この作品は、NIH（5T32GM008275 - 22）とアメリカ心臓協会博士号を取得する前のフェローシップ（EASまで）からの助成金によって支えられて、化学、生物学のインターフェイスのNIH（2T32GM071339 - 06A1）（MEDまで）からフェローシップ、およびからの補助金NIH（1DP2OD002177 - 01とNS067354 - 0110）、エリソン医学財団、ビル＆メリンダゲイツ財団（JSまで）。

1。 Hsp104の発現<ol><li>プラスミドは、E.の精製に用いる大腸菌 、pPROEX - HTB - Hsp104は、trcプロモーター26の誘導制御下Hsp104オープンリーディングフレームが含まれています。プラスミドは、TEVプロテアーゼ切断により除去することができるN -末端His 6 - tagをHsp104を生成します。コドン最適化E.にpPROEX - HTB - Hsp104を変換典型的な細菌の形質転換法を用いて大腸菌は BL21 - CodonPlus - RIL細胞（Stratagene、アジレントテクノロジー）（例：製造業者の指示に従って）。コドン最適化E.を使用することが重要です。 Hsp104は珍しいコドンバイアスを持っているので、 大腸菌の菌株。 </li><li> 100mLの2XYT文化（USB.レシピさ：16g / Lカゼインペプトン、10gの/ L酵母エキス、5グラム/ LのNaCl、pH 7.0）に植菌、新鮮な形質で100μg/mLアンピシリン及び34μg/mLクロラムフェニコールを添加したが、37で一晩成長° 200rpmで振盪しながらC。 </li><li> 2Lフラスコに100μg/mLアンピシリン及び34μg/mLクロラムフェニコールで6 × 1L 2XYTに一晩培養液10mLを接種する。 37 ° CまでのOD 600 = 0.4〜0.6で、250rpmで振とうする。揺れを停止し、15に温度を下げる℃にそれは15℃に達するまで細胞がインキュベーターに30分間落ち着きはらった平衡させる一度15 ° Cは1mmの最終濃度になるようにIPTGを添加し、タンパク質発現を誘導達している。 （12〜16時間）一晩250rpmで振盪しながら再開する。 </li></ol> 2。細胞の収穫と溶解<ol><li> 4℃20分のための4,000 rpmで遠心分離により細胞を回収（予備冷却したローターで）° C（我々はソーバルRC 3BP +遠心機を使用）。 Hsp104の活性が減少しているため、以降のステップは、すぐに実行する必要があるときにE.大腸菌の細胞が凍結されています。さらに、後続のすべてのステップは氷上または4℃で行ってください</li><li>予冷した（氷上で）10mLの溶解バッファー（40mmのHEPES - KOH pH7.4の、500mmの塩化カリウム、20mMのMgCl 2を 、2.5％（w / v）のグリセロール、20mMのイミダゾール、5μMのペプスタチン、完全なプロテアーゼ阻害剤カクテル（1 EDTAに再懸濁し、細胞ペレットフリーtablet/50mL）、および2mMβ-メルカプトエタノール）。 </li><li>氷水に浸漬熱交換器を使用するフレンチプレス（Emulsiflex）ホモジナイザーで細胞を溶解する。使用前に、すべての細胞塊が可溶化されていることを確認してください。溶解緩衝液でホモジナイザーを平衡化した後、15,000-18,000 psiの圧力でシリンダーを介して2つのパスが完全に溶解するのに十分です。フレンチプレスを使用できない場合は、超音波処理に続いてリゾチームとのインキュベーションは、（議論を参照）を使用することができる。 SDS - PAGE分析（1μL）（図中のライセート。2）に溶解した細胞の小さなサンプルを保存します。 </li><li> 4時20分、16,000 rpmで遠心分離により細胞破片を除去° C（我々は+ centifugeソーバルRC5Cを使用）。次のステップの上清を保持し、SDS - PAGE解析のために上澄みの少量のサンプル（1μL）を保存する（図中のNiのロード。2）。 </li></ol> 3。 Hsp104の精製<ol><li>溶解バッファー平衡化したNi -セファロースビーズ（GE）の50％スラリー12mL（細胞の1L当たり2mLのニッケル - セファロースビーズ）で、ステップ2.4​​から上清を混ぜる。 </li><li> 4℃で3時間ゆっくりとサンプルを回転℃でのNi -セファロースが均等に中断し、泡が最小化されているままであるように。短いインキュベーション時間は可能ですが、収量が低下します。 4℃でプロテアーゼ阻害剤の存在下でC、少し劣化が発生し、3時間のNi -セファロースのインキュベーション時間は、最終産物の活性を減少させない。 4℃で2分2000回転（エッペンドルフ5810R遠心）でCのための遠心分離によるNi -セファロースを収集する。 SDS - PAGE解析のために上清の小さなサンプルを保存（1μL）と（図を介してNIの流れ（FT）2）、残りを捨てる。 </li><li>洗浄バッファー（40mmのHEPES - KOH pH7.4の、150MMのKCl、20mMのMgCl 2を 、2.5％（w / v）のグリセロール、20mMのイミダゾール、2mMのβ-メルカプトエタノール）、の5カラム容量の25カラム容積で取得したのNi -セファロースを洗浄してくださいHsp104に静電的に結合した汚染物質、および洗浄緩衝液の25カラムボリュームを削除するには、1M KClでバッファを洗う。 4℃で2分2000回転（エッペンドルフ5810R遠心）でCのための遠心分離により各洗浄後のNi -セファロースを収集する。各洗浄と遠心分離サイクルの後、吸引してバッファーを除去する。 </li><li> 1mLのニッケル-セファロースあたりHsp104を溶出するために、1mLの溶出バッファーでミックスのNi -セファロース（40mmのHEPES - KOH pH7.4の、150MMのKCl、20mMのMgCl 2を 、2.5％（w / v）のグリセロール、350mmのイミダゾール、2mMのβ-メルカプトエタノール）と4℃で20分間回転させます。