からとフェデラル·ファンド; NCIとCalidrisピュー間共同研究契約、; OTに米国癌協会助成IRG 97-152-17この作品は、部分的にNIH、国立がん研究所、がん研究センターの学内研究プログラムによってサポートされていました契約HHSN26120080001E下の国立がん研究所、NIH、。

1。細胞溶解物の準備このプロトコルは、任意のGFP融合タンパク質を発現する接着細胞を対象としています。必要とされる細胞数は、低タンパク質発現のレベルに応じて、最大20×10 6細胞〜6 10とで変えることができる。例えば、HEK細胞を過剰発現するGFP-STAT3の溶解物を、1mlの溶解緩衝液で70％コンフルエントに近い10 T75フラスコ中で培養した細胞を処理することによって調製した。しかし、この溶解物MST実験に蛍光の最適なレベルを提供するために150倍に希釈しなければならなかった。細胞溶解プロトコルは、調査中の性質と蛋白質の細胞内局在化に強く依存する。洗剤を使用しているため、タンパク質の不安定性の望ましくない場合は、超音波処理は、以下に説明するように、最良の選択かもしれません。別の添加剤は、タンパク質の修飾反応を防ぐために、溶解緩衝液に添加することができる。EDTAは、リン酸化を防ぎ、バナジン酸ナトリウムので、チロシンプロテインホスファターゼの阻害diumフッ化セリン/スレオニンホスファターゼの阻害剤である。 <ol><li>溶解バッファーを準備します。以下の組成がうまくための簡単​​に抽出する細胞質タンパク質：25mMトリス塩酸、pHは8.0、および2mM AEBSF、0.3μMアプロチニン、130μMのベスタチン、から構成される（シグマアルドリッチP2714、100倍希釈したプロテアーゼ阻害剤カクテル1mMのEDTA、14μME-64、1μMロイペプチン）。また、少ない可溶性タンパク質、1つは、プロテアーゼ阻害剤カクテルと非変性洗剤と商業RIPA緩衝液を使用することができます。氷の上のバッファに保管してください。 </li><li>氷冷PBSでT75フラスコ当たりバッファー10mlのを使って簡単に細胞を洗浄する。 5分間氷上で細胞を維持する、または細胞がフラスコから取り外し始めるまで。必要に応じてデタッチするには、セルスクレーパーで細胞をこすり取る。 </li><li> 10ミリリットルの氷冷PBSと予冷14ミリリットルの丸底遠心管への転送中に再懸濁した細胞。 </li><li> 4で400-600×gで遠心分離により細胞をペレット化℃で5分間。私はこの時点でいくつかのフラスコから細胞を組み合わせるfは必要としていました。 </li><li>あらかじめ冷やした1.5​​ミリリットルエッペンドルフチュー​​ブにサスペンションを転送、氷冷溶解バッファー200μlのPBS清とペレットを再懸濁しを削除します。 </li><li>局所的な過熱を最小限に抑えるために氷の上に細胞を保管してください。あらかじめ冷やした先端2〜3ミリメートルを使用して30％の振幅で超音波処理の3倍の10秒パルスで細胞を溶解。泡立ち最小限に抑えるために表面下先端を保管してください。代わりに30分間氷上で洗剤含有バッファとインキュベートを使用している場合、この手順を省略します。 </li><li>生理的塩濃度（100mMのNaCl）5 MのNaClを使用して必要に応じて格納するための溶解液ソリューションを修正してください。 </li><li> 10分間4℃で約26,000×gで遠心分離によって溶解物を収集します。 </li><li> 1滴（通常プレ希釈ライセート300μlの周り）に必要な溶解液の最適な溶解液の希釈（以下のセクション3に記載）と量を決定します。 </li><li>調査中のタンパク質（-80°C、ほとんどの場合）に適した温度でアリコートライセートや店舗。 </li> &lt;/ OL&gt; 2。 MSTバッファの選択と準備<ol><li>タンパク質 - リガンド相互作用は、緩衝液条件に依存するので、MST緩衝液組成物は、特定のシステムの特性に基づいて選択される。それは、少なくとも2つの異なるバッファをテストすることが一般に有利である。 </li><li> 2 5倍MSTバッファを準備します。とトリス塩酸（250mMのトリス塩酸、pH7.4の; 750のNaCl、50 HEPES（; 25のMgCl 2;; 500mMのNaClを0.25％NP-40 250のHEPES、pH7.4）に：我々は、これらの2つの組成物との良好な経験を持っていたのMgCl 2、0.05％のTween-20）。 BSAの添加（最終結合混合物中の5％）、プラスチックチューブやガラスキャピラリーへのタンパク質の付着を防ぐことができます。のNaN 3（0.5ミリモル）も、微生物の増殖を防ぐために含めることができる。 </li></ol> 3。最適な溶解物の希釈の決定<ol><li> MST機器に波長λ= 470nmのLEDで励起源を選択します。 </li><li> CEと毛細血管を読み込む2に希釈し、MSTバッファーで10倍抽出う。 </li><li> MST機器の制御ソフトウェアの &quot;毛細血管を検索&quot;操作を実行します。希釈溶解物中の最適な蛍光範囲は400〜1,500蛍光単位からのものである。 </li></ol> 4。最適なリガンド濃度範囲の決定<ol><li>リガンドの最高濃度は、予想される解離定数よりも少なくとも20倍以上である必要があります。 </li><li>最低のリガンド濃度は、蛍光タンパク質のモル濃度よりも低くなければなりません。 </li></ol>リガンド濃度範囲推定のためNanoTemperテクノロジーズ集中ファインダーツールを参照してください。 5。細胞可溶化物とリガンド希釈の調製<ol><li>氷の上の0.5ml LoBind遠心管の必要な番号（通常は10-16）と管ラックを置きます。各チューブの底にMSTバッファのピペットで25μlの。最初のタブにリガンドストック溶液25μlをE（＃1、リガンド最高濃度）とチューブの残りの部分を使用したリガンドの連続2倍希釈を行う。氷の上のリガンドサンプルでラックに保管してください。 </li><li>雪解けセルは氷の上でゆっくりと溶解物。 </li><li>結合反応における蛍光標的タンパク質の最適なレベルを提供するために、MST緩衝液で細胞溶解物を希釈する。最終タンパク質濃度が予想されるK D以下に近くなければならない。これは、最終溶液中の蛍光カウント必要な数が得られるように調整されるべきである。溶解物中のGFP-STAT3の濃度を決定するために、器具は、フルオレセインの助けを借りて較正した。溶解物中のGFPのモル濃度は、フルオレセインおよびEGFPの量子収率は、それぞれ0.85および0.61の比を用いて決定した。15 </li></ol> 6。マイクロスケール熱泳動バインディング研究<ol><li> MST機器でλ= 470nmでのLED励起源を選択します。 </li><li> Tにおける場所の0.5ml LoBindチューブリガンド連続希釈サンプルとチューブの向かいUBEラック。慎重に各チューブの底に細胞溶解液15μLを加える。サンプルの損失を回避するために、管壁に触れないようにしてください。 </li><li>細胞溶解物に対応するチューブに最高濃度（＃1）＃1とリガンドのサンプル15μLを加える。よく混ぜ、ピペットチップを変更してください。全く配位子を含むべきではありません最後のを除いて、チューブの残りの部分と、この手順を繰り返します。 </li><li>最後のチューブにMSTバッファー15μLを加え、よく混ぜる。 </li><li>中心に向かって解決策を移動し、位置＃1（トレイ開口部に最も近い位置）にキャピラリートレイにキャピラリーを配置し、それを傾け、チューブ＃1から結合混合物を用いて約2/3最初のキャピラリーを埋める。残り毛細血管でこの手順を繰り返します。キャピラリー両端はもはや実験のためのワックスで差し込むことができます。 </li><li> MST機器内部にトレイを置き、機器のドアを閉める。 </li><li> &quot;毛細血管を検索&quot;を実行コマンドでは、楽器が毛細血管の正確な位置を見つけて、サンプルの蛍光を測定できるようにする。 </li><li>蛍光信号強度に基づいて、400-1,500単位間隔にそれを持って来るために電源LEDを（10から100パーセントから）を調整します。 </li><li>熱泳動実験を実行するための &quot;スタート&quot;ボタンをクリックします。複数のIRレーザーパワーは、特定のシステムのための最適な温度勾配を見つけるために実験のために選択することができる。測定の再現性を確保するための毛細血管の同じセットの実行2-3からデータを収集する。それは16毛細血管の1セットを実行するために10-12分かかります。 </li></ol> 7。マイクロスケール熱泳動データ解析<ol><li>解析ソフトウェアを開きます。 </li><li>プロジェクトフォルダを読み込みます。登場情報ランビューアで選択し、特定のIRレーザパワー熱泳動曲線で収集。このようなIRレーザーパワーなど、さまざまな条件の下で収集されたすべての熱泳動トレースを開くためのオプションがあり、pは、LEDとower、温度、濃度など 。一度、それらをオンとオフを切り替えることにより、解析のために、任意の曲線を選択すると、（実験の名前をクリックします）。 </li><li>評価点グラフ]ウィンドウで、[T-ジャンプと熱泳動または熱泳動を選択します。青と​​赤の線が正しく配置されていることを確認。標準偏差と平均点を取得するには、選択し、 &quot;平均を使用する&quot;、または別の実行のために、 &quot;区別が実行されます&quot;。 </li><li>解離定数近似をプロットするには、標識分子の濃度値（フィットウィンドウメニューの &quot;濃度&quot;正方形を確認）を入力して修正し、 &quot;平均を使用する&quot;を選択し、曲線にフィット。その標準偏差とのK D値は、独立した情報のポップアップウィンドウに表示されます。ヒルメソッドを使用してフィット感をプロットするには、 &quot;平均&quot;ヒル方法を選択し、カーブにフィット。その標準偏差との親和性EC 50値は、この場合、示されている。時飽和K Dまたはヒル&quot;枠&quot;の特徴を利用することもできる束縛状態に達していない。 </li><li>テキストフ​​ァイル内の平均近似データを保存して、Excelに転送します。 </li><li>非標識（滴定）分子の濃度の関数として（下記化学式参照）を結合したプロットF ノルム （正規化された蛍光）、ΔF ノルム （正規化蛍光の差が異なる実験が比較される場合）、または画分。 </li></ol>サーム（C）は、結合していないが、バインドされていない状態のために熱泳動濃度Cを測定し熱泳動です分数バウンド（複合体における分子の割合）=（サーム（C）非結合）/（バウンド非結合）、（分子があるとき完全に束縛状態に対する熱泳動ではない複雑な）、およびバインドされています。

