Siamo grati ai nostri collaboratori Knut Holthoff, Arthur Konnerth e Marco Canepari che hanno partecipato allo sviluppo iniziale di questa tecnica e per Leslie M. Loew per la gentile fornitura di coloranti. Supportato da NSF concedere IOS-0817969, sovvenzioni NIH NS068407 e M136043 e Kavli Istituto di Neuroscienze all&#39;Università di Yale.

1. Impostazione dell&#39;apparecchiatura Passo 1.1. Imaging di installazione La chiave per la registrazione dei segnali di tensione colorante sensibili è la progettazione di configurazione appropriato. Usiamo un microscopio in posizione verticale (BX51WI Olympus o AxioExaminer Zeiss) dotato di tre telecamere. L&#39;installazione è stata progettata per l&#39;illuminazione di singoli neuroni in fettine di cervello di luce di eccitazione in epi-fluorescenza, wide-field modalità microscopia utilizzando sia 60X/1.0 Nikon NA o Zeiss 63X/1.0 acqua NA obiettivi immersione. Nostri microscopi sono imbullonati a una tabella di isolamento di vibrazione e dotate motorizzati fasi mobili. Ogni microscopio è dotato di tre porte fotocamera. Una porta fotocamera è dotata di un elevato standard risoluzione spaziale camera CCD per DIC video-microscopia a raggi infrarossi (IR-1000, Dage MTI, USA). La porta ha una seconda fotocamera veloce acquisizione dei dati della telecamera (fino a 20 frame rate kHz) con relativamente bassa risoluzione spaziale (80 x 80 pixel), ma eccezionale gamma dinamica (14 bit) e eccezionalmente basso leggererumore (NeuroCCD-SM, RedShirtImaging LLC, Decatur, GA). La terza porta fotocamera ha una fotocamera CCD ad alta risoluzione spaziale (PixelFly, 1392x1024 pixel, PCO AG, Germania) montato su un disco rotante-scanner confocale (CSU-10, Yokogawa, Giappone) utilizzato per raccogliere z-stacks di immagini confocali per dettagliata ricostruzione morfologica della cellula colorata. Un diodo a frequenza doppia-pompato Nd: YVO4 laser ad onda continua (400 mW) che emette a 532 nm (MLL-III/400 mW; CNI, Changchun, Cina) è la sorgente di luce di eccitazione. Il diametro di 2 millimetri fascio laser gated da un otturatore (LS6; Associates Vincent) è diretta ad una guida di luce accoppiato al microscopio tramite una singola porta condensatore epifluorescenza (TILL Photonics GmbH, Gräfelfing, Germania) progettati per riempire completamente l&#39;apertura posteriore del obiettivo e fornire un&#39;illuminazione uniforme prossimità del piano oggetto. La luce laser viene utilizzato al posto di un convenzionale lampada Xenon ad arco per massimizzare la sensibilità del V m-imaging da: (1) usando un ex monocromaticaluce citazione all&#39;ala rossa dello spettro di assorbimento di massimizzare V m sensibilità del colorante 9, 10 e (2) aumentare l&#39;intensità della luce di eccitazione oltre il livello che può essere raggiunto da una lampada ad arco. La luce di eccitazione è riflessa alla preparazione da uno specchio dicroico con una lunghezza d&#39;onda centrale di 560 nm e la luce di fluorescenza registrata fatto passare attraverso un filtro barriera 610 nm (a Schott RG610). L&#39;effetto combinato di un aumento dell&#39;intensità della luce e l&#39;utilizzo di lunghezze d&#39;onda ottimali vicino eccitazione monocromatiche era un drammatico miglioramento della sensibilità di imaging tensione di un fattore di circa 50 rispetto alle misurazioni precedenti 6. Passo 1,2. Regolare per un&#39;illuminazione uniforme Utilizzare uno standard fluorescenza diapositiva (eccitazione verde / emissione rossa). Inserire opportuni filtri di densità neutri nel percorso del raggio laser in modo che il CCD non è saturo. Focalizzare l&#39;obiettivo sulla superficiela diapositiva. Regolare la posizione del lato di ricezione della guida di luce quarzo davanti all&#39;obiettivo lanciatore laser, e regolare la posizione della estremità di uscita della guida di luce collegato al microscopio mediante opportuni attuatori sulla epi-fluorescenza condensatore per ottenere centrato ed uniforme illuminazione del campo di vista. Passo 1.3. Determinare il rumore vibrazionale Inserire un segno piccola inchiostro nero sulla superficie del vetrino fluorescenza. Registrare l&#39;intensità della luce con NeuroCCD nella modalità di registrazione continua. Mettere a fuoco l&#39;obiettivo su un bordo scuro del marchio inchiostro nero. Registrare l&#39;intensità luminosa per circa 100 msec a 2 kHz di frequenza di fotogrammi. Visualizzare la media spaziale delle tracce frazionari intensità luminosa (Af / F) di ~ 20 pixel che ricevono luce dalla zona illuminata uniformemente e da circa 20 pixel lungo il bordo del marchio inchiostro. Il rumore in eccesso nelle registrazioni da pixel con bordi ad alto contrasto riflette il rumore vibrazionale inil sistema. Passo 1.4. Vibrazioni isolamento È obbligatorio per ridurre le vibrazioni utilizzando una tavola di isolamento vibrazioni ad un livello inferiore al rumore di sparo con intensità di luce paragonabili a condizioni di registrazione sperimentali. Regolare la tavola di isolamento delle vibrazioni finché il rumore di vibrazione in dell&#39;intensità luminosa da pixel che coprono il bordo tagliente dell&#39;immagine è trascurabile. Nessuna delle apparecchiature con parti mobili (persiane, ventilatori meccanici) può essere montato sulla tavola. I cavi dal materiale sulla tavola allegata ad altri componenti che non sono isolati dalle vibrazioni devono essere allentato in modo che non trasmettono vibrazioni meccaniche al microscopio. 