高いイミダゾール濃度は、Niビーズ-彼の6の相互作用を破壊する。 4℃、2分間の遠心により空の1.2 mlをスピンカラム（Bio - Rad社）°、2,000 rpmでC（エッペンドルフ5810R遠心）でNI -セファロースを削除します。 （図中のNiの溶出液2）SDS - PAGE解析のために溶出液の1μLを保存します。細胞の1リットルの場合は、Hsp104の〜15mgは、このステップで得られる。 </li><li> MWCO3万アミコンウルトラ（ミルを使用してバッファQ（20mMのトリス- HCl pH8の、0.5mmのEDTA、5mMのMgCl 2を 、50mmの塩化ナトリウム）にバッファー交換の溶出液lipore）15mlの遠心濃縮装置。最初に、10倍のタンパク質を希釈するバッファーQの14.5mLを追加して〜1.5mlのためにタンパク質を集中。緩衝液交換を3回繰り返します。増加したpHと低塩濃度は、Hsp104は高い負の電荷を持つことが保証されます。 </li><li>バッファQ平衡化したリソースQ 6mLカラム（GE）を用いて陰イオン交換クロマトグラフィーを経由してHsp104を浄化する。注射の前に、蛋白質は低タンパク結合マイレクスGP PESメンブレン0.22μMシリンジフィルター（Millipore）で濾過する。我々は、1mL/minの流量を採用。 20％のバッファの1列のボリュームと弱く結合タンパク質洗い流すQ +（20mMのトリス- HCl pH8の、0.5mmのEDTA、5mMのMgCl 2を 、1MのNaCl）。 5カラム体積以上の直線勾配で溶出Hsp104（20％〜50％バッファQ +）（図3）。 1ミリリットルフラクションを集める。 Hsp104とほとんどの亜種は、一般的に〜400mmの塩化ナトリウム（31mS/cm）で溶出。 SDS - PAGE解析のためのピーク分画（1μL）（図3、挿入図）のサンプルを保存します。 </li><li>アミコン遠心濃縮器を使用して、彼の6タグを削除するには、交換のタンパク質は、切断バッファー（20mMのHEPES - KOH pH7.4の、140mmの塩化カリウム、及び10mMのMgCl 2の ）に（ステップ3.5を参照）上記の説明。製造元の指示に従ってproTEVプロテアーゼ（Promega社製）またはAcTEVプロテアーゼ（Invitrogen）を使用してください。 Hsp104完全な切断のために必要とされています：Hsp104のために、我々は、TEVプロテアーゼの高い比率がことを発見した。我々は、12μgHsp104あたり1プロテアーゼのユニットの比率を使用してください。開裂は、4で16時間のインキュベーション℃に続いて、2〜4時間、30℃で実施されるべき最後のHsp104の濃度は20 -75μmの単量体の間でなければなりません。開裂反応（ビーズがパックされた樹脂のmL当たりのタンパク質15mg結合することができると仮定）におけるHsp104の量に対して過剰のNi -セファロースを追加することにより、ニッケル - セファロース（GE）と残りのしたHis6 -タグ付きHsp104とTEVプロテアーゼを使い果たす。 4℃で2,000 rpmで2分間遠心分離して、空のスピンカラム（Bio - Rad社）でビーズを削除℃に開裂、および未切断タンパク質の除去（図4）を確保するためにSDS - PAGE解析のための開裂（1μL）の前と後のサンプルを収集する。 </li><li>ステップ3.5で説明したようにMWCO3万アミコンウルトラ（Millipore）を用いてサイズ排除バッファー（20mMのHEPES - KOH pH7.4の、140mmの塩化カリウム、10mMのMgCl 2を 、0.1mmのEDTA、1mMのDTT）に交換。 </li><li>さらにサイズ排除クロマトグラフィーを経由してHsp104を浄化する。サイズ排除バッファーで平衡化スーパーローズ6またはSuperdex 200カラム（GEからの両方）（図5）を使用してください。注射の前に、蛋白質は低タンパク結合マイレクスGP PESメンブレン0.22μMシリンジフィルター（Millipore）で濾過する。タンパク質未満の10mgのために、300分の10サイズのカラム（24mL）を使用することができますし、0.5ミリリットル分画を集めています。 10mgのより大きいサンプルについては、60分の12サイズの列は（120mL）を使用する必要がありますし、1mlの画分を収集している。フローレートおよびロードするサンプル量については、製造元の説明書を参照してください。精製後、Hsp104の画分を、図2に示すようにプールされます。 5、アミコン遠心濃縮ユニット（ミリポア）に集中。後述するようにHsp104が格納されています。材料の損失によるHsp104分解生成物と汚染物質を分離するにはフルレングスHsp104を精製の最終収率は出発文化のリットルあたり〜1ミリグラムです。 </li></ol> 4。 Hsp104 Disaggregase活動<ol><li>精製後、それは分解アッセイでHsp104活性を評価することをお勧めします。一般的に、我々はルシフェラーゼ再活性化アッセイ2（図6）を採用。このアッセイにおいて、Hsp70のシャペロンシステム（Hsp70のとHSP40）disaggregates尿素変性ホタルルシフェラーゼの凝集体2と共にHsp104。水溶性のルシフェラーゼは、ルシフェリン、光を放出反応にルシフェリンの酸化を触媒する。ルシフェラーゼの監視発光、相対的な再活性化、そのため分解によって決定することができる。 Hsp104は相乗的にHsp70のコシャペロンシステムと協力できなければなりません。利用HSP40ペア：回収された発光量は、正確なHsp70のに依存します。我々は日常的にHsp72とHSP40を（アッセイデザイン）採用。