私たちは親切に染料を提供するためレスリー·M.·レーブにだけでなく、この技術の初期開発に参加した私たちの共同研究者クヌートHolthoff、アーサーKonnerthとマルコCanepariに感謝しています。 NSFの助成金、IOS-0817969、NIHの助成NS068407とM136043で、エール大学神経科学カヴリ研究所によってサポートされています。

1。機器セットアップステップ1.1。イメージングセットアップ膜電位感受性色素信号を記録するための鍵は、適切なセットアップデザインです。我々は、3つのカメラを搭載した正立顕微鏡（オリンパスBX51WIまたはツァイスAxioExaminer）を使用します。セットアップはニコン60X/1.0 NAまたはツァイス63X/1.0 NAの水浸漬目標のいずれかを使用して、落射蛍光、広い視野顕微鏡モードでの励起光によって脳スライスにおける照明個々のニューロンのために設計されています。当社の顕微鏡は防振台にボルトで固定し、電動可動ステージを完備しています。各顕微鏡は、3つのカメラポートが装備されています。一台のカメラポートがビデオ顕微鏡（IR-1000、DAGE MTI、米国）赤外線DICのための標準的な高空間分解能のCCDカメラを持っています。第2のカメラポートは、比較的低い空間分解能（80×80ピクセル）が、優れたダイナミックレンジ（14ビット）と読み、非常に低いと、高速データ·アクイジション·カメラ（最大20 kHzのフレームレート）を有しているノイズ（NeuroCCD-SM RedShirtImaging LLCは、ディケーター、ジョージア州）。用共焦点画像のzスタックを収集するために使用スピニングディスク共焦点スキャナ（CSU-10、横河電機、日本）に搭載され、第3のカメラポートは、高空間分解能を持つCCDカメラ（PCO AG、ドイツPixelFly、1392x1024ピクセル）を持つ染色された細胞の詳細な形態学的再建。倍周波数ダイオード励起Nd：波長532 nm（MLL-III/400 mWで、CNI、長春、中国）での連続波YVO4レーザ（400 mW）の発光は、励起光の源である。シャッター（LS6、ビンセント·アソシエイツ）によってゲート直径2mmのレーザービームがあふれへの背面開口部を設計したシングルポートの落射蛍光コンデンサー（フォトニクス社、グレーフェルフィングまで、ドイツ）を介して顕微鏡に結合された光ガイドに導かれる客観的かつ物体面の均一な照明の近くに提供する。レーザ光 ​​はによってV メートルイメージングの感度を最大にするために、従来のキセノンアークランプの代わりに使用されます：（1）単色EXを使用して染料9、10、（2）アークランプによって達成することができるレベルを超えて、励起光の強度を増加させるのV mの感度を最大にするために、吸収スペクトルの赤い翼で引用光。励起光は560nmの中心波長を持つダイクロイックミラーにより準備に反映されていたと記録された蛍光の光は610nmのバリアフィルタ（Schott社RG610）に通した。光強度の増加とほぼ最適な単色励起波長の使用の複合効果により、以前の測定6に比べて約50倍の電圧イメージングの感度が劇的に改善しました。 ステップ1.2。均一な照明を調整蛍光スライド標準（緑色励起/赤色発光）を使用します。 CCDが飽和しないように、レーザ光路の適切な減光フィルターを挿入します。の表面に目的を集中スライド。レーザーランチャー対物レンズの前の石英光導路の受信端の位置を調整し、中心と均一達成するために、落射蛍光コンデンサー上の適切なアクチュエータを用いた顕微鏡に取り付けられたライトガイドの出力端の位置を調整視野の照明。 ステップ1.3。振動ノイズを決定蛍光スライドの表面に小さな黒いインクマークを置きます。連続記録モードでNeuroCCD持つレコード光強度。黒インクマークの暗い端に目的を当てる。 2 kHzのフレームレートで約100ミリ秒の光強度を記録します。均一に照明エリアから、インクマークの縁に沿って約20ピクセルからの光を受けて〜20ピクセルから小数光強度トレース（ΔF/ F）の空間平均を表示します。高コントラストのエッジを持つピクセルから録音中の過剰なノイズがで振動ノイズを反映システム。 手順1.4。振動絶縁これは実験的な撮影状況に匹敵する光強度におけるショット雑音以下のレベルに振動アイソレーションテーブルを使用することにより、振動を低減するために必須です。画像のシャープなエッジをカバーするピクセルからの光強度の振動ノイズが無視できるまで防振台を調整します。可動部品（メカニカルシャッター、ファン）を備えた機器はいずれもテーブルの上にマウントすることはできません。