<ol>
	<li>Lea, W. A., Simeonov, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+polarization+assays+in+small+molecule+screening.">Fluorescence polarization assays in small molecule screening.</a> Expert. Opin. Drug Discov. 6, 17-32 (2011).</li><li>Willander, M., Al-Hilli, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+biomolecules+using+surface+plasmons.">Analysis of biomolecules using surface plasmons.</a> Methods Mol. Biol. 544, 201-229 (2009).</li><li>Hulme, E. C., Trevethick, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ligand+binding+assays+at+equilibrium:+validation+and+interpretation.">Ligand binding assays at equilibrium: validation and interpretation.</a> Br. J. Pharmacol. 161, 1219-1237 (2010).</li><li>Ghai, R., Falconer, R. J., Collins, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Applications+of+isothermal+titration+calorimetry+in+pure+and+applied+research--survey+of+the+literature+from+2010.">Applications of isothermal titration calorimetry in pure and applied research--survey of the literature from 2010.</a> J. Mol. Recognit. 25, 32-52 (2012).</li><li>Vuignier, K., Schappler, J., Veuthey, J. L., Carrupt, P. A., Martel, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drug-protein+binding:+a+critical+review+of+analytical+tools.">Drug-protein binding: a critical review of analytical tools.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. , 398-3953 (2010).</li><li>Lebowitz, J., Lewis, M. 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R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Roles+of+unphosphorylated+STATs+in+signaling.">Roles of unphosphorylated STATs in signaling.</a> Cell Res. 18, 443-451 (2008).</li><li>Timofeeva, O. A., Chasovskikh, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+unphosphorylated+STAT3+transcription+factor+binding+to+DNA.">Mechanisms of unphosphorylated STAT3 transcription factor binding to DNA.</a> J. Biol. Chem. 287, 14192-14200 (2012).</li><li>Timofeeva, O. A., Tarasova, N. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=STAT3+suppresses+transcription+of+proapoptotic+genes+in+cancer+cells+with+the+involvement+of+its+N-terminal+domain.">STAT3 suppresses transcription of proapoptotic genes in cancer cells with the involvement of its N-terminal domain.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. , (2013).</li><li>Patterson, G., Day, R. N., Piston, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+protein+spectra.">Fluorescent protein spectra.</a> J. Cell Sci. 114, 837-838 (2001).</li></ol>

著者は、彼らが競合する経済的利益を持っていないことを宣言します。本書の内容は、必ずしも、保健社会福祉省の見解あるいは政策を反映していない、また、商号、商用製品、または組織の言及は、米国政府による承認を意味するものではありません。

タンパク質の発現および精製は、しかし、ほとんどの現在使用されている方法により相互作用&#39;K Dを決定するために必要な労力を要しかつ高価な工程である。 MSTの適用が大幅に相互作用の定量的な特性評価を簡素化し、加速するため、タンパク質精製を避けることができます。このような膜タンパク質及び転写因子などの困難な発現及び精製タンパク質の場合に特に顕著な利点を?...

分子間相互作用の親和性の定量的特性評価は、生物医学研究の多くの分野において重要である。結合定数（K D）解離だけでなく、創薬に不可欠であるだけでなく、任意の生物学的システム内の任意のバイナリの相互作用の特性評価に重要なパラメータである。このような免疫沈降および酵母ツーハイブリッドスクリーニングなどのタンパク質-タンパク質相互作用の検出のために使用生化学的方法では、親和性は、この特定の複合体が、生体内で与えられた条件の下に存在するかどうかを定義しながら、それらの相互作用は、どのように締まっている私たちを上に通知していない。創薬プロセスにおいては、結合アッセイの開発が必要と頻繁に最も時間のかかる工程の一つである。 K D判定の最も一般的に使用される方法は、蛍光偏光、1表面プラズモン共鳴（SPR）技術、2放射性リガンド結合、3等温滴定熱量測定、4 equilibriを含むウム透析（ED）、5限外濾過（UF）、5及び超遠心分離（UC）6は、それらのすべては、標的タンパク質の精製かなりの量を必要とする。マイクロスケール熱泳動（MST）は、微視的温度勾配​​中の分子の指示動きを検出急速に発展方式です。温度勾配に沿った移動の相対的な変化で生体分子結果の水和殻のいずれかに変化する。7 MSTが結合親和性を決定するために使用され、蛍光標識したタンパク質または標的タンパク質の蛍光リガンドに結合するリガンドの研究に適用されている。8、 9 MSTは表面への固定化の必要性（固定フリー技術）せずに直接溶液中での相互作用の測定が可能。変化の大きさが大きく、システムによって異なるが、実質的に、任意の結合は、MST信号の変化を伴っている。 MSTによる分子の動きの検出のために、彼らが蛍光を発するしなければならないNT。このメソッドの主な制限は、利点に変換することができます。タンパク質は、任意のシステムにおけるGFP融合体として発現される場合、それは唯一の蛍光分子となり、従って、細胞溶解物又は無細胞発現系から単離することなく研究することができる。最小限のアーティファクトとの結合条件を可能に細胞溶解物の生成は、大きな課題です。ここでは、多くの可溶性および膜タンパク質を使用することができ、細胞溶解物の準備とMST実験のプロトコルを記述します。 STATタンパク質は、細胞外シグナルに応答してチロシンリン酸化により活性化細胞転写因子の潜在していると免疫、造血、炎症、および開発を含む多くの生物学的過程に関与している。哺乳類で10、STATファミリーは、STAT 1、2、3、4から成り、5A、5B、及び図6。すべてのアクティブ統計をIFN-γ活性化するシーケンスので、GASモチーフと呼ばれる、同じDNA配列に結合することが知られている。しかし、transcriSTATは異なるのptional効果は非常に異なっています。関与にもかかわらず、11種類のDNA配列と17,000出版、STAT相互作用のK Dにわたってもたらす多くの病理学的プロセスと広範な研究で決定されていない。ガスのみモチーフの変種に異なるSTATはの相対親和性が特徴づけられている。タンパク質の発現と精製11難しさは、STATS &#39;DNA結合選択性の特性評価における主要な障害である。研究の大半はTyrのリン酸化転写因子への代名詞となった&quot;活性化&quot; STATは、転写の調節に非リン酸化STATは（U-STATS）の役割の役割に焦点を当ててきたが、急速に浮上している12は、しかし、これらのメカニズムは十分に理解され、それがU-STATSは、実際に他の転写因子との相互作用を介してDNAまたは行為にバインドするかどうかは不明であったされています。我々は最近、U-STAT3がDNA sequenに結合することができることが示されているさらに高い親和性を有するガスモチーフ異なるCES 13は、発見は、この重要なタンパク質の生物学的機能の理解のために重要な意味を持っています。我々はガスにし、オリゴヌクレオチドS +100（ 図4）豊富なAT STAT3の相対的な親和性を決定するために、マイクロ熱泳動を適用している。陰性対照として用いた関連転写因子、GFP-STAT1とほぼ同一のプロトコルが異なるSTAT3リガンド、リポペプチド阻害剤の結合のためのK Dを決定するために使用されている。14結合はこのような相互作用の選択性を確認した検出することができなかった。 14