2. Selezione di un Neuron Adeguato per V m-Imaging Passo 2.1. Selezione di neuroni Rendere fettine cerebrali secondo procedure standard. Utilizzare una linea di topi esprimono EGFP in singole cellule nervose di iINTERESSE. Con un sistema di rotazione del disco confocale, visualizzare i neuroni EGFP marcati nella sezione. Selezionare neuroni per V m-imaging con intatte dendritiche / assonale alberi, e con processi parallelo e vicino alla superficie della fetta. Ciò non può essere realizzato in topi selvatici perché assoni e dendriti sottili, per la maggior parte, non sono visibili in modalità microscopia DIC. 3. Neuroni di carico con tensione sensibile Dye Passo 3.1. Riempimento della pipetta di patch Riempire pipette di patch vetro dalla punta con colorante senza soluzione intracellulare applicando pressione negativa per circa 15 s fino a 2/3 del cono dell&#39;elettrodo. La soluzione colorante libero in punta è necessaria per evitare la fuoriuscita del colorante sulla fetta che aumenta la fluorescenza di fondo e riduce drasticamente rapporto segnale-rumore. Back-riempire l&#39;elettrodo con la soluzione contenente il colorante impermeant membrana sensibile tensione JPW3028 discioltoin soluzione intracellulare (0,8 mM). JPW3028, la sonda di tensione di maggior successo per l&#39;applicazione intracellulare, è un analogo doppiamente carica positiva del ANEP serie di coloranti lipofili stirilici ancora sufficientemente solubile in acqua da utilizzare per microiniezione. Il di-etil analogica di questo colorante è praticamente identiche caratteristiche (inclusa la tensione-sensibilità) ed è disponibile in commercio come JPW1114 (vedi Tabella 1). Prepariamo soluzione stock 20 mM in acqua distillata H 2 O. Aliquote di 50 microlitri della soluzione stock sono conservati congelati a -20 ° C. Per la concentrazione di colorante finale di 0,8 mM, 2 ml di soluzione madre viene sciolto in 50 ml di soluzione intracellulare nel giorno dell&#39;esperimento. La soluzione colorante magazzino è stabile e può essere conservato a temperatura ambiente per diversi mesi. Pertanto, manteniamo uno aliquota 50 microlitri a temperatura ambiente fino al suo esaurimento. Passo 3.2. Stabilire una giga-sigillo in fretta <p class = &quot;jove_content&quot;&gt; Patch un neurone selezionato in precedenza e consentire libera diffusione del colorante da una pipetta di patch somatica al soma in configurazione whole-cell per 20-45 min. È essenziale ottenere una tenuta più velocemente possibile in modo che la quantità di colorante libero in soluzione la punta può essere piccola. Inizia la pratica patch veloce senza il colorante nella elettrodo. Successivo, patch pratica e caricamento neuroni con il colorante con l&#39;obiettivo di utilizzare una quantità minima di colorante libero in soluzione punta senza contaminare il tessuto circostante. Con la pratica, è possibile creare una tenuta entro 1-2 min. Passo 3.3. Monitorare il livello di colorazione Durante la diffusione colorante nella configurazione whole-cell, monitorare lo stato fisiologico del neurone registrando potenziali d&#39;azione evocati in current-clamp mode. Inoltre, controllare la quantità di colorazione registrando l&#39;intensità della luce di riposo (RLI) dal soma cellulare a un frame rate di 2 k<html> Hz e ad una frazione di intensità luminosa piena regolata con filtri a densità neutra (usiamo 0,04% dell&#39;intensità della luce laser da un laser 400 mW). Continuare il processo di tintura carico fino al potenziale di azione inizia ad ampliare, di solito dopo 20-40 minuti, a seconda della dimensione e resistenza dell&#39;elettrodo. L&#39;ampliamento del picco è completamente reversibile e molto probabilmente a causa dell&#39;effetto di carico capacitivo della concentrazione del colorante saturi nella membrana somatica. La forma d&#39;onda del picco viene completamente ripristinata dopo la concentrazione di colorante è equilibrata tutto il neurone. Passo 3.4. Rimuovere l&#39;elettrodo colorante Alla fine del periodo di colorazione, tirare la pipetta cerotto dalla soma in configurazione voltage clamp garantire che la transizione da cellule intere di fuori-out configurazione patch viene raggiunto nel processo. Passo 3,5. Attendere per la diffusione colorante ent &quot;&gt; Incubare la fetta per un ulteriore 1,5-2 ore a temperatura ambiente per permettere la tensione colorante sensibile a diffondersi in processi neuronali. Dopo una notevole quantità di colorante diffonde dal soma in processi dendritiche e assonali, la forma d&#39;onda di l&#39;AP è completamente ristrutturato. 