振動から絶縁されていません他のコンポーネントに接続されているテーブルの上に機器​​のケーブルは、顕微鏡に機械的振動を伝達しないように緩んでなければなりません。 2。 V メートルイメージングのための適切なニューロンの選択ステップ2.1。ニューロンの選択標準的な手順に従って、脳スライスを作成します。 iの個々の神経細胞にEGFPを発現するマウスラインを使用nterest。回転するディスク共焦点システムでは、スライスのEGFP標識された神経細胞を可視化する。無傷の軸索/樹木でV メートルイメージングのための神経細胞を選択し、プロセスはスライスの表面に平行かつ近接し実行されています。軸索と樹状突起は薄いが、ほとんどの部分は、DIC顕微鏡モードでは表示されませんので、これは野生型マウスでは実現できません。 3。電位感受性色素を使用したロードニューロンステップ3.1。パッチピペットの充填電極テーパーの2月3日までの約15秒間陰圧を適用することにより、色素無細胞内液で先端からガラスパッチピペットを埋める。先端における染料の無料のソリューションは、バックグラウンド蛍光を増加させ、劇的に信号対雑音比を減少させるスライスに色素の流出を防止することが必要である。膜非透過性の膜電位感受性色素JPW3028が溶解含有する溶液と電極を埋戻し細胞内溶液（0.8 mM）のインチ JPW3028、細胞内のアプリケーションのために最も成功した電圧プローブは、まだ十分に水をマイクロインジェクションに使用するには可溶である親油性スチリル色素のANEPシリーズの二重に正に帯電アナログである。この色素のジ-エチル類縁体と実質的に同一の特性（電圧感度を含む）を有しており、JPW1114（ 表1参照）として市販されている。私たちは、蒸留H 2 O中の20mMストック溶液を調製ストック溶液の50μlアリコートを-20℃で凍結保存されます0.8 mMの最終色素濃度は、原液の2μlを実験当日の細胞内溶液50μlに溶解させる。在庫色素溶液は安定しており、数ヶ月のために室温に保つことができる。それが使い果たされるまで、したがって、私たちは、室温で150μlアリコートを保つ。 ステップ3.2。迅速ギガシールを確立<p claSS = &quot;jove_content&quot;&gt;パッチ以前に選択されたニューロンと20から45分間、全細胞構成でソーマに体パッチピペットからの染料の自由拡散を可能にします。それは先端の染料を含まない溶液の量を小さく保つことができるように、できるだけ早くシールを得ることが不可欠である。電極における色素なしで速いパッチを実践することによって開始します。周囲の組織を汚染することなく、チップ内の色素を含まない溶液の最小量を使用することを目的とした染料と次に、実際のパッチ適用およびローディングニューロン。練習すれば、それは1〜2分以内にシールを確立することが可能である。 ステップ3.3。染色のレベルを監視全細胞構成における染料拡散中、電流クランプモードで誘発活動電位を記録することによって、ニューロンの生理的状態を監視します。さらに、2 kのフレームレートで細胞体からの安静時の光強度（RLI）を記録することにより、染色の量を監視<html> HzとNDフィルター（我々は400 mWのレーザーからのレーザー光強度の0.04％を使用）で調整フル光強度のほんの一部で。活動電位は、電極の大きさと抵抗に応じて、通常20から40分後に、広げるために開始されるまで色素ローディング処理を続行します。 スパイクの広がりは、完全に可逆および体膜中の色素の飽和濃度の容量性負荷効果による可能性が最も高い。染料濃度はニューロン全体で平衡化した後にスパイクの波形が完全に復元されます。 ステップ3.4。染料電極を取り外し期間を染色するの終わりには、慎重に持ち上げ全細胞から外にアウトパッチ設定への移行のプロセスで達成されることを確実に電圧クランプ構成でソーマからパッチピペットを引き抜きます。 ステップ3.5。染料拡散待つENT &quot;&gt;神経プロセスに広めるために電位感受性色素を可能にするために、室温でさらに1.5から2時間のスライスをインキュベートする。染料拡散し、かなりの量の後に離れてからの樹状細胞体と軸索のプロセスに、波形をAPは完全に復元されます。 4。光学式記録手順4.1。イメージングのための細胞区画を選択低光レベル蛍光とDICの下で標準（無色素）パッチ電極で再度パッチニューロンの下で染色されたニューロンの細胞体の位置を確認します。電圧撮像するCCDの連続記録モードで10から40 Hzのフレームレートで低照度下で神経プロセスを可視化します。