勾配で精製後2。精製mRFPをタグ付きDISC1アグレソーム図 。 <img src="/files/ftp_upload/4132/4132fig3.jpg" alt="図3" /> 図3に侵攻アグレソームの蛍光画像。 mRFPをタグ付きflDISC1アグレソームはDISC1には、（598から854）を過剰発現する可溶性のGFPタグSH-SY5Y神経芽腫細胞を用いて精製し、インキュベートした。ラベル付きアグレソームの取り込みはレーザースキャン顕微鏡（Zeiss LSM 510）上のZ-スタックイメージングによって監視されています。 <img src="/files/ftp_upload/4132/4132fig4.jpg" alt="図4" /> 図4 recのSEC-プロファイル。 S704とC704の一塩基多型（SNP）を含むDISC1（598から785）。両方の変異体は、順序付けられたオリゴマーの中断および高分子量MULTの形成を示すimers（赤矢印）。この写真はLeliveld らの出版物。、生化学、2009年から変更されています。 <img src="/files/ftp_upload/4132/4132fig5.jpg" alt="図5" /> 図5。侵襲DyLight標識組換えDISC1（598から785）の蛍光Zスタック画像。水溶性のGFP-DISC1を（598から854）を発現するSH-SY5Y神経芽細胞は、5μg/ mlの濃度で標識された組換えタンパク質とともにインキュベートした。 （A）は赤の集計はRECの侵略を示しています。 DISC1（598から785）タンパク質と黄色のドットの集合体に水溶性のGFP-DISC1（598から854）の動員を示す。 （b）組換えα-シヌクレイン（赤）が約20％の頻度で募集せずに細胞に侵入する。 <a href="/files/ftp_upload/4132/4132fig5large.jpg" target="_blank">拡大図を表示するには、ここをクリックしてください</a> 。 <img src="/files/ftp_upload/4132/4132fig6.jpg" alt="図6" /> 図6の免疫蛍光画像注入されたラベルが付いた組換えDISC1（598から785）タンパク質。 Z-スタックイメージングは​​RECの存在を確認する。 DISC1（598から785）の神経核（NeuN、緑）に対する抗体で染色したラット皮質ニューロンにおけるタンパク質。

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特別な利害関係は宣言されません。

本研究では、トランスフェクトされた神経芽腫細胞株、組換えDISC1タンパク質種の準備とラベリングし、in vitro および in vivo での受容細胞の細胞侵入実験でそれぞれのアプリケーションからmRFP/eGFP-DISC1アグレソームの精製について説明します。 ネイティブmRFP/eGFP-DISC1アグレソームの精製は、レビー小体のような構造と大きな凝集体13,14を分離するためのプロトコルから開発されたが、洗剤の使用を回避し、発生する可能性の細胞浸潤、偽陽性のリスクを最小限にするように変更されました洗剤促進性膜浸透に起因する。 一つの可能​​な将来の改善がさらに完全にアグレソームから残っている膜と細胞骨格を分離するために、超音波処理によってアグレソームの純度を高めるためにあるかもしれない。 、大アグレソームミリアンペアのために記録合計侵攻イベントの数を全体の純度を高めることによりyは5を増加させること。私たちが提案した3相スクロースの限られた定義は、他のタンパク質種のアグレソームために十分であるかどうかをテストする必要があり、この意味では、プロトコルがここに概説さは、個々の最適化のための出発点として考慮されるべきである。精製アグレソームは、スクロースの痕跡が著しく全体の収率を低下させなかった排除するために、追加の洗浄工程（洗剤なしで）、私たちの手の中に非常に堅牢であることが判明した。 前の刊行物では、DISC1のオリゴマーアセンブリはC末端4（ 図4）に明確な多量体化ドメインに依存していることを説明した。我々は、 大腸菌での組換え可溶性発現のために、この断片を選択しました大腸菌および後続とNi-NTA精製。その多量体化を監視するには、α-シヌクレインのように記載される細胞侵襲性のタンパク質とその細胞の浸潤を比較するために、我々は、蛍光色素DyLight594とDISC1（598から785）を標識し、比較してその均等に標識したα-シヌクレインのそれと細胞浸潤。組換えDISC1断片の細胞浸潤は劇的ネイティブ、全長DISC1アグレソームを、おそらくそれより小さいサイズとはるかに高い純度のためのそれに比べて増加した。繰り返しになりますが、純度は細胞浸潤に決定的な役割を果たしているように見える。 今回の例では侵襲アグレソームは、組換え可溶性、 すなわち細胞分散された形態で発現させた標的細胞株の可溶性ホモログタンパク質を募集した。それがZ-スタックイメージング経由受容細胞の制限内に侵襲アグレソームと組換えタンパク質の共局在化を可能にするので、レシピエント細胞ラインの蛍光タンパク質（ 例えば、GFPまたはRFP）の発現が利点です。 大腸菌から発現および精製された細胞侵襲性DISC1のアグレソームおよび多量の断片大腸菌は、DISC1、DIに関連するタンパク質コンフォメーション病の決定的な特徴かもしれませんSC1opathies 15。 トラブルシューティング： ショ糖勾配精製後の低aggresome収率： このプロトコルで導入されたショ糖勾配はeGFP/mRFP-DISC1（フロリダ州）アグレソームでうまく動作します。他のタンパク質からなるアグレソームは変数の次元があるかもしれない従ってスクロース濃度は、他のユーザによって最適化されるべきである。 組換えタンパク質の精製が不十分： 組換えタンパク質の精製プロセスの任意の細菌汚染は、プロトコルの後の手順でラベル付けされます。汚染を避けるために、SDS-PAGEでタンパク質を実行し、組換えタンパク質は、クーマシーブルーで染色することにより、純粋な少なくとも95％であることを確認します。最高の品質と収量を確保するために、プロトコルは、個々の蛋白質のために最適化する必要があります。 低ラベリングEF組換えタンパク質のFICIENCY： 遊離SH基を含む任意の汚染は、タンパク質の効率的な標識を減少させるであろう。したがって、大規模な透析とNi-NTAベースの浄化は必須です。