4. Registrazione ottica Passo 4.1. Selezionare un compartimento cellulare per l&#39;imaging Individuare la soma del neurone colorato con fluorescenza a basso livello di luce e ri-patch il neurone con uno standard (senza colorante) elettrodo patch nell&#39;ambiente DIC. Visualizza processi neuronali sotto il livello di scarsa luminosità a un frame rate di 10-40 Hz in modalità di registrazione continua del CCD per tensione-imaging. Ridurre il livello di luce con filtri a densità neutra al minimo richiesto per visualizzare l&#39;oggetto di interesse. Usiamo 0,01% dell&#39;intensità laser 400 mW durante il posizionamento del neurone macchiato. Utilizzando uno stadio XY, posizionare il processo neuronale di interesse in tegli centro l&#39;area di esposizione. Proteggere il soma dalla luce di eccitazione con il diaframma parzialmente chiuso fermata campo del microscopio. Proteggere il soma dalla luce di eccitazione ad alta intensità riduce in modo significativo i danni fotodinamica durante la registrazione. Passaggio 4.2 segnali Record ottiche relative ai transitori potenziale di membrana Registrare segnali ottici relativi a punti di accesso backpropagated nei singoli rami dendritici. Registrare segnali ottici relativi punti di accesso nel assone. Registrare segnali ottici legati alla backpropagating AP in spine dendritiche. Utilizzare frame rate adeguate per la ricostruzione accurata della forma d&#39;onda del segnale e mantenere i periodi di registrazione e l&#39;esposizione alla luce ad alta intensità di eccitazione più corti possibile per ridurre al minimo colorante sbianca e danni fotodinamica. Ad esempio, esaminando la sequenza di iniziazione e propagazione dei potenziali d&#39;azione unico nel assone richiede periodi di registrazione di 5-10 msec. L&#39;eccitazione luce intenty durante la registrazione è un compromesso tra il rapporto segnale-rumore, da un lato e il grado di tintura candeggio e danni fotodinamica dall&#39;altro. Usiamo 100% di intensità del laser 400 mW in registrazione da lunghi tratti di assoni quando un&#39;area di 300 micron di diametro è illuminato. Quando la luce di eccitazione è focalizzato ad una zona 30 micron di diametro per l&#39;imaging spina dendritica, usiamo 10-25% dell&#39;intensità della luce laser. La durata della registrazione è un fattore determinante l&#39;intensità ottimale luce di eccitazione; periodi di registrazione più brevi consentono intensità di luce più elevate. L&#39;intensità di illuminazione ottimale è meglio determinata empiricamente per ogni preparazione e le impostazioni di misurazione. 5. Analisi dei dati Passo 5.1. Correggere i dati grezzi per errori noti L&#39;analisi e la visualizzazione dei dati sono state effettuate utilizzando il programma NeuroPlex (RedShirtImaging) scritto in IDL (ITT Visual Information Solutioni, Boulder, Colorado) e personalizzati routine di Visual Basic. Nelle condizioni di scarsa luminosità, la fluorescenza di fondo diventa un fattore determinante della Af / F dimensioni del segnale. I dati grezzi sono stati corretti per questo effetto sottraendo la media intensità di fluorescenza di fondo determinato da una zona non colorato sulla fetta. Successivamente, il software di allineamento dei segnali è stato utilizzato per correggere jitter temporale in AP iniziazione e per eventuali piccoli movimenti della preparazione durante media. Nel dominio temporale, segnali di AP sono stati allineati da cross correlazione degli AP elettricamente registrato in ogni prova al segnale di riferimento acquisita all&#39;inizio della media (Figura 1B). Nel dominio spaziale, le immagini sono state allineate in due dimensioni offline per immagine cross-correlazione per compensare eventuali piccoli movimenti laterali della preparazione. La corretta messa a fuoco dell&#39;immagine nel z-dimensione è stato verificato prima di ogni prova individuale; smal<html> rettifiche l erano spesso necessario. I segnali spazialmente e temporalmente allineati stati mediati come mostrato in figura 1B. Lenti cambiamenti di intensità luminosa dovuta allo sbiancamento del colorante sono stati corretti dividendo i dati da un opportuno duplice funzione esponenziale derivata dagli studi di registrazione senza stimolazione (Figura 1B). La forma d&#39;onda del segnale di AP è stato ricostruito da un insieme di punti di dati utilizzando Cubic Spline interpolazione, una curva continua a tratti passante per ciascun punto di dati. Per confermare che la tensione di segnale sensibile colorante tracce potenziale di membrana senza distorsione significativa alla scala temporale millisecondo, il segnale elettrico dal soma AP è stato confrontato con il segnale ottico AP dal poggio assone adiacente come mostrato in figura 3B. I due segnali si sovrappongono molto da vicino, consentendo il rumore colpo ottico di registrazione. les/ftp_upload/4261/4261fig1.jpg &quot;/&gt; Figura 1. Analisi dei dati (Animazione). (A) Pannello superiore: immagine ad alta risoluzione confocale macchiato di un neurone con assone nella posizione di registrazione. Elettrodo di registrazione allegata alla soma ed extracellulare elettrodo stimolante accanto dendrite basale schematizzato. I potenziali d&#39;azione evocati da extracellulare, la stimolazione sinaptica. Pannello inferiore: immagine a bassa risoluzione spaziale di fluorescenza della assone ottenuta con CCD utilizzata per l&#39;imaging V m (B) registrazioni elettrodo da soma (tracce nere), registrazioni ottiche da AIS (tracce rosse) e dal nodo di Ranvier (tracce verdi). . Tracce Top: i dati grezzi da 9 studi che mostrano il jitter temporale in AP iniziazione. Seconda fila di tracce: allineato temporalmente segnali. Terza fila di tracce: segnale medio. Quarta fila di tracce: correzione candeggina. Tracce di fondo: interpolazione spline cubica con un passaggio di smoothing temporale.