目的のオブジェクトを視覚化するために必要な最小限度の減光フィルターで光レベルを下げてください。我々は、染色されたニューロンの位置決め時に400mWのレーザー強度の0.01％を使用しています。 XYステージを使用して、トンへの関心の神経突起を配置彼撮像領域の真ん中。顕微鏡の部分的に閉じ視野絞り虹彩を用いた励起光からソーマを保護します。高強度の励起光からソーマをシールドすることが大幅に記録中に光線力学的ダメージを減らすことができます。 膜電位の過渡に関連4.2記録された光信号をステップ個々の樹枝状でbackpropagated APに関連した光信号を記録します。軸索内のAPに関連する光信号を記録します。樹状突起棘のAPをbackpropagatingに関連した光信号を記録します。信号波形の正確な再構成のための適切なフレームレートを使用し、漂白、染料と光線力学損害を最小限にするために記録期間と高強度の励起光への曝露はできるだけ短くしてください。例えば、軸索内の単一活動電位の発生と進展のシーケンスを調べると、5から10ミリ秒の期間を記録する必要があります。励起光激化録音中にtyは一方では信号対雑音比、他方で漂白染料および光線力学損傷の程度との間の妥協である。我々は、直径300μmの領域が点灯している軸索の長い部分から記録で400 mWのレーザの強度を100％使用。励起光が樹状突起スパインのイメージングのための30μmの直径の領域にフォーカスされている場合、我々は、レーザ光強度の10〜25％を使用しています。記録の必要な期間は、最適な励起光強度を決定する重要な要因であり、短い記録期間は、より高い光強度を可能にします。最適な照度は、それぞれ最高の準備と​​測定の設定について経験的に決定されます。 5。データ解析ステップ5.1。既知のエラーの生データを訂正データの分析と表示はIDL（ITT視覚情報solutをで書かNeuroPlexプログラム（RedShirtImaging）を用いて行ったイオンは、コロラド州ボルダー）とカスタムのVisual Basicルーチン。低光レベルの条件の下では、バックグラウンド蛍光はΔF/ F信号の大きさの重要な決定要因となります。生データは、最初のスライス上に染色されていない領域から求めた平均バックグラウンド蛍光強度を差し引くことによってこの効果を補正した。その後、信号アライメントソフトウェアはAP開始の時間ジッタのためだけでなく、平均化時の準備の可能小さな動きを補正するために使用されていました。時間領域では、AP信号が平均化の開始（ 図1B）で取得された基準信号に各試験で電気的に記録されたAPの相互相関によって整列させた。空間領域では、画像は準備の可能性のある小さな横方向の動きを補正するために画像の相互相関によってオフラインに二次元的に配列していた。 z次元の画像のピントは、個々の試験の前に確認された。Smalの<html>リットルの調整が頻繁に必要であった。 図1Bに示すように、空間的にも時間的に整列された信号を平均化した。染料の脱色による光強度の緩やかな変化は無刺激（ 図1B）で記録試験から得適切なデュアル指数関数でデータを分割して補正した。 APの信号の波形はキュービックスプライン補間は、各データ点を通る区分的に連続した曲線を使用して一連のデータポイントから再構築されました。電位感受性色素信号がミリ秒の時間スケールでかなりの歪みが無く、膜電位を追跡していることを確認するには、相馬からの電気AP信号は 、 図3Bに示すように、隣接する軸索小丘からの光AP信号と比較した。二つの信号は、光記録におけるショットノイズを考慮して、非常に密接に重ねる。 les/ftp_upload/4261/4261fig1.jpg &quot;/&gt; 図1。データ解析（アニメーション）。 （A）はアッパーパネル：記録位置で軸索で染色したニューロンの高分解能共焦点画像。記録電極は、模式的に示さ基底樹状突起の横のソーマ、細胞外刺激電極に接続されている。活動電位は細胞外、シナプス刺激により誘発される。ソーマ（黒のトレース）は、AISからの光学録音（赤いトレース）からV メートルイメージングのために使用されるCCDによって得られた軸索の低空間分解能蛍光像（B）電極レコーディング、およびランヴィエ絞輪（緑のトレース）から：下のパネル。 。トップトレース：AP通信開始の時間ジッタを示す9の試験からの生データ。トレースの2行目：時間的に整列信号。トレースの3行目：平均化された信号。トレースの4行目：漂白剤補正。ボトムトレース：テンポラル平滑化の1つのパスを持つ3次スプライン補間。