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬名 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td><td> 注釈 </td></tr><tr><td> RPMI 1640 </td><td>インビトロジェン</td><td> 11875-093 </td><td>培地は、宿主細胞系に依存しています。最適なレシピエント細胞株は、ユーザによって決定されるべきである。 </td></tr><tr><td> DMEM/F-12 </td><td>インビトロジェン</td><td> 11320-033 </td><td>培地は、レシピエント細胞株に依存しています。最適なレシピエント細胞株は、ユーザによって決定されるべきである。 </td></tr><tr><td> PBS </td><td>インビトロジェン</td><td> 14190-250 </td><td></td></tr><tr><td> Metafectene </td><td> Biontex </td><td> T020-1.0 </td><td>他のトランスフェクション試薬は、同様に動作するかもしれないが、我々のプロトコルでテストしていません。 </td></tr><tr><td> Ni-NTAアガロース</td><td>キアゲン</td><td> 30210 &lt;/ TD&gt; <td>実験はQiagenからNi_NTAアガロースを用いて行われた、他のサプライヤーも同様に動作するはずです。 </td></tr><tr><td> DNase Iを</td><td>ロッシュ</td><td> 04716728001 </td><td>アグレソーム精製の過程でRNaseフリーのDNaseの必要は全くありません。 </td></tr><tr><td>スクロース</td><td>シグマアルドリッチ</td><td> S0389 </td><td></td></tr><tr><td>のOpti-MEM </td><td>インビトロジェン</td><td> 31985-062 </td><td>無血清培地は、同様に動作します</td></tr><tr><td>ペニシリン/ストレプトマイシン</td><td>インビトロジェン</td><td> 15140122 </td><td> SH-SY5YとNLFの媒体のためのサプリメント</td></tr><tr><td>非必須アミノ酸（NEAA） </td><td>シグマアルドリッチ</td><td> M7145 </td><td> SH-SY5Y媒体のためのサプリメント</td></tr><tr><td>トリパンブルー0.4パーセント</td><td>シグマアルドリッチ</td><td> T8154 </td><td>有毒な試薬</td></tr><tr><td> DyLight 594マleimide </td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td> 46608 </td><td>安定なチオエーテル結合を形成するシステイン反応性染料を削減しました。また、他の色で利用できる。 </td></tr><tr><td> DAPIで金を延ばす</td><td>インビトロジェン</td><td> P36935 </td><td>この退色液体封入は我々の手で最高の結果をもたらしてくれた。 </td></tr><tr><td>プロテアーゼ阻害剤カクテル</td><td>ロッシュ</td><td> 11873580001 </td><td> 100Xソリューションの500μlのH 2 Oに1テーブルを溶かす。 </td></tr><tr><td>合成α-シヌクレイン</td><td>シグマ</td><td> S7820 </td><td>フォールディングなどのテキストで説明しています。 </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> 特定の試薬 ​​のテーブル。 </td></tr><tr><td> Precellys 24 </td><td>ベルタンテクノロジーズ</td><td> 03119.200.RD000 </td><td>我々は、他の機械的な均質をテストしていませんこれ以外nizers。他の洗剤フリー均質化法は、同様に動作するかもしれないが、このプロトコルのためにテストされていません。 </td></tr><tr><td> 5301コンセントレータ（speedvac） </td><td>エッペンドルフ</td><td> 5301 000.210 </td><td>タンパク質を濃縮する必要がある場合にのみ必要。 </td></tr><tr><td> LSM 510とAxioVisionのApotome2 </td><td>ツァイス</td><td>メーカーカタログを参照してください。 </td><td>両方の顕微鏡は、Z-スタックイメージングを実行する能力を抱く。これは、侵入イベントの固体と深刻な評価をするための前提条件です。 </td></tr><tr><td>細胞培養用プラスチック材料</td><td>ヌンク</td><td> 10cmの皿＃172958、24ウェルプレート＃142475 </td><td>異なるプラスチック材料の使用は、組換えタンパク質またはアグレソームおよびプラスチック表面との相互作用に影響を及ぼす可能性がある。我々は、ここで説明されたもの以外の材料をテストしていません。 </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> 特定の材料および装置のテーブル。 </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td><table border="1"><tbody><tr><td> 数 </td><td> バッファ名 </td><td> コンテンツ </td><td> 注釈 </td></tr><tr><td> 1。 </td><td>細菌増殖培地</td><td>硫酸マグネシウム5mMの16グラム/ lバクトトリプトン、10g / lのバクト酵母エキス、5g / LのNaCl、5mM-アルギニン-HCl、100μg/ mlのcarbencillin、35μg/ mlのクロラムフェニコール</td><td> OD 600まで細菌を培養：0.6から0.8は、1mMのIPTGで発現を誘導する。 </td></tr><tr><td> 2。 </td><td>細菌の懸濁緩衝液</td><td> 50mMのトリス-HCl pH 8.0、5mMのEDTA、2mMのPMSF、1％TX-100、250μg/ mlのリゾチーム、20mMのMgCl 2および400 U/50ミリリットルのDNase I </td><td>オベ1 Lから細菌ペレットをResupend50mlの懸濁緩衝液でrnight文化。 </td></tr><tr><td> 3。 </td><td>タンパク質抽出バッファー</td><td> 50mMのトリスpH8.0、5mMイミダゾール、500mMのNaCl、8M尿素及び10mMのβ-ME </td><td></td></tr><tr><td> 4。 </td><td> Ni-NTAカラムの洗浄​​緩衝液</td><td> 50mMのトリスpH8.0、5mMイミダゾール、500mMのNaCl、8M尿素及び10mMのβ-ME、12 mMイミダゾール</td><td> 12 mMイミダゾールを有する変性抽出バッファーが追加されました。 </td></tr><tr><td> 5。 </td><td> Ni-NTAカラム溶出バッファー</td><td> 50mMトリス、500mMのNaCl、300 mMイミダゾール、8M尿素、1mMのPMSF、5mMのEDTAおよび10mMβ-ME </td><td>溶出緩衝液は、後に透析し、10mMのβ-MEを含んでいます。 </td></tr><tr><td> 6。 </td><td> PBS </td><td>は8g / lのNaCl、0.2g / LのKCl、1.44g / LのNa 2 HPO 4、0.24グラム/ L KH 2 PO 4、pH7.4に調整</td><td></td></tr><tr><td>7。 </td><td>バッファのラベリング</td><td> 5mMのTCEPを含むPBS </td><td></td></tr><tr><td colspan="4"> レシピのテーブル。 </td></tr></tbody></table></td></tr></tbody></table>