単独でHSP40（図6）：最低でも、アクティブHsp104はHsp​​72によって再活性化と比較してルシフェラーゼの再活性化の5倍の増加を生成する必要があります。活動のこのレベルに達するために失敗したHsp104の準備は破棄されます。 </li></ol> 5。 Hsp104ストレージ<ol><li>短期記憶の場合は、Hsp104は° Cサイズ排除バッファ4に保つことができる。しかし、活動は4℃と急激に1週間後に4で2〜3日後に低下する℃に分解アッセイのために我々は、Hsp104は精製後できるだけ早く使用することをお勧めします。理想的には、Hsp104はアミロイド分解アッセイのために直ちに使用する必要があります。 </li><li>タンパク質は、長期保存しなければならない場合、Hsp104は保存バッファー（20mMのHEPES - KOH pH7.4の、140mmの塩化カリウム、10mMのMgCl 2を 、0.1mmのEDTA、1mMのDTT、10％グリセロール（W / V））に交換されます。 100μlのアリコートを液体窒素で凍結し、-80℃で保存されているスナップです。凍結融解サイクルが大幅にHsp104活性を低下させるとは避けるべきである。我々は徐々に氷の上Hsp104を解凍することをお勧めします。アミロイド- disaggregase活性が-80 1ヶ月後に急激に減少する℃に</li></ol> 6。代表的な結果と図： <img src="/files/ftp_upload/3190/3190fig1.jpg" alt="図1"/> 図1。 Hsp104は、二官能性disaggregaseです。不規則な凝集体の分解は、（左図参照）Hsp70のシャペロンシステム（Hsp70のとHSP40）2の協力が必要です。 Hsp104のremodels は 、in vitro での Hsp70のとHSP40の援助なしにアミロイドの凝集体を（右図）注文が、Hsp70のとHSP40は、アミロイド26,28に対してHsp104の活性を向上させることができます。集約された構造、分解を促進するため、その中心的なチャネルを介して基板の転座にHsp104結合ATPの加水分解の両方のタイプの。チロシン-ベアリング細孔ループは中央のチャネル49から52を介して関与し、シャトルの基板。 <img src="/files/ftp_upload/3190/3190fig2.jpg" alt="図2"/> 図2。のNi -セファロースアフィニティー精製ステップのSDS - PAGE分析。ライセート、ニッケルの負荷、ニッケルFTとNiの溶出液のサンプルは4-20％トリス-塩酸1.0ミリメートル基準ゲル（Bio - Rad社）とクマシー染色したを使用してSDS - PAGEで分画し、 。すべてのHsp104は、Ni -セファロースに結合することができることに注意してください。広い範囲の分子量マーカー（Bio - Rad社）（レーン左）が表示されます。 <img src="/files/ftp_upload/3190/3190fig3.jpg" alt="図3"/> 図3。のNi -セファロース溶出液のリソースのQ精製。青のトレースは、280と緑のトレースでの吸光度を表すには％バッファQ +を（50％最大値）を表します。 20％で溶出最初のピーク、Q +不純物、分解生成物と不適切に折り畳まHsp104が含まれています。番目と主要なピークが正しく折り畳まれたとアクティブHsp104が含まれています。流速は1ml/minであった。 20から50パーセントQ +からの勾配は30分または5カラム体積のです。挿入図：ピーク画分を4-20％トリス - 塩酸1.0ミリメートル基準ゲル（Bio - Rad社）とクマシー染色したを使用してSDS - PAGE分析によって解決されます。広い範囲の分子量マーカー（バイオラッド）は、（左）が表示されます。 <img src="/files/ftp_upload/3190/3190fig4.jpg" alt="図4"/> 図4。 proTEVプロテアーゼ切断ステップのSDS - PAGE分析。彼の6 Hsp104リソースQの精製から、30で4次に℃、16時間℃で4時間proTEVのプロテアーゼで処理し、サンプルでは4-20％トリス - 塩酸1.0ミリメートル基準ゲル（Bio - Rad社）とクマシー染色したを使用してSDS - PAGEによって分画した。 proTEV劈開Hsp104がより迅速に移行することに注意してください。ステップ3.7で説明したようにTEVプロテアーゼと未開Hsp104をNi -セファロースで枯渇している。広い範囲の分子量マーカー（バイオラッド）は、（左）が表示されます。 <img src="/files/ftp_upload/3190/3190fig5.jpg" alt="図5"/> 図5。 Hsp104。劈開Hsp104 のサイズ排除精製は、さらにスーパーローズ6ゲル濾過カラム（300分の10、GE）を経由して精製した。流速= 0.4ml/min。破線の間にピークがプールされた画分を表します。挿入図：ピーク画分を4-20％トリス - 塩酸1.0ミリメートル基準ゲル（Bio - Rad社）とクマシー染色したを使用してSDS - PAGE分析によって解決されます。広い範囲の分子量マーカー（バイオラッド）は、（左）が表示されます。 <img src="/files/ftp_upload/3190/3190fig6.jpg" alt="図6"/> 図6。ルシフェラーゼ再活性化アッセイ。変性ホタルルシフェラーゼ凝集体（50nmのは）25℃でHsp72及びHSP40（1μM）（アッセイデザインから両方）、Hsp104（量6μm単量体）またはHsp104、Hsp72と90分のためのHSP40のどちらかとインキュベートした変性ルシフェラーゼは、完全にHsp104とHsp40/Hsp72両方の存在下で再アクティブ化されます。回収された発光は、無限M1000プレートリーダー（テカン）で測定されます。値は平均± SEM（n = 3の）を表す。