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デヤンZecevic彼はLLCをRedShirtImagingの共同経営者。、電位感受性色素記録に使用される高速、低ノイズCCDカメラに特化した会社であることを宣言します。他のすべての著者らは金銭的な利益または現在の研究に関連した潜在的な利益相反が報告されていない。

この記事では、サブミクロンおよびサブミリ時空間分解能で個々の神経細胞の電気的活動を監視するための電位感受性色素記録方法を説明します。最適に近い波長のレーザー励起が（信号の大きさに関して）従来のアプローチ以上〜50倍記録の感度を向上させました。感度電流は樹状突起、軸索、軸索側枝と軸索末端だけでなく、個々の樹状突起棘を含む個々のニューロンのすべての部分か?...

<table border="1"><tbody><tr><td> コンポーネントの名前 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td><td> コメント（オプション） </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> セットアップコンポーネント </td></tr><tr><td>正立顕微鏡</td><td>オリンパス株式会社</td><td> BX51WI </td><td> 3つのカメラのポートを持つ</td></tr><tr><td>電動可動ステージ</td><td> Siskiyou </td><td> MXOPi.2 </td><td></td></tr><tr><td>オリンパスBX51用落射蛍光コンデンサー</td><td>フォトニクスTILL </td><td> 0000-560-11659 </td><td></td></tr><tr><td>正立顕微鏡</td><td>カールツァイス、LLC </td><td> AxioExaminer D1は</td><td> 3つのカメラのポートを持つ</td></tr><tr><td>電動トッププレート</td><td> Scientificaリミテッド</td><td> MMBP </td><td></td> &lt;/ TR&gt; <tr><td>ツァイスAxioExaminer用落射蛍光コンデンサー</td><td>フォトニクスTILL </td><td></td><td></td></tr><tr><td>データ·アクイジション·カメラ</td><td> RedShirtImaging LLC </td><td> NeuroCCD-SM </td><td>高速、低読み出しノイズ</td></tr><tr><td> IR-DIC用CCD </td><td> DAGE-MTI </td><td> IR-1000 </td><td></td></tr><tr><td>スピニングディスク共焦点スキャナ</td><td>横河電機</td><td> CSU-10 </td><td></td></tr><tr><td>共焦点スキャナの高空間解像度CCD </td><td> PCO AG </td><td> PixelFly </td><td> 1392x1024ピクセル</td></tr><tr><td> DPSS CWレーザ（波長532nm） </td><td> CNIのオプトエレクトロニクス技術。株式会社</td><td> MLL-III-532 400mWの</td><td>励起光源</td></tr><tr><td>マルチモードファイバランチャー</td><td> Siskiyou </td><td> SM-CFT </td><td></td></tr><tr><td>ライトガイド</td><td>写真TILLのNIC </td><td> 0000-515-11524 </td><td></td></tr><tr><td>シャッター</td><td>ヴィンセント·アソシエイツ</td><td> LS6 </td><td></td></tr><tr><td>防振台</td><td>マイナスKテクノロジー</td><td> MK26 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> 特定の試薬 </td></tr><tr><td>ジ-2 - ANEPEQ（JPW 1114） </td><td>ライフテクノロジーズ</td><td> D-6923 </td><td>電位感受性色素</td></tr><tr><td> Crym-EGFPマウスライン</td><td> GENSAT（MMRRC） </td><td>ストックTG（Crym-EGFP）GF82Gsat/Mmcd </td><td>まばらにレイヤ5皮質ニューロンにEGFPを発現する</td></tr></tbody></table>

voltage-sensitive dye recording from axons, dendrites and dendritic spines of individual neurons in brain slices

生物物理学的特性および単一ニューロンの機能的な組織を理解し、それらがどのように情報を処理する脳がどのように機能するかを理解するための基本です。任意の神経細胞の主な機能は、通常、複数の情報源から、電気信号​​を処理することです。神経突起の電気的特性は、詳細な測定の不存在下で予測することは非常に、複雑でダイナミック、そして、一般的な場合では、不可能である。彼らは活動電位の開始に影響を与えるために特定の場所で神経プロセスと合計する上の原点のサイトから移動する際に、複数のサイトで、サブスレッショルドイベントを一つは、理想的には、監視できるようにしたいと思い、このような測定を得るために。この目標は、電極を用いる測定の技術的制限により、任意のニューロンで達成されていません。この欠点を克服するために、それは大規模な並列recordinを許可するイメージング技術でパッチ電極のアプローチを補完することが非常に望ましいニューロンのすべての部分からのGS。サブミリセカンド、サブマイクロメートルの分解能によって特徴付け-有機電位感受性色素（V メートルイメージング）と膜電位の過渡光記録-ここでは、このような手法を説明します。我々の方法は、電位感受性分子プローブ2の先駆的な研究に基づいています。初期の技術の多くの側面を連続数十3、5、11より改善されてきた。また、前作はV メートルイメージングの二つの本質的な特性を文書化した。まず、蛍光シグナルは、全体の生理的な範囲で膜電位（、10、14、16、100 mVから-100 MV）に直線的に比例します。第二に、ここで使用される電圧感受性色素（JPW 3028）と、ロード·ニューロンは、検出可能な薬理作用を持っていません。色素ローディング中にスパイクの広がり記録、7 4完全に可逆的である。さらに、実験的証拠は、それが得ることが可能であることを示しています前の任意の検出可能な光毒性効果4、6、12、13への録音のかなりの数（最大数百人まで）。現在のところ、我々は、V メートルイメージング技術の感度を最大にするために、最適に近い波長でのレーザ光 ​​源の明るさと優れた安定性を活用しています。現在の感度は軸索と軸索側枝は、端末樹の枝、及び個々の樹状突起棘含むニューロンのすべての部分からV メートル過渡の複数のサイト光学録音を可能にする。信号の相互作用に関する情報が取得された定量的な解析だけでなく、ムービーの形で直接可視化することができます。

成功した共焦点顕微鏡は、スライスの表面に近いとフォーカスの一方の面に配置されている無傷の神経プロセスの明確な識別を可能にするべきである。前電位感受性色素負荷への電圧イメージングに適した神経細胞の選択は非常に重要です。皮質スライス（Crymトランスジェニックマウス系統）にEGFPを発現L5錐体細胞の共焦点画像の例を図2に示します。個々のニューロンの軸索は...

