非常に初期の胚でさえ、多くの異なるシグナル伝達分子が含まれており、個々の胚シグナルの完全な機能を識別することは困難です。これらの外植者は、内因性シグナル伝達センターから細胞を単離することにより、研究者が相対的な単離における特定のシグナル伝達分子の役割を調べることを可能にする。この技術の主な利点は、培養中の幹細胞を維持するのに必要な時間や労力をかけずに、単純化されたex-vivoシステム内で胚のタイミング、細胞の動き、遺伝子発現パターンを再現できることです。
まず、感染していない胚から外植を切断することから始めます。もし外植木が培養を拡張するならば、カットは黄身に近づくとなされた。引っ張られたガラスの毛細血管の針にRNAを充填することで始めます。
充填した針をマイクロマニピュレータに入れ、鉗子で針の先端を壊します。ミネラルオイルの滴でステージマイクロメーターを使用して注入量を校正し、空気圧インジェクターの注入時間と圧力を調整して、所望の大きさのボーラスを達成します。RNA針の先端を注入する準備ができるまで油に沈めておきます。
パスツールピペットとピペットポンプを使用して胚を注入プレートにロードし、手袋をした指を使って卵をトラフにそっと押し込みます。所望の数の胚に達するまで、または胚が分裂し始めるまで、単一細胞胚の黄身に10個のピコグラムndr2 RNAを注入する。スクイーズボトルから卵水の穏やかな流れを使用して、注射プレートから胚をラベル付きのペトリ皿に洗い流します。
128細胞の段階に達するまで、胚を摂氏28.5度のインキュベーターに入れる。未受精卵と死んだ胚を皿から取り除きます。胚が128の細胞段階に達したら、ラベル付きガラスペトリ皿に入れ、そこからできるだけ多くの卵水をデカントします。
小さな皿の名前に対応するラボテープで皿を結晶化するガラスにラベルを付け、卵の水で道の3分の2を埋めます。迅速なアクセシビリティのために解剖顕微鏡の隣にこれらの料理を置きます。1ミリリットルのプロナーゼストックあたり20ミリグラムの1ミリリットルを加え、氷の上で解凍して3Xダノーの溶液を50ミリリットルの円錐チューブに入れ、
胚を含む各ガラスペトリ皿にプロナーゼ溶液の少なくとも5ミリリットルを追加します。ガラス皿を円形の動きで攪拌し、解剖顕微鏡の下で一貫してデコール化の進行を監視する。コリオンがしわになり始め、1〜2個の胚がコリオンから出たら、プロナーゼと胚を含むガラスペトリ皿を卵水を含む対応するガラス結晶皿に慎重にダンクします。
デコールリオネーション胚を卵水で3回洗い、皿から卵水をデカントします。0.3Xダノーの溶液で3回目の最終洗浄を行います。ペトリ皿の蓋でデコリオネートされた胚を覆い、256細胞の段階に達するまで摂氏28.5度で保育器に戻します。
アガロースコーティングされたペトリ皿に3Xダニアウの溶液を入れます。胚が256細胞の段階になったら、3Xダノーの溶液を含むアガロースコーティングプレートに移し、皿の中央に沿って並べます。一組の鉗子を使用し、閉じた状態で胚を安定させ、もう一方をブラスタードラムを切断します。
切断するには、1組の鉗子でブラストデラム細胞を静かに絞り、安定化鉗子を取り、他の鉗子に沿って走らし、ブラストドラムを約半分にスライスします。胚を回転させ、鉗子を既存のカットに入れ、残りのブラソドリンムを最初の切り傷に対して切断する。3Xダニアウの溶液に外植物を少なくとも5分間保管し、4ミリリットルの外植培地で満たされた6ウェルプレートのウェルでコーティングされたアガロースに移します。
必要なタイムポイントまたはステージに達するまで、外植培養プレートを摂氏28.5度のインキュベーターに入れる。キメラの外植木をカットするには、1ミリメートルガラスビーズを使用して12の小さな浅い井戸に成形されたアガロースを持つ料理を使用してください。3Xダノーの溶液でプレートを埋めます。
1つの遺伝子型または条件の12個の胚をプレートの左側に加えて準備し、もう12個の遺伝子型の胚をプレートの右側に調整する。各条件の1つの胚を12の井戸の近くのプレートの中心に移動します。鉗子を使用して、単一胚外植に関して記載されているように、各胚から外植を切断する。
2つの外植のカットエッジを、鉗子を使用して浅い井戸内で一緒に押し、2つの半分を単一の外植に一緒に癒すことができます。プレート内の残りの12ウェルを続けます。外植が治癒したら、4ミリリットルの外植培地で満たされた6ウェルプレートのウェルでコーティングされたアガロースに移します。
必要な数の外植が達成されるまで繰り返します。28.5°Cインキュベーターの培養は、無傷の兄弟胚が所望の段階に達するまで。未感染の野生型胚または緑色蛍光タンパク質をコードする50ピコグラムのmRNAを注入したものから切り取られた排植物をコントロールすることは、培養期間を通じて丸みを帯びたままであり、中胚、内胚、または神経切除物のマーカーを発現することができなかった。
10ピコグラムのndr2 mRNAを注射した胚から切り取られた外植は、培養中の8〜9時間後に非常に細長くなった。これらの外植体の生きたタイムラプスイメージングは、微分干渉対照顕微鏡による、受精後8時間程度で延長が発症することを明らかにした。10ピコグラムのndr2を注射した胚からの外植は、中胚マーカー、tbxta、能、tbx16、および神経切除マーカーsox2の強い発現を示した。
胚のマージンをはるかに上回る外植体を切断することは非常に重要です。それ以外の場合、外植はマージンからの内因性シグナルを含み、ナイーブではありません。この方法では、気管形成における節点シグナル伝達の役割に対処するために外植体を使用した。
将来的には、他の研究者は、このアプローチを使用して、例えば、任意の数の発達過程における追加のシグナル伝達分子の役割をテストすることができます。
