우리는 우리의 공동 친절 염료를 제공하기 위해이 기술의 초기 개발에뿐만 아니라 레슬리 M. 로우에 참가 Knut Holthoff, 아서 Konnerth와 마르코 Canepari에 감사하고 있습니다. NSF 부여 IOS-0817969, NIH 보조금 NS068407와 M136043 의해 예일 대학에서 신경 과학을위한 Kavli 연구소에 의해 지원.

1. 장비 설치 1.1 단계. 영상 설정 전압에 민감한 염료 신호를 기록하기위한 핵심은 적절한 설치 디자인입니다. 우리는 세 대의 카메라가 장착 수직 현미경 (BX51WI 올림푸스 또는 Zeiss AxioExaminer)을 사용합니다. 설정은 니콘 60X/1.0 NA 또는 Zeiss 63X/1.0 NA 물을 찍어 목표를 사용하여 에피 형광, 넓은 필드 현미경 모드에서 여기 빛으로 뇌 조각의 조명 개별 뉴런을 위해 설계되었습니다. 우리 현미경은 진동 절연 테이블에 고정 방문객 이동 단계가 구비되어 있습니다. 각 현미경은 세 카메라 포트를 갖추고 있습니다. 하나의 카메라 포트는 비디오 현미경 (IR-1000, Dage MTI, USA) 적외선 DIC에 대한 표준 높은 공간 해상도 CCD 카메라가 있습니다. 두 번째 카메라 포트는 상대적으로 낮은 공간 해상도 (80 X 80 픽셀)하지만, 뛰어난 동적 범위 (14 비트) 및 읽기 매우 낮은과 빠른 데이터 수집 카메라 (최대 20 kHz에서 프레임 속도)이소음 (NeuroCCD-SM, RedShirtImaging LLC, 디카 터, GA). 에 대한 공 촛점 이미지의 Z-스택을 수집하는 데 사용하는 회전 - 디스크 공 촛점 스캐너 (CSU-10, 요코, 일본)에 장착, 세 번째 카메라 포트는 높은 공간 해상도를 가진 CCD 카메라 (PCO AG, 독일 PixelFly, 1392x1024 픽셀)이 스테인드 세포의 자세한 형태학의 재건. 주파수 두 배로 다이오드 펌프 ND를 : 532 nm의 (MLL-III/400 MW, CNI, 장춘, 중국)에서 YVO4 연속 웨이브 레이저 (400 MW) 발광은 여기 빛의 원천입니다. 셔터 (LS6, 빈센트 연결합니다)에 의해 개폐 2mm 직경의 레이저 빔이 뒤쪽 조리개를 너무 많이 넣다하도록 설계된 단일 포트 epifluorescence 응축기 (포토닉스 GmbH의, Gräfelfing까지 독일)를 통해 현미경에 커플 링 라이트 가이드로 이동합니다 객관적이고 객체 비행기의 균일 한 조명 근처에 있습니다. 레이저 광은이 V m-영상의 감도를 극대화 할 수있는 기존의 제논 아크 - 램프 대신에 사용됩니다 : (1) 단색 예를 사용하여염료 9, 10 (2) 아크 - 램프에 의해 달성 할 수있는 수준을 넘어서 여기 빛의 강도를 증가 V m 감도를 극대화 할 수있는 흡수 스펙트럼의 붉은 날개에서 인용 빛. 기진 빛이 560 나노 미터와 기록 형광 빛이 610 nm의 장벽 필터 (SCHOTT RG610)를 통해 전달 된의 중심 파장과 이색 성 거울로 준비에 반영되었습니다. 빛 강도 증가와 가까운 최적의 단색 여기 파장의 사용의 통합 효과는 이전의 측정 6에 비해 약 50의 요소를 기준으로 전압 이미지의 감도에 극적으로 개선했다. 1.2 단계. 균일 한 조명으로 조정 형광 슬라이드 표준을 (녹색 여진 / 빨간색 방출)을 사용합니다. CCD는 포화되지 않은 수 있도록 레이저 빔 경로에 해당하는 중립적 인 밀도 필터를 삽입합니다. 의 표면에 목표를 집중슬라이드. 레이저 런처 목표 앞의 석영 빛 가이드의 수신 끝의 위치를​​ 조정하고, 달성하기 어려운 형광 콘덴서에 적절한 액츄에이터를 사용하여 현미경에 부착 된 광 가이드의 출력 끝의 위치를​​ 조정 중심의 균일 시야의 조명. 1.3 단계. 진동 소음을 결정 형광 슬라이드의 표면에 작은 검은 색 잉크 표시를하십시오. 연속 촬영 모드에서 NeuroCCD과 기록 빛의 세기. 검은 색 잉크 마크의 어두운 가장자리에 목표를 집중하십시오. 2 kHz에서 프레임 속도 약 100 밀리 초에 대한 빛의 세기를 기록합니다. 균일하게 조명 영역에서와 잉크 마크의 가장자리 ~ 20 픽셀의 빛을받는 ~ 20 픽셀의 부분 광도 흔적 (ΔF / F)의 공간 평균을 표시합니다. 고 대비 가장자리와 픽셀의 녹음에 과다한 소음의 진동 소음을 반영시스템. 1.4 단계. 진동 절연 이 실험 녹음 조건에 비해 광도의 샷 노이즈 아래 수준으로 진동 절연 테이블을 사용하여 진동을 줄이기 위해 필수입니다. 이미지의 날카로운 가장자리를 덮고 픽셀에서 빛의 세기에 진동 소음이 무시할 때까지 진동 절연 테이블을 조정합니다. 움직이는 부품 (기계 셔터, 팬)과 장비의 없음이 테이블에 장착 할 수 없습니다. 