我々は、データ、ビデオ、および原稿について報告用RayhanアリフとHassaan Shahawyカメラワークのため、TriptiグプタとFrederike Alwes細胞除去技術を洗練支援のため、およびExtavourラボのメンバーに感謝します。この作品は、部分的にハーバード幹細胞研究所によってサポートされていました（シード·グラント番号SG-0057-10-00）エリソン医療財団（新規奨学生賞番号AG-、NS-07010から10）CGEに、ハーバード大学の研究プログラム賞へARN。

特定の手順を実行する際に役立つかもしれないコメントはイタリック体で示されている。 1。 1日目：材料の調製<ol><li>以下の材料を（材料および装置の表を参照）準備します。 <ul><li> 15センチメートルと22センチパスツールピペット</li><li>ダイヤモンドスクライブ</li><li> 1 mg / mlのアムホテリシンB（100 mg / mlの保存溶液の1:100）、100単位/ mlペニシリンおよび100 mg / mlのストレプトマイシン（原液の1:50に含むフィルター人工海水（0.0018から0.0020の間に塩分） ）、ペニシリンおよびストレプトマイシン5,000 mg / mlの5,000単位/ mlを含有する</li><li>無添加フィルター人工海水（0.0018から0.0020の間塩分） </li><li>住宅カップルのための大規模なプラスチック容器（15cm以上×15センチ×5cm）に</li><li>小さな（3 cm以上5cm）にシルガードを敷いたペトリ皿</li><li>小さな（3 cm以上5cm）にペトリ皿</li><li>時計皿またはガラス製マルチウェルプレート</li><li>鉗子（私たちはあちこちに派生鈍鉗子を使用我々は鉗子の端が両方の歯が同じ長さであることを、滑らかであり、彼らはもはや持っていることをことを保証するために、石を研ぐ鉗子を使用して再利用している、誤って他の実験手順で被害を受けたM旧デュモン＃5鉗子、シャープポイント。彼らは胚および/または女性を傷つける可能性がある新たなデュモン＃5鉗子などの非常に微細な鉗子は、望ましくない。） </li><li>終了したパスツールピペット（下記ステップ1.2を参照）を広げ</li><li>パスツールピペットの細い端部に埋め込まれた薄い、湾曲タングステンワイヤからなる胚検索ツール（代替の実装で置き換えることができ、1.3以下を参照のこと） </li><li>小さな開口部で口ピペット（以下のステップ1.4を参照してください） </li><li>プルガラスキャピラリーから作られたガラス針（以下のステップ1.5を参照してください） </li></ul>人間に有毒ない材料は、このプロトコルで使用されていません。リスク管理のGuidelで必要とされるが、研究者は、手袋などの保護服装を着用することを確認する必要があります所属機関のINES。 </li><li>それから広がったパスツールピペット、ピペットは、ダイヤモンドスク狭い指を保護するためにキムワイプや紙タオルでピペットの得点部位をラップし始めの時点で15cmのパスツールピペットの周りの第1のスコア、慎重を作成するにはスコアラインの先端を解消。エッジを滑らかにするために、数秒間ブンゼンバーナーの炎の上ピペットの壊れた端を持ってください。開口部は、ピペットの最大幅より若干狭くする必要があります。 </li><li>ツールを解剖タングステン線を作るために、15cmのガラスパスツールピペットの端部にタングステン線を挿入し、所定の位置にワイヤーを固定し、ガラスを溶融するブンゼンバーナーの炎の上に簡単に保持します。フック形状に穏やかにカーブワイヤの端に鉗子を使用してください。このツールの適切な形状の例については、 図3を参照してください。 </li><li>口のピペット用の小さな開口部を作るために、二つの部分OV開始22センチパスツールピペットの細い端を引っ張るER炎、小端の先端を解消。口のピペットホルダーの端部に挿入します。 </li><li>ニードルプラーを用いて切除処置中に関心対象の割球を穿刺するために使用されるガラス針を作る。適切な形状の針が図4に示されている。この針は、パラメータ2X（熱= 566、プル= 100、速度= 20時間= 250）+ 1Xでプログラムを使用してサターのP97針プラーで引いた（熱= 566、プル= 100、速度= 100時間= 250）。まだまた、胚の絨毛膜に押し付けたときに破損しないよう十分に頑丈であること、針を作るために使用される特定のプログラムと機器を変えることができるが、針は細かい点を持っている必要があります。 </li></ol> 2。 1日目：ザ·ギャザリングParhyale嵌合カップル<ol><li> Pを交配収集するために拡大し、パスツールピペット（上記の手順は1.2）を使用して、大規模な培養容器からhawaiensisカップル 、およびCを含む別の容器に転送人工海水を傾けます。これは海水を濾過する必要はない。翌朝は、ほとんどの胚は最近受精や堆積ため、早期の切断に適したステージされていますように、後の午後には、相手のペアを収集し、室温で一晩（20〜23℃）でカップルを残すために最善のことですアブレーション。一部の女性は、次の朝までに初期卵割期胚を運ぶされることを保証するために、少なくとも20の嵌合ペアを収集します。 </li></ol> 3。 2日目：ザ·ギャザリングParhyale胚<ul><li>翌朝、CO 2を用いて濾過人工海水（FASW）を注入する。メスの中には、夜の間にその男性から無料で泳いているでしょう。これらの分離の女性を集めて、FASW / CO 2でそれらを麻酔。 残りの不対男性は交配対容器から取り出し、大きな培養に戻すことができる。残りの交配のペアは、後の胚の収集のために保存することができます当日または翌日中。 </li><li> FASW / CO 2中の時計皿に胚を運ぶ単一の麻酔をかけた女性を転送します。