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Voltage-sensitive Dye Recording from Axons, Dendrites and Dendritic Spines of Individual Neurons in Brain Slices

サブミクロンの空間とサブミリ秒の時間分解能で膜電位の変化を監視するためのイメージング技術が記載されている。電位感受性色素のレーザー励起に基づく手法では、軸索と軸索側枝、樹枝状の端子、および個々の樹状突起棘における信号の測定が可能です。

軸索、樹状突起および脳スライスにおける個々のニューロンの樹状突起棘から電位感受性色素記録

Understanding the biophysical properties and functional organization of single neurons and how they process information is fundamental for understanding ...

voltage-sensitive-dye-recording-from-axons-dendrites-dendritic-spines

Research

JoVE Journal

Neuroscience

16.6K ビュー.  Yale University School of Medicine. サブミクロンの空間とサブミリ秒の時間分解能で膜電位の変化を監視するためのイメージング技術が記載されている。電位感受性色素のレーザー励起に基づく手法では、軸索と軸索側枝、樹枝状の端子、および個々の樹状突起棘における信号の測定が可能です。

ビデオ: Voltage-sensitive Dye Recording from Axons, Dendrites and Dendritic Spines of Individual Neurons in Brain Slices

DiOLISTIC Labeling of Neurons from Rodent and Non-human Primate Brain Slices

DiOLISTIC staining uses the gene gun to introduce fluorescent dyes, such as DiI, into neurons of brain slices (Gan et al., 2009; O'Brien and Lummis, 2007; Gan et al., 2000). Here we provide a detailed description of each step required together with exemplary images of good and bad outcomes that will help when setting up the technique. In our experience, a few steps proved critical for the successful application of DiOLISTICS. These considerations include the quality of the DiI-coated bullets, the extent of fixative exposure, and the concentration of detergent used in the incubation solutions. Tips and solutions for common problems are provided. This is a versatile labeling technique that can be applied to multiple animal species at a wide range of ages. Unlike other fluorescent labeling techniques that are limited to preparations from young animals or restricted to mice because they rely on the expression of a fluorescent transgene, DiOLISTIC labeling can be applied to animals of all ages, species and genotypes and it can be used in combination with immunostaining to identify a specific subpopulation of cells. Here we demonstrate the use of DiOLISTICS to label neurons in brain slices from adult mice and adult non-human primates with the purpose of quantifying dendrite branching and dendritic spine morphology.

We demonstrate the use of the gene gun to introduce fluorescent dyes, such as DiI, into neurons in brain slices from rodents and non-human primates of different ages. In this particular case, we use adult mice (3-6 months old) and adult cynomologus monkeys (9-15 years old). This technique, originally described by the laboratory of Dr. Lichtman (Gan et al., 2000), is well suited for the study of dendritic branching and dendritic spine morphology and can be combined with traditional immunostaining, if detergents are kept at a low concentration.

げっ歯類からの神経細胞とヒト以外の霊長類の脳スライスのDiOLISTIC標識

DiOLISTIC staining uses the gene gun to introduce fluorescent dyes, such as DiI, into neurons of brain slices (Gan et al., 2009; O'Brien and Lummis, 2007; ...

神経科学

Optical Imaging of Neurons in the Crab Stomatogastric Ganglion with Voltage-sensitive Dyes

Voltage-sensitive dye imaging of neurons is a key methodology for the understanding of how neuronal networks are organised and how the simultaneous activity of participating neurons leads to the emergence of the integral functionality of the network. Here we present the methodology of application of this technique to identified pattern generating neurons in the crab stomatogastric ganglion. We demonstrate the loading of these neurons with the fluorescent voltage-sensitive dye Di-8-ANEPPQ and we show how to image the activity of dye loaded neurons using the MiCAM02 high speed and high resolution CCD camera imaging system. We demonstrate the analysis of the recorded imaging data using the BVAna imaging software associated with the MiCAM02 imaging system. The simultaneous voltage-sensitive dye imaging of the detailed activity of multiple neurons in the crab stomatogastric ganglion applied together with traditional electrophysiology techniques (intracellular and extracellular recordings) opens radically new opportunities for the understanding of how central pattern generator neural networks work.

Here we present the methodology for fast and high resolution fluorescent voltage-sensitive dye imaging of detailed activity of neurons in the crab stomatogastric ganglion.

電位感受性色素を持つカニ口と胃の神経節における神経細胞の光学的イメージング

Voltage-sensitive dye imaging of neurons is a key methodology for the understanding of how neuronal networks are organised and how the simultaneous ...

Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) of Fluorescence Tagged Proteins in Dendritic Spines of Cultured Hippocampal Neurons

FRAP has been used to quantify the mobility of GFP-tagged proteins. Using a strong excitation laser, the fluorescence of a GFP-tagged protein is bleached in the region of interest. The fluorescence of the region recovers when the unbleached GFP-tagged protein from outside of the region diffuses into the region of interest. The mobility of the protein is then analyzed by measuring the fluorescence recovery rate. This technique could be used to characterize protein mobility and turnover rate.
In this study, we express the (enhanced green fluorescent protein) EGFP vector in cultured hippocampal neurons. Using the Zeiss 710 confocal microscope, we photobleach the fluorescence signal of the GFP protein in a single spine, and then take time lapse images to record the fluorescence recovery after photobleaching. Finally, we estimate the percentage of mobile and immobile fractions of the GFP in spines, by analyzing the imaging data using ImageJ and Graphpad softwares.
This FRAP protocol shows how to perform a basic FRAP experiment as well as how to analyze the data.

Fluorescence Recovery After Photobleaching FRAP of Fluorescence Tagged Proteins in Dendritic Spines of Cultured Hippocampal Neurons

FRAP has been used to quantify the mobility of Green Fluorescence Protein (GFP)-tagged proteins in cultured cells. We examined the mobile/immobile fractions of the GFP by analyzing the fluorescence recovery percentage after photobleaching. In this study, FRAP was performed at spines of hippocampal neurons.

培養海馬ニューロンの樹状突起棘の蛍光タグ融合タンパク質の光退色後蛍光回復（FRAP）

FRAP has been used to quantify the mobility of GFP-tagged proteins. Using a strong excitation laser, the fluorescence of a GFP-tagged protein is bleached ...

Vibrodissociation of Neurons from Rodent Brain Slices to Study Synaptic Transmission and Image Presynaptic Terminals

Mechanical dissociation of neurons from the central nervous system has the advantage that presynaptic boutons remain attached to the isolated neuron of interest. This allows for examination of synaptic transmission under conditions where the extracellular and postsynaptic intracellular environments can be well controlled. A vibration-based technique without the use of proteases, known as vibrodissociation, is the most popular technique for mechanical isolation. A micropipette, with the tip fire-polished to the shape of a small ball, is placed into a brain slice made from a P1-P21 rodent. The micropipette is vibrated parallel to the slice surface and lowered through the slice thickness resulting in the liberation of isolated neurons. The isolated neurons are ready for study within a few minutes of vibrodissociation. This technique has advantages over the use of primary neuronal cultures, brain slices and enzymatically isolated neurons including: rapid production of viable, relatively mature neurons suitable for electrophysiological and imaging studies; superior control of the extracellular environment free from the influence of neighboring cells; suitability for well-controlled pharmacological experiments using rapid drug application and total cell superfusion; and improved space-clamp in whole-cell recordings relative to neurons in slice or cell culture preparations. This preparation can be used to examine synaptic physiology, pharmacology, modulation and plasticity. Real-time imaging of both pre- and postsynaptic elements in the living cells and boutons is also possible using vibrodissociated neurons. Characterization of the molecular constituents of pre- and postsynaptic elements can also be achieved with immunological and imaging-based approaches.

This report demonstrates a technique for mechanical isolation of individual viable neurons retaining attached presynaptic boutons. Vibrodissociated neurons have the advantages of rapid production, excellent pharmacological control and improved space-clamp without influence from neighboring cells. This method can be used for imaging of synaptic elements and patch-clamp recording.

シナプス伝達とイメージシナプス前終末を研究するために齧歯類の脳スライスからの神経細胞のVibrodissociation

Mechanical dissociation of neurons from the central nervous system has the advantage that presynaptic boutons remain attached to the isolated neuron of ...

Morphological Analysis of Drosophila Larval Peripheral Sensory Neuron Dendrites and Axons Using Genetic Mosaics

Nervous system development requires the correct specification of neuron position and identity, followed by accurate neuron class-specific dendritic development and axonal wiring. Recently the dendritic arborization (DA) sensory neurons of the Drosophila larval peripheral nervous system (PNS) have become powerful genetic models in which to elucidate both general and class-specific mechanisms of neuron differentiation.
There are four main DA neuron classes (I-IV)1. They are named in order of increasing dendrite arbor complexity, and have class-specific differences in the genetic control of their differentiation2-10. The DA sensory system is a practical model to investigate the molecular mechanisms behind the control of dendritic morphology11-13 because: 1) it can take advantage of the powerful genetic tools available in the fruit fly, 2) the DA neuron dendrite arbor spreads out in only 2 dimensions beneath an optically clear larval cuticle making it easy to visualize with high resolution in vivo, 3) the class-specific diversity in dendritic morphology facilitates a comparative analysis to find key elements controlling the formation of simple vs. highly branched dendritic trees, and 4) dendritic arbor stereotypical shapes of different DA neurons facilitate morphometric statistical analyses.
DA neuron activity modifies the output of a larval locomotion central pattern generator14-16. The different DA neuron classes have distinct sensory modalities, and their activation elicits different behavioral responses14,16-20. Furthermore different classes send axonal projections stereotypically into the Drosophila larval central nervous system in the ventral nerve cord (VNC)21. These projections terminate with topographic representations of both DA neuron sensory modality and the position in the body wall of the dendritic field7,22,23. Hence examination of DA axonal projections can be used to elucidate mechanisms underlying topographic mapping7,22,23, as well as the wiring of a simple circuit modulating larval locomotion14-17.
We present here a practical guide to generate and analyze genetic mosaics24 marking DA neurons via MARCM (Mosaic Analysis with a Repressible Cell Marker)1,10,25 and Flp-out22,26,27 techniques (summarized in Fig. 1).