진동으로부터 격리되지 않은 다른 구성 요소에 연결된 테이블에 장비의 케이블들은 현미경을 기계적 진동을 전송하지 않는 것이 느슨한 있도록해야합니다. 2. V m-이미징을위한 적절한 신경 세포의 선택 2.1 단계. 뉴런의 선택 표준 절차에 따라 뇌 조각을 만듭니다. 나는의 개별 신경 세포에서 EGFP을 표현 마우스 줄을 사용하여nterest. 회전 디스크 공 촛점 시스템으로 슬라이스에서 EGFP 표시 뉴런을 표시합니다. 그대로 axonal / 수지상 나무가 V m-이미징에 대한 뉴런를 선택하고 프로세스가 슬라이스의 표면과 평행과 가까이에 실행으로. axons과 얇은 수석은 대부분의 경우, DIC 현미경 모드에서 볼 수 없습니다 때문 야생 형 생쥐에서 수행 할 수 없습니다. 3. 전압에 민감한 염료로로드 뉴런 3.1 단계. 패치 피펫의 작성 전극 테이퍼의 2 / 3까지 약 15 s에 대한 부정적 압력을 적용하여 염색 무료 세포 솔루션을 끝에서 유리 패치 피펫를 입력합니다. 끝에서 염료를 무료로 솔루션은 배경 형광을 증가하고 극적 노이즈 비율로 신호를 감소 슬라이스에 염료의 유출을 방지 할 필요가 있습니다. 용해 막 impermeant 전압에 민감한 염료 JPW3028를 포함하는 솔루션을 전극을 백업 작성세포 솔루션 (0.8 ㎜). JPW3028, 세포 내 응용 프로그램에 대한 가장 성공적인 전압 프로브는 아직 microinjection에 사용 할 용해 충분히 물 lipophilic styryl 염료의 ANEP 시리즈의 이중 긍정적으로 청구 아날로그입니다. 이 염료의 디 에틸 아날로그 거의 동일한 특성을 (전압 감도 포함) 보유하고 JPW1114 (표 1 참조)와 같은 상업적으로 사용할 수 있습니다. 우리는 소주 H 2 O.에서 20 MM 주식 솔루션을 준비 재고 솔루션 50 μl aliquots는 -20 ° C.에 고정 유지됩니다 0.8 mm의 최종 염료 농도를 들어, 재고 솔루션 2 μl는 실험 당일 세포 솔루션의 50 μl에 용해되어 있습니다. 재고 염료 솔루션은 안정적이며, 몇 개월 동안 실온에서 보관 할 수 있습니다. 이 소진 될 때까지 따라서, 우리는 실내 온도에 하나의 50 μl 나누어지는을 유지. 3.2 단계. 신속 기가 - 인감을 수립 <p claSS = &quot;jove_content&quot;&gt; 패치 이전에 선택한 뉴런과 20-45 분에 대한 전체 셀 구성에서 소마에 체세포 패치 피펫에서 염료를 무료로 보급 할 수 있습니다. 이 팁에서 염료 무료 솔루션의 금액이 작은 유지 될 수 있도록 가능한 한 빠른 속도로 인장을 얻기 위해 필수적입니다. 전극에 염료없이 빠른 패치를 실행하여 시작합니다. 주변 조직을 오염하지 않고 끝에서 염료 무료 솔루션의 최소 금액을 사용하는 목적으로 염료와 다음, 연습 패치 및 로딩 뉴런. 연습으로, 그것은 1-2 분 이내에 인감을 구축 할 수 있습니다. 3.3 단계. 착색의 수준을 모니터 전체 셀 구성에 염료 확산되는 동안, 전류 클램프 모드에서 evoked 액션 잠재력을 기록하여 신경 세포의 생리 상태를 모니터링 할 수 있습니다. 또한, 2 K의 프레임 속도로 셀 소마에서 휴식 광도 (RLI)를 기록하여 착색의 양을 모니터링<html> Hz에서하고 중립적 인 밀도 필터 (우리는 400 MW 레이저에서 레이저 광 강도의 0.04 %를 사용)로 조정 전체 광도의 일부에서. 액션 잠재력은 전극의 크기와 저항에 따라, 보통 20-40분 후, 확대하기 시작 때까지 염료로드 프로세스를 계속합니다. 스파이크의 확대는 완전히 치료와 체세포의 막에있는 염료의 포화 농도의 용량 부하 효과 때문일 가능성이 높습니다. 염료 농도가 신경에 걸쳐 equilibrated 후 스파이크의 파형이 완전히 복원됩니다. 3.4 단계. 염료 전극을 제거 기간 얼룩의 말에 조심스럽게 외부 아웃 패치 구성에 전체 세포의 전환이 과정에서 달성되어 있도록 전압 클램프 구성에 소마에서 떨어져 패치 피펫을 당긴다. 3.5 단계. 염료 확산 기다립니다 다닐 &quot;&gt; neuronal 프로세스에 전파 할 수있는 전압에 민감한 염료를 사용할 수 있도록 상온에서 추가 1.5-2 시간의 조각을 배양. 수지상 및 axonal 프로세스의 파형으로 소마에서 도보로 염색 diffuses 상당한 양의 후 AP가 완전히 복원됩니다. 4. 광학 녹음 4.1 단계. 이미지에 대한 세포 구획을 선택 낮은 조명 수준의 형광 및 재 패치 DIC 아래 표준 (없음 염료) 패치 전극과 뉴런에서 스테인드 뉴런의 소마를 찾습니다. 전압 이미징을위한 CCD의 연속 녹화 모드에서 10-40 Hz의 프레임 속도에서 낮은 조명 수준에서 neuronal 프로세스를 표시합니다. 관심의 대상을 시각화하는 데 필요한 최소 중립적 인 밀도 필터를 빛 수준을 줄일 수 있습니다. 