すべての分離の女性はおそらく、女性の透明寛骨プレート（ 図1A）を介して淡いピンクや紫色の球状体などの目で見えるようになりますこれ、卵を堆積しているでしょう。胚は初期卵割段階にあると割球の切除のためこのように適切かどうかを判断するために、研究者が育児嚢から胚を削除し、顕微鏡下でそれらを検討する必要があります。 </li><li>解剖顕微鏡下で手順を見て、鉗子で体の片側に沿って寛骨プレートを把握する。胚は、これらの寛骨プレート（ 図1B）間の腹側育児嚢に表示されます。 </li><li>育児嚢の後端に、ゆっくりひなを分離するために育児嚢の前端に向かってワイヤーを持ち上げ、細い、曲がったワイヤ工具（上記の手順1.3 の図3）を挿入しますポーチ用敷物（これらは30 oostegites呼ばれる腹側の付属を修正している）、ポーチを開いて胚を緩める。この膜は、産卵後約2〜3時間で消え、胚はバインドされていない、すべてが簡単にワイヤ工具によって破壊され、非常に薄い、透明な膜で囲まれて置かれている最初の1時間かそこら内にある胚お互いに、またはどのような方法で女性に胚形成を通じてこれ以降。研究者が育児嚢から胚を除去するための湾曲したワイヤ工具を操縦することは、不都合なまたは困難見つけた場合、代わりの実装がある限り動きが穏やかであり、全く厳しい圧力が胚または育児嚢に適用されていないとして、使用することができる。育児嚢から胚を除去するのに適切な他のツールを密封し、平滑末端と平滑化鉗子やガラスキャピラリーが含まれています。 </li><li> Tを押し出し、開かれた育児嚢を介して水をフラッシュするために変更されていない15cmのパスツールピペットを使用して、彼は時計皿の底に沈殿べき胚。本培養に彼女を再導入する前に、リカバリを可能にするために（CO 2を含まない）FASWをきれいにする女性を転送します。複数の雌は同じリカバリ·皿に入れたが、彼らはまだ部分的に麻酔をかけた場合、彼らは他の動物に食べられるように、女性がメインの文化にそれらを返す前に完全に回復することを可能にすることができます。 </li><li>きれいなFASWでペトリ皿に胚を転送し、その胚の段階を決定するために、顕微鏡下で表示する変更されていない15cmのパスツールピペットを使用してください。この手順に適している第三の切断（ステージ4 5）にある別々の胚。また、従来の生殖ディスク成立の卵割期にこのプロトコルを適用することが可能であるべきである（7-8 5段 ）。 </li></ul> 4。 2日目：単一細胞を切除する<ol><li> FASWの浅い層でのSylgardが並ぶペトリ皿を埋める。変更されていない15cmのパスツールPIを使用してくださいプレートに、単一の胚を転送するpette。 </li><li>鈍鉗子を用いて、穏やかに（ 図2Aおよび2B）切除される細胞を同定するために胚をロール。生殖細胞系前駆体gは、最小の大割球MAVの上に座っている最小の小割球として同定することができる。また、Gは、直接中胚葉前駆体micromeres ML、MRをシェア胚の中央にあるセルの境界線として、その向かいに直接小割球である、専用のセルに接触しない。MRがGの右の割球であり、 ミリリットルは、Gの左側の小割球です。 MR、ML、および ENの姉妹macromeresは外胚葉前駆体それぞれのEr、EL、および EPである。 </li><li> LEF中のピンセットで研究者が右利きの場合は、Tの手が（あるいは右手の研究者が左利きされている場合）、右に目的の細胞と胚の向き（または左に研究者が左利きされている場合）、および静かに安定させる鉗子間の胚を把握する。 </li><li>プルガラス針（上記の手順1.5、 図4）を使用して、ゆっくりと目的の細胞に穴を開ける。隣接する細胞へ、または目的の細胞の下に針をプッシュしないように、あまりにも遠くに針を挿入しないでください。針は絨毛膜とその下の細胞膜に穴を開ける必要があり、切除される細胞内に深く拡張する必要はありません。 </li><li>交換罰金口のピペットのガラス終わりのための胚を穿刺するために使用される針は、パスツールピペットチップ（上記のステップ1.4）を引っ張った。目的の細胞内に作成穴の近くにピペットの先端を持ち、非常に穏やかな吸引を適用します。 </li><li>非常に静かに鉗子で胚を絞る。胚盤の内容として単なるステップ4.4で作成した穴から絨毛膜の外に押し出され、胚の遮るもののないビューを可能にするために口のピペットにそれを吸う。孔が十分に大きい場合、パンクチャ細胞の核は、同様に現れることが分かる。これは全体のセルの内容が削除されていると再生できないことを確認するには良いチェックです。 </li><li>興味の割球が取り除かれたとして、慎重に胚を観察します。パンクしたセルの枠線は、基礎となる細胞の交点が見えるように、絨毛膜の穴の方に後退します。興味の割球のすべてが除去されるまで圧力をかけ続ける。左右に胚をロールバックする鉗子を使用して、視覚的に興味のある割球のすべてがなくなっていることを確認してください。 </li><li>変更されていない15cmのパスツールピペットを用いて、（FASW + 1 mg / mlのアムホテリシンB、100単位/ mlペニシリンおよび100 mg / mlのストレプトマイシン）FASW +をきれいに胚を移す。 </li><li>個々のウェル中の割球アブレーション胚を上げるFASW +クリーン48ウェルプレートの、日々の抗生物質を補充FASW +の50％を変更する。私たちの手の中に胚が生存し、18〜28ºCからの温度範囲で、よくても、次のアブレーションを開発研究者は、最小限の乱れで胚を上げるために、クリーン（必ずしも無菌ではない）の面を持っている温度で、その胚を発生させる必要があります。コントロールと割球アブレーション胚における発生事象のタイミングを比較できるように、我々は18ºC 4、25ºC 4で上昇胚可能です詳細な発達ステージング情報を読者に参照し、26ºC 5,6。 </li></ol>