generation, purification, and characterization of cell-invasive disc1 protein species

タンパク質凝集は、アルツハイマー病（Aβ、タウ）、パーキンソン病（α-シヌクレイン）、ハンチントン病（ポリグルタミン、チンチン）、および他の神経変性疾患、例えば、変性脳の条件が好きで、慢性の一般的特質として見られている。タンパク質の凝集が妨げproteostasisが原因で発生すると考えられ、発生したと誤って折り畳まれたタンパク質の分解との間の不均衡、 すなわち 。注目すべきは、同じタンパク質が家族性の稀少変異の変異であるこれらの疾患の散発型に集約発見されています。 統合失調症は、多くの場合、永久的で不可逆的な認知障害と一緒に行くの慢性進行性の脳の状態です。候補遺伝子アプローチでは、混乱·イン·統合失調症1（DISC1）、慢性の精神疾患1、2へのリンケージとスコットランドの家族の中でクローニングされた遺伝子が、BRAIに不溶性の凝集体として見つけることができるかどうかを検討nは統合失調症3の散発例。 SMRI CCを使用して、我々はCMDで例約20％で同定が、生化学的分画後の神経変性疾患ではない通常のコントロールや患者がサルコシル不溶性DISC1の免疫反応。 in vitroでのその後の研究は、DISC1の凝集傾向を疾患関連多型S704C 4の影響を受けていたことを明らかにし、in vitro で生成されたDISC1アグレソームはAβ6に示されていたものと同様の5、タウ7-9、α細胞侵襲的であったこと-シヌクレイン10、ポリグルタミン11、SOD1凝集体12。これらの知見は、私たちは、CMDを持つケースの少なくとも一部、集約されたDISC1とのそれらは、タンパク質立体配座の疾患かもしれないことを提案するように求められます。 ここで我々は、哺乳動物細胞におけるDISC1アグレソームを生成する方法を説明し、ショ糖密度勾配上でそれらを浄化し、細胞浸潤のストゥディのためにそれらを使用するES。同様に、我々は我々が独占的に多量のC末端フラグメントDISC1、ラベルを生成し、細胞浸潤の研究のためにそれを浄化する方法を説明します。 DISC1の組換え多量体を用いて、我々は同様に標識合成α-シヌクレインフラグメントの場合と同様の細胞浸潤能を実現しています。我々はまた、定位レシピエント動物の脳に注入する場合は、このフラグメントを in vivo で取り上げられていることを示している。