우리는 스테인드 신경의 위치 동안 400 MW 레이저 강도의 0.01 %를 사용합니다. XY 스테이지 사용하여 t에 대한 관심의 neuronal 과정을 위치이미지 영역의 중간 그는. 현미경의 부분적 폐쇄 필드 스톱 아이리스를 사용하여 여기 빛으로부터 소마를 보호합니다. 높은 강도 여기 빛으로부터 소마를 차폐하는 것은 상당히 녹화하는 동안 photodynamic 손상을 줄일 수 있습니다. 막 잠재적 인 과도에 관한 기록 4.2 광 신호를 단계 개인 수지상 가지의 backpropagated APS에 관한 광학 신호를 기록합니다. 축삭의 APS에 관한 광학 신호를 기록합니다. 수지상 쪽의 APS를 backpropagating에 관한 광학 신호를 기록합니다. 신호 파형의 정확한 복원에 적합한 프레임 속도를 사용하고 표백 염색 및 photodynamic 피해를 최소화하기 위해 녹음 기간과 높은 강도 여기 빛에 노출 가능한 한 짧은으로 유지. 예를 들어, 축삭에 하나의 액션 전위의 개시와 전파의 순서를 검토하는 것은 5-10 밀리 초의 기록 기간이 필요합니다. 여기 빛 intensi녹화하는 동안 티는 한 손에 신호 대 잡음 비율과 표백 염색의 정도와 다른 한편으로는 photodynamic 손상 사이의 타협이다. 우리는 직경 300 μm의 영역이 밝아 axons의 긴 섹션에서 녹화에 400 MW 레이저의 강도의 100 %를 사용합니다. 여기 광이 수지상 척추 이미징을위한 30 μm 직경 영역에 초점을 맞추고 있습니다 때, 우리는 레이저 광도의 10~25%을 사용합니다. 녹화 필요한 기간은 최적의 여기 광도의 중요한 결정자이다; 짧은 녹음 기간은 높은 빛 농도 할 수 있습니다. 최적의 조명 강도가 가장 각 준비 및 측정 설정에 경험적으로 결정됩니다. 5. 데이터 분석 5.1 단계. 알려진 오류에 대한 원시 데이터를 수정 데이터의 분석 및 디스플레이 IDL (ITT 영상 정보 Solut로 작성된 NeuroPlex 프로그램 (RedShirtImaging)를 사용하여 수행되었다이온, 볼더, 콜로라도) 및 사용자 정의 비주얼 베이직 루틴. 낮은 조명 수준의 조건에서 배경 형광은 ΔF / F 신호 크기의 중요한 결정자가된다. 원시 데이터가 먼저 슬라이스에 흠없는 지역에서 결정된 평균 배경 형광 강도를 차감하여이 효과 수정되었습니다. 그 후, 신호 정렬 소프트웨어는 AP 개시의 시간적 지터에 대한뿐만 아니라 평균 동안 준비의 가능한 작은 움직임에 대한 해결하기 위해 사용되었다. 시간적 도메인에서 AP의 신호 평균화의 시작 (그림 1B)에 인수 기준 신호 각 재판에서 전기적으로 기록 된 APS의 교차 상관 관계에 의해 정렬되었습니다. 공간 도메인에서 이미지는 준비의 가능한 작은 측면 움직임을 보상하기 위해 이미지 간 상관 관계에 의해 2 차원 오프라인으로 정렬되었습니다. Z-차원의 이미지의 정확한 초점은 각각의 재판 전에 확인했습니다, smal<html> 난 조정은 종종 필요했다. 그림 1b에 도시 된 바와 같이 spatially과 시간적으로 정렬 신호를 평균했다. 염료의 표백에 의한 빛의 세기에 느린 변경 사항은 더 자극 (그림 1B)를 기록 재판에서 파생 적절한 이중 지수 함수로 데이터를 나누어 해결되었습니다. AP 신호의 파형은 큐빅 스플라인 보간, 각 데이터 포인트를 통과 piecewise 연속 곡선을 사용하여 데이터 포인트의 세트에서 복원되었습니다. 전압에 민감한 염료 신호가 밀리 초 시간 규모에서 큰 왜곡없이 막 잠재력을 추적 확인하려면 소마에서 전기 AP 신호는 그림 3B와 같이 인접한 축삭의 소구에서 광학 AP 신호에 비해되었다. 두 신호는 광학 녹음의 샷 잡음을 허용하는 매우 밀접하게 비교하십시오. les/ftp_upload/4261/4261fig1.jpg &quot;/&gt; 1 그림. 데이터 분석 (애니메이션). (A) 상단 패널 : 기록 위치에 축삭과 스테인드 신경 세포의 고해상도 공 촛점 이미지입니다. 기록 전극 소마와 개략적으로 표시 기저 dendrite 옆에있는 세포 자극 전극에 부착. 액션 잠재력은 세포, 신경 자극에 의​​해 evoked. 낮은 패널 :. V m 이미징에 사용 (B) 소마 (검은 흔적)에서 전극 녹음, AIS (빨간색 흔적)에서 광학 녹음하고, Ranvier의 노드 (녹색 흔적)에서 CCD에 의해 얻은 축삭의 낮은 공간 해상도 형광 이미지 . 인기 흔적 : AP 개시의 관자놀이 지터를 보여 9 평가판에서 원시 데이터입니다. 트레이스의 두 번째 행 : 시간적으로 신호를 정렬. 흔적의 셋째 줄 : 평균 신호. 흔적 번째 행 : 표백제를 수정. 하단 트레이스 : 일시적으로 스무딩 중 하나를 패스 입방 스플라인 보간.