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	<li>Rehm, E. J., Hannibal, R. L., Chaw, R. C., Vargas-Vila, M. A., Patel, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+3.">Chapter 3.</a> Emerging Model Organisms: A Laboratory Manual Volume. , 373-404 .</li><li>Sander, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pattern+formation+in+insect+embryogenesis:+the+evolution+of+concepts+and+mechanisms.">Pattern formation in insect embryogenesis: the evolution of concepts and mechanisms.</a> Int. J.Insect Morphol. Embryol. 25, 349-367 (1997).</li><li>Regier, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arthropod+relationships+revealed+by+phylogenomic+analysis+of+nuclear+protein-coding+sequences.">Arthropod relationships revealed by phylogenomic analysis of nuclear protein-coding sequences.</a> Nature. 463, 1079-1083 (2010).</li><li>Extavour, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+fate+of+isolated+blastomeres+with+respect+to+germ+cell+formation+in+the+amphipod+crustacean+Parhyale+hawaiensis.">The fate of isolated blastomeres with respect to germ cell formation in the amphipod crustacean Parhyale hawaiensis.</a> Dev. Biol. 277, 387-402 (2005).</li><li>Browne, W. E., Price, A. L., Gerberding, M., Patel, N. 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J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+homothorax+and+extradenticle+mRNA+in+the+legs+of+the+crustacean+Parhyale+hawaiensis:+evidence+for+a+reversal+of+gene+expression+regulation+in+the+pancrustacean+lineage.">Expression of homothorax and extradenticle mRNA in the legs of the crustacean Parhyale hawaiensis: evidence for a reversal of gene expression regulation in the pancrustacean lineage.</a> Dev. Genes Evol. 218, 333-339 (2008).</li><li>Kizil, G., Havemann, J., Gerberding, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Germ+cells+in+the+crustacean+Parhyale+hawaiensis+depend+on+Vasa+protein+for+their+maintenance+but+not+for+their+formation.">Germ cells in the crustacean Parhyale hawaiensis depend on Vasa protein for their maintenance but not for their formation.</a> Dev. 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Z., Patel, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+prominent+requirement+for+single-minded+and+the+ventral+midline+in+patterning+the+dorsoventral+axis+of+the+crustacean+Parhyale+hawaiensis.">A prominent requirement for single-minded and the ventral midline in patterning the dorsoventral axis of the crustacean Parhyale hawaiensis.</a> Development. 137, 3469-3476 (2010).</li><li>Simanton, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conservation+of+arthropod+midline+netrin+accumulation+revealed+with+a+cross-reactive+antibody+provides+evidence+for+midline+cell+homology.">Conservation of arthropod midline netrin accumulation revealed with a cross-reactive antibody provides evidence for midline cell homology.</a> Evol. Dev. 11, 260-268 (2009).</li><li>Rehm, E. J., Hannibal, R. L., Chaw, R. C., Vargas-Vila, M. A., Patel, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibody+staining+of+Parhyale+hawaiensis+embryos.">Antibody staining of Parhyale hawaiensis embryos.</a> Cold Spring Harbor Protoc. 2009, (2009).</li><li>Pavlopoulos, A., Averof, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishing+genetic+transformation+for+comparative+developmental+studies+in+the+crustacean+Parhyale+hawaiensis.">Establishing genetic transformation for comparative developmental studies in the crustacean Parhyale hawaiensis.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102, 7888-7893 (2005).</li><li>Kontarakis, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+versatile+strategy+for+gene+trapping+and+trap+conversion+in+emerging+model+organisms.">A versatile strategy for gene trapping and trap conversion in emerging model organisms.</a> Development. 138, 2625-2630 (2011).</li><li>Zeng, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=De+novo+assembly+and+characterization+of+a+maternal+and+developmental+transcriptome+for+the+emerging+model+crustacean+Parhyale+hawaiensis.">De novo assembly and characterization of a maternal and developmental transcriptome for the emerging model crustacean Parhyale hawaiensis.</a> BMC Genom. 12, 581 (2011).</li><li>Zeng, V., Extavour, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ASGARD:+an+open-access+database+of+annotated+transcriptomes+for+emerging+model+arthropod+species.">ASGARD: an open-access database of annotated transcriptomes for emerging model arthropod species.</a> Database. , (2012).</li><li>Nestorov, P., Battke, F., Levesque, M. P., Gerberding, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Maternal+Transcriptome+of+the+Crustacean+Parhyale+hawaiensis+Is+Inherited+Asymmetrically+to+Invariant+Cell+Lineages+of+the+Ectoderm+and+Mesoderm.">The Maternal Transcriptome of the Crustacean Parhyale hawaiensis Is Inherited Asymmetrically to Invariant Cell Lineages of the Ectoderm and Mesoderm.</a> PLoS ONE. 8, (2013).</li><li>Alwes, F., Hinchen, B., Extavour, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patterns+of+cell+lineage,+movement,+and+migration+from+germ+layer+specification+to+gastrulation+in+the+amphipod+crustacean+Parhyale+hawaiensis.">Patterns of cell lineage, movement, and migration from germ layer specification to gastrulation in the amphipod crustacean Parhyale hawaiensis.</a> Dev. Biol. 139, 110-123 (2011).</li><li>Ewen-Campen, B., Schwager, E. E., Extavour, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+molecular+machinery+of+germ+line+specification.">The molecular machinery of germ line specification.</a> Mol. Reprod. Dev. 77, 3-18 (2010).</li><li>Price, A. L., Modrell, M. S., Hannibal, R. L., Patel, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesoderm+and+ectoderm+lineages+in+the+crustacean+Parhyale+hawaiensis+display+intra-germ+layer+compensation.">Mesoderm and ectoderm lineages in the crustacean Parhyale hawaiensis display intra-germ layer compensation.</a> Dev. Biol. 341, 256-266 (2010).</li><li>Fraser, S. E., Harland, R. 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H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Injection+of+Parhyale+hawaiensis+blastomeres+with+fluorescently+labeled+tracers.">Injection of Parhyale hawaiensis blastomeres with fluorescently labeled tracers.</a> Cold Spring Harbor Protoc. 2009, (2009).</li><li>Chaw, R., Patel, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Independent+migration+of+cell+populations+in+the+early+gastrulation+of+the+amphipod+crustacean+Parhyale+hawaiensis.">Independent migration of cell populations in the early gastrulation of the amphipod crustacean Parhyale hawaiensis.</a> Dev. Biol. 371, 94-109 (2012).</li><li>Schmitz, E. H., Harrison, F. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crustacea+Microscopic+Anatomy+of+Invertebrates.">Crustacea Microscopic Anatomy of Invertebrates.</a> Microscopic Anatomy of Invertebrates. 9, 443-528 (1992).</li></ol>