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Generation, Purification, and Characterization of Cell-invasive DISC1 Protein Species

細胞培養液からの細胞内、細胞質の全長DISC1タンパク質のアグレソームのとで標識し、多量換えDISC1タンパク質断片の生成、精製および細胞浸潤<em&gt; E大腸菌の</em&gt;記載されています。細胞の浸潤は、細胞培養とニューロンの受容細胞のために示されて<em生体内で&gt;</em&gt; stereotactical脳接種後。

細胞侵襲DISC1タンパク質種の生成、精製とキャラクタリゼーション

Protein aggregation is seen as a general hallmark of chronic, degenerative brain conditions like, for example, in the neurodegenerative diseases ...

generation-purification-characterization-cell-invasive-disc1-protein

Research

JoVE Journal

Biology

13.6K ビュー.  Medical School Düsseldorf, Germany. 細胞培養液からの細胞内、細胞質の全長DISC1タンパク質のアグレソームのとで標識し、多量換えDISC1タンパク質断片の生成、精製および細胞浸潤 E大腸菌の記載されています。細胞の浸潤は、細胞培養とニューロンの受容細胞のために示されて stereotactical脳接種後。

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Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents (Methanol, Ethanol or 2-Propanol) and acetic acid are used for fixation, staining and destaining of proteins in a gel after SDS-PAGE. To speed up the procedure, heating the staining solution in the microwave oven for a short time is frequently used. This usually results in evaporation of toxic or hazardous Methanol, Ethanol or 2-Propanol and a strong smell of acetic acid in the lab which should be avoided due to safety considerations. In a protocol originally published in two patent applications by E.M. Wondrak (US2001046709 (A1), US6319720 (B1)), an alternative composition of the staining solution is described in which no organic solvent or acid is used. The CBB is dissolved in bidistilled water (60-80mg of CBB G-250 per liter) and 35 mM HCl is added as the only other compound in the staining solution. The CBB staning of the gel is done after SDS-PAGE and thorough washing of the gel in bidistilled water. By heating the gel during the washing and staining steps, the process can be finished faster and no toxic or hazardous compunds are evaporating. The staining of proteins occurs already within 1 minute after heating the gel in staining solution and is fully developed after 15-30 min with a slightly blue background that is destained completely by prolonged washing of the stained gel in bidistilled water, without affecting the stained protein bands.

A short protocol for protein staining with Coomassie Brilliant Blue (CBB) G-250 in polyacrylamide gels is described without using organic solvents or acetic acid as in the classical staining procedures with CBB.

クーマシー有機溶媒および酢酸のないG - 250でゲル中のタンパク質の染色

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

生物学

Purification of the M. magneticum Strain AMB-1 Magnetosome Associated Protein MamA&Delta;41

Magnetotactic bacteria comprise a diverse group of aquatic microorganisms that are able to orientate themselves along geomagnetic fields. This behavior is believed to aid their search for suitable environments (1). This capability is conferred by the magnetosome, a subcellular organelle that consists of a linear-chain assembly of lipid vesicles each able to biomineralize and enclose a ~50-nm crystal of magnetite or greigite. A principle component of the magnetosome that was shown to be required for the formation of functional vesicles is MamA. MamA is a highly abundant magnetosome-associated protein which is one of the most characterized magnetosome-associated proteins in vivo (2-6). This article focuses on the purification of MamA, which despite being studied in vivo, no clear functional or structural details have been identified for it. Bioinformatics analysis suggested that MamA is a tetra-tricopeptide repeat (TPR) containing protein. TPR is a structural motif found as such or forming part of a bigger fold in a wide range of proteins, it serves as a template for protein-protein interactions and mediates multi-protein complexes (7). TPRs are involved in many crucial tasks in eukaryotic cell organelle processes and many bacterial pathways (8-14). In order to understand MamA, a unique TPR containing protein, highly purified protein is required as a first step. In this article, we present the purification protocol for a stable MamA deletion mutant (MamA&Delta;41) from M. magneticum AMB-1.