<table border="1">
	<tbody>
 <tr>
 <td>Name of the Reagent/material</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalogue Number</td>
 <td>Comments </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>RIPA buffer</td>
 <td>Millipore</td>
 <td>20-188</td>
 <td>Other manufacturer's buffers work as well</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Protease inhibitors cocktail</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>P2714</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Monolith NT.115</td>
 <td>NanoTemper Technologies GmbH</td>
 <td>G008</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Monolith NT.115 Capillary Tray</td>
 <td>NanoTemper Technologies GmbH</td>
 <td>T001</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Monolith NT.115 Standard Treated Capillaries</td>
 <td>NanoTemper Technologies GmbH</td>
 <td>K002</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>NT Control software</td>
 <td>NanoTemper Technologies GmbH</td>
 <td>2.0.2.29</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>NT Analysis software</td>
 <td>NanoTemper Technologies GmbH</td>
 <td>1.4.27</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Table-top refrigerated centrifuge</td>
 <td>Eppendorf </td>
 <td>5417R</td>
 <td>Other microtube refrigerated centrifuges</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Protein LoBind Tube 0.5 ml</td>
 <td>Eppendorf </td>
 <td>22431064</td>
 <td></td>
 </tr>
	 </tbody>
 </table>

protein purification-free method of binding affinity determination by microscale thermophoresis

タンパク質相互作用の定量的特性評価、特に生命科学、創薬の実質的にすべての分野で必要不可欠である。 K D判定の現在利用可能な方法のほとんどは、時間がかかり、高価である生成うち目的のタンパク質を精製へのアクセスを必要とする。我々は、細胞溶解物から標的タンパク質の精製をせずにマイクロ熱泳動（MST）による結合親和性の決定を可能にするプロトコルを開発した。この方法は、非変性条件下でのGFP融合タンパク質および細胞溶解の過剰発現を伴う。 STAT3-GFPへの法の適用は、一過性に初めて異なる配列を有するオリゴヌクレオチドによく研究転写因子の親和性を決定するために許可されたHEK293細胞で発現。プロトコルは、簡単であり、小分子、ペプチド、DNA、RNAとタンパク質の相互作用を研究するための、アプリケーションの様々な構造を有することができ、及びproteins。

オリゴヌクレオチドに結合非リン酸化STAT3タンパク質の親和性を測定する。 STAT3-GFPを発現するHEK293細胞を、DNA結合アッセイのために蛍光標識されたSTAT3の供給源として使用した。細胞溶解物をRIPA緩衝液（20×10 6細胞/ ml）を用いて調製した。結合研究のために、溶解物を結合反応（約20nM）の蛍光タンパク質の最適なレベルを提供するようにMST-DNA結合緩?...