著者らは、開示することは何もありません。

我々は、手動の切除や端脚Pの初期卵割段階から単一割球を完全に物理的に除去するためのプロトコルを記述hawaiensis。我々は、8細胞期胚から単一の生殖系列前駆細胞gを除去することによって、このプロトコルの使用を示す、アブレーションは、後胚発生におけるグラムの娘細胞の有無を確認することに成功していることを示している。このプロトコル?...

端脚甲殻類のParhyaleのhawaiensisは、進化発生生物学研究1で使用するための大きな可能性を秘めた有望なモデル生物として、過去10年間にわたって浮上している。節足動物の中では、ほとんどのモデル系は昆虫であり、最も広範に研究され、これらの果物はキイロショウジョウバエフライです。D.キイロは昆虫双翅目のメンバーであり、基底に分岐昆虫2のものに対して誘導されるそのようなディスプレイの多くの発生学的特徴のような。また、昆虫は昆虫がpancrustaceansと呼ばれる長年の&quot;自然な&quot;グループ内の最も近い親戚があり、このグループは側系統であること。つまり、Pancrustacea 3亜門の中にネストされています。これは、基底部虫モデルを分岐に加えて、他の甲殻類の研究が発達形質αの進化の歴史のより広い視野を得るために必要であることを示唆しているとてもよくDに研究されているND分子機構キイロ 。しかし、非常に少数の甲殻類は、よく開発の実験室分析のために確立されている。端脚P. hawaiensisは、実験技術の範囲に従う非常に扱いやすい実験モデルシステムである。ヨコエビは親上目フクロエビ上目（ビーチホッパー、スカッド、井戸エビ）内の多くのユニークな機能を表示するため、比較的甲殻類のこのグループ内で誘導されると考えられている。それにもかかわらず、Parhyaleが提供する発生学的で機能的遺伝子操作の相対的な容易さは、この端脚モデル生物の現在の在庫に貴重な追加します。 実験動物、Pとしてhawaiensisは多くの利点を提供しています。動物は、温度と塩分の広い範囲に寛容であり、人工海水1の大文化でよく生き残る。それはbetwを区別することは容易である最も顕著なのは、明確な形態​​的な違いに基づいてEENの男性と女性、交尾の際にメスを把握するために使用する男性が大規模な、フック、前トランク付属。発生学的と開発作業のために、P. hawaiensisはいくつかの非常に魅力的な特徴を持っています。胚形成は、約10日間持続し、性的に成熟するまでの時間は、28ºC（約6週間ですが、Parhyaleは約20〜30ºCの範囲の温度で十分に生存し、その詳細な発達ステージング情報は、C 4 18度で昇胚のために利用可能であることに注意してください、25ºC 4、および26ºC 5,6）。大人の実験室で一年中交尾ので、胚は、一年中いつでも可能です。女性は最初のいくつかの脚部の対（ 図1Aおよび図1B）との間に位置する腹側育児嚢への受精卵（雌の年齢に応じて）2-20を置き、それは、これらの胚を収集することが可能である女性を殺すか、胚（ 図1C）を損傷することなく、非常に早い段階で開発中のS。胚が孵化に通して濾過した人工海水中で生き残り、その後の遺伝子発現または組織学的分析のために固定7、詳細ステージング表5を介して、現像進行の正確な同定を可能にすることができる。堅牢なプロトコルは、RNA干渉13,15又はモルホリノ12、及び安定した生殖系列遺伝子導入18による機能ノックダウン、in situハイブリダイゼーション 8-15 4,16,17または免疫染色におけるによる遺伝子発現解析を行うために使用されている。遺伝子導入システム、誘導発現14および19の方法はまた、P.における遺伝子機能を研究するために用いることができるエンハンサートラップを使用してhawaiensis。公的に利用可能なゲノム配列は、現在利用可能ではありませんが、卵形成および胚発生中に生成転写物を含んだトランスクリプトームは、蜂を持っているN デノボを組み立て、20の注釈付き、および遺伝子発見を容易に検索可能なデータベース21に寄託。要するに、P. hawaiensisは、開発を理解するための複数の実験的および遺伝的アプローチに適し、非常に扱いやすいモデル生物である。 Dの初期の多核体の切断とは異なり、 キイロ、P. hawaiensis胚は受精（ 図2A）以下の全割で切断する。分析のトレースは、第三の系統切断により、第三の開裂割球の各々が具体的に三胚葉又は生殖細胞系6（ 図2B）のいずれかを生じさせるように運命づけられていることを示している。これらのデータは、一緒になって、マイクロアレイデータ22と、細胞系統は6,23を解析し、割球分離実験4は、発生電位はセルの非対称継承によって、少なくともいくつかの第三の開裂割球に偏析していることを示唆しているLの運命決定因子。細胞の非存在によって示されるように従って、（Parhyale細胞系統命名法6の「 グラム 」と呼ばれる）の生殖細胞系前駆体は、8細胞期で除去された割球アブレーション実験において、胚は、後期発生段階4から生殖細胞を欠いていほとんどの後生動物24における生殖細胞系列のマーカーであるタンパク質ヴァーサ号を発現する。対照的に、体細胞割球アブレーション実験は、P. hawaiensis胚も8細胞期で切除され、中胚葉または外胚葉前駆割球の運命は、残りの割球25のいくつかの子孫に引き継がれ ​​ることができるような大幅な規制能力を持っている。どのように調節的細胞運命の交換が発生する可能性があり、体細胞割球による自律的な細胞運命の採用の程度は、未知のままである。このような割球アブレーションなどの実験発生学的手法は、understanに便利です鼎は相対的な自律性と細胞運命決定26,27のnonautonomyとは、P.の研究に興味がある、したがってhawaiensisの胚発生。 外胚葉および中胚葉系統の調節的置換を示した実験において、割球アブレーションは、注射28及び光毒性色素25の後続の励起により行った。この技術は注入された割球（複数可）を殺すのに効果的であるが、それは完全に胚から死んだ細胞体は削除されません。また、違いは細胞系譜蛍光系統トレーサー28,29と割球を注入することによって、胚発生の原腸段階に至るまで収集されたデータ、及び同じ胚のステージ23の開発を通じて非摂動割球に従うことによって収集されたデータとの間で観察されている。特定の割球の完全な物理的除去は、したがって、いくつかのアプリケーションのためのアブレーションの好ましい方法であってもよい。 我々は以前、細胞系統の結果は、単セル23を手動でアブレーションされた胚の分析を発表した。しかし、初期の卵割期胚からの単一割球を除去するために必要な繊細な操作は、まだ完全に記載されていない。ここでは、Pの収集のためのプロトコルを提示hawaiensis胚と8細胞期胚からの単一割球を手動で切除。この方法の目的は、胚発生および後胚発生中に残存する細胞の細胞挙動の観察および細胞運命の能力を可能にする胚からの細胞体の完全な除去を達成することである。我々のプロトコルは、生殖細胞系前駆グラム （ 図2C）の除去を示しているが、以前の開裂段階の割球を、8細胞段階で任意のセルに適用することができる。原則として、このプロトコルは、パーソナルプラグインの初期卵割期胚から単一細胞を除去するために適用することができるR全割で海洋無脊椎動物を切断。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1060">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:164px;">15 cm Pasteur pipette</td>
			<td style="width:164px;">Wheaton</td>
			<td style="width:123px;">53499-630</td>
			<td style="width:495px;">For transferring intact and blastomere-ablated embryos from dish to dish. 
			VWR</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:164px;">22 cm Pasteur pipette</td>
			<td style="width:164px;">Wheaton</td>
			<td style="width:123px;">53499-632</td>
			<td style="width:495px;">For making mouth pipette tips. 
			VWR</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:164px;">3 cm petri dishes</td>
			<td style="width:164px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:123px;">25382-334</td>
			<td style="width:495px;">Use some unaltered to collect and store embryos; coat some with a layer of Sylgard (see below) to create a working surface for blastomere ablations. 
			VWR</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:164px;">48-well plates</td>
			<td style="width:164px;">Greiner Bio-One</td>
			<td style="width:123px;">82051-004</td>
			<td style="width:495px;">For culturing embryos following ablation. 
			VWR</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:164px;">Bottle top filters 0.2 micron</td>
			<td style="width:164px;">Nalge Nunc International</td>
			<td style="width:123px;">28199-296</td>
			<td style="width:495px;">For creating FASW (See below) 
			VWR</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:164px;">Bunsen burner</td>
			<td style="width:164px;">VWR</td>
			<td style="width:123px;">89038-530</td>
			<td style="width:495px;">For creating tungsten wire tool and fine tip of mouth pipette. 
			VWR</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:164px;">Diamond scribe</td>
			<td style="width:164px;">Musco Sports Lighting</td>