Morphological Analysis of Drosophila Larval Peripheral Sensory Neuron Dendrites and Axons Using Genetic Mosaics

The dendritic arborization sensory neurons of the Drosophila larval peripheral nervous system are useful models to elucidate both general and neuron class-specific mechanisms of neuron differentiation. We present a practical guide to generate and analyze dendritic arborization neuron genetic mosaics.

の形態素解析ショウジョウバエ</em遺伝モザイクを使用>幼虫末梢感覚ニューロンの樹状突起と軸索

Nervous system development requires the correct specification of neuron position and identity, followed by accurate neuron class-specific dendritic ...

Recording Electrical Activity from Identified Neurons in the Intact Brain of Transgenic Fish

Understanding the cell physiology of neural circuits that regulate complex behaviors is greatly enhanced by using model systems in which this work can be performed in an intact brain preparation where the neural circuitry of the CNS remains intact. We use transgenic fish in which gonadotropin-releasing hormone (GnRH) neurons are genetically tagged with green fluorescent protein for identification in the intact brain. Fish have multiple populations of GnRH neurons, and their functions are dependent on their location in the brain and the GnRH gene that they express1 . We have focused our demonstration on GnRH3 neurons located in the terminal nerves (TN) associated with the olfactory bulbs using the intact brain of transgenic medaka fish (Figure 1B and C). Studies suggest that medaka TN-GnRH3 neurons are neuromodulatory, acting as a transmitter of information from the external environment to the central nervous system; they do not play a direct role in regulating pituitary-gonadal functions, as do the well-known hypothalamic GnRH1 neurons2, 3 .The tonic pattern of spontaneous action potential firing of TN-GnRH3 neurons is an intrinsic property4-6, the frequency of which is modulated by visual cues from conspecifics2 and the neuropeptide kisspeptin 15. In this video, we use a stable line of transgenic medaka in which TN-GnRH3 neurons express a transgene containing the promoter region of Gnrh3 linked to enhanced green fluorescent protein7 to show you how to identify neurons and monitor their electrical activity in the whole brain preparation6.

In this video, we will demonstrate how to record electrical activity from identified single neurons in a whole brain preparation, which preserves complex neural circuits. We use transgenic fish in which gonadotropin-releasing hormone (GnRH) neurons are genetically tagged with a fluorescent protein for identification in the intact brain preparation.

トランスジェニックフィッシュの無傷の脳内で識別ニューロンからの電気的活動を記録する

Understanding the cell physiology of neural circuits that regulate complex behaviors is greatly enhanced by using model systems in which this work can be ...

Imaging Dendritic Spines of Rat Primary Hippocampal Neurons using Structured Illumination Microscopy

Dendritic spines are protrusions emerging from the dendrite of a neuron and represent the primary postsynaptic targets of excitatory inputs in the brain. Technological advances have identified these structures as key elements in neuron connectivity and synaptic plasticity. The quantitative analysis of spine morphology using light microscopy remains an essential problem due to technical limitations associated with light's intrinsic refraction limit. Dendritic spines can be readily identified by confocal laser-scanning fluorescence microscopy. However, measuring subtle changes in the shape and size of spines is difficult because spine dimensions other than length are usually smaller than conventional optical resolution fixed by light microscopy's theoretical resolution limit of 200 nm.
Several recently developed super resolution techniques have been used to image cellular structures smaller than the 200 nm, including dendritic spines. These techniques are based on classical far-field operations and therefore allow the use of existing sample preparation methods and to image beyond the surface of a specimen. Described here is a working protocol to apply super resolution structured illumination microscopy (SIM) to the imaging of dendritic spines in primary hippocampal neuron cultures. Possible applications of SIM overlap with those of confocal microscopy. However, the two techniques present different applicability. SIM offers higher effective lateral resolution, while confocal microscopy, due to the usage of a physical pinhole, achieves resolution improvement at the expense of removal of out of focus light. In this protocol, primary neurons are cultured on glass coverslips using a standard protocol, transfected with DNA plasmids encoding fluorescent proteins and imaged using SIM. The whole protocol described herein takes approximately 2 weeks, because dendritic spines are imaged after 16-17 days in vitro, when dendritic development is optimal. After completion of the protocol, dendritic spines can be reconstructed in 3D from series of SIM image stacks using specialized software.

This article describes a working protocol to image dendritic spines from hippocampal neurons in vitro using Structured Illumination Microscopy (SIM). Super-resolution microscopy using SIM provides image resolution significantly beyond the light diffraction limit in all three spatial dimensions, allowing the imaging of individual dendritic spines with improved detail.