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Protein Purification-free Method of Binding Affinity Determination by Microscale Thermophoresis

マイクロ熱泳動（MST）が広く細胞溶解物から標的タンパク質を精製することなく結合親和性の決定のために用いることができる。プロトコルは、GFP融合タンパク質、非変性条件下での細胞溶解、及びリガンドの濃度を変化させるの存在下で、MST信号の検出の過剰発現を伴う。

マイクロスケール熱泳動によって結合親和性の決定のタンパク質精製·フリー法

Quantitative characterization of protein  interactions is essential in practically any field of life sciences,  particularly drug discovery. Most of ...

protein-purification-free-method-binding-affinity-determination

Research

JoVE Journal

Biology

30.3K ビュー.  National Cancer Institute. マイクロ熱泳動（MST）が広く細胞溶解物から標的タンパク質を精製することなく結合親和性の決定のために用いることができる。プロトコルは、GFP融合タンパク質、非変性条件下での細胞溶解、及びリガンドの濃度を変化させるの存在下で、MST信号の検出の過剰発現を伴う。

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Microvolume Protein Concentration Determination using the NanoDrop 2000c Spectrophotometer

Traditional spectrophotometry requires placing samples into cuvettes or capillaries. This is often impractical due to the limited sample volumes often used for protein analysis. The Thermo Scientific NanoDrop 2000c Spectrophotometer solves this issue with an innovative sample retention system that holds microvolume samples between two measurement surfaces using the surface tension properties of liquids, enabling the quantification of samples in volumes as low as 0.5-2 &mu;L. The elimination of cuvettes or capillaries allows real time changes in path length, which reduces the measurement time while greatly increasing the dynamic range of protein concentrations that can be measured. The need for dilutions is also eliminated, and preparations for sample quantification are relatively easy as the measurement surfaces can be simply wiped with laboratory wipe. This video article presents modifications to traditional protein concentration determination methods for quantification of microvolume amounts of protein using A280 absorbance readings or the BCA colorimetric assay.

Microvolume samples are quantified by a spectrophotometer system that uses natural surface tension to retain samples without the use of cuvettes or capillaries. The dynamic range of protein concentrations and speed by which they can be measured are greatly increased with this method.

光度計2000C分光光度計を使った微量タンパク質の濃度測定

Traditional spectrophotometry requires placing samples into cuvettes or capillaries. This is often impractical due to the limited sample volumes often ...

生物学

The Importance of Correct Protein Concentration for Kinetics and Affinity Determination in Structure-function Analysis 

In this study, we explore the interaction between the bovine cysteine protease inhibitor cystatin B and a catalytically inactive form of papain (Fig. 1), a plant cysteine protease, by real-time label-free analysis using Biacore X100. Several cystatin B variants with point mutations in areas of interaction with papain, are produced. For each cystatin B variant we determine its specific binding concentration using calibration-free concentration analysis (CFCA) and compare the values obtained with total protein concentration as determined by A280. After that, the kinetics of each cystatin B variant binding to papain is measured using single-cycle kinetics (SCK). We show that one of the four cystatin B variants we examine is only partially active for binding. This partial activity, revealed by CFCA, translates to a significant difference in the association rate constant (ka) and affinity (KD), compared to the values calculated using total protein concentration. Using CFCA in combination with kinetic analysis in a structure-function study contributes to obtaining reliable results, and helps to make the right interpretation of the interaction mechanism.

The Importance of Correct Protein Concentration for Kinetics and Affinity Determination in Structure-function Analysis

We apply label-free protein interaction analysis using Biacore X100 for structure-function analysis of the binding of several cystatin B mutants to papain through kinetic characterization. Calibration-free concentration analysis (CFCA) measures the concentration of protein with retained binding activity without the need for a standard curve. We show that confirmation of concentrations using CFCA increases the reliability of the kinetic analysis and that kinetic constants can reliably be determined even if the activity of a recombinant protein is reduced.

速度論と構造機能解析のアフィニティ定量のための適切なタンパク質濃度の重要性

In this study, we explore the interaction between the bovine cysteine protease inhibitor cystatin B and a catalytically inactive form of papain (Fig. 1), ...

Isolation of Labile Multi-protein Complexes by in vivo Controlled Cellular Cross-Linking and Immuno-magnetic Affinity Chromatography

The dynamic nature of cellular machineries is frequently built on transient and/or weak protein associations. These low affinity interactions preclude stringent methods for the isolation and identification of protein networks around a protein of interest. The use of chemical crosslinkers allows the selective stabilization of labile interactions, thus bypassing biochemical limitations for purification. Here we present a protocol amenable for cells in culture that uses a homobifunctional crosslinker with a spacer arm of 12 &Aring;, dithiobis-(succinimidyl proprionate) (DSP). DSP is cleaved by reduction of a disulphide bond present in the molecule. Cross-linking combined with immunoaffinity chromatography of proteins of interest with magnetic beads allows the isolation of protein complexes that otherwise would not withstand purification. This protocol is compatible with regular western blot techniques and it can be scaled up for protein identification by mass spectrometry1.
Stephanie A. Zlatic and Pearl V. Ryder contributed equally to this work.

Isolation of Labile Multi-protein Complexes by in vivo Controlled Cellular Cross-Linking and Immuno-magnetic Affinity Chromatography

The cell permeable crosslinker DSP [dithiobis-(succinimidyl propionate)] stabilizes transient and labile interactions in vivo, which allows their isolation using stringent protein complex purification techniques. Here we present a technique for crosslinking cells grown in culture followed by isolation of protein complexes by immunoprecipitation.

不安定な多タンパク質複合体の単離で in vivoで制御セルラー架橋及び免疫磁気アフィニティークロマトグラフィー

The dynamic nature of cellular machineries is frequently built on transient and/or weak protein associations. These low affinity interactions preclude ...

