このプロトコルは、組織内の多様な細胞タイプ間の細胞間相互作用、および生体内での実現可能性が低いex vivo分子および薬理学的操作の細胞間の評価を可能にする。この技術の主な利点は、これらの組織切片を培養中に長期間維持し、後の時点での評価を可能にすることである。この技術は、唾液腺損傷を矯正するために治療化合物のより迅速なスクリーニングを可能にし、これらの研究に使用されるマウスの数を減らす可能性が高い。
この技術を用いて、中間時点での放射線療法に対する唾液腺応答を理解し、特定の間隔で遺伝子のオン/オフを切り出す計画です。この手順の最も困難な側面は、組織の切片と培養中の組織切片の損失を防止し、染色ステップです。手順を開始する前に70%エタノールで取り外し可能なビブラートーム成分を消毒し、その後、少なくとも30分間UV殺菌を行う。
バッファートレイの上に追加の実験室用フィルムシートを確保して氷が入るのを防ぎ、氷室を砕いた氷で満たします。実験室用フィルムをバッファートレイから取り出し、1%ペニシリンストレプトマイシンアンピシリンまたはPSAを補った氷冷PBSの100ミリリットルでバッファートレイを充填します。次に、ステンレススチール製のカミソリの刃をブレードホルダーに配置し、ドライバーを使用してブレードの角度の調整を容易にします。
唾液腺を単離した後、収穫した組織を1%PSAを補った2ミリリットルの氷冷PBSを含む滅菌30ミリメートル培養皿に入れる。オートクレーブ鉗子を使用して、埋め込み型の底に腺を移し、液体3%低融点アガロースで組織を覆う。鉗子を使用して、適切な平面のブロックの中央に組織を調整し、10分間氷の上にアガロースブロックを置きます。
アガロースが硬化したら、鋳型の外側の端の周りにカミソリの刃を慎重に実行し、ブロックをUV滅菌した実験室フィルムにスライドさせます。かみそりの刃を使用して唾液腺を含むアガロースボックスを切り取り、セクションの平面がブロックの反対側にまっすぐで平行であることを注意してください。スーパーグルーを使用してブロックを切断面に取り付け、100ヘルツ周波数で0.075ミリメートル/秒の速度でビブラートメの厚さ50または90マイクロメートルのセクションを得ます。
次に、オートクレーブ化された天然毛髪の絵筆を使用して、1ミリリットルの氷冷PBSを含む24のウェル組織培養皿の個々の井戸にセクションを移し、得られる。すべての切片が獲得されたら、使用し、個々の0.4マイクロセンチュラを使用して、300マイクロリットルのビブラードーム培養培地を含む24ウェル組織培養プレートの各ウェルに各ウェルに膜挿入物を注ぐようにする。その後、プレートを湿度付きの摂氏37度と5%の二酸化炭素インキュベーターに入れ、各ウェルの底部で媒体をリフレッシュし、必要に応じて1日おきに40マイクロリットルの培地を膜インサートに30日まで添加します。
組織を照射するには、温度の変動を避けるために覆われた発泡スチロール容器の照射器施設にセクションを移し、放射線の単一の5等級線量でセクションを扱います。次いで、放射線安全な組織培養インキュベーターに培養を戻す。組織切片の抗体染色の場合、滅菌PBSで少なくとも2回の5分間の洗浄でサンプルを洗浄し、一晩で摂氏4度で4%パラホルムアルデヒドで切片を固定します。
翌朝、PBSで0.3%トリトンX-100を30分間透過させる前に、1%ウシ血清アルブミンと0.1%トリトンX-100(PBT)を補ったPBSでセクションを3回洗浄します。1%正常なヤギ血清を1時間補充したブロッキング剤で非特異的結合を遮断する前に、実証したようにPBTで3回セクションを洗浄します。次に、目的の適切な一次抗体で一晩その切片をインキュベートする。
原発性2D唾液腺切除培養の明視野顕微鏡画像は、血清補充試験のすべての濃度の下で最大30日間の培養に生存可能な組織の存在を明らかにする。これらの代表的培養スライスの増殖能力をKi-67免疫染色により評価し、このマーカーは評価されたすべての時点で観察した。低レベルの切断カスパーゼ-3陽性細胞もすべての時点で観察され、30日目に小さな増加が検出された。
30日間培養期間を通して、下顎腺および耳下腺の両方のスライスにEカドヘリン染色が認められた。平滑筋アクチン陽性細胞および細胞骨格組織は、培養期間を通じて同様のレベルで検出された。同様に、アミラーゼやアクアポリン-5などの機能性タンパク質も検出され、14日目では染色がより粒状に見えたものの、
対照的に、CD31およびTUBB3は、両方の腺の培養期間を通じて一貫して発現していなかったが、30日間の培養期間を通じて異なる期間にわたって維持される組織構成成分の多様性があることを示唆している。両方の腺で照射されたスライスは、生体内で観察された同様の増殖性アポトーシスおよび細胞骨格変化を模倣した。ビブラートのPBS浴から培養プレートに切片を移動する際や、セクションが小さく繊細な染色手順の間に注意してください。
セクション培養は、ほとんどの細胞株培養方法で、in vivoとより密接に関連する条件下にあるという付加的な利点を有して処理することができる。これは、他の研究者が実験に取り入れることのできる強力な技術になると予想しています。ビブラートメの刃は鋭く、取り扱うときに疲れるので挿入するのが難しい場合があります。
また、トリパンブルー染料は有毒で発がん性があるので、すべてのPPガイドラインに従ってください。