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노래 부를 Zecevic 그는 LLC를 RedShirtImaging의 공동 소유자., 전압에 민감한 염료 녹음에 사용되는 고속, 낮은 소음 CCD 카메라 전문 회사입니다 함을 선언합니다. 다른 모든 저자는 금융 관심사 나 현재 연구에 관한 관심의 잠재적 인 충돌을보고하지 않습니다.

이 문서는 하위 마이크로 미터와 하위 밀리 초 spatiotemporal 해상도 개별 뉴런의 전기 활동을 모니터링하기위한 전압에 민감한 염료 기록 방법을 설명합니다. 가까운 최적의 파장 (신호 크기에 관한)에 레이저 여기가 ~ 50 이전 방법여의 비율에 의해 녹음의 감도를 향상되었습니다. 현재 감도는 수석, axons, 축삭의 민간인 피해와 축삭 터미널뿐만 아니라 개인 수지상의 쪽 등의 개인 뉴런의 모든 부분?...

<table border="1"><tbody><tr><td> 구성 요소의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td><td> 코멘트 (선택 사항) </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> 설치 구성 요소 </td></tr><tr><td> 입식 현미경 </td><td> 올림푸스 주식회사 </td><td> BX51WI </td><td> 세 카메라 포트 </td></tr><tr><td> 전동 이동식 무대 </td><td> Siskiyou </td><td> MXOPi.2 </td><td></td></tr><tr><td> 올림푸스 BX51에 대한 에피 형광 응축기 </td><td> 포토닉스까지 </td><td> 0000-560-11659 </td><td></td></tr><tr><td> 입식 현미경 </td><td> 칼 Zeiss, LLC </td><td> AxioExaminer의 D1 </td><td> 세 카메라 포트 </td></tr><tr><td> 동력 톱 플레이트 </td><td> Scientifica 제한 </td><td> MMBP </td><td></td> &lt;/ TR&gt; <tr><td> Zeiss AxioExaminer에 대한 에피 형광 응축기 </td><td> 포토닉스까지 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 데이터 수집 카메라 </td><td> RedShirtImaging LLC </td><td> NeuroCCD-SM </td><td> 고속 낮은 읽기 노이즈 </td></tr><tr><td> IR-DIC를위한 CCD </td><td> Dage - MTI </td><td> IR - 1000 </td><td></td></tr><tr><td> 회전 - 디스크 공 촛점 스캐너 </td><td> 요코 </td><td> CSU-10 </td><td></td></tr><tr><td> 공 촛점 스캐너에 대한 높은 공간 해상도 CCD </td><td> PCO AG </td><td> PixelFly </td><td> 1392x1024 픽셀 </td></tr><tr><td> DPSS 레이저 CW (532 Nm 수준) </td><td> CNI 광전자 공학 기술. (주) </td><td> MLL-III-532 400mW </td><td> 여기 광원 </td></tr><tr><td> 멀티 모드 광섬유 실행기 </td><td> Siskiyou </td><td> SM-CFT </td><td></td></tr><tr><td> 라이트 가이드 </td><td> 사진까지NIC가 </td><td> 0000-515-11524 </td><td></td></tr><tr><td> 셔터 </td><td> 빈센트 제휴 </td><td> LS6 </td><td></td></tr><tr><td> 진동 절연 표 </td><td> 마이너스 K 기술 </td><td> MK26 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> 특정 시약 </td></tr><tr><td> 디-2-ANEPEQ (JPW 1114) </td><td> 생명 기술 </td><td> D-6923 </td><td> 전압에 민감한 염료 </td></tr><tr><td> Crym-EGFP 마우스 선 </td><td> GENSAT (MMRRC) </td><td> STOCK TG (Crym-EGFP) GF82Gsat/Mmcd </td><td> 띄엄 띄엄 레이어 5 대뇌 피질의 뉴런에서 EGFP을 표현 </td></tr></tbody></table>

voltage-sensitive dye recording from axons, dendrites and dendritic spines of individual neurons in brain slices