利害の衝突は宣言されません。

タイムライン：最大Hsp104の活動は私達が全体の精製スキームが可能な限り迅速に完了することをお勧めします。しかし、精製ステップの数は、必ずしも実用的ではないかもしれない厳しいスケジュールになります。精製工程は30℃インキュベーションの2-4時間まで、できるだけ早く一晩式の終わりから時間を実施している場合° TEVプロテアーゼとCは、約9〜11時間です。一時停止のひと?...

<table border="1"><tbody><tr><th>試薬の名前</th><th>会社</th><th>カタログ番号</th></tr><tr><td> BL21 - CodonPlus - RILコンピテントセル</td><td>ストラタジーン社、アジレントテクノロジー</td><td> 230255 </td></tr><tr><td> 2XYTスープ</td><td> USB </td><td> 75864 </td></tr><tr><td>完全な、ミニ、EDTAフリープロテアーゼ阻害剤の錠剤</td><td>ロッシュ</td><td> 1836170 </td></tr><tr><td>ペプスタチン</td><td>シグマ</td><td> P4265 </td></tr><tr><td> NI -セファロース6 Fast Flowは</td><td> GEヘルスケア</td><td> 17-5318-02 </td></tr><tr><td>アミコンウルトラ- 15遠心フィルターユニット（分画分子量30,000） </td><td>ミリポア</td><td> UFC903008 </td></tr><tr><td>資源Q - 6ミリリットル列</td><td> GEヘルスケア</td><td> 17-1179-01 </td></tr><tr><td> proTEVプロテアーゼ</td><td>プロメガ</td><td> V6052 </td></tr><tr><td> AcTEVプロテアーゼ</td><td>インビトロジェン</td><td> 12575015 </td></tr><tr><td>スーパーローズ6 300分の10 GL </td><td> GEヘルスケア</td><td> 17-5172-01 </td></tr><tr><td> HSP40 </td><td>アッセイデザイン</td><td> SPP - 400 </td></tr><tr><td> Hsp72 </td><td>アッセイデザイン</td><td> ADI - NSP - 555 </td></tr></tbody></table>

purification of hsp104, a protein disaggregase

Hsp104は酵母から六量AAA +タンパク質1、タンパク質分解2-10の結合ATPの加水分解（図1）です。この活動は2つの重要な選択的な利点を与える。最初に、Hsp104による無秩序な集合体の再生は、熱ショック3,5,11,12を含む、様々なタンパク質折り畳みのストレスの後に酵母の生存を支援します。第二に、Hsp104によるクロスβアミロイド線維の改造は、有益なの貯水池として無数のプリオン（感染性アミロイド）を悪用し、13から22まで表現型変異を遺伝する酵母を可能にします。驚くべきことに、Hsp104は直接酵母のプリオンタンパク質Sup35由来とUre2 23から30で構成されるものを含むpreamyloidのオリゴマーおよびアミロイド線維を、remodels。このアミロイド-リモデリング機能は、酵母Hsp104の特殊な一面です。 E.大腸菌オルソログ、ClpBは、改造のpreamyloidのオリゴマーまたはアミロイド線維26,31,32に失敗します。 Hsp104のオルソログは、動物、perplexingly、除く生命のすべての国で発見されています。確かに、動物細胞は、任意の酵素システムを持っているかどうかを再生（むしろ劣化より）に結合する蛋白質の分解は、未知の33から35のままという。従って、我々と他のHsp104は毒性preamyloidのオリゴマーおよびアミロイド線維4,7,23,36-38に特定のタンパク質の折り畳みと接続されているさまざまな神経変性疾患の治療薬として開発される可能性がありますことを提案した。直接これらの疾患に関連する集約された種を対象にない治療法はありません。まだ、Hsp104はパーキンソン病23と同様にPrPの39のアミロイドの形態で接続されているα-シヌクレイン、から構成される毒性オリゴマーとアミロイド線維を溶解する。重要なのは、Hsp104は、タンパク質の凝集を低減し、パーキンソン病23ハンチントン病38の齧歯類モデルでの神経変性を改善する。理想的には、治療を最適化し、副作用を最小限に抑えるために、Hsp104は選択問題4,7の疾患に中心的な特定の集合体を改造するように設計し、増強される。しかし、どのようにHsp104 disaggregatesの限られた構造とメカニズムの理解が集約された構造と無関係な蛋白質のそのような多様なレパートリーは、これらの努力の30,40-42をいらだた。 Hsp104の構造とメカニズムを理解するには、最小限のコンポーネントを使用して、純粋な蛋白質と再構成するそのdisaggregaseの活動を研究することが不可欠である。 Hsp104は、ADPまたはATPの存在下で、またはヌクレオチド43から46の非存在下での高タンパク質濃度でhexamerizes〜5.3のpIを持つ102kDa蛋白質である。ここでは、Eからの高活性、安定Hsp104の精製に最適化されたプロトコルを記述する大腸菌 。 E.の使用大腸菌は、簡略化された大規模な生産を可能にし、私たちの手法は、多数のHsp104バリアントのために迅速かつ確実に行うことができます。我々のプロトコルは、Hsp104純度を向上させ、Eからの以前の精製法に比べて彼の6タグの除去を簡素化大腸菌 47。また、我々のプロトコルは2つのより最近のプロトコル26,48よりも容易な、便利です。