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Dejan Zecevic dichiara che si tratta di un co-proprietario della RedShirtImaging LLC., Una società specializzata in alta velocità, a basso rumore telecamere CCD utilizzati in voltaggio-dipendenti registrazione colorante. Tutti gli altri autori non riportano interessi finanziari o potenziali conflitti di interesse legati allo studio corrente.

Questo articolo descrive un voltaggio-dipendenti metodo di registrazione colorante per monitorare l&#39;attività elettrica dei neuroni individuali con sub-micrometrica e sub-millisecondo risoluzione spazio-temporale. Eccitazione laser a lunghezza d&#39;onda quasi ottimale (considerando le dimensioni segnale) migliorato la sensibilità di registrazione di un fattore ~ ​​50 rispetto agli approcci precedenti. La sensibilità attuale consente il monitoraggio dei segnali elettrici da tutte le parti di neuroni individual...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome del componente </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td><td> Commenti (opzionale) </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Installazione componenti </td></tr><tr><td> Microscopio verticale </td><td> Olympus Inc. </td><td> BX51WI </td><td> Con tre porte della fotocamera </td></tr><tr><td> Motorizzato mobile stage </td><td> Siskiyou </td><td> MXOPi.2 </td><td></td></tr><tr><td> Epi-fluorescenza condensatore per Olympus BX51 </td><td> TILL Photonics </td><td> 0000-560-11659 </td><td></td></tr><tr><td> Microscopio verticale </td><td> Carl Zeiss, LLC </td><td> AxioExaminer D1 </td><td> Con tre porte della fotocamera </td></tr><tr><td> Motorizzato piastra superiore </td><td> Scientifica limitata </td><td> MMBP </td><td></td> &lt;/ Tr&gt; <tr><td> Epi-fluorescenza a condensatore per Zeiss AxioExaminer </td><td> TILL Photonics </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Acquisizione Dati Camera </td><td> RedShirtImaging LLC </td><td> NeuroCCD-SM </td><td> Ad alta velocità, a basso rumore di lettura </td></tr><tr><td> CCD per IR-DIC </td><td> Dage-MTI </td><td> IR-1000 </td><td></td></tr><tr><td> Spinning-Disc scanner confocale </td><td> Yokogawa </td><td> CSU-10 </td><td></td></tr><tr><td> CCD ad alta risoluzione spaziale nello scanner confocale </td><td> PCO AG </td><td> PixelFly </td><td> 1392x1024 pixel </td></tr><tr><td> DPSS laser CW (532 Nm) </td><td> CNI Optoelettronica Tech. Co., Ltd </td><td> MLL-III-532 400mW </td><td> Eccitazione sorgente di luce </td></tr><tr><td> Fibra multi-mode Launcher </td><td> Siskiyou </td><td> SM-CFT </td><td></td></tr><tr><td> Light Guide </td><td> FINO Fotonic </td><td> 0000-515-11524 </td><td></td></tr><tr><td> Otturatore </td><td> Vincent Associates </td><td> LS6 </td><td></td></tr><tr><td> Vibrazioni isolamento Tabella </td><td> Minus k Tecnologia </td><td> MK26 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Reagenti specifici </td></tr><tr><td> Di-2-ANEPEQ (JPW 1114) </td><td> Life Technologies </td><td> D-6923 </td><td> Tensione colorante sensibile </td></tr><tr><td> Crym-EGFP mouse Linea </td><td> GENSAT (MMRRC) </td><td> STOCK Tg (Crym-EGFP) GF82Gsat/Mmcd </td><td> Scarsamente esprimere EGFP nel livello 5 neuroni corticali </td></tr></tbody></table>

voltage-sensitive dye recording from axons, dendrites and dendritic spines of individual neurons in brain slices

Comprendere le proprietà biofisiche e l&#39;organizzazione funzionale dei neuroni singoli e come informazioni di processo è fondamentale per capire come funziona il cervello. La funzione primaria di qualsiasi cellula nervosa è di elaborare i segnali elettrici, solitamente da più fonti. Proprietà elettriche dei processi neuronali sono straordinariamente complessa, dinamica, e, nel caso generale, impossibile prevedere in assenza di misurazioni dettagliate. Per ottenere tale misurazione si sarebbe, idealmente, come essere in grado di monitorare, in più siti, eventi sottosoglia mentre viaggiano dai siti di origine sui processi neuronali e sommare in posizioni particolari di influenzare iniziazione potenziale d&#39;azione. Questo obiettivo non è stato raggiunto in un neurone a causa di limitazioni tecniche di misurazioni che utilizzano elettrodi. Per superare questo inconveniente, è altamente desiderabile per integrare la patch-elettrodo approccio con tecniche di imaging che permettono ampia Recordin parallelogs da tutte le parti di un neurone. Qui, descriviamo una tecnica - ottico di registrazione dei transitori potenziale di membrana con organici tensione coloranti sensibili (V m-imaging) - caratterizzati da sub-millisecondo e sub-micrometrica risoluzione. Il nostro metodo si basa sul lavoro pionieristico di sonde molecolari tensione-sensibili 2. Molti aspetti della tecnologia iniziale sono stati continuamente migliorati per decenni 3, 5, 11. Inoltre, lavoro precedente documentato due caratteristiche essenziali di V m-imaging. In primo luogo, i segnali di fluorescenza sono linearmente proporzionale al potenziale di membrana su tutta la gamma fisiologica (-100 mV a +100 mV, 10, 14, 16). In secondo luogo, i neuroni di carico con la tensione di colorante sensibile usato qui (JPW 3028) non ha effetti farmacologici rilevabili. L&#39;ampliamento del picco registrato durante il caricamento del colorante è completamente reversibile 4, 7. Inoltre, prove sperimentali mostrano che è possibile ottenereun numero significativo (fino a centinaia) di registrazioni prima di eventuali effetti rilevabili fototossiche 4, 6, 12, 13. Attualmente, sfruttare la luminosità eccezionale e stabilità di una sorgente di luce laser a lunghezza d&#39;onda quasi ottimale per massimizzare la sensibilità della m-imaging tecnica V. La sensibilità attuale consente registrazioni di più siti di ottica di V transitori m da tutte le parti di un neurone, tra assoni e assoni collaterali, rami terminali dendritiche, e spine dendritiche individuali. Le informazioni acquisite sulle interazioni di segnale possono essere analizzati quantitativamente e direttamente visualizzati sotto forma di un film.

