生物学における多くの現代的な質問に答える鍵は、一次細胞モデルまたはオルガノイドのような構造を生成する鍵です。例えば、私たちは、水平感染の重要な場所であるため、唾液腺での複製を容易にするためにヒトウイルスが使用するメカニズムにかなり長い間興味を持っていました。このプロトコルに記載されている唾液系システムの開発は、これらのタイプの質問に答えるために私たちの探求の重要な進歩です。
この技術により、さまざまな患者サンプルから一次細胞を生成することができます。細胞モデルは、細胞が体外実験で一般的に使用される多くの細胞タイプのようにモデル化または変換されていないので、in vivo型の状況をより連想させる。我々は、マウスの主要な顎下腺から同様の細胞を生成するためにこのプロトコルを使用しており、プロトコルは、同様の細胞構造を有する他の器官に有用であろう。
患者から除去してから2〜4時間以内に、培養プレート上で、オートクレーブ殺菌された滅菌解剖ハサミと外科用鉗子を使用して、唾液腺組織を1〜2ミリメートルの大きさで細かい部分にミンチする。6ミリリットルのディスパーゼ/コラゲターゼ溶液を細かく組織に加えます。その後、摂氏37度で約30分から1時間インキュベートします。
5ミリリットル血清ピペットを15〜20回ピペット化して組織を破壊する。摂氏37度でさらに30分から1時間インキュベートします。ピペットとインキュベーションのステップを2〜3回繰り返すか、組織がスラリーに似ていてピペットの開口部を簡単に通過できるまで繰り返します。
BMMで井戸をコーティングするには、ゆっくりとピペット500マイクロリットルの一晩のBMMを6つのウェルプレートの各ウェルに解凍しました。ゆっくりと井戸の上にBMMを均等に分配するためにプレートを渦巻きます。その後、BMMを固めるために使用する前に少なくとも15分間、37°Cでコーティングされたプレートをインキュベートします。
まず、均質化した組織を含むディスパーゼ/コラゲターゼ溶液を15ミリリットルの円錐チューブに移します。プレートの壁を6ミリリットルのDPBSで1回洗浄し、残りの細胞を円錐管に移します。その後、70マイクロメートルのナイロンメッシュセルストレーナーを介して、未消化組織を除去するために新しい50ミリリットルの円錐管にホモゲネートをフィルター処理します。
遠心分離機は500倍gで5分間細胞を緊張させる。上清を吸引する。その後、細胞ペレットを1X RBCライシスバッファーの10ミリリットルで再懸濁する。
摂氏37度で5分間インキュベートします。その後、20〜25ミリリットルのDPBSを加え、RBC溶菌緩衝液を中和し、唾液細胞の溶菌を最小限に抑える。500回gで5分間遠心分離機。
白い細胞ペレットは、全てのRBCの完全なリシスを示す。ペレットが赤色の場合は、RBCライシスバッファーで処理を繰り返します。上清を吸引し、BEGMの1〜2ミリリットルでペレットを再懸濁し、再懸濁細胞をBMMコーティングされたウェルに移す。
摂氏37度でインキュベートする。BMMでメッキされると、細胞は2〜3日間にわたって球状の構造または唾液に形成されます。細胞は、BMMが分解し始める前に約5〜7日間唾液として維持することができ、細胞がプラスチックにアクセスして付着し、単層として成長することを可能にする。
まず、井戸から培地を吸引し、各ウェルに1ミリリットルのディスパス/コラゲターゼ溶液を加えます。摂氏37度で約15分間、またはBMMがほとんど溶解するまでインキュベートします。その後、細胞を15ミリリットルの円錐管に移し、1~3ミリリットルのDPBSでウェルを1回洗浄し、残りの細胞を得る。
500回gで5分間遠心分離機。上清を吸引し、トリプシンの2ミリリットルでペレットを再懸濁します。摂氏37度で15分間再びインキュベートします。
次に、10%血清を含む完全な培地をチューブに加えてトリプシンを中和する。500回gで5分間遠心分離機。上清を吸引して残留培地、トリプシン、血清を除去し、DPBS中の細胞を再懸濁する。
500回gで5分間遠心分離機。上清を吸引し、BEGM中のペレットを再懸濁する。ペレットを球体として維持するために、再懸濁した細胞を固化したBMMコーティングされた培養皿にプレートします。
加湿インキュベーター内のすべての細胞を、5〜7日間5〜7日間、摂氏37度で維持し、5〜7日間培養する。2~3日ごとに新鮮なBEGMでフィードします。単層として細胞をプラスチック培養皿に増殖させるために、BEGM培地を皿から吸引し、DBPSで一度洗浄して残留培地を除去する。
トリプシンを2ミリリットル加え、摂氏37度で15分間、または細胞が完全に剥離するまでインキュベートします。10%の血清を含む完全な培地の4ミリリットルを使用してトリプシンを中和する。その後、皿をそっと傾け、15ミリリットルの円錐管に細胞を移します。
残りの細胞を収集するためにDPBSの約5ミリリットルでプレートを1回洗浄します。500回gで5分間遠心分離機。上清を吸引する。
残留培地を除去するために、DPBSの6〜10ミリリットルで細胞を再懸濁する。500回gで5分間遠心分離機。上清を吸引し、BEGMで再中断する。
その後、処理されたプラスチック組織培養皿に細胞をプレートします。加湿インキュベーターで細胞を培養し、摂氏37度で5%の二酸化炭素を5〜7日間培養した後、下皮化する。2~3日ごとに新鮮なBEGMでフィードします。
このプロトコルでは、消化した組織からBMMに細胞を2〜3日間めっきした後、細胞は容易に小さなクラスターを形成し、クラスターあたり最大15〜20個の細胞まで拡大し続けた。唾液細胞を細胞培養処理プラスチックにメッキし、上皮起源の細胞と一致する形態を示す単層として増殖させた。細菌や真菌の汚染を避けるために適切な無菌技術とケアが必要です。
抗生物質や抗ミコティックの量は、微生物で群がる培養物を保存しません。私たちは、ウイルスの病因と伝染に関する質問に答えています。しかし、他の人にとっては、これは組織再生療法などの任意の数のアプリケーションのためにヒト唾液細胞を研究する方法を提供します。
ヒトサイトメガロウイルスを研究する私たちにとって、この技術は、ウイルスが感染し、最終的に新しい宿主に感染するために利用する分子メカニズムの探求を始めさせてきた。このプロトコルで使用するものは本質的に危険ですが、人間の組織やあらゆる種類の化学試薬を扱うときには常に注意が必要です。