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Purification of Hsp104, a Protein Disaggregase

ここで、我々は、高活性Hsp104、六量体AAA +タンパク質酵母、タンパク質の分解に結合ATPの加水分解からの精製のためのプロトコルについて説明します。このスキームでは、からアフィニティー精製のためのしたHis6 -タグ付き構造を活用して<em&gt; E.大腸菌</em&gt; TEVプロテアーゼとアニオン交換クロマトグラフィー、His 6 - タグの削除、およびサイズ​​排除クロマトグラフィー。

Hsp104の精製、タンパク質Disaggregase

Hsp104 is a hexameric AAA+ protein1 from yeast, which couples ATP hydrolysis to protein disaggregation2-10 (Fig. 1). This activity imparts two key ...

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Research

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Biology

17.3K ビュー.  University of Pennsylvania. ここで、我々は、高活性Hsp104、六量体AAA +タンパク質酵母、タンパク質の分解に結合ATPの加水分解からの精製のためのプロトコルについて説明します。このスキームでは、からアフィニティー精製のためのしたHis6 -タグ付き構造を活用して E.大腸菌 TEVプロテアーゼとアニオン交換クロマトグラフィー、His 6 - タグの削除、およびサイズ​​排除...

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Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents (Methanol, Ethanol or 2-Propanol) and acetic acid are used for fixation, staining and destaining of proteins in a gel after SDS-PAGE. To speed up the procedure, heating the staining solution in the microwave oven for a short time is frequently used. This usually results in evaporation of toxic or hazardous Methanol, Ethanol or 2-Propanol and a strong smell of acetic acid in the lab which should be avoided due to safety considerations. In a protocol originally published in two patent applications by E.M. Wondrak (US2001046709 (A1), US6319720 (B1)), an alternative composition of the staining solution is described in which no organic solvent or acid is used. The CBB is dissolved in bidistilled water (60-80mg of CBB G-250 per liter) and 35 mM HCl is added as the only other compound in the staining solution. The CBB staning of the gel is done after SDS-PAGE and thorough washing of the gel in bidistilled water. By heating the gel during the washing and staining steps, the process can be finished faster and no toxic or hazardous compunds are evaporating. The staining of proteins occurs already within 1 minute after heating the gel in staining solution and is fully developed after 15-30 min with a slightly blue background that is destained completely by prolonged washing of the stained gel in bidistilled water, without affecting the stained protein bands.

A short protocol for protein staining with Coomassie Brilliant Blue (CBB) G-250 in polyacrylamide gels is described without using organic solvents or acetic acid as in the classical staining procedures with CBB.

クーマシー有機溶媒および酢酸のないG - 250でゲル中のタンパク質の染色

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

生物学

Using the GELFREE 8100 Fractionation System for Molecular Weight-Based Fractionation with Liquid Phase Recovery

The GELFREE 8100 Fractionation System is a novel protein fractionation system designed to maximize protein recovery during molecular weight based fractionation. The system is comprised of single-use, 8-sample capacity cartridges and a benchtop GELFREE Fractionation Instrument. During separation, a constant voltage is applied between the anode and cathode reservoirs, and each protein mixture is electrophoretically driven from a loading chamber into a specially designed gel column gel. Proteins are concentrated into a tight band in a stacking gel, and separated based on their respective electrophoretic mobilities in a resolving gel. As proteins elute from the column, they are trapped and concentrated in liquid phase in the collection chamber, free of the gel. The instrument is then paused at specific time intervals, and fractions are collected using a pipette. This process is repeated until all desired fractions have been collected. If fewer than 8 samples are run on a cartridge, any unused chambers can be used in subsequent separations.
This novel technology facilitates the quick and simple separation of up to 8 complex protein mixtures simultaneously, and offers several advantages when compared to previously available fractionation methods. This system is capable of fractionating up to 1mg of total protein per channel, for a total of 8mg per cartridge. Intact proteins over a broad mass range are separated on the basis of molecular weight, retaining important physiochemical properties of the analyte. The liquid phase entrapment provides for high recovery while eliminating the need for band or spot cutting, making the fractionation process highly reproducible1.

The accompanying video describes the use of the GELFREE 8100 Fractionation System, which partitions complex protein samples on the basis of molecular weight and recovers the fractions in liquid phase. The video describes how the technology works, how it is used, and provides resultant data, with polyacrylamide gel electrophoresis analysis of fractionated bovine liver homogenate.

液相の回復と分子量ベース画用GELFREE 8100分別システムの使用

The GELFREE 8100 Fractionation System is a novel protein fractionation system designed to maximize protein recovery during molecular weight based ...

Purification of the M. magneticum Strain AMB-1 Magnetosome Associated Protein MamA&Delta;41

Magnetotactic bacteria comprise a diverse group of aquatic microorganisms that are able to orientate themselves along geomagnetic fields. This behavior is believed to aid their search for suitable environments (1). This capability is conferred by the magnetosome, a subcellular organelle that consists of a linear-chain assembly of lipid vesicles each able to biomineralize and enclose a ~50-nm crystal of magnetite or greigite. A principle component of the magnetosome that was shown to be required for the formation of functional vesicles is MamA. MamA is a highly abundant magnetosome-associated protein which is one of the most characterized magnetosome-associated proteins in vivo (2-6). This article focuses on the purification of MamA, which despite being studied in vivo, no clear functional or structural details have been identified for it. Bioinformatics analysis suggested that MamA is a tetra-tricopeptide repeat (TPR) containing protein. TPR is a structural motif found as such or forming part of a bigger fold in a wide range of proteins, it serves as a template for protein-protein interactions and mediates multi-protein complexes (7). TPRs are involved in many crucial tasks in eukaryotic cell organelle processes and many bacterial pathways (8-14). In order to understand MamA, a unique TPR containing protein, highly purified protein is required as a first step. In this article, we present the purification protocol for a stable MamA deletion mutant (MamA&Delta;41) from M. magneticum AMB-1.