Successo microscopia confocale dovrebbe consentire una chiara identificazione dei processi neuronali intatti che sono vicino alla superficie della fetta e situato in un piano di messa a fuoco. La selezione delle cellule nervose che sono appropriate per l&#39;imaging di tensione prima della voltaggio-dipendenti carico colorante è fondamentale. Un esempio di immagini confocali di L5 neuroni piramidali esprimono EGFP in una fetta corticale (Crym transgenico linea mouse) è mostrato in Figura 2. Gli assoni...

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Voltage-sensitive Dye Recording from Axons, Dendrites and Dendritic Spines of Individual Neurons in Brain Slices

Una tecnica di imaging per il monitoraggio dei cambiamenti potenziale di membrana con una risoluzione spaziale sub-micrometrica e sub-millisecondo temporale è descritta. La tecnica, sulla base di eccitazione del laser di tensione-sensibili coloranti, consente misure di segnali in assoni e assoni collaterali, rami terminali dendritiche, e singoli spine dendritiche.

Tensione sensibile registrazione Dye da assoni, dendriti e spine dendritiche dei singoli neuroni in fettine di cervello

Understanding the biophysical properties and functional organization of single neurons and how they process information is fundamental for understanding ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

16.6K Views.  Yale University School of Medicine. Una tecnica di imaging per il monitoraggio dei cambiamenti potenziale di membrana con una risoluzione spaziale sub-micrometrica e sub-millisecondo temporale è descritta. La tecnica, sulla base di eccitazione del laser di tensione-sensibili coloranti, consente misure di segnali in assoni e assoni collaterali, rami terminali dendritiche, e singoli spine dendritiche.

Video: Voltage-sensitive Dye Recording from Axons, Dendrites and Dendritic Spines of Individual Neurons in Brain Slices

DiOLISTIC Labeling of Neurons from Rodent and Non-human Primate Brain Slices

DiOLISTIC staining uses the gene gun to introduce fluorescent dyes, such as DiI, into neurons of brain slices (Gan et al., 2009; O'Brien and Lummis, 2007; Gan et al., 2000). Here we provide a detailed description of each step required together with exemplary images of good and bad outcomes that will help when setting up the technique. In our experience, a few steps proved critical for the successful application of DiOLISTICS. These considerations include the quality of the DiI-coated bullets, the extent of fixative exposure, and the concentration of detergent used in the incubation solutions. Tips and solutions for common problems are provided. This is a versatile labeling technique that can be applied to multiple animal species at a wide range of ages. Unlike other fluorescent labeling techniques that are limited to preparations from young animals or restricted to mice because they rely on the expression of a fluorescent transgene, DiOLISTIC labeling can be applied to animals of all ages, species and genotypes and it can be used in combination with immunostaining to identify a specific subpopulation of cells. Here we demonstrate the use of DiOLISTICS to label neurons in brain slices from adult mice and adult non-human primates with the purpose of quantifying dendrite branching and dendritic spine morphology.

We demonstrate the use of the gene gun to introduce fluorescent dyes, such as DiI, into neurons in brain slices from rodents and non-human primates of different ages. In this particular case, we use adult mice (3-6 months old) and adult cynomologus monkeys (9-15 years old). This technique, originally described by the laboratory of Dr. Lichtman (Gan et al., 2000), is well suited for the study of dendritic branching and dendritic spine morphology and can be combined with traditional immunostaining, if detergents are kept at a low concentration.

Etichettatura DiOLISTIC di neuroni da roditori e non-umano Fette cervello dei primati

DiOLISTIC staining uses the gene gun to introduce fluorescent dyes, such as DiI, into neurons of brain slices (Gan et al., 2009; O'Brien and Lummis, 2007; ...

Ricerca

Neuroscienze

Optical Imaging of Neurons in the Crab Stomatogastric Ganglion with Voltage-sensitive Dyes

Voltage-sensitive dye imaging of neurons is a key methodology for the understanding of how neuronal networks are organised and how the simultaneous activity of participating neurons leads to the emergence of the integral functionality of the network. Here we present the methodology of application of this technique to identified pattern generating neurons in the crab stomatogastric ganglion. We demonstrate the loading of these neurons with the fluorescent voltage-sensitive dye Di-8-ANEPPQ and we show how to image the activity of dye loaded neurons using the MiCAM02 high speed and high resolution CCD camera imaging system. We demonstrate the analysis of the recorded imaging data using the BVAna imaging software associated with the MiCAM02 imaging system. The simultaneous voltage-sensitive dye imaging of the detailed activity of multiple neurons in the crab stomatogastric ganglion applied together with traditional electrophysiology techniques (intracellular and extracellular recordings) opens radically new opportunities for the understanding of how central pattern generator neural networks work.