Purification of the &lt;em&gt;M. magneticum&lt;/em&gt; Strain AMB-1 Magnetosome Associated Protein MamA&amp;Delta;41

MamA is a unique Magnetosome associated protein which was shown to be involved in magnetosome activation. Here we present the purification protocol of MamA deletion mutant (MamA&Delta;41) from M. magneticum AMB-1.

の精製 M. magneticum株AMB - 1 Magnetosome関連タンパク質MamAΔ41

Magnetotactic bacteria comprise a diverse group of aquatic microorganisms that are able to orientate themselves along geomagnetic fields. This behavior is ...

A Noninvasive Hair Sampling Technique to Obtain High Quality DNA from Elusive Small Mammals

Noninvasive genetic sampling approaches are becoming increasingly important to study wildlife populations. A number of studies have reported using noninvasive sampling techniques to investigate population genetics and demography of wild populations1. This approach has proven to be especially useful when dealing with rare or elusive species2. While a number of these methods have been developed to sample hair, feces and other biological material from carnivores and medium-sized mammals, they have largely remained untested in elusive small mammals. In this video, we present a novel, inexpensive and noninvasive hair snare targeted at an elusive small mammal, the American pika (Ochotona princeps). We describe the general set-up of the hair snare, which consists of strips of packing tape arranged in a web-like fashion and placed along travelling routes in the pikas&#x2019; habitat. We illustrate the efficiency of the snare at collecting a large quantity of hair that can then be collected and brought back to the lab. We then demonstrate the use of the DNA IQ system (Promega) to isolate DNA and showcase the utility of this method to amplify commonly used molecular markers including nuclear microsatellites, amplified fragment length polymorphisms (AFLPs), mitochondrial sequences (800bp) as well as a molecular sexing marker. Overall, we demonstrate the utility of this novel noninvasive hair snare as a sampling technique for wildlife population biologists. We anticipate that this approach will be applicable to a variety of small mammals, opening up areas of investigation within natural populations, while minimizing impact to study organisms.

We present a noninvasive sampling approach to efficiently collect hair samples from elusive small mammals, as shown for the American pika. We demonstrate the utility of this method by extracting DNA from sampled hair and amplifying several types of molecular markers commonly used in studies of wildlife ecology and conservation.

見つけにくい小型哺乳類から高品質のDNAを得るために非侵襲ヘアサンプリング法

Noninvasive genetic sampling approaches are becoming increasingly important to study wildlife populations. A number of studies have reported using ...

Purification of Hsp104, a Protein Disaggregase

Hsp104 is a hexameric AAA+ protein1 from yeast, which couples ATP hydrolysis to protein disaggregation2-10 (Fig. 1). This activity imparts two key selective advantages. First, renaturation of disordered aggregates by Hsp104 empowers yeast survival after various protein-misfolding stresses, including heat shock3,5,11,12. Second, remodeling of cross-beta amyloid fibrils by Hsp104 enables yeast to exploit myriad prions (infectious amyloids) as a reservoir of beneficial and heritable phenotypic variation13-22. Remarkably, Hsp104 directly remodels preamyloid oligomers and amyloid fibrils, including those comprised of the yeast prion proteins Sup35 and Ure223-30. This amyloid-remodeling functionality is a specialized facet of yeast Hsp104. The E. coli orthologue, ClpB, fails to remodel preamyloid oligomers or amyloid fibrils26,31,32.
Hsp104 orthologues are found in all kingdoms of life except, perplexingly, animals. Indeed, whether animal cells possess any enzymatic system that couples protein disaggregation to renaturation (rather than degradation) remains unknown33-35. Thus, we and others have proposed that Hsp104 might be developed as a therapeutic agent for various neurodegenerative diseases connected with the misfolding of specific proteins into toxic preamyloid oligomers and amyloid fibrils4,7,23,36-38. There are no treatments that directly target the aggregated species associated with these diseases. Yet, Hsp104 dissolves toxic oligomers and amyloid fibrils composed of alpha-synuclein, which are connected with Parkinson's Disease23 as well as amyloid forms of PrP39. Importantly, Hsp104 reduces protein aggregation and ameliorates neurodegeneration in rodent models of Parkinson's Disease23 and Huntington's disease38. Ideally, to optimize therapy and minimize side effects, Hsp104 would be engineered and potentiated to selectively remodel specific aggregates central to the disease in question4,7. However, the limited structural and mechanistic understanding of how Hsp104 disaggregates such a diverse repertoire of aggregated structures and unrelated proteins frustrates these endeavors30,40-42.
To understand the structure and mechanism of Hsp104, it is essential to study the pure protein and reconstitute its disaggregase activity with minimal components. Hsp104 is a 102kDa protein with a pI of ~5.3, which hexamerizes in the presence of ADP or ATP, or at high protein concentrations in the absence of nucleotide43-46. Here, we describe an optimized protocol for the purification of highly active, stable Hsp104 from E. coli. The use of E. coli allows simplified large-scale production and our method can be performed quickly and reliably for numerous Hsp104 variants. Our protocol increases Hsp104 purity and simplifies His6-tag removal compared to a previous purification method from E. coli47. Moreover, our protocol is more facile and convenient than two more recent protocols26,48.