構造化照明顕微鏡を用いてラット初代海馬ニューロンの樹状突起棘を画像化

Dendritic spines are protrusions emerging from the dendrite of a neuron and represent the primary postsynaptic targets of excitatory inputs in the brain. ...

Acute Dissociation of Lamprey Reticulospinal Axons to Enable Recording from the Release Face Membrane of Individual Functional Presynaptic Terminals

Synaptic transmission is an extremely rapid process. Action potential driven influx of Ca2+&#160;into the presynaptic terminal, through voltage-gated calcium channels (VGCCs) located in the release face membrane, is the trigger for vesicle fusion and neurotransmitter release. Crucial to the rapidity of synaptic transmission is the spatial and temporal synchrony between the arrival of the action potential, VGCCs and the neurotransmitter release machinery. The ability to directly record Ca2+&#160;currents from the release face membrane of individual presynaptic terminals is imperative for a precise understanding of the relationship between presynaptic Ca2+&#160;and neurotransmitter release. Access to the presynaptic release face membrane for electrophysiological recording is not available in most preparations and presynaptic Ca2+&#160;entry has been characterized using imaging techniques and macroscopic current measurements &#8211; techniques that do not have sufficient temporal resolution to visualize Ca2+ entry. The characterization of VGCCs directly at single presynaptic terminals has not been possible in central synapses and has thus far been successfully achieved only in the calyx-type synapse of the chick ciliary ganglion and in rat calyces. We have successfully addressed this problem in the giant reticulospinal synapse of the lamprey spinal cord by developing an acutely dissociated preparation of the spinal cord that yields isolated reticulospinal axons with functional presynaptic terminals devoid of postsynaptic structures. We can fluorescently label and identify individual presynaptic terminals and target them for recording. Using this preparation, we have characterized VGCCs directly at the release face of individual presynaptic terminals using immunohistochemistry and electrophysiology approaches. Ca2+ currents have been recorded directly at the release face membrane of individual presynaptic terminals, the first such recording to be carried out at central synapses.

Recording Ca2+ currents at the presynaptic release face membrane is key to a precise understanding of Ca2+ entry and neurotransmitter release. We present an acute dissociation of the lamprey spinal cord that yields functional isolated reticulospinal axons, permitting recording directly from the release face membrane of individual presynaptic terminals.

ヤツメウナギ網様体軸索の急性解離は、個別の機能シナプス前終末のリリース顔膜から録音を有効にする方法

Synaptic transmission is an extremely rapid process. Action potential driven influx of Ca2+&#160;into the presynaptic terminal, through voltage-gated ...

Recording Synaptic Plasticity in Acute Hippocampal Slices Maintained in a Small-volume Recycling-, Perfusion-, and Submersion-type Chamber System

Even though experiments on brain slices have been in use since 1951, problems remain that reduce the probability of achieving a stable and successful analysis of synaptic transmission modulation when performing field potential or intracellular recordings. This manuscript describes methodological aspects that might be helpful in improving experimental conditions for the maintenance of acute brain slices and for recording field excitatory postsynaptic potentials in a commercially available submersion chamber with an outflow-carbogenation unit. The outflow-carbogenation helps to stabilize the oxygen level in experiments that rely on the recycling of a small buffer reservoir to enhance the cost-efficiency of drug experiments. In addition, the manuscript presents representative experiments that examine the effects of different carbogenation modes and stimulation paradigms on the activity-dependent synaptic plasticity of synaptic transmission.

This protocol describes the stabilization of the oxygen level in a small volume of recycled buffer and methodological aspects of recording activity-dependent synaptic plasticity in submerged acute hippocampal slices.

少量循環、血流 - と水没型チャンバー システムで管理急性海馬スライスにおけるシナプス可塑性を記録

Even though experiments on brain slices have been in use since 1951, problems remain that reduce the probability of achieving a stable and successful ...

Two-photon Calcium Imaging in Neuronal Dendrites in Brain Slices

Calcium (Ca2+) imaging is a powerful tool to investigate the spatiotemporal dynamics of intracellular Ca2+ signals in neuronal dendrites. Ca2+ fluctuations can occur through a variety of membrane and intracellular mechanisms and play a crucial role in the induction of synaptic plasticity and regulation of dendritic excitability. Hence, the ability to record different types of Ca2+ signals in dendritic branches is valuable for groups studying how dendrites integrate information. The advent of two-photon microscopy has made such studies significantly easier by solving the problems inherent to imaging in live tissue, such as light scattering and photodamage. Moreover, through combination of conventional electrophysiological techniques with two-photon Ca2+ imaging, it is possible to investigate local Ca2+ fluctuations in neuronal dendrites in parallel with recordings of synaptic activity in soma. Here, we describe how to use this method to study the dynamics of local Ca2+ transients (CaTs) in dendrites of GABAergic inhibitory interneurons. The method can be also applied to studying dendritic Ca2+ signaling in different neuronal types in acute brain slices.

We present a method combining whole-cell patch-clamp recordings and two-photon imaging to record Ca2+ transients in neuronal dendrites in acute brain slices.