			<td style="width:123px;">52865-005</td>
			<td style="width:495px;">For creating wide-mouthed Pasteur pipettes for collecting couples. 
			VWR</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:164px;">Forceps</td>
			<td style="width:164px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:123px;">11050-10</td>
			<td style="width:495px;">For holding anaesthetized females during removal of embryos from brood pouch. These do not have to be fine-tipped Dumont forceps - the tips can be at least as blunt as that in the forceps for which the catalogue number is listed here. 
			Fine Science Tools</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:164px;">Fungizone-Amphotericin B</td>
			<td style="width:164px;">Sigma</td>
			<td style="width:123px;">A2942</td>
			<td style="width:495px;">Add to FASW to a final concentration of 1mg/ml, and use this solution to culture blastomere-ablated embryos. 
			Sigma Aldrich</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:164px;">Glass capillaries 4 inches long, 1/0.58 OD/ID (mm)</td>
			<td style="width:164px;">World Precision Instruments</td>
			<td style="width:123px;">1B100-4</td>
			<td style="width:495px;">need to include glass capillary and needle puller machine? 
			World Precision Instruments</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:164px;">Glass watchglass 300 mm diameter</td>
			<td style="width:164px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:123px;">70543-30</td>
			<td style="width:495px;">For use in removing embryos from the brood pouch of anaesthetized females. 
			Electron Microscopy Sciences</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:164px;">Instant Ocean Artificial Sea Water (ASW)</td>
			<td style="width:164px;">Instant Ocean</td>
			<td style="width:123px;">IS160</td>
			<td style="width:495px;">Make ASW by dissolving salt in deionized water to a salinity of X. 
			Aquatic EcoSystems</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:164px;">Instant Ocean Filtered Artificial Sea Water (FASW)</td>
			<td style="width:164px;">Instant Ocean</td>
			<td style="width:123px;">IS160</td>
			<td style="width:495px;">Use 0.2 micron filters to sterilize ASW. Make up in small amounts (&#60; 250 ml) as needed. 
			Aquatic EcoSystems</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:164px;">Kimwipes</td>
			<td style="width:164px;">Kimberly-Clark</td>
			<td style="width:123px;">21905-026</td>
			<td style="width:495px;">For safely breaking off the fine end of Pasteur pipettes modified for collecting couples. 
			VWR</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:164px;">Mouth pipette adaptor</td>
			<td style="width:164px;">Drummond Labware</td>
			<td style="width:123px;">A5177-5EA</td>
			<td style="width:495px;">Insert the fine pulled pasteur pipette tip into this end, to be used for removing extruded cell contents during the ablation procedure. 
			Sigma Aldrich</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:164px;">Mouth pipette tubing</td>
			<td style="width:164px;">Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">Z280356</td>
			<td style="width:495px;">Cut this to be long enough to comfortably hang around your neck during the ablation procedure. 
			Sigma Aldrich</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:164px;">Needle Puller</td>
			<td style="width:164px;">Sutter Instrument Company</td>
			<td style="width:123px;">P97</td>
			<td style="width:495px;">For making needles from glass capillaries for puncturing the blastomere to be ablated. 
			Sutter Instrument Company</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:164px;">Penicillin-Streptomycin Solution</td>
			<td style="width:164px;">Mediatech</td>
			<td style="width:123px;">45000-650</td>
			<td style="width:495px;">Add to FASW to a final concentration of 100 units/ml penicillin and 100 mg/ml streptomycin, and use this solution to culture blastomere-ablated embryos. 
			VWR</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:164px;">Rubber bulb</td>
			<td style="width:164px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:123px;">100488-418</td>
			<td style="width:495px;">For using Pasteur pipettes to transfer embryos from dish to dish. 
			VWR</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:164px;">Sylgard 184</td>
			<td style="width:164px;">K. R. Anderson, Inc.</td>
			<td style="width:123px;">NC9659604</td>
			<td style="width:495px;">Make up according to manufacturer&#39;s instructions. Pour a layer 2-5 mm thick into a 3cm petri dish to create a working surface for blastomere ablations. 
			Fisher Scientific</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:164px;">Tungsten wire 0.004 inches diameter</td>
			<td style="width:164px;">A-M Systems</td>
			<td style="width:123px;">719000</td>
			<td style="width:495px;">Use this to make a tool for removing embryos from the brood pouch of anaesthetized females. 
			A-M Systems</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