MamA is a unique Magnetosome associated protein which was shown to be involved in magnetosome activation. Here we present the purification protocol of MamA deletion mutant (MamA&Delta;41) from M. magneticum AMB-1.

の精製 M. magneticum株AMB - 1 Magnetosome関連タンパク質MamAΔ41

Magnetotactic bacteria comprise a diverse group of aquatic microorganisms that are able to orientate themselves along geomagnetic fields. This behavior is ...

Expression, Detergent Solubilization, and Purification of a Membrane Transporter, the MexB Multidrug Resistance Protein

Multidrug resistance (MDR), the ability of a cancer cell or pathogen to be resistant to a wide range of structurally and functionally unrelated anti-cancer drugs or antibiotics, is a current serious problem in public health. This multidrug resistance is largely due to energy-dependent drug efflux pumps. The pumps expel anti-cancer drugs or antibiotics into the external medium, lowering their intracellular concentration below a toxic threshold. We are studying multidrug resistance in Pseudomonas aeruginosa, an opportunistic bacterial pathogen that causes infections in patients with many types of injuries or illness, for example, burns or cystic fibrosis, and also in immuno-compromised cancer, dialysis, and transplantation patients. The major MDR efflux pumps in P. aeruginosa are tripartite complexes comprised of an inner membrane proton-drug antiporter (RND), an outer membrane channel (OMF), and a periplasmic linker protein (MFP) 1-8. The RND and OMF proteins are transmembrane proteins. Transmembrane proteins make up more than 30% of all proteins and are 65% of current drug targets. The hydrophobic transmembrane domains make the proteins insoluble in aqueous buffer. Before a transmembrane protein can be purified, it is necessary to find buffer conditions containing a mild detergent that enable the protein to be solubilized as a protein detergent complex (PDC) 9-11. In this example, we use an RND protein, the P. aeruginosa MexB transmembrane transporter, to demonstrate how to express a recombinant form of a transmembrane protein, solubilize it using detergents, and then purify the protein detergent complexes. This general method can be applied to the expression, purification, and solubilization of many other recombinantly expressed membrane proteins. The protein detergent complexes can later be used for biochemical or biophysical characterization including X-ray crystal structure determination or crosslinking studies.

In this protocol we demonstrate the expression, solubilization, and purification of a recombinantly expressed membrane protein, MexB, as a soluble protein detergent complex. MexB is a multidrug resistance membrane transporter from the opportunistic bacterial pathogen Pseudomonas aeruginosa.

表現、界面活性剤可溶化、および膜トランスポーター、MexBの多剤耐性タンパク質の精製

Multidrug resistance (MDR), the ability of a cancer cell or pathogen to be resistant to a wide range of structurally and functionally unrelated ...

Automated Hydrophobic Interaction Chromatography Column Selection for Use in Protein Purification

In contrast to other chromatographic methods for purifying proteins (e.g. gel filtration, affinity, and ion exchange), hydrophobic interaction chromatography (HIC) commonly requires experimental determination (referred to as screening or "scouting") in order to select the most suitable chromatographic medium for purifying a given protein 1. The method presented here describes an automated approach to scouting for an optimal HIC media to be used in protein purification.
HIC separates proteins and other biomolecules from a crude lysate based on differences in hydrophobicity. Similar to affinity chromatography (AC) and ion exchange chromatography (IEX), HIC is capable of concentrating the protein of interest as it progresses through the chromatographic process. Proteins best suited for purification by HIC include those with hydrophobic surface regions and able to withstand exposure to salt concentrations in excess of 2 M ammonium sulfate ((NH4)2SO4). HIC is often chosen as a purification method for proteins lacking an affinity tag, and thus unsuitable for AC, and when IEX fails to provide adequate purification. Hydrophobic moieties on the protein surface temporarily bind to a nonpolar ligand coupled to an inert, immobile matrix. The interaction between protein and ligand are highly dependent on the salt concentration of the buffer flowing through the chromatography column, with high ionic concentrations strengthening the protein-ligand interaction and making the protein immobile (i.e. bound inside the column) 2. As salt concentrations decrease, the protein-ligand interaction dissipates, the protein again becomes mobile and elutes from the column. Several HIC media are commercially available in pre-packed columns, each containing one of several hydrophobic ligands (e.g. S-butyl, butyl, octyl, and phenyl) cross-linked at varying densities to agarose beads of a specific diameter 3. Automated column scouting allows for an efficient approach for determining which HIC media should be employed for future, more exhaustive optimization experiments and protein purification runs 4.
The specific protein being purified here is recombinant green fluorescent protein (GFP); however, the approach may be adapted for purifying other proteins with one or more hydrophobic surface regions. GFP serves as a useful model protein, due to its stability, unique light absorbance peak at 397 nm, and fluorescence when exposed to UV light 5. Bacterial lysate containing wild type GFP was prepared in a high-salt buffer, loaded into a Bio-Rad DuoFlow medium pressure liquid chromatography system, and adsorbed to HiTrap HIC columns containing different HIC media. The protein was eluted from the columns and analyzed by in-line and post-run detection methods. Buffer blending, dynamic sample loop injection, sequential column selection, multi-wavelength analysis, and split fraction eluate collection increased the functionality of the system and reproducibility of the experimental approach.