PAR-CliP - A Method to Identify Transcriptome-wide the Binding Sites of RNA Binding Proteins

RNA transcripts are subjected to post-transcriptional gene regulation by interacting with hundreds of RNA-binding proteins (RBPs) and microRNA-containing ribonucleoprotein complexes (miRNPs) that are often expressed in a cell-type dependently. To understand how the interplay of these RNA-binding factors affects the regulation of individual transcripts, high resolution maps of in vivo protein-RNA interactions are necessary1.
A combination of genetic, biochemical and computational approaches are typically applied to identify RNA-RBP or RNA-RNP interactions. Microarray profiling of RNAs associated with immunopurified RBPs (RIP-Chip)2 defines targets at a transcriptome level, but its application is limited to the characterization of kinetically stable interactions and only in rare cases3,4 allows to identify the RBP recognition element (RRE) within the long target RNA. More direct RBP target site information is obtained by combining in vivo UV crosslinking5,6 with immunoprecipitation7-9 followed by the isolation of crosslinked RNA segments and cDNA sequencing (CLIP)10. CLIP was used to identify targets of a number of RBPs11-17. However, CLIP is limited by the low efficiency of UV 254 nm RNA-protein crosslinking, and the location of the crosslink is not readily identifiable within the sequenced crosslinked fragments, making it difficult to separate UV-crosslinked target RNA segments from background non-crosslinked RNA fragments also present in the sample.
We developed a powerful cell-based crosslinking approach to determine at high resolution and transcriptome-wide the binding sites of cellular RBPs and miRNPs that we term PAR-CliP (Photoactivatable-Ribonucleoside-Enhanced Crosslinking and Immunoprecipitation) (see Fig. 1A for an outline of the method). The method relies on the incorporation of photoreactive ribonucleoside analogs, such as 4-thiouridine (4-SU) and 6-thioguanosine (6-SG) into nascent RNA transcripts by living cells. Irradiation of the cells by UV light of 365 nm induces efficient crosslinking of photoreactive nucleoside-labeled cellular RNAs to interacting RBPs. Immunoprecipitation of the RBP of interest is followed by isolation of the crosslinked and coimmunoprecipitated RNA. The isolated RNA is converted into a cDNA library and deep sequenced using Solexa technology. One characteristic feature of cDNA libraries prepared by PAR-CliP is that the precise position of crosslinking can be identified by mutations residing in the sequenced cDNA. When using 4-SU, crosslinked sequences thymidine to cytidine transition, whereas using 6-SG results in guanosine to adenosine mutations. The presence of the mutations in crosslinked sequences makes it possible to separate them from the background of sequences derived from abundant cellular RNAs.
Application of the method to a number of diverse RNA binding proteins was reported in Hafner et al.18

RNA transcripts are subject to extensive posttranscriptional regulation that is mediated by a multitude of trans-acting RNA-binding proteins (RBPs). Here we present a generalizable method to identify precisely and on a transcriptome-wide scale the RNA binding sites of RBPs.

PAR -クリップ - RNA結合タンパク質のトランスクリプトーム全体の結合部位を同定する方法

RNA transcripts are subjected to post-transcriptional gene regulation by interacting with hundreds of RNA-binding proteins (RBPs) and microRNA-containing ...

Lipid Vesicle-mediated Affinity Chromatography using Magnetic Activated Cell Sorting (LIMACS): a Novel Method to Analyze Protein-lipid Interaction

The analysis of lipid protein interaction is difficult because lipids are embedded in cell membranes and therefore, inaccessible to most purification procedures. As an alternative, lipids can be coated on flat surfaces as used for lipid ELISA and Plasmon resonance spectroscopy. However, surface coating lipids do not form microdomain structures, which may be important for the lipid binding properties. Further, these methods do not allow for the purification of larger amounts of proteins binding to their target lipids.
 To overcome these limitations of testing lipid protein interaction and to purify lipid binding proteins we developed a novel method termed lipid vesicle-mediated affinity chromatography using magnetic-activated cell sorting (LIMACS). In this method, lipid vesicles are prepared with the target lipid and phosphatidylserine as the anchor lipid for Annexin V MACS. Phosphatidylserine is a ubiquitous cell membrane phospholipid that shows high affinity to the protein Annexin V. Using magnetic beads conjugated to Annexin V the phosphatidylserine-containing lipid vesicles will bind to the magnetic beads. When the lipid vesicles are incubated with a cell lysate the protein binding to the target lipid will also be bound to the beads and can be co-purified using MACS. This method can also be used to test if recombinant proteins reconstitute a protein complex binding to the target lipid. 
 We have used this method to show the interaction of atypical PKC (aPKC) with the sphingolipid ceramide and to co-purify prostate apoptosis response 4 (PAR-4), a protein binding to ceramide-associated aPKC. We have also used this method for the reconstitution of a ceramide-associated complex of recombinant aPKC with the cell polarity-related proteins Par6 and Cdc42. Since lipid vesicles can be prepared with a variety of sphingo- or phospholipids, LIMACS offers a versatile test for lipid-protein interaction in a lipid environment that resembles closely that of the cell membrane. Additional lipid protein complexes can be identified using proteomics analysis of lipid binding protein co-purified with the lipid vesicles.

Lipid Vesicle-mediated Affinity Chromatography using Magnetic Activated Cell Sorting LIMACS: a Novel Method to Analyze Protein-lipid Interaction

To test the interaction of a protein with its target lipid we used MACS and Annexin V-conjugated magnetic beads and lipid vesicles synthesized from the target lipid and Annexin V-binding phosphatidylserine. Proteins bound to the target lipid are co-purified and analyzed after elution from the beads.