Here, we describe a protocol for the purification of highly active Hsp104, a hexameric AAA+ protein from yeast, which couples ATP hydrolysis to protein disaggregation. This scheme exploits a His6-tagged construct for affinity purification from E. coli followed by anion-exchange chromatography, His6-tag removal with TEV protease, and size-exclusion chromatography.

Hsp104の精製、タンパク質Disaggregase

Hsp104 is a hexameric AAA+ protein1 from yeast, which couples ATP hydrolysis to protein disaggregation2-10 (Fig. 1). This activity imparts two key ...

Identification of Protein Interacting Partners Using Tandem Affinity Purification

A critical and often limiting step in understanding the function of host and viral proteins is the identification of interacting cellular or viral protein partners. There are many approaches that allow the identification of interacting partners, including the yeast two hybrid system, as well as pull down assays using recombinant proteins and immunoprecipitation of endogenous proteins followed by mass spectrometry identification1. Recent studies have highlighted the utility of double-affinity tag mediated purification, coupled with two specific elution steps in the identification of interacting proteins. This approach, termed Tandem Affinity Purification (TAP), was initially used in yeast2,3 but more recently has been adapted to use in mammalian cells4-8.
As proof-of-concept we have established a tandem affinity purification (TAP) method using the well-characterized eukaryotic translation initiation factor eIF4E9,10.The cellular translation factor eIF4E is a critical component of the cellular eIF4F complex involved in cap-dependent translation initiation10. The TAP tag used in the current study is composed of two Protein G units and a streptavidin binding peptide separated by a Tobacco Etch Virus (TEV) protease cleavage sequence. The TAP tag used in the current study is composed of two Protein G units and a streptavidin binding peptide separated by a Tobacco Etch Virus (TEV) protease cleavage sequence8. To forgo the need for the generation of clonal cell lines, we developed a rapid system that relies on the expression of the TAP-tagged bait protein from an episomally maintained plasmid based on pMEP4 (Invitrogen). Expression of tagged murine eIF4E from this plasmid was controlled using the cadmium chloride inducible metallothionein promoter.
Lysis of the expressing cells and subsequent affinity purification via binding to rabbit IgG agarose, TEV protease cleavage, binding to streptavidin linked agarose and subsequent biotin elution identified numerous proteins apparently specific to the eIF4E pull-down (when compared to control cell lines expressing the TAP tag alone). The identities of the proteins were obtained by excision of the bands from 1D SDS-PAGE and subsequent tandem mass spectrometry. The identified components included the known eIF4E binding proteins eIF4G and 4EBP-1. In addition, other components of the eIF4F complex, of which eIF4E is a component were identified, namely eIF4A and Poly-A binding protein. The ability to identify not only known direct binding partners as well as secondary interacting proteins, further highlights the utility of this approach in the characterization of proteins of unknown function.

Tandem affinity purification is a robust approach for the identification of protein binding partners. As proof of concept, this methodology was applied to the well-characterized translation initiation factor eIF4E to co-precipitate the host cell factors involved in translation initiation. This method is easily adapted to any cellular or viral protein.

タンデムアフィニティー精製を用いたタンパク質相互作用するパートナーの識別

A critical and often limiting step in understanding the function of host and viral proteins is the identification of interacting cellular or viral protein ...

Identification and Characterization of Protein Glycosylation using Specific Endo- and Exoglycosidases