biophysical 속성과 하나의 뉴런의 기능 조직을 이해하고 어떻게 프로세스 정보가 뇌가 어떻게 작동하는지 이해하는 중요한 요소입니다. 모든 신경 세포의 주요 기능은 보통 여러 소스에서 전기 신호를 처리하는 것입니다. neuronal 프로세스의 전기적 특성은 세부 측정의 부재에 예측하기 매우 복잡한 동적, 그​​리고 일반 경우에는 불​​가능합니다. 하나가 겠어 이러한 측정을 얻으려면 이상적으로, 그들은 neuronal 프로세스 및 작업 가능성 개시에 영향을 특정 위치에서 summate에 원산지 사이트의 여행으로 여러 사이트에서 subthreshold 이벤트를 모니터링 할 수 싶어요. 이 목표는 전극을 채용 측정의 기술적 한계로 인해 모든 신경을 달성되지 않았습니다. 이 단점을 극복하기 위해, 그것은 광범위한 병렬 recordin을 허용 이미징 기술을 패치 - 전극 접근 방식을 보완하기 위해 매우 바람직하다신경 세포의 모든 부분에서 GS. 하위 밀리 초와 하위 마이크로 미터 해상도의 특징 - 유기 전압에 민감한 염료 (V m-영상)과 막 잠재적 인 과도의 광학 녹음 - 여기, 우리는 이러한 기술을 설명합니다. 우리의 방법은 전압에 민감한 분자 프로브 2 선구적인 작업을 기반으로합니다. 초기 기술의 여러 측면이 지속적으로 수십 년 3, 5, 11을 통해 향상되었습니다. 또한, 이전의 작품은 V m 이미징의 두 중요한 특성을 문서화. 첫째, 형광 신호는 전체 생리적 범위 (, 10, 14, 16 100 뮤직 비디오에 -100 뮤직 비디오)를 통해 막전위에 비례합니다. 둘째, 여기에 사용되는 전압에 민감한 염료 (JPW 3028)와로드 뉴런이 감지 약리 효과가 없습니다. 기록 염료를로드하는 동안 스파이크를 확대하는 것은 7 4 완전히 치료입니다. 또한, 실험 증거는 확보하는 것이 가능하다는 것을 보여줍니다모든 감지 phototoxic 효과 4 이전 녹음의 상당수 (최대 수백), 6, 12, 13. 현재, 우리는 V m-이미징 기술의 감도를 극대화 할에 가까운 최적의 파장 레이저 광원의 뛰어난 밝기와 안정성의 이점을 누리십시오. 현재 감도는 axons과 축삭의 민간인 피해, 터미널 수지상 가지, 개인 수지상의 쪽 포함하여 신경 세포의 모든 부분에서 V m의 과도의 여러 사이트 광학 녹음 할 수 있습니다. 신호의 상호 작용을 취득 정보뿐만 아니라 동영상의 형태로 직접 시각화와 같은 양적 분석 할 수 있습니다.

성공적인 공 촛점 현미경은 슬라이스의 표면에 인접 해 있으며, 초점 중 하나가 비행기에있는 그대로 neuronal 프로세스의 명확한 식별을 허용해야합니다. 전에 전압에 민감한 염색 로딩에 전압 이미징에 적합한 신경 세포의 선택은 중요합니다. 대뇌 피질의 슬라이스 (Crym 유전자 변형 마우스 라인)에서 EGFP을 표현 L5 피라미드 뉴런의 공 촛점 이미지의 예는 그림 2에 표시됩니다. 개별 ?...

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Voltage-sensitive Dye Recording from Axons, Dendrites and Dendritic Spines of Individual Neurons in Brain Slices

서브 마이크로 미터 공간과 하위 밀리 초 시간적 해상도 막 잠재적 인 변화의 모니터링을위한 이미징 기술은 설명되어 있습니다. 전압에 민감한 염색의 레이저 여기에 기반을 둔 기술은, axons과 축삭의 민간인 피해, 터미널 수지상 지점, 개인 수지상 쪽의 신호를 측정 할 수 있습니다.

Axons, 수석 및 뇌 슬라이스의 개별 뉴런의 수지상 쪽의 전압에 민감한 염료 기록

Understanding the biophysical properties and functional organization of single neurons and how they process information is fundamental for understanding ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

16.6K 조회수.  Yale University School of Medicine. 서브 마이크로 미터 공간과 하위 밀리 초 시간적 해상도 막 잠재적 인 변화의 모니터링을위한 이미징 기술은 설명되어 있습니다. 전압에 민감한 염색의 레이저 여기에 기반을 둔 기술은, axons과 축삭의 민간인 피해, 터미널 수지상 지점, 개인 수지상 쪽의 신호를 측정 할 수 있습니다.

비디오: Voltage-sensitive Dye Recording from Axons, Dendrites and Dendritic Spines of Individual Neurons in Brain Slices

DiOLISTIC Labeling of Neurons from Rodent and Non-human Primate Brain Slices

DiOLISTIC staining uses the gene gun to introduce fluorescent dyes, such as DiI, into neurons of brain slices (Gan et al., 2009; O'Brien and Lummis, 2007; Gan et al., 2000). Here we provide a detailed description of each step required together with exemplary images of good and bad outcomes that will help when setting up the technique. In our experience, a few steps proved critical for the successful application of DiOLISTICS. These considerations include the quality of the DiI-coated bullets, the extent of fixative exposure, and the concentration of detergent used in the incubation solutions. Tips and solutions for common problems are provided. This is a versatile labeling technique that can be applied to multiple animal species at a wide range of ages. Unlike other fluorescent labeling techniques that are limited to preparations from young animals or restricted to mice because they rely on the expression of a fluorescent transgene, DiOLISTIC labeling can be applied to animals of all ages, species and genotypes and it can be used in combination with immunostaining to identify a specific subpopulation of cells. Here we demonstrate the use of DiOLISTICS to label neurons in brain slices from adult mice and adult non-human primates with the purpose of quantifying dendrite branching and dendritic spine morphology.

We demonstrate the use of the gene gun to introduce fluorescent dyes, such as DiI, into neurons in brain slices from rodents and non-human primates of different ages. In this particular case, we use adult mice (3-6 months old) and adult cynomologus monkeys (9-15 years old). This technique, originally described by the laboratory of Dr. Lichtman (Gan et al., 2000), is well suited for the study of dendritic branching and dendritic spine morphology and can be combined with traditional immunostaining, if detergents are kept at a low concentration.

로던트에서 뉴런과 비 인간 메이트 뇌 조각의 DiOLISTIC 라벨링

DiOLISTIC staining uses the gene gun to introduce fluorescent dyes, such as DiI, into neurons of brain slices (Gan et al., 2009; O'Brien and Lummis, 2007; ...