磁気活性化細胞選別（LIMACS）を使用して、脂質小胞を介したアフィニティクロマトグラフィー：タンパク質脂質相互作用を解析する新手法

The analysis of lipid protein interaction is difficult because lipids are embedded in cell membranes and therefore, inaccessible to most purification ...

Orthogonal Protein Purification Facilitated by a Small Bispecific Affinity Tag

Due to the high costs associated with purification of recombinant proteins the protocols need to be rationalized. For high-throughput efforts there is a demand for general methods that do not require target protein specific optimization1 . To achieve this, purification tags that genetically can be fused to the gene of interest are commonly used2 . The most widely used affinity handle is the hexa-histidine tag, which is suitable for purification under both native and denaturing conditions3 . The metabolic burden for producing the tag is low, but it does not provide as high specificity as competing affinity chromatography based strategies1,2.
Here, a bispecific purification tag with two different binding sites on a 46 amino acid, small protein domain has been developed. The albumin-binding domain is derived from Streptococcal protein G and has a strong inherent affinity to human serum albumin (HSA). Eleven surface-exposed amino acids, not involved in albumin-binding4 , were genetically randomized to produce a combinatorial library. The protein library with the novel randomly arranged binding surface (Figure 1) was expressed on phage particles to facilitate selection of binders by phage display technology. Through several rounds of biopanning against a dimeric Z-domain derived from Staphylococcal protein A5, a small, bispecific molecule with affinity for both HSA and the novel target was identified6 .
The novel protein domain, referred to as ABDz1, was evaluated as a purification tag for a selection of target proteins with different molecular weight, solubility and isoelectric point. Three target proteins were expressed in Escherishia coli with the novel tag fused to their N-termini and thereafter affinity purified. Initial purification on either a column with immobilized HSA or Z-domain resulted in relatively pure products. Two-step affinity purification with the bispecific tag resulted in substantial improvement of protein purity. Chromatographic media with the Z-domain immobilized, for example MabSelect SuRe, are readily available for purification of antibodies and HSA can easily be chemically coupled to media to provide the second matrix.
This method is especially advantageous when there is a high demand on purity of the recovered target protein. The bifunctionality of the tag allows two different chromatographic steps to be used while the metabolic burden on the expression host is limited due to the small size of the tag. It provides a competitive alternative to so called combinatorial tagging where multiple tags are used in combination1,7.

A novel and highly efficient two-step affinity chromatography protocol has been developed and is described in detail. The method is based on a small purification tag with two inherent affinities and is applicable to a wide range of target proteins with different properties.

小型二重特異性アフィニティタグによって容易に直交するタンパク質の精製

Due to the high costs associated with purification of recombinant proteins the protocols need to be rationalized. For high-throughput efforts there is a ...

Identification of Protein Interacting Partners Using Tandem Affinity Purification

A critical and often limiting step in understanding the function of host and viral proteins is the identification of interacting cellular or viral protein partners. There are many approaches that allow the identification of interacting partners, including the yeast two hybrid system, as well as pull down assays using recombinant proteins and immunoprecipitation of endogenous proteins followed by mass spectrometry identification1. Recent studies have highlighted the utility of double-affinity tag mediated purification, coupled with two specific elution steps in the identification of interacting proteins. This approach, termed Tandem Affinity Purification (TAP), was initially used in yeast2,3 but more recently has been adapted to use in mammalian cells4-8.
As proof-of-concept we have established a tandem affinity purification (TAP) method using the well-characterized eukaryotic translation initiation factor eIF4E9,10.The cellular translation factor eIF4E is a critical component of the cellular eIF4F complex involved in cap-dependent translation initiation10. The TAP tag used in the current study is composed of two Protein G units and a streptavidin binding peptide separated by a Tobacco Etch Virus (TEV) protease cleavage sequence. The TAP tag used in the current study is composed of two Protein G units and a streptavidin binding peptide separated by a Tobacco Etch Virus (TEV) protease cleavage sequence8. To forgo the need for the generation of clonal cell lines, we developed a rapid system that relies on the expression of the TAP-tagged bait protein from an episomally maintained plasmid based on pMEP4 (Invitrogen). Expression of tagged murine eIF4E from this plasmid was controlled using the cadmium chloride inducible metallothionein promoter.
Lysis of the expressing cells and subsequent affinity purification via binding to rabbit IgG agarose, TEV protease cleavage, binding to streptavidin linked agarose and subsequent biotin elution identified numerous proteins apparently specific to the eIF4E pull-down (when compared to control cell lines expressing the TAP tag alone). The identities of the proteins were obtained by excision of the bands from 1D SDS-PAGE and subsequent tandem mass spectrometry. The identified components included the known eIF4E binding proteins eIF4G and 4EBP-1. In addition, other components of the eIF4F complex, of which eIF4E is a component were identified, namely eIF4A and Poly-A binding protein. The ability to identify not only known direct binding partners as well as secondary interacting proteins, further highlights the utility of this approach in the characterization of proteins of unknown function.

Tandem affinity purification is a robust approach for the identification of protein binding partners. As proof of concept, this methodology was applied to the well-characterized translation initiation factor eIF4E to co-precipitate the host cell factors involved in translation initiation. This method is easily adapted to any cellular or viral protein.