Glycosylation, the addition of covalently linked sugars, is a major post-translational modification of proteins that can significantly affect processes such as cell adhesion, molecular trafficking, clearance, and signal transduction1-4. In eukaryotes, the most common glycosylation modifications in the secretory pathway are additions at consensus asparagine residues (N-linked); or at serine or threonine residues (O-linked) (Figure 1). Initiation of N-glycan synthesis is highly conserved in eukaryotes, while the end products can vary greatly among different species, tissues, or proteins. Some glycans remain unmodified ("high mannose N-glycans") or are further processed in the Golgi ("complex N-glycans"). Greater diversity is found for O-glycans, which start with a common N-Acetylgalactosamine (GalNAc) residue in animal cells but differ in lower organisms1.
The detailed analysis of the glycosylation of proteins is a field unto itself and requires extensive resources and expertise to execute properly. However a variety of available enzymes that remove sugars (glycosidases) makes possible to have a general idea of the glycosylation status of a protein in a standard laboratory setting. Here we illustrate the use of glycosidases for the analysis of a model glycoprotein: recombinant human chorionic gonadotropin beta (hCG&beta;), which carries two N-glycans and four O-glycans 5. The technique requires only simple instrumentation and typical consumables, and it can be readily adapted to the analysis of multiple glycoprotein samples.
Several enzymes can be used in parallel to study a glycoprotein. PNGase F is able to remove almost all types of N-linked glycans6,7. For O-glycans, there is no available enzyme that can cleave an intact oligosaccharide from the protein backbone. Instead, O-glycans are trimmed by exoglycosidases to a short core, which is then easily removed by O-Glycosidase. The Protein Deglycosylation Mix contains PNGase F, O-Glycosidase, Neuraminidase (sialidase), &beta;1-4 Galactosidase, and &beta;-N-Acetylglucosaminidase. It is used to simultaneously remove N-glycans and some O-glycans8 . Finally, the Deglycosylation Mix was supplemented with a mixture of other exoglycosidases (&alpha;-N-Acetylgalactosaminidase, &alpha;1-2 Fucosidase, &alpha;1-3,6 Galactosidase, and &beta;1-3 Galactosidase ), which help remove otherwise resistant monosaccharides that could be present in certain O-glycans.
SDS-PAGE/Coomasie blue is used to visualize differences in protein migration before and after glycosidase treatment. In addition, a sugar-specific staining method, ProQ Emerald-300, shows diminished signal as glycans are successively removed. This protocol is designed for the analysis of small amounts of glycoprotein (0.5 to 2 &mu;g), although enzymatic deglycosylation can be scaled up to accommodate larger quantities of protein as needed.

Using specific glycosidases to remove sugars from glycoproteins followed by SDS-PAGE is a valuable method to detect glycan modifications on protein samples and is a good choice for initial glycobiology studies. Changes following deglycosylation can be detected as shifts in gel mobility or by staining with glycan sensitive reagents.

特定のエンド - およびエキソグリコシダーゼを用いたタンパク質のグリコシル化の同定と特性評価

Glycosylation, the addition of covalently linked sugars, is a major post-translational modification of proteins that can significantly affect processes ...

Expression and Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein in Saccharomyces cerevisiae

The cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) is a chloride channel, that when mutated, can give rise to cystic fibrosis in humans.There is therefore considerable interest in this protein, but efforts to study its structure and activity have been hampered by the difficulty of expressing and purifying sufficient amounts of the protein1-3. Like many 'difficult' eukaryotic membrane proteins, expression in a fast-growing organism is desirable, but challenging, and in the yeast S. cerevisiae, so far low amounts were obtained and rapid degradation of the recombinant protein was observed 4-9. Proteins involved in the processing of recombinant CFTR in yeast have been described6-9 .In this report we describe a methodology for expression of CFTR in yeast and its purification in significant amounts. The protocol describes how the earlier proteolysis problems can be overcome and how expression levels of CFTR can be greatly improved by modifying the cell growth conditions and by controlling the induction conditions, in particular the time period prior to cell harvesting. The reagants associated with this protocol (murine CFTR-expressing yeast cells or yeast plasmids) will be distributed via the US Cystic Fibrosis Foundation, which has sponsored the research. An article describing the design and synthesis of the CFTR construct employed in this report will be published separately (Urbatsch, I.; Thibodeau, P. et al., unpublished). In this article we will explain our method beginning with the transformation of the yeast cells with the CFTR construct - containing yeast plasmid (Fig. 1). The construct has a green fluorescent protein (GFP) sequence fused to CFTR at its C-terminus and follows the system developed by Drew et al. (2008)10. The GFP allows the expression and purification of CFTR to be followed relatively easily. The JoVE visualized protocol finishes after the preparation of microsomes from the yeast cells, although we include some suggestions for purification of the protein from the microsomes. Readers may wish to add their own modifications to the microsome purification procedure, dependent on the final experiments to be carried out with the protein and the local equipment available to them. The yeast-expressed CFTR protein can be partially purified using metal ion affinity chromatography, using an intrinsic polyhistidine purification tag. Subsequent size-exclusion chromatography yields a protein that appears to be &gt;90% pure, as judged by SDS-PAGE and Coomassie-staining of the gel.

Expression and Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein in Saccharomyces cerevisiae

Attempts to express the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) in Saccharomyces cerevisiae have, until now, yielded relatively low amounts of protein. This protocol and the associated reagents distributed via the Cystic Fibrosis Foundation should allow the preparation of milligram amounts of this 'difficult' eukaryotic membrane protein.

で嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子タンパク質の発現および精製サッカロマイセスセレビシエ

The  cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) is a chloride  channel, that when mutated, can give rise to cystic fibrosis in  ...

Protein Purification-free Method of Binding Affinity Determination by Microscale Thermophoresis

Quantitative characterization of protein interactions is essential in practically any field of life sciences, particularly drug discovery. Most of currently available methods of KD determination require access to purified protein of interest, generation of which can be time-consuming and expensive. We have developed a protocol that allows for determination of binding affinity by microscale thermophoresis (MST) without purification of the target protein from cell lysates. The method involves overexpression of the GFP-fused protein and cell lysis in non-denaturing conditions. Application of the method to STAT3-GFP transiently expressed in HEK293 cells allowed to determine for the first time the affinity of the well-studied transcription factor to oligonucleotides with different sequences. The protocol is straightforward and can have a variety of application for studying interactions of proteins with small molecules, peptides, DNA, RNA, and proteins.

Microscale thermophoresis (MST) can be widely used for determination of binding affinity without purification of the target protein from cell lysates. The protocol involves overexpression of the GFP-fused protein, cell lysis in non-denaturing conditions, and detection of MST signal in the presence of varying concentrations of the ligand.

マイクロスケール熱泳動によって結合親和性の決定のタンパク質精製·フリー法

Quantitative characterization of protein  interactions is essential in practically any field of life sciences,  particularly drug discovery. Most of ...

Detecting, Visualizing and Quantitating the Generation of Reactive Oxygen Species in an Amoeba Model System

Reactive oxygen species (ROS) comprise a range of reactive and short-lived, oxygen-containing molecules, which are dynamically interconverted or eliminated either catalytically or spontaneously. Due to the short life spans of most ROS and the diversity of their sources and subcellular localizations, a complete picture can be obtained only by careful measurements using a combination of protocols. Here, we present a set of three different protocols using OxyBurst Green (OBG)-coated beads, or dihydroethidium (DHE) and Amplex UltraRed (AUR), to monitor qualitatively and quantitatively various ROS in professional phagocytes such as Dictyostelium. We optimised the beads coating procedures and used OBG-coated beads and live microscopy to dynamically visualize intraphagosomal ROS generation at the single cell level. We identified lipopolysaccharide (LPS) from E. coli as a potent stimulator for ROS generation in Dictyostelium. In addition, we developed real time, medium-throughput assays using DHE and AUR to quantitatively measure intracellular superoxide and extracellular H2O2 production, respectively.

We adapted a set of protocols for the measurement of reactive oxygen species (ROS) that can be applied in various amoeba and mammalian cellular models for qualitative and quantitative studies.

、検出し可視化し、アメーバモデル系で活性酸素種の生成を定量

Reactive oxygen species (ROS) comprise a range of reactive and short-lived, oxygen-containing molecules, which are dynamically interconverted or ...

Identifying Protein-protein Interaction in Drosophila Adult Heads by Tandem Affinity Purification (TAP)

Genetic screens conducted using Drosophila melanogaster (fruit fly) have made numerous milestone discoveries in the advance of biological sciences. However, the use of biochemical screens aimed at extending the knowledge gained from genetic analysis was explored only recently. Here we describe a method to purify the protein complex that associates with any protein of interest from adult fly heads. This method takes advantage of the Drosophila GAL4/UAS system to express a bait protein fused with a Tandem Affinity Purification (TAP) tag in fly neurons in vivo, and then implements two rounds of purification using a TAP procedure similar to the one originally established in yeast1 to purify the interacting protein complex. At the end of this procedure, a mixture of multiple protein complexes is obtained whose molecular identities can be determined by mass spectrometry. Validation of the candidate proteins will benefit from the resource and ease of performing loss-of-function studies in flies. Similar approaches can be applied to other fly tissues. We believe that the combination of genetic manipulations and this proteomic approach in the fly model system holds tremendous potential for tackling fundamental problems in the field of neurobiology and beyond.

Identifying Protein-protein Interaction in Drosophila Adult Heads by Tandem Affinity Purification TAP

Drosophila is famous for its powerful genetic manipulation, but not for its suitability of in-depth biochemical analysis. Here we present a TAP-based procedure to identify interacting partners of any protein of interest from the fly brain. This procedure can potentially lead to new avenues of research.

中のタンパク質 - タンパク質相互作用を特定する<em&gt;ショウジョウバエ</emタンデムアフィニティー精製（TAP）による&gt;アダルトヘッド

Genetic screens conducted using Drosophila melanogaster (fruit fly) have made numerous milestone discoveries in the advance of biological sciences. ...