연구

신경과학

Optical Imaging of Neurons in the Crab Stomatogastric Ganglion with Voltage-sensitive Dyes

Voltage-sensitive dye imaging of neurons is a key methodology for the understanding of how neuronal networks are organised and how the simultaneous activity of participating neurons leads to the emergence of the integral functionality of the network. Here we present the methodology of application of this technique to identified pattern generating neurons in the crab stomatogastric ganglion. We demonstrate the loading of these neurons with the fluorescent voltage-sensitive dye Di-8-ANEPPQ and we show how to image the activity of dye loaded neurons using the MiCAM02 high speed and high resolution CCD camera imaging system. We demonstrate the analysis of the recorded imaging data using the BVAna imaging software associated with the MiCAM02 imaging system. The simultaneous voltage-sensitive dye imaging of the detailed activity of multiple neurons in the crab stomatogastric ganglion applied together with traditional electrophysiology techniques (intracellular and extracellular recordings) opens radically new opportunities for the understanding of how central pattern generator neural networks work.

Here we present the methodology for fast and high resolution fluorescent voltage-sensitive dye imaging of detailed activity of neurons in the crab stomatogastric ganglion.

전압에 민감한 염료와 크랩 Stomatogastric 신경절에서 뉴런의 광학 이미징

Voltage-sensitive dye imaging of neurons is a key methodology for the understanding of how neuronal networks are organised and how the simultaneous ...

Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) of Fluorescence Tagged Proteins in Dendritic Spines of Cultured Hippocampal Neurons

FRAP has been used to quantify the mobility of GFP-tagged proteins. Using a strong excitation laser, the fluorescence of a GFP-tagged protein is bleached in the region of interest. The fluorescence of the region recovers when the unbleached GFP-tagged protein from outside of the region diffuses into the region of interest. The mobility of the protein is then analyzed by measuring the fluorescence recovery rate. This technique could be used to characterize protein mobility and turnover rate.
In this study, we express the (enhanced green fluorescent protein) EGFP vector in cultured hippocampal neurons. Using the Zeiss 710 confocal microscope, we photobleach the fluorescence signal of the GFP protein in a single spine, and then take time lapse images to record the fluorescence recovery after photobleaching. Finally, we estimate the percentage of mobile and immobile fractions of the GFP in spines, by analyzing the imaging data using ImageJ and Graphpad softwares.
This FRAP protocol shows how to perform a basic FRAP experiment as well as how to analyze the data.

Fluorescence Recovery After Photobleaching FRAP of Fluorescence Tagged Proteins in Dendritic Spines of Cultured Hippocampal Neurons

FRAP has been used to quantify the mobility of Green Fluorescence Protein (GFP)-tagged proteins in cultured cells. We examined the mobile/immobile fractions of the GFP by analyzing the fluorescence recovery percentage after photobleaching. In this study, FRAP was performed at spines of hippocampal neurons.

교양 Hippocampal 뉴런의 돌기 쪽이에서 형광 단백질의 태그 Photobleaching 후 형광 복구 (FRAP)

FRAP has been used to quantify the mobility of GFP-tagged proteins. Using a strong excitation laser, the fluorescence of a GFP-tagged protein is bleached ...

Vibrodissociation of Neurons from Rodent Brain Slices to Study Synaptic Transmission and Image Presynaptic Terminals

Mechanical dissociation of neurons from the central nervous system has the advantage that presynaptic boutons remain attached to the isolated neuron of interest. This allows for examination of synaptic transmission under conditions where the extracellular and postsynaptic intracellular environments can be well controlled. A vibration-based technique without the use of proteases, known as vibrodissociation, is the most popular technique for mechanical isolation. A micropipette, with the tip fire-polished to the shape of a small ball, is placed into a brain slice made from a P1-P21 rodent. The micropipette is vibrated parallel to the slice surface and lowered through the slice thickness resulting in the liberation of isolated neurons. The isolated neurons are ready for study within a few minutes of vibrodissociation. This technique has advantages over the use of primary neuronal cultures, brain slices and enzymatically isolated neurons including: rapid production of viable, relatively mature neurons suitable for electrophysiological and imaging studies; superior control of the extracellular environment free from the influence of neighboring cells; suitability for well-controlled pharmacological experiments using rapid drug application and total cell superfusion; and improved space-clamp in whole-cell recordings relative to neurons in slice or cell culture preparations. This preparation can be used to examine synaptic physiology, pharmacology, modulation and plasticity. Real-time imaging of both pre- and postsynaptic elements in the living cells and boutons is also possible using vibrodissociated neurons. Characterization of the molecular constituents of pre- and postsynaptic elements can also be achieved with immunological and imaging-based approaches.

This report demonstrates a technique for mechanical isolation of individual viable neurons retaining attached presynaptic boutons. Vibrodissociated neurons have the advantages of rapid production, excellent pharmacological control and improved space-clamp without influence from neighboring cells. This method can be used for imaging of synaptic elements and patch-clamp recording.

쥐 뇌 조각에서 뉴런의 Vibrodissociation는 시냅틱 전송 및 이미지 Presynaptic 터미널 공부

Mechanical dissociation of neurons from the central nervous system has the advantage that presynaptic boutons remain attached to the isolated neuron of ...