タンデムアフィニティー精製を用いたタンパク質相互作用するパートナーの識別

A critical and often limiting step in understanding the function of host and viral proteins is the identification of interacting cellular or viral protein ...

Real-time Analyses of Retinol Transport by the Membrane Receptor of Plasma Retinol Binding Protein

Vitamin A is essential for vision and the growth/differentiation of almost all human organs. Plasma retinol binding protein (RBP) is the principle and specific carrier of vitamin A in the blood. Here we describe an optimized technique to produce and purify holo-RBP and two real-time monitoring techniques to study the transport of vitamin A by the high-affinity RBP receptor STRA6. The first technique makes it possible to produce a large quantity of high quality holo-RBP (100%-loaded with retinol) for vitamin A transport assays. High quality RBP is essential for functional assays because misfolded RBP releases vitamin A readily and bacterial contamination in RBP preparation can cause artifacts. Real-time monitoring techniques like electrophysiology have made critical contributions to the studies of membrane transport. The RBP receptor-mediated retinol transport has not been analyzed in real time until recently. The second technique described here is the real-time analysis of STRA6-catalyzed retinol release or loading. The third technique is real-time analysis of STRA6-catalyzed retinol transport from holo-RBP to cellular retinol binding protein I (CRBP-I). These techniques provide high sensitivity and resolution in revealing RBP receptor's vitamin A uptake mechanism.

Here we describe an optimized technique to produce high-quality vitamin A/RBP complex and two real-time monitoring techniques to study vitamin A transport by STRA6, the RBP receptor.

血漿レチノール結合タンパク質の膜受容体によってレチノール交通のリアルタイム解析

Vitamin A is essential for vision and the growth/differentiation of almost all human organs.  Plasma retinol binding protein (RBP) is the principle and ...

A Protocol for Phage Display and Affinity Selection Using Recombinant Protein Baits

Using recombinant phage as a scaffold to present various protein portions encoded by a directionally cloned cDNA library to immobilized bait molecules is an efficient means to discover interactions. The technique has largely been used to discover protein-protein interactions but the bait molecule to be challenged need not be restricted to proteins. The protocol presented here has been optimized to allow a modest number of baits to be screened in replicates to maximize the identification of independent clones presenting the same protein. This permits greater confidence that interacting proteins identified are legitimate interactors of the bait molecule. Monitoring the phage titer after each affinity selection round provides information on how the affinity selection is progressing as well as on the efficacy of negative controls. One means of titering the phage, and how and what to prepare in advance to allow this process to progress as efficiently as possible, is presented. Attributes of amplicons retrieved following isolation of independent plaque are highlighted that can be used to ascertain how well the affinity selection has progressed. Trouble shooting techniques to minimize false positives or to bypass persistently recovered phage are explained. Means of reducing viral contamination flare up are discussed.

Phage display is a powerful technique to capture proteins or protein moieties that interact with an immobilized molecule of interest. Once a decision of the type of phage cDNA library to create and screen has been made, the protocol described here permits efficient affinity selection leading to identification of interactors.

組換えタンパク質ベイトを用いてファージディスプレイおよび親和性選択のためのプロトコル

Using  recombinant phage as a scaffold to present various protein portions encoded by  a directionally cloned cDNA library to immobilized bait molecules ...

A Sensitive and Specific Quantitation Method for Determination of Serum Cardiac Myosin Binding Protein-C by Electrochemiluminescence Immunoassay

Biomarkers are becoming increasingly more important in clinical decision-making, as well as basic science. Diagnosing myocardial infarction (MI) is largely driven by detecting cardiac-specific proteins in patients' serum or plasma as an indicator of myocardial injury. Having recently shown that cardiac myosin binding protein-C (cMyBP-C) is detectable in the serum after MI, we have proposed it as a potential biomarker for MI. Biomarkers are typically detected by traditional sandwich enzyme-linked immunosorbent assays. However, this technique requires a large sample volume, has a small dynamic range, and can measure only one protein at a time.	
Here we show a multiplex immunoassay in which three cardiac proteins can be measured simultaneously with high sensitivity. Measuring cMyBP-C in uniplex or together with creatine kinase MB and cardiac troponin I showed comparable sensitivity. This technique uses the Meso Scale Discovery (MSD) method of multiplexing in a 96-well plate combined with electrochemiluminescence for detection. While only small sample volumes are required, high sensitivity and a large dynamic range are achieved. Using this technique, we measured cMyBP-C, creatine kinase MB, and cardiac troponin I levels in serum samples from 16 subjects with MI and compared the results with 16 control subjects. We were able to detect all three markers in these samples and found all three biomarkers to be increased after MI. This technique is, therefore, suitable for the sensitive detection of cardiac biomarkers in serum samples.

Measuring biomarkers in complex biological samples is increasingly guiding clinical decision-making. We describe a highly sensitive method to simultaneously measure cardiac myosin binding protein-C, creatine kinase MB, and cardiac troponin I in serum samples from subjects with myocardial infarction and healthy control subjects.

電気化学発光免疫測定法により血清心臓ミオシン結合タンパク質-Cの定量のための高感度で特異的な定量法

Biomarkers are becoming increasingly more  important in clinical decision-making, as well as basic science. Diagnosing  myocardial infarction (MI) is ...