Here we present the methodology for fast and high resolution fluorescent voltage-sensitive dye imaging of detailed activity of neurons in the crab stomatogastric ganglion.

Imaging ottico di neuroni nel ganglio Granchio Stomatogastric con tensione sensibili Coloranti

Voltage-sensitive dye imaging of neurons is a key methodology for the understanding of how neuronal networks are organised and how the simultaneous ...

Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) of Fluorescence Tagged Proteins in Dendritic Spines of Cultured Hippocampal Neurons

FRAP has been used to quantify the mobility of GFP-tagged proteins. Using a strong excitation laser, the fluorescence of a GFP-tagged protein is bleached in the region of interest. The fluorescence of the region recovers when the unbleached GFP-tagged protein from outside of the region diffuses into the region of interest. The mobility of the protein is then analyzed by measuring the fluorescence recovery rate. This technique could be used to characterize protein mobility and turnover rate.
In this study, we express the (enhanced green fluorescent protein) EGFP vector in cultured hippocampal neurons. Using the Zeiss 710 confocal microscope, we photobleach the fluorescence signal of the GFP protein in a single spine, and then take time lapse images to record the fluorescence recovery after photobleaching. Finally, we estimate the percentage of mobile and immobile fractions of the GFP in spines, by analyzing the imaging data using ImageJ and Graphpad softwares.
This FRAP protocol shows how to perform a basic FRAP experiment as well as how to analyze the data.

Fluorescence Recovery After Photobleaching FRAP of Fluorescence Tagged Proteins in Dendritic Spines of Cultured Hippocampal Neurons

FRAP has been used to quantify the mobility of Green Fluorescence Protein (GFP)-tagged proteins in cultured cells. We examined the mobile/immobile fractions of the GFP by analyzing the fluorescence recovery percentage after photobleaching. In this study, FRAP was performed at spines of hippocampal neurons.

Recupero della fluorescenza dopo photobleaching (FRAP) di fluorescenza proteine ​​Tagged in spine dendritiche di colture di neuroni ippocampali

FRAP has been used to quantify the mobility of GFP-tagged proteins. Using a strong excitation laser, the fluorescence of a GFP-tagged protein is bleached ...

Vibrodissociation of Neurons from Rodent Brain Slices to Study Synaptic Transmission and Image Presynaptic Terminals

Mechanical dissociation of neurons from the central nervous system has the advantage that presynaptic boutons remain attached to the isolated neuron of interest. This allows for examination of synaptic transmission under conditions where the extracellular and postsynaptic intracellular environments can be well controlled. A vibration-based technique without the use of proteases, known as vibrodissociation, is the most popular technique for mechanical isolation. A micropipette, with the tip fire-polished to the shape of a small ball, is placed into a brain slice made from a P1-P21 rodent. The micropipette is vibrated parallel to the slice surface and lowered through the slice thickness resulting in the liberation of isolated neurons. The isolated neurons are ready for study within a few minutes of vibrodissociation. This technique has advantages over the use of primary neuronal cultures, brain slices and enzymatically isolated neurons including: rapid production of viable, relatively mature neurons suitable for electrophysiological and imaging studies; superior control of the extracellular environment free from the influence of neighboring cells; suitability for well-controlled pharmacological experiments using rapid drug application and total cell superfusion; and improved space-clamp in whole-cell recordings relative to neurons in slice or cell culture preparations. This preparation can be used to examine synaptic physiology, pharmacology, modulation and plasticity. Real-time imaging of both pre- and postsynaptic elements in the living cells and boutons is also possible using vibrodissociated neurons. Characterization of the molecular constituents of pre- and postsynaptic elements can also be achieved with immunological and imaging-based approaches.

This report demonstrates a technique for mechanical isolation of individual viable neurons retaining attached presynaptic boutons. Vibrodissociated neurons have the advantages of rapid production, excellent pharmacological control and improved space-clamp without influence from neighboring cells. This method can be used for imaging of synaptic elements and patch-clamp recording.

Vibrodissociation di neuroni da fettine di cervello di roditore studio di trasmissione sinaptica e Immagine terminali presinaptici

Mechanical dissociation of neurons from the central nervous system has the advantage that presynaptic boutons remain attached to the isolated neuron of ...

Morphological Analysis of Drosophila Larval Peripheral Sensory Neuron Dendrites and Axons Using Genetic Mosaics