Morphological Analysis of Drosophila Larval Peripheral Sensory Neuron Dendrites and Axons Using Genetic Mosaics

Nervous system development requires the correct specification of neuron position and identity, followed by accurate neuron class-specific dendritic development and axonal wiring. Recently the dendritic arborization (DA) sensory neurons of the Drosophila larval peripheral nervous system (PNS) have become powerful genetic models in which to elucidate both general and class-specific mechanisms of neuron differentiation.
There are four main DA neuron classes (I-IV)1. They are named in order of increasing dendrite arbor complexity, and have class-specific differences in the genetic control of their differentiation2-10. The DA sensory system is a practical model to investigate the molecular mechanisms behind the control of dendritic morphology11-13 because: 1) it can take advantage of the powerful genetic tools available in the fruit fly, 2) the DA neuron dendrite arbor spreads out in only 2 dimensions beneath an optically clear larval cuticle making it easy to visualize with high resolution in vivo, 3) the class-specific diversity in dendritic morphology facilitates a comparative analysis to find key elements controlling the formation of simple vs. highly branched dendritic trees, and 4) dendritic arbor stereotypical shapes of different DA neurons facilitate morphometric statistical analyses.
DA neuron activity modifies the output of a larval locomotion central pattern generator14-16. The different DA neuron classes have distinct sensory modalities, and their activation elicits different behavioral responses14,16-20. Furthermore different classes send axonal projections stereotypically into the Drosophila larval central nervous system in the ventral nerve cord (VNC)21. These projections terminate with topographic representations of both DA neuron sensory modality and the position in the body wall of the dendritic field7,22,23. Hence examination of DA axonal projections can be used to elucidate mechanisms underlying topographic mapping7,22,23, as well as the wiring of a simple circuit modulating larval locomotion14-17.
We present here a practical guide to generate and analyze genetic mosaics24 marking DA neurons via MARCM (Mosaic Analysis with a Repressible Cell Marker)1,10,25 and Flp-out22,26,27 techniques (summarized in Fig. 1).

Morphological Analysis of Drosophila Larval Peripheral Sensory Neuron Dendrites and Axons Using Genetic Mosaics

The dendritic arborization sensory neurons of the Drosophila larval peripheral nervous system are useful models to elucidate both general and neuron class-specific mechanisms of neuron differentiation. We present a practical guide to generate and analyze dendritic arborization neuron genetic mosaics.

의 형태학의 분석 Drosophila</em유전 모자이크 사용하기> 애벌레 주변 감각 신경 세포의 Dendrites 및 Axons

Nervous system development requires the correct specification of neuron position and identity, followed by accurate neuron class-specific dendritic ...

Recording Electrical Activity from Identified Neurons in the Intact Brain of Transgenic Fish

Understanding the cell physiology of neural circuits that regulate complex behaviors is greatly enhanced by using model systems in which this work can be performed in an intact brain preparation where the neural circuitry of the CNS remains intact. We use transgenic fish in which gonadotropin-releasing hormone (GnRH) neurons are genetically tagged with green fluorescent protein for identification in the intact brain. Fish have multiple populations of GnRH neurons, and their functions are dependent on their location in the brain and the GnRH gene that they express1 . We have focused our demonstration on GnRH3 neurons located in the terminal nerves (TN) associated with the olfactory bulbs using the intact brain of transgenic medaka fish (Figure 1B and C). Studies suggest that medaka TN-GnRH3 neurons are neuromodulatory, acting as a transmitter of information from the external environment to the central nervous system; they do not play a direct role in regulating pituitary-gonadal functions, as do the well-known hypothalamic GnRH1 neurons2, 3 .The tonic pattern of spontaneous action potential firing of TN-GnRH3 neurons is an intrinsic property4-6, the frequency of which is modulated by visual cues from conspecifics2 and the neuropeptide kisspeptin 15. In this video, we use a stable line of transgenic medaka in which TN-GnRH3 neurons express a transgene containing the promoter region of Gnrh3 linked to enhanced green fluorescent protein7 to show you how to identify neurons and monitor their electrical activity in the whole brain preparation6.

In this video, we will demonstrate how to record electrical activity from identified single neurons in a whole brain preparation, which preserves complex neural circuits. We use transgenic fish in which gonadotropin-releasing hormone (GnRH) neurons are genetically tagged with a fluorescent protein for identification in the intact brain preparation.

형질 전환 생선의 본래 뇌에서 발견 뉴런의 전기적 활동을 기록

Understanding the cell physiology of neural circuits that regulate complex behaviors is greatly enhanced by using model systems in which this work can be ...

Imaging Dendritic Spines of Rat Primary Hippocampal Neurons using Structured Illumination Microscopy

Dendritic spines are protrusions emerging from the dendrite of a neuron and represent the primary postsynaptic targets of excitatory inputs in the brain. Technological advances have identified these structures as key elements in neuron connectivity and synaptic plasticity. The quantitative analysis of spine morphology using light microscopy remains an essential problem due to technical limitations associated with light's intrinsic refraction limit. Dendritic spines can be readily identified by confocal laser-scanning fluorescence microscopy. However, measuring subtle changes in the shape and size of spines is difficult because spine dimensions other than length are usually smaller than conventional optical resolution fixed by light microscopy's theoretical resolution limit of 200 nm.
Several recently developed super resolution techniques have been used to image cellular structures smaller than the 200 nm, including dendritic spines. These techniques are based on classical far-field operations and therefore allow the use of existing sample preparation methods and to image beyond the surface of a specimen. Described here is a working protocol to apply super resolution structured illumination microscopy (SIM) to the imaging of dendritic spines in primary hippocampal neuron cultures. Possible applications of SIM overlap with those of confocal microscopy. However, the two techniques present different applicability. SIM offers higher effective lateral resolution, while confocal microscopy, due to the usage of a physical pinhole, achieves resolution improvement at the expense of removal of out of focus light. In this protocol, primary neurons are cultured on glass coverslips using a standard protocol, transfected with DNA plasmids encoding fluorescent proteins and imaged using SIM. The whole protocol described herein takes approximately 2 weeks, because dendritic spines are imaged after 16-17 days in vitro, when dendritic development is optimal. After completion of the protocol, dendritic spines can be reconstructed in 3D from series of SIM image stacks using specialized software.