An automated method for identifying suitable hydrophobic interaction chromatography (HIC) media to be used in the process of protein purification is presented. The method utilizes a medium-pressure liquid chromatography system including automated buffer blending, dynamic sample loop injection, sequential column selection, multi-wavelength analysis, and split fraction eluate collection.

タンパク質の精製で使用するための自​​動化された疎水性相互作用クロマトグラフィーカラムの選択

In contrast to other chromatographic methods for purifying proteins (e.g. gel filtration, affinity, and ion exchange), hydrophobic interaction ...

Chromatographic Purification of Highly Active Yeast Ribosomes

Eukaryotic ribosomes are much more labile as compared to their eubacterial and archael counterparts, thus posing a significant challenge to researchers. Particularly troublesome is the fact that lysis of cells releases a large number of proteases and nucleases which can degrade ribosomes. Thus, it is important to separate ribosomes from these enzymes as quickly as possible. Unfortunately, conventional differential ultracentrifugation methods leaves ribosomes exposed to these enzymes for unacceptably long periods of time, impacting their structural integrity and functionality. To address this problem, we utilize a chromatographic method using a cysteine charged Sulfolink resin. This simple and rapid application significantly reduces co-purifying proteolytic and nucleolytic activities, producing high yields of intact, highly biochemically active yeast ribosomes. We suggest that this method should also be applicable to mammalian ribosomes. The simplicity of the method, and the enhanced purity and activity of chromatographically purified ribosome represents a significant technical advancement for the study of eukaryotic ribosomes.

Contamination of preparations of eukaryotic ribosomes purified by traditional methods by co-purifying nucleases and proteases negatively impacts on downstream biochemical and structural analyses. A rapid and simple chromatographic purification method is used to solve this problem using yeast ribosomes as a model system.

高活性酵母のリボソームのクロマトグラフィー精製

Eukaryotic ribosomes are much more labile as compared to their eubacterial and archael counterparts, thus posing a significant challenge to researchers.  ...

Orthogonal Protein Purification Facilitated by a Small Bispecific Affinity Tag

Due to the high costs associated with purification of recombinant proteins the protocols need to be rationalized. For high-throughput efforts there is a demand for general methods that do not require target protein specific optimization1 . To achieve this, purification tags that genetically can be fused to the gene of interest are commonly used2 . The most widely used affinity handle is the hexa-histidine tag, which is suitable for purification under both native and denaturing conditions3 . The metabolic burden for producing the tag is low, but it does not provide as high specificity as competing affinity chromatography based strategies1,2.
Here, a bispecific purification tag with two different binding sites on a 46 amino acid, small protein domain has been developed. The albumin-binding domain is derived from Streptococcal protein G and has a strong inherent affinity to human serum albumin (HSA). Eleven surface-exposed amino acids, not involved in albumin-binding4 , were genetically randomized to produce a combinatorial library. The protein library with the novel randomly arranged binding surface (Figure 1) was expressed on phage particles to facilitate selection of binders by phage display technology. Through several rounds of biopanning against a dimeric Z-domain derived from Staphylococcal protein A5, a small, bispecific molecule with affinity for both HSA and the novel target was identified6 .
The novel protein domain, referred to as ABDz1, was evaluated as a purification tag for a selection of target proteins with different molecular weight, solubility and isoelectric point. Three target proteins were expressed in Escherishia coli with the novel tag fused to their N-termini and thereafter affinity purified. Initial purification on either a column with immobilized HSA or Z-domain resulted in relatively pure products. Two-step affinity purification with the bispecific tag resulted in substantial improvement of protein purity. Chromatographic media with the Z-domain immobilized, for example MabSelect SuRe, are readily available for purification of antibodies and HSA can easily be chemically coupled to media to provide the second matrix.
This method is especially advantageous when there is a high demand on purity of the recovered target protein. The bifunctionality of the tag allows two different chromatographic steps to be used while the metabolic burden on the expression host is limited due to the small size of the tag. It provides a competitive alternative to so called combinatorial tagging where multiple tags are used in combination1,7.

A novel and highly efficient two-step affinity chromatography protocol has been developed and is described in detail. The method is based on a small purification tag with two inherent affinities and is applicable to a wide range of target proteins with different properties.

小型二重特異性アフィニティタグによって容易に直交するタンパク質の精製

Due to the high costs associated with purification of recombinant proteins the protocols need to be rationalized. For high-throughput efforts there is a ...

Identification of Protein Interacting Partners Using Tandem Affinity Purification