Nervous system development requires the correct specification of neuron position and identity, followed by accurate neuron class-specific dendritic development and axonal wiring. Recently the dendritic arborization (DA) sensory neurons of the Drosophila larval peripheral nervous system (PNS) have become powerful genetic models in which to elucidate both general and class-specific mechanisms of neuron differentiation.
There are four main DA neuron classes (I-IV)1. They are named in order of increasing dendrite arbor complexity, and have class-specific differences in the genetic control of their differentiation2-10. The DA sensory system is a practical model to investigate the molecular mechanisms behind the control of dendritic morphology11-13 because: 1) it can take advantage of the powerful genetic tools available in the fruit fly, 2) the DA neuron dendrite arbor spreads out in only 2 dimensions beneath an optically clear larval cuticle making it easy to visualize with high resolution in vivo, 3) the class-specific diversity in dendritic morphology facilitates a comparative analysis to find key elements controlling the formation of simple vs. highly branched dendritic trees, and 4) dendritic arbor stereotypical shapes of different DA neurons facilitate morphometric statistical analyses.
DA neuron activity modifies the output of a larval locomotion central pattern generator14-16. The different DA neuron classes have distinct sensory modalities, and their activation elicits different behavioral responses14,16-20. Furthermore different classes send axonal projections stereotypically into the Drosophila larval central nervous system in the ventral nerve cord (VNC)21. These projections terminate with topographic representations of both DA neuron sensory modality and the position in the body wall of the dendritic field7,22,23. Hence examination of DA axonal projections can be used to elucidate mechanisms underlying topographic mapping7,22,23, as well as the wiring of a simple circuit modulating larval locomotion14-17.
We present here a practical guide to generate and analyze genetic mosaics24 marking DA neurons via MARCM (Mosaic Analysis with a Repressible Cell Marker)1,10,25 and Flp-out22,26,27 techniques (summarized in Fig. 1).

Morphological Analysis of Drosophila Larval Peripheral Sensory Neuron Dendrites and Axons Using Genetic Mosaics

The dendritic arborization sensory neurons of the Drosophila larval peripheral nervous system are useful models to elucidate both general and neuron class-specific mechanisms of neuron differentiation. We present a practical guide to generate and analyze dendritic arborization neuron genetic mosaics.

Analisi morfologica del Drosophila Larvale dendriti sensoriali e periferico Neuron assoni utilizzo Mosaici genetici

Nervous system development requires the correct specification of neuron position and identity, followed by accurate neuron class-specific dendritic ...

Recording Electrical Activity from Identified Neurons in the Intact Brain of Transgenic Fish

Understanding the cell physiology of neural circuits that regulate complex behaviors is greatly enhanced by using model systems in which this work can be performed in an intact brain preparation where the neural circuitry of the CNS remains intact. We use transgenic fish in which gonadotropin-releasing hormone (GnRH) neurons are genetically tagged with green fluorescent protein for identification in the intact brain. Fish have multiple populations of GnRH neurons, and their functions are dependent on their location in the brain and the GnRH gene that they express1 . We have focused our demonstration on GnRH3 neurons located in the terminal nerves (TN) associated with the olfactory bulbs using the intact brain of transgenic medaka fish (Figure 1B and C). Studies suggest that medaka TN-GnRH3 neurons are neuromodulatory, acting as a transmitter of information from the external environment to the central nervous system; they do not play a direct role in regulating pituitary-gonadal functions, as do the well-known hypothalamic GnRH1 neurons2, 3 .The tonic pattern of spontaneous action potential firing of TN-GnRH3 neurons is an intrinsic property4-6, the frequency of which is modulated by visual cues from conspecifics2 and the neuropeptide kisspeptin 15. In this video, we use a stable line of transgenic medaka in which TN-GnRH3 neurons express a transgene containing the promoter region of Gnrh3 linked to enhanced green fluorescent protein7 to show you how to identify neurons and monitor their electrical activity in the whole brain preparation6.

In this video, we will demonstrate how to record electrical activity from identified single neurons in a whole brain preparation, which preserves complex neural circuits. We use transgenic fish in which gonadotropin-releasing hormone (GnRH) neurons are genetically tagged with a fluorescent protein for identification in the intact brain preparation.

La registrazione dell&#39;attività elettrica dai neuroni identificati nel cervello intatto di pesci transgenici

Understanding the cell physiology of neural circuits that regulate complex behaviors is greatly enhanced by using model systems in which this work can be ...

Imaging Dendritic Spines of Rat Primary Hippocampal Neurons using Structured Illumination Microscopy

Dendritic spines are protrusions emerging from the dendrite of a neuron and represent the primary postsynaptic targets of excitatory inputs in the brain. Technological advances have identified these structures as key elements in neuron connectivity and synaptic plasticity. The quantitative analysis of spine morphology using light microscopy remains an essential problem due to technical limitations associated with light's intrinsic refraction limit. Dendritic spines can be readily identified by confocal laser-scanning fluorescence microscopy. However, measuring subtle changes in the shape and size of spines is difficult because spine dimensions other than length are usually smaller than conventional optical resolution fixed by light microscopy's theoretical resolution limit of 200 nm.
Several recently developed super resolution techniques have been used to image cellular structures smaller than the 200 nm, including dendritic spines. These techniques are based on classical far-field operations and therefore allow the use of existing sample preparation methods and to image beyond the surface of a specimen. Described here is a working protocol to apply super resolution structured illumination microscopy (SIM) to the imaging of dendritic spines in primary hippocampal neuron cultures. Possible applications of SIM overlap with those of confocal microscopy. However, the two techniques present different applicability. SIM offers higher effective lateral resolution, while confocal microscopy, due to the usage of a physical pinhole, achieves resolution improvement at the expense of removal of out of focus light. In this protocol, primary neurons are cultured on glass coverslips using a standard protocol, transfected with DNA plasmids encoding fluorescent proteins and imaged using SIM. The whole protocol described herein takes approximately 2 weeks, because dendritic spines are imaged after 16-17 days in vitro, when dendritic development is optimal. After completion of the protocol, dendritic spines can be reconstructed in 3D from series of SIM image stacks using specialized software.