This article describes a working protocol to image dendritic spines from hippocampal neurons in vitro using Structured Illumination Microscopy (SIM). Super-resolution microscopy using SIM provides image resolution significantly beyond the light diffraction limit in all three spatial dimensions, allowing the imaging of individual dendritic spines with improved detail.

구조적 조명 현미경을 사용하여 쥐 차 해마 신경 세포의 돌기 쪽 이미징

Dendritic spines are protrusions emerging from the dendrite of a neuron and represent the primary postsynaptic targets of excitatory inputs in the brain. ...

Acute Dissociation of Lamprey Reticulospinal Axons to Enable Recording from the Release Face Membrane of Individual Functional Presynaptic Terminals

Synaptic transmission is an extremely rapid process. Action potential driven influx of Ca2+&#160;into the presynaptic terminal, through voltage-gated calcium channels (VGCCs) located in the release face membrane, is the trigger for vesicle fusion and neurotransmitter release. Crucial to the rapidity of synaptic transmission is the spatial and temporal synchrony between the arrival of the action potential, VGCCs and the neurotransmitter release machinery. The ability to directly record Ca2+&#160;currents from the release face membrane of individual presynaptic terminals is imperative for a precise understanding of the relationship between presynaptic Ca2+&#160;and neurotransmitter release. Access to the presynaptic release face membrane for electrophysiological recording is not available in most preparations and presynaptic Ca2+&#160;entry has been characterized using imaging techniques and macroscopic current measurements &#8211; techniques that do not have sufficient temporal resolution to visualize Ca2+ entry. The characterization of VGCCs directly at single presynaptic terminals has not been possible in central synapses and has thus far been successfully achieved only in the calyx-type synapse of the chick ciliary ganglion and in rat calyces. We have successfully addressed this problem in the giant reticulospinal synapse of the lamprey spinal cord by developing an acutely dissociated preparation of the spinal cord that yields isolated reticulospinal axons with functional presynaptic terminals devoid of postsynaptic structures. We can fluorescently label and identify individual presynaptic terminals and target them for recording. Using this preparation, we have characterized VGCCs directly at the release face of individual presynaptic terminals using immunohistochemistry and electrophysiology approaches. Ca2+ currents have been recorded directly at the release face membrane of individual presynaptic terminals, the first such recording to be carried out at central synapses.

Recording Ca2+ currents at the presynaptic release face membrane is key to a precise understanding of Ca2+ entry and neurotransmitter release. We present an acute dissociation of the lamprey spinal cord that yields functional isolated reticulospinal axons, permitting recording directly from the release face membrane of individual presynaptic terminals.

장어 Reticulospinal 축삭의 급성 해리는 개별 기능 시냅스 터미널의 릴리스 얼굴 막에서 녹음을 활성화하는

Synaptic transmission is an extremely rapid process. Action potential driven influx of Ca2+&#160;into the presynaptic terminal, through voltage-gated ...

Recording Synaptic Plasticity in Acute Hippocampal Slices Maintained in a Small-volume Recycling-, Perfusion-, and Submersion-type Chamber System

Even though experiments on brain slices have been in use since 1951, problems remain that reduce the probability of achieving a stable and successful analysis of synaptic transmission modulation when performing field potential or intracellular recordings. This manuscript describes methodological aspects that might be helpful in improving experimental conditions for the maintenance of acute brain slices and for recording field excitatory postsynaptic potentials in a commercially available submersion chamber with an outflow-carbogenation unit. The outflow-carbogenation helps to stabilize the oxygen level in experiments that rely on the recycling of a small buffer reservoir to enhance the cost-efficiency of drug experiments. In addition, the manuscript presents representative experiments that examine the effects of different carbogenation modes and stimulation paradigms on the activity-dependent synaptic plasticity of synaptic transmission.

This protocol describes the stabilization of the oxygen level in a small volume of recycled buffer and methodological aspects of recording activity-dependent synaptic plasticity in submerged acute hippocampal slices.

급성 Hippocampal 조각에 작은 볼륨 재활용-, 관류-침수 형 챔버 시스템 유지에 시 냅 스가 소성을 기록

Even though experiments on brain slices have been in use since 1951, problems remain that reduce the probability of achieving a stable and successful ...

Two-photon Calcium Imaging in Neuronal Dendrites in Brain Slices

Calcium (Ca2+) imaging is a powerful tool to investigate the spatiotemporal dynamics of intracellular Ca2+ signals in neuronal dendrites. Ca2+ fluctuations can occur through a variety of membrane and intracellular mechanisms and play a crucial role in the induction of synaptic plasticity and regulation of dendritic excitability. Hence, the ability to record different types of Ca2+ signals in dendritic branches is valuable for groups studying how dendrites integrate information. The advent of two-photon microscopy has made such studies significantly easier by solving the problems inherent to imaging in live tissue, such as light scattering and photodamage. Moreover, through combination of conventional electrophysiological techniques with two-photon Ca2+ imaging, it is possible to investigate local Ca2+ fluctuations in neuronal dendrites in parallel with recordings of synaptic activity in soma. Here, we describe how to use this method to study the dynamics of local Ca2+ transients (CaTs) in dendrites of GABAergic inhibitory interneurons. The method can be also applied to studying dendritic Ca2+ signaling in different neuronal types in acute brain slices.

We present a method combining whole-cell patch-clamp recordings and two-photon imaging to record Ca2+ transients in neuronal dendrites in acute brain slices.