ablation of a single cell from eight-cell embryos of the amphipod crustacean parhyale hawaiensis

端脚Parhyaleのhawaiensisは、世界中の潮間帯の海洋生息地で見られる小型の甲殻類です。過去10年間、Parhyaleは十分に研究節足動物モデル生物ショウジョウバエにとって有用な外集団の比較を提供し、開発の実験室での研究のための有望なモデル生物として浮上している。 ショウジョウバエの多核体の切断とは対照的に、Parhyaleの早期切断は全割のです。初期の割球に注入されたトレーサー染料を使用フェイト·マッピングは、3つすべての胚葉及び生殖系列は、8細胞期によって確立されることが示されている。この段階では、以下の3つの割球は外胚葉を生じさせる運命され、3つは中胚葉を生じさせる運命、残りの2つの割球は、それぞれ、内胚葉および生殖細胞の前駆体であるている。しかし、割球の切除実験はParhyale胚でも大幅な規制capabilitiを有することが示されている8細胞期のアブレーション割球の運命は、残りの割球の一部の子孫に引き継がれることができるようなES、。注入及び光毒性色素または手動切除のその後の活性化：割球アブレーションは、以前のいずれかの方法によって記載されている。しかし、光切除は、割球を殺すが、胚から死んだ細胞体は削除されません。特定の割球の完全な物理的除去は、したがって、いくつかのアプリケーションのためのアブレーションの好ましい方法であってもよい。ここでは、生きているとそのまま残りの割球を保持したまま細胞体を完全に除去するために必要な機器や手動の手順を示す、Parhyale胚の 8細胞期から単一割球を手動で除去するためのプロトコルを提示する。このプロトコルは、8細胞期、または他の初期卵割段階の割球に任意Parhyaleセルに適用することができる。また、原則的に、このプロトコルは、初期のクレアにも適用できる可能性が他の全割で切断する海洋無脊椎動物のvage期胚。

単一の第3の切断Pの成功アブレーション次このプロトコルで説明したように部分的に切除された旧割球の占有スペースを占めるようにhawaiensisの micromeresは、残りのmicromeresは徐々に少しの位置をずらす。 Gが除去されると、たとえば、割球のMRに隣接しては若干シフトし、Gと直接接触する（ 図2Aおよび2Cの比較）で、?...

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Ablation of a Single Cell From Eight-cell Embryos of the Amphipod Crustacean Parhyale hawaiensis

端脚Parhyaleのhawaiensisは甲殻類発生学および比較節足動物発展と進化の研究のための有望なモデル生物である。このプロトコルは、Parhyaleの初期卵割期胚からの単一割球を手動で除去する方法を説明します。

端脚甲殻類の8細胞胚から単セルのアブレーション<em&gt; Parhyale hawaiensis</em

The amphipod Parhyale hawaiensis is a small crustacean found in intertidal marine habitats worldwide. Over the past decade, Parhyale has emerged as a ...

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Research

JoVE Journal

Biology

Ablation of a Single Cell From Eight-cell Embryos of the Amphipod Crustacean Parhyale hawaiensis

12.4K ビュー.  Harvard University. 端脚Parhyaleのhawaiensisは甲殻類発生学および比較節足動物発展と進化の研究のための有望なモデル生物である。このプロトコルは、Parhyaleの初期卵割期胚からの単一割球を手動で除去する方法を説明します。 

ビデオ: Ablation of a Single Cell From Eight-cell Embryos of the Amphipod Crustacean Parhyale hawaiensis

Dissection of Organizer and Animal Pole Explants from Xenopus laevis Embryos and Assembly of a Cell Adhesion Assay

This video demonstrates the technique used for preparation of organizer and animal pole explants from Xenopus laevis embryos, including the use of the eyebrow knife - a specialized dissection tool made of one's eyebrow. The protocol for assembling an adhesion assay is also given, which probes for the presence of key adhesion molecules present on the surface organizer or animal pole cells that are critical for proper development.

アフリカツメガエルの胚および細胞接着アッセイのアセンブリから主催し、動物極の外植片の解剖

生物学

Preparation of Neuronal Cultures from Midgastrula Stage Drosophila Embryos

This video illustrates the procedure for making primary neuronal cultures from midgastrula stage Drosophila embryos. The methods for collecting embryos and their dechorionation using bleach are demonstrated. Using a glass pipet attached to a mouth suction tube, we illustrate the removal of all cells from single embryos. The method for dispersing cells from each embyro into a small (5 l) drop of medium on an uncoated glass coverslip is demonstrated. A view through the microscope at 1 hour after plating illustrates the preferred cell density. Most of the cells that survive when grown in defined medium are neuroblasts that divide one or more times in culture before extending neuritic processes by 12-24 hours. A view through the microscope illustrates the level of neurite outgrowth and branching expected in a healthy culture at 2 days in vitro. The cultures are grown in a simple bicarbonate based defined medium, in a 5% CO2 incubator at 22-24&deg;C. Neuritic processes continue to elaborate over the first week in culture and when they make contact with neurites from neighboring cells they often form functional synaptic connections. Neurons in these cultures express voltage-gated sodium, calcium, and potassium channels and are electrically excitable. This culture system is useful for studying molecular genetic and environmental factors that regulate neuronal differentiation, excitability, and synapse formation/function.

This video demonstrates the preparation of primary neuronal cultures from midgastrula stage Drosophila embryos. Views of live cultures show cells 1 hour after plating and differentiated neurons after 2 days of growth in a bicarbonate-based defined medium. The neurons are electrically excitable and form synaptic connections.

Midgastrulaステージショウジョウバエの胚からの神経培養の準備

This video illustrates the procedure for making primary neuronal cultures from midgastrula stage Drosophila embryos. The methods for collecting embryos ...

Preparation of Single-Cell Suspensions from Mouse Spleen with the gentleMACS Dissociator

Single-cell suspensions are a prerequisite for experiments in cell separation, cell analysis and cell culture.  To avoid tedious and often painful manual dissociations the gentleMACS Dissociator allows one to dissociate tissue very efficiently under controlled and reproducible conditions.  The gentleMACS Dissociator can optimally dissociate mouse spleen, combining timesaving and standardization with user-safety.