This article describes a working protocol to image dendritic spines from hippocampal neurons in vitro using Structured Illumination Microscopy (SIM). Super-resolution microscopy using SIM provides image resolution significantly beyond the light diffraction limit in all three spatial dimensions, allowing the imaging of individual dendritic spines with improved detail.

Imaging spine dendritiche di Rat Primaria neuroni dell&#39;ippocampo utilizzando Structured Illumination Microscopy

Dendritic spines are protrusions emerging from the dendrite of a neuron and represent the primary postsynaptic targets of excitatory inputs in the brain. ...

Acute Dissociation of Lamprey Reticulospinal Axons to Enable Recording from the Release Face Membrane of Individual Functional Presynaptic Terminals

Synaptic transmission is an extremely rapid process. Action potential driven influx of Ca2+&#160;into the presynaptic terminal, through voltage-gated calcium channels (VGCCs) located in the release face membrane, is the trigger for vesicle fusion and neurotransmitter release. Crucial to the rapidity of synaptic transmission is the spatial and temporal synchrony between the arrival of the action potential, VGCCs and the neurotransmitter release machinery. The ability to directly record Ca2+&#160;currents from the release face membrane of individual presynaptic terminals is imperative for a precise understanding of the relationship between presynaptic Ca2+&#160;and neurotransmitter release. Access to the presynaptic release face membrane for electrophysiological recording is not available in most preparations and presynaptic Ca2+&#160;entry has been characterized using imaging techniques and macroscopic current measurements &#8211; techniques that do not have sufficient temporal resolution to visualize Ca2+ entry. The characterization of VGCCs directly at single presynaptic terminals has not been possible in central synapses and has thus far been successfully achieved only in the calyx-type synapse of the chick ciliary ganglion and in rat calyces. We have successfully addressed this problem in the giant reticulospinal synapse of the lamprey spinal cord by developing an acutely dissociated preparation of the spinal cord that yields isolated reticulospinal axons with functional presynaptic terminals devoid of postsynaptic structures. We can fluorescently label and identify individual presynaptic terminals and target them for recording. Using this preparation, we have characterized VGCCs directly at the release face of individual presynaptic terminals using immunohistochemistry and electrophysiology approaches. Ca2+ currents have been recorded directly at the release face membrane of individual presynaptic terminals, the first such recording to be carried out at central synapses.

Recording Ca2+ currents at the presynaptic release face membrane is key to a precise understanding of Ca2+ entry and neurotransmitter release. We present an acute dissociation of the lamprey spinal cord that yields functional isolated reticulospinal axons, permitting recording directly from the release face membrane of individual presynaptic terminals.

Acuta dissociazione di Lamprey reticulospinal assoni per attivare la registrazione dal rilascio Volto membrana di singoli funzionali terminali presinaptici

Synaptic transmission is an extremely rapid process. Action potential driven influx of Ca2+&#160;into the presynaptic terminal, through voltage-gated ...

Recording Synaptic Plasticity in Acute Hippocampal Slices Maintained in a Small-volume Recycling-, Perfusion-, and Submersion-type Chamber System

Even though experiments on brain slices have been in use since 1951, problems remain that reduce the probability of achieving a stable and successful analysis of synaptic transmission modulation when performing field potential or intracellular recordings. This manuscript describes methodological aspects that might be helpful in improving experimental conditions for the maintenance of acute brain slices and for recording field excitatory postsynaptic potentials in a commercially available submersion chamber with an outflow-carbogenation unit. The outflow-carbogenation helps to stabilize the oxygen level in experiments that rely on the recycling of a small buffer reservoir to enhance the cost-efficiency of drug experiments. In addition, the manuscript presents representative experiments that examine the effects of different carbogenation modes and stimulation paradigms on the activity-dependent synaptic plasticity of synaptic transmission.

This protocol describes the stabilization of the oxygen level in a small volume of recycled buffer and methodological aspects of recording activity-dependent synaptic plasticity in submerged acute hippocampal slices.

Registrazione di plasticità sinaptica in fettine ippocampali Acute mantenuti in un piccolo volume riciclaggio - aspersione- e sistema di immersione-tipo camera

Even though experiments on brain slices have been in use since 1951, problems remain that reduce the probability of achieving a stable and successful ...

Two-photon Calcium Imaging in Neuronal Dendrites in Brain Slices

Calcium (Ca2+) imaging is a powerful tool to investigate the spatiotemporal dynamics of intracellular Ca2+ signals in neuronal dendrites. Ca2+ fluctuations can occur through a variety of membrane and intracellular mechanisms and play a crucial role in the induction of synaptic plasticity and regulation of dendritic excitability. Hence, the ability to record different types of Ca2+ signals in dendritic branches is valuable for groups studying how dendrites integrate information. The advent of two-photon microscopy has made such studies significantly easier by solving the problems inherent to imaging in live tissue, such as light scattering and photodamage. Moreover, through combination of conventional electrophysiological techniques with two-photon Ca2+ imaging, it is possible to investigate local Ca2+ fluctuations in neuronal dendrites in parallel with recordings of synaptic activity in soma. Here, we describe how to use this method to study the dynamics of local Ca2+ transients (CaTs) in dendrites of GABAergic inhibitory interneurons. The method can be also applied to studying dendritic Ca2+ signaling in different neuronal types in acute brain slices.

We present a method combining whole-cell patch-clamp recordings and two-photon imaging to record Ca2+ transients in neuronal dendrites in acute brain slices.