A critical and often limiting step in understanding the function of host and viral proteins is the identification of interacting cellular or viral protein partners. There are many approaches that allow the identification of interacting partners, including the yeast two hybrid system, as well as pull down assays using recombinant proteins and immunoprecipitation of endogenous proteins followed by mass spectrometry identification1. Recent studies have highlighted the utility of double-affinity tag mediated purification, coupled with two specific elution steps in the identification of interacting proteins. This approach, termed Tandem Affinity Purification (TAP), was initially used in yeast2,3 but more recently has been adapted to use in mammalian cells4-8.
As proof-of-concept we have established a tandem affinity purification (TAP) method using the well-characterized eukaryotic translation initiation factor eIF4E9,10.The cellular translation factor eIF4E is a critical component of the cellular eIF4F complex involved in cap-dependent translation initiation10. The TAP tag used in the current study is composed of two Protein G units and a streptavidin binding peptide separated by a Tobacco Etch Virus (TEV) protease cleavage sequence. The TAP tag used in the current study is composed of two Protein G units and a streptavidin binding peptide separated by a Tobacco Etch Virus (TEV) protease cleavage sequence8. To forgo the need for the generation of clonal cell lines, we developed a rapid system that relies on the expression of the TAP-tagged bait protein from an episomally maintained plasmid based on pMEP4 (Invitrogen). Expression of tagged murine eIF4E from this plasmid was controlled using the cadmium chloride inducible metallothionein promoter.
Lysis of the expressing cells and subsequent affinity purification via binding to rabbit IgG agarose, TEV protease cleavage, binding to streptavidin linked agarose and subsequent biotin elution identified numerous proteins apparently specific to the eIF4E pull-down (when compared to control cell lines expressing the TAP tag alone). The identities of the proteins were obtained by excision of the bands from 1D SDS-PAGE and subsequent tandem mass spectrometry. The identified components included the known eIF4E binding proteins eIF4G and 4EBP-1. In addition, other components of the eIF4F complex, of which eIF4E is a component were identified, namely eIF4A and Poly-A binding protein. The ability to identify not only known direct binding partners as well as secondary interacting proteins, further highlights the utility of this approach in the characterization of proteins of unknown function.

Tandem affinity purification is a robust approach for the identification of protein binding partners. As proof of concept, this methodology was applied to the well-characterized translation initiation factor eIF4E to co-precipitate the host cell factors involved in translation initiation. This method is easily adapted to any cellular or viral protein.

タンデムアフィニティー精製を用いたタンパク質相互作用するパートナーの識別

A critical and often limiting step in understanding the function of host and viral proteins is the identification of interacting cellular or viral protein ...

Generation, Purification, and Characterization of Cell-invasive DISC1 Protein Species

Protein aggregation is seen as a general hallmark of chronic, degenerative brain conditions like, for example, in the neurodegenerative diseases Alzheimer's disease (A&beta;, tau), Parkinson's Disease (&alpha;-synuclein), Huntington's disease (polyglutamine, huntingtin), and others. Protein aggregation is thought to occur due to disturbed proteostasis, i.e. the imbalance between the arising and degradation of misfolded proteins. Of note, the same proteins are found aggregated in sporadic forms of these diseases that are mutant in rare variants of familial forms.
Schizophrenia is a chronic progressive brain condition that in many cases goes along with a permanent and irreversible cognitive deficit. In a candidate gene approach, we investigated whether Disrupted-in-schizophrenia 1 (DISC1), a gene cloned in a Scottish family with linkage to chronic mental disease1, 2, could be found as insoluble aggregates in the brain of sporadic cases of schizophrenia3. Using the SMRI CC, we identified in approximately 20 % of cases with CMD but not normal controls or patients with neurodegenerative diseases sarkosyl-insoluble DISC1 immunoreactivity after biochemical fractionation. Subsequent studies in vitro revealed that the aggregation propensity of DISC1 was influenced by disease-associated polymorphism S704C4, and that DISC1 aggresomes generated in vitro were cell-invasive5, similar to what had been shown for A&beta;6, tau7-9, &alpha;-synuclein10, polyglutamine11, or SOD1 aggregates12. These findings prompted us to propose that at least a subset of cases with CMD, those with aggregated DISC1 might be protein conformational disorders.
 Here we describe how we generate DISC1 aggresomes in mammalian cells, purify them on a sucrose gradient and use them for cell-invasiveness studies. Similarly, we describe how we generate an exclusively multimeric C-terminal DISC1 fragment, label and purify it for cell invasiveness studies. Using the recombinant multimers of DISC1 we achieve similar cell invasiveness as for a similarly labeled synthetic &alpha;-synuclein fragment. We also show that this fragment is taken up in vivo when stereotactically injected into the brain of recipient animals.

The generation, purification and cell invasion of intracellular, cytoplasmic full length DISC1 protein aggresomes from cell cultures and of a labeled, multimeric recombinant DISC1 protein fragment in E. coli are described. Cell invasiveness is shown for recipient cells in cell culture and for neurons in vivo after stereotactical brain inoculation.

細胞侵襲DISC1タンパク質種の生成、精製とキャラクタリゼーション

Protein aggregation is seen as a general hallmark of chronic, degenerative brain conditions like, for example, in the neurodegenerative diseases ...

Protein Purification-free Method of Binding Affinity Determination by Microscale Thermophoresis

Quantitative characterization of protein interactions is essential in practically any field of life sciences, particularly drug discovery. Most of currently available methods of KD determination require access to purified protein of interest, generation of which can be time-consuming and expensive. We have developed a protocol that allows for determination of binding affinity by microscale thermophoresis (MST) without purification of the target protein from cell lysates. The method involves overexpression of the GFP-fused protein and cell lysis in non-denaturing conditions. Application of the method to STAT3-GFP transiently expressed in HEK293 cells allowed to determine for the first time the affinity of the well-studied transcription factor to oligonucleotides with different sequences. The protocol is straightforward and can have a variety of application for studying interactions of proteins with small molecules, peptides, DNA, RNA, and proteins.

Microscale thermophoresis (MST) can be widely used for determination of binding affinity without purification of the target protein from cell lysates. The protocol involves overexpression of the GFP-fused protein, cell lysis in non-denaturing conditions, and detection of MST signal in the presence of varying concentrations of the ligand.

マイクロスケール熱泳動によって結合親和性の決定のタンパク質精製·フリー法

Quantitative characterization of protein  interactions is essential in practically any field of life sciences,  particularly drug discovery. Most of ...