This video describes how to dissociate mouse spleens using the gentleMACS Dissociator, an automated bench-top device that can mechanically disrupt tissues using special tubes to produce viable cell suspensions. Following dissociation, spleens are filtered, centrifuged, and resuspended for further applications.

This video describes a simple, time-saving technique for automated tissue dissociation using the gentleMACS Dissociator to prepare single-cell suspensions of mouse splenocytes.

gentleMACS Dissociatorとマウス脾臓からの単細胞懸濁液の調製

Single-cell suspensions are a prerequisite for experiments in cell separation, cell analysis and cell culture.  To avoid tedious and often painful manual ...

Single Cell Transfection in Chick Embryos

A central theme in developmental biology is the diversification of lineages and the elucidation of underlying molecular mechanisms. This entails a thorough analysis of the fates of single cells under normal and experimental conditions. To this end, transfection methods that target single progenitors are a prerequisite. We describe here a technically straightforward method for transfecting single cells in chicken tissues in-ovo, allowing reliable lineage tracing as well as genetic manipulation. Specific tissue domains are targeted within the somite or neural tube, and DNA is injected directly into the epithelium of interest, resulting in sporadic transfection of single cells. Using reporters, clonal populations may consequently be traced for up to three days, and behavior of genetically manipulated clonal populations can be compared with that of controls. This method takes advantage of the accessibility of the chick embryo along with emerging tools for genetic manipulation. We compare and discuss its advantages over the widely-used electroporation method, and possible applications and use in additional in-vivo models are also suggested. We advocate the use of this method as a significant addition and complement for existing lineage tracing and genetic interference tools.

Using fine tip micropipettes we inject plasmid DNA into subdomains of chicken somites or neural tubes. The concentration of the plasmid is adjusted to generate single transfected cells. We then allow the cells to develop into clonal populations.

鶏胚における単一細胞のトランスフェクション

A central theme in developmental biology is the diversification of lineages and the elucidation of underlying molecular mechanisms. This entails a ...

Primary Cell Cultures from Drosophila Gastrula Embryos

Here we describe a method for preparing and culturing primary cells dissociated from Drosophila gastrula embryos. In brief, a large amount of staged embryos from young and healthy flies are collected, sterilized, and then physically dissociated into a single cell suspension using a glass homogenizer. After being plated on culture plates or chamber slides at an appropriate density in culture medium, these cells can further differentiate into several morphologically-distinct cell types, which can be identified by their specific cell markers. Furthermore, we present conditions for treating these cells with double stranded (ds) RNAs to elicit gene knockdown. Efficient RNAi in Drosophila primary cells is accomplished by simply bathing the cells in dsRNA-containing culture medium. The ability to carry out effective RNAi perturbation, together with other molecular, biochemical, cell imaging analyses, will allow a variety of questions to be answered in Drosophila primary cells, especially those related to differentiated muscle and neuronal cells.

Primary Cell Cultures from Drosophila Gastrula Embryos

We provide a detailed protocol for preparing primary cells dissociated from Drosophila embryos. The ability to carry out the effective RNAi perturbation, together with other molecular, biochemical and cell imaging methods will allow a variety of questions to be addressed in Drosophila primary cells.

から初代細胞培養ショウジョウバエ原腸胚

Here we describe a method for preparing and culturing primary cells dissociated from Drosophila gastrula embryos.   In brief, a large amount of staged ...

Isolation and Purification of Kinesin from Drosophila Embryos

Motor proteins move cargos along microtubules, and transport them to specific sub-cellular locations. Because altered transport is suggested to underlie a variety of neurodegenerative diseases, understanding microtubule based motor transport and its regulation will likely ultimately lead to improved therapeutic approaches. Kinesin-1 is a eukaryotic motor protein which moves in an anterograde (plus-end) direction along microtubules (MTs), powered by ATP hydrolysis. Here we report a detailed purification protocol to isolate active full length kinesin from Drosophila embryos, thus allowing the combination of Drosophila genetics with single-molecule biophysical studies. Starting with approximately 50 laying cups, with approximately 1000 females per cup, we carried out overnight collections. This provided approximately 10 ml of packed embryos. The embryos were bleach dechorionated (yielding approximately 9 grams of embryos), and then homogenized. After disruption, the homogenate was clarified using a low speed spin followed by a high speed centrifugation. The clarified supernatant was treated with GTP and taxol to polymerize MTs. Kinesin was immobilized on polymerized MTs by adding the ATP analog, 5'-adenylyl imidodiphosphate at room temperature. After kinesin binding, microtubules were sedimented via high speed centrifugation through a sucrose cushion. The microtubule pellet was then re-suspended, and this process was repeated. Finally, ATP was added to release the kinesin from the MTs. High speed centrifugation then spun down the MTs, leaving the kinesin in the supernatant. This kinesin was subjected to a centrifugal filtration using a 100 KD cut off filter for further purification, aliquoted, snap frozen in liquid nitrogen, and stored at -80 &deg;C. SDS gel electrophoresis and western blotting was performed using the purified sample. The motor activity of purified samples before and after the final centrifugal filtration step was evaluated using an in vitro single molecule microtubule assay. The kinesin fractions before and after the centrifugal filtration showed processivity as previously reported in literature. Further experiments are underway to evaluate the interaction between kinesin and other transport related proteins.

Isolation and Purification of Kinesin from Drosophila Embryos

This is a protocol to isolate active full length Kinesin from Drosophila embryos for single-molecule biophysical studies. We show how to collect embryos, make the embryo lysate, and then polymerize microtubules (MTs). Kinesin is purified by immobilizing it on the MTs, spinning down the Kinesin-MT complexes, and then releasing the kinesin from the MTs via ATP addition.

キネシンの単離及び精製からショウジョウバエ胚

Motor proteins move cargos along microtubules, and transport them to specific sub-cellular locations. Because altered transport is suggested to underlie a ...

Single-cell Microinjection for Cell Communication Analysis

Gap junctions are intercellular channels that allow the communication of neighboring cells. This communication depends on the contribution of a hemichannel by each neighboring cell to form the gap junction. In mammalian cells, the hemichannel is formed by six connexins, monomers with four transmembrane domains and a C and N terminal within the cytoplasm. Gap junctions permit the exchange of ions, second messengers, and small metabolites. In addition, they have important roles in many forms of cellular communication within physiological processes such as synaptic transmission, heart contraction, cell growth and differentiation. We detail how to perform a single-cell microinjection of Lucifer Yellow to visualize cellular communication via gap-junctions in living cells. It is expected that in functional gap junctions, the dye will diffuse from the loaded cell to the connected cells. It is a very useful technique to study gap junctions since you can evaluate the diffusion of the fluorescence in real time. We discuss how to prepare the cells and the micropipette, how to use a micromanipulator and inject a low molecular weight fluorescent dye in an epithelial cell line.

We describe here how to perform a single-cell microinjection of Lucifer Yellow to visualize cellular communication via gap-junctions in living cells, and provide some useful tips. We expect that this paper will help everyone to evaluate the degree of cellular coupling due to functional gap junctions. Everything described here could be, in principle, adapted to other fluorescent dyes with molecular weight below 1,000 Daltons.

セル通信解析のための単一細胞のマイクロインジェクション

Gap junctions are intercellular channels that allow the communication of neighboring cells. This communication depends on the contribution of a ...

Single Cell Collection of Trophoblast Cells in Peri-implantation Stage Human Embryos

Human implantation, the apposition and adhesion to the uterine surface epithelia and subsequent invasion of the blastocyst into the maternal decidua, is a critical yet enigmatic biological event that has been historically difficult to study due to technical and ethical limitations. Implantation is initiated by the development of the trophectoderm to early trophoblast and subsequent differentiation into distinct trophoblast sublineages. Aberrant early trophoblast differentiation may lead to implantation failure, placental pathologies, fetal abnormalities, and miscarriage. Recently, methods have been developed to allow human embryos to grow until day 13 post-fertilization in vitro in the absence of maternal tissues, a time-period that encompasses the implantation period in humans. This has given researchers the opportunity to investigate human implantation and recapitulate the dynamics of trophoblast differentiation during this critical period without confounding maternal influences and avoiding inherent obstacles to study early embryo differentiation events in vivo. To characterize different trophoblast sublineages during implantation, we have adopted existing two-dimensional (2D) extended culture methods and developed a procedure to enzymatically digest and isolate different types of trophoblast cells for downstream assays. Embryos cultured in 2D conditions have a relatively flattened morphology and may be suboptimal in modeling in vivo three-dimensional (3D) embryonic architectures. However, trophoblast differentiation seems to be less affected as demonstrated by anticipated morphology and gene expression changes over the course of extended culture. Different trophoblast sublineages, including cytotrophoblast, syncytiotrophoblast and migratory trophoblast can be separated by size, location, and temporal emergence, and used for further characterization or experimentation. Investigation of these early trophoblast cells may be instrumental in understanding human implantation, treating common placental pathologies, and mitigating the incidence of pregnancy loss.

Here, we describe a method for warming vitrified human blastocysts, culturing them through the implantation period in vitro, digesting them into single cells and collecting early trophoblast cells for further investigation.

ヒト胚形成期における栄養芽細胞の単一細胞回収

Human implantation, the apposition and adhesion to the uterine surface epithelia and subsequent invasion of the blastocyst into the maternal decidua, is a ...

Single-Cell Suspension Preparation from Nile Tilapia Intestine for Single-Cell Sequencing

Nile tilapia is one of the most commonly cultured freshwater fish species worldwide and is a widely used research model for aquaculture fish studies. The preparation of high-quality single-cell suspensions is essential for single-cell level studies such as single-cell RNA or genome sequencing. However, there is no ready-to-use protocol for aquaculture fish species, particularly for the intestine of tilapia. The effective dissociation enzymes vary depending on the tissue type. Therefore, optimizing the tissue dissociation protocol by selecting the appropriate enzyme or enzyme combination to obtain enough viable cells with minimum damage is essential. This study illustrates an optimized protocol to prepare a high-quality single-cell suspension from Nile tilapia intestine with an enzyme combination of collagenase/dispase. This combination is highly effective for dissociation with the utilization of bovine serum albumin and DNase to reduce cell aggregation after digestion. The cell output satisfies the requirements for single-cell sequencing, with 90% cell viability and a high cell concentration. This protocol can also be modified to prepare a single-cell suspension from the intestines of other fish species. This research provides an efficient reference protocol and reduces the need for additional trials in the preparation of single-cell suspensions for aquaculture fish species.

Here, we demonstrate the preparation of a high-quality single-cell suspension of tilapia intestine for single-cell sequencing.

シングルセルシーケンシングのためのナイルティラピア腸からのシングルセル懸濁液調製(英語)

Nile tilapia is one of the most commonly cultured freshwater fish species worldwide and is a widely used research model for aquaculture fish studies. The ...

Isolation and Transcriptome Analysis of Plant Cell Types

In multicellular organisms, developmental programming and environmental responses can be highly divergent in different cell types or even within cells, which is known as cellular heterogeneity. In recent years, single-cell and cell-type isolation combined with next-generation sequencing (NGS) techniques have become important tools for studying biological processes at single-cell resolution. However, isolating plant cells is relatively more difficult due to the presence of plant cell walls, which limits the application of single-cell approaches in plants. This protocol describes a robust procedure for fluorescence-activated cell sorting (FACS)-based single-cell and cell-type isolation with plant cells, which is suitable for downstream multi-omics analysis and other studies. Using Arabidopsis root fluorescent marker lines, we demonstrate how particular cell types, such as xylem-pole pericycle cells, lateral root initial cells, lateral root cap cells, cortex cells, and endodermal cells, are isolated. Furthermore, an effective downstream transcriptome analysis method using Smart-seq2 is also provided. The cell isolation method and transcriptome analysis techniques can be adapted to other cell types and plant species and have broad application potential in plant science.

The feasibility and effectiveness of high-throughput scRNA-seq methods herald a single-cell era in plant research. Presented here is a robust and complete procedure for isolating specific Arabidopsis thaliana root cell types and subsequent transcriptome library construction and analysis.

植物細胞タイプの単離とトランスクリプトーム解析

In multicellular organisms, developmental programming and environmental responses can be highly divergent in different cell types or even within cells, ...