著者らは、プラスミドを提供するためのトレイシー·ヤング·ピアースと淳神谷に感謝します。 CKに、そして（DE 792/2-4）の塊に、この作品は、ORおよびCKにニューロンERANET DISCOVER（BMBF 01EW1003）、DFG（GRK1033パンガン1679/3-1）によって賄われていた

国家と欧州の法律に基づいて、すべての動物実験は責任Landesministeriumエリーゼ漢方、環境世界ウントVerbraucherschutz（87-51.05.2010.A​​301 LANUV NRW）によって承認された。 1。 子宮内電気穿孔法この方法は、Walantus らによるラット3、ならびにRice ら。4についてJoveのに詳細に記載されており、ここでは簡単に要約されている。 6-8匹の産子数は、良好な転帰が得られます。 （下記参照）、全体的な生存率を増加させるために、少なくとも2つの非胚のエレクトロポレーションがあるべきである。 <ol><li> 1.5μgの/μLを含むDNA-混合物を製造ターゲットプラスミド（shRNAを：をpENTR-U6、Invitrogen社、ユージーン、OR / DISC1の過剰発現：pCAX 21）、0.5μgの/プラスミド（pCAX）、0.5μgの/ GFPμLを含むルシフェラーゼμL 1X PBS溶液で染色ライトブルーにプラスミド（のpCAGGS 22）を含むファストグリーン色素でE。 </li><li>ニードルピペットプラーとガラスキャピラリーの外に注射針を準備します。アルコール系消毒剤（講談Tinkturフォルテ）と高圧蒸気滅菌またはインキュベーションのいずれかにより手術器具を滅菌する。 </li><li> 16日受精（E16）の後に妊娠したラットに手術前にブプレノルフィンの術前の用量（0.05 mg / kg）を15分を管理します。その後、イソフルランチャンバー内に動物を麻酔。 <ol><li>麻酔時には、1.8％で0.4リットル/分であり、イソフルランで酸素の設定を使用して、麻酔装置に接続された呼吸マスク37℃温めておいた操作テーブル上の仰臥位でのラットを置く。 </li><li>腹部を剃毛した後、講談社Tinkturフォルテ（アルコール系消毒剤）で剃毛面積を3回消毒する。 </li><li>唯一の剃毛オペレーションフィールドを公開、無菌布でラットをカバーしています。 </li></ol></li><li> 子宮内電気穿孔法で行う。 <ol><li> scissoで腹部を切る白線に沿ってR（〜2センチメートル）。 </li><li>リングピンセットで慎重に子宮角を公開します。 </li><li>全体手術中に温めた滅菌PBSで濡れた子宮壁を維持するように注意してください。 </li><li>胚の側脳室のいずれかに薄いガラス針でDNA溶液を注入する。 </li><li>胚の頭の周りに7ミリメートルの電極を配置します。上層皮質層の細胞集団をヒットするには、E16 23でIUEを実行し、わずかに背側/横傾向を注入心室上半球上の正極を配置。海馬細胞を標的とすることは、わずかに背側方向（ 図1）の横を注射された脳室とは反対側に正電極配置を変更してください。 </li><li>方形波パルスエレクトロと950ミリ秒休憩で55 Vで5 50ミリ秒パルスでエレクトロポレーションを行う。 </li><li>トンを増加させるために、各子宮角の膣の端部に第胚スペア彼のすべての胚の生存の可能性。 </li><li>バック母ラットへの子宮角を置く。 </li><li>吸収性ビクリル縫合糸材料と腹壁をスティッチ。 </li><li>ビクリル縫合材料または縫合クリップで皮膚を閉じます。 </li><li>バックホームケージに母ラットを置き、2〜3時間保温し。 </li><li>動物施設の部屋や飼料を自由摂取でのホームケージに一人でラットを開催しています。彼らは、E22-24の間に出産する。 </li><li> 3週間の彼らの母と仔ラットを維持し、男女別、その後それらを分離。 </li></ol></li></ol> 2。酵素ルシフェラーゼ反応の生物発光ライブイメージングこの方法は、 子宮内でトランスフェクトされた細胞の位置を分析するために使用される。共同エレクトロポレーションホタルルシフェラーゼcDNAは、オキシルシフェリンのD-ルシフェリンを代謝すると、光子（ 図2を発するアクティブルシフェラーゼに翻訳されている</stron得&gt;）。生じた発光は、出生後（ 図4）約35日齢までIVISスペクトラムの正エレクトロポレーションの若いラットの脳で検出することができる。 本研究では、ルシフェラーゼアッセイおよび生物発光イメージングは​​、P7から始まる行った。この時点は、母と仔が誕生ストレスから回復できるようにするために選ばれました。当初はP0に子犬を操作する場合は、仔の生存率は大幅​​に子犬が死亡して発見または母に食べたことの影響を受けました。 最初に、成功したエレクトロポレーションを有する仔ラットを、3分間の露光時間で2D-生物発光画像により識別される。続いて、正の仔はエレクトロポレーション領域の位置を特定するために、3D画像を作成するために使用される。 <ol><li>溶液15mgの/の濃度にPBS中でD-ルシフェリンナトリウム塩を希釈し、滅菌シリンジフィルターで濾過して滅菌する。 </li><li>子犬の重さ。 </li><li>上部の腹部に片手で子犬を取り、少し腹部を伸ばす。ルシフェリン溶液の腹腔内の体重の10μL/ Gを注入。古く、より機敏なものについては、ルシフェリンを注入する前に、誘導チャンバー内のイソフルランで子犬を事前に麻酔し。 </li><li> 3％のイソフルランでIVISスペクトル内XGI-8ガス麻酔システムのイソフルランの流入をオンにします。 </li><li>麻酔システムのガラスノーズコーンに動物の鼻を入れてください。 </li><li>それは深い麻酔（2〜3分）になるまで、腹臥位で動物を保​​持します。その後、1.5％イソフルラン流入を減らすことができます。 </li><li>全体ごみから正の子犬を選択するために2D-生物発光測定を選択します。次の設定を使用 <img alt="画面1" src="/files/ftp_upload/50146/50146screen1.jpg" /> <a href="http:///www.jove.com/files/ftp_upload/50146/50146screen1large.jpg" target="_blank">大きな画像を見るにはここをクリックしてください</a> 。 <ol><li> CHECを設定kmarkは8でメディアビニングとF /ストップと写真上、カメラは、測定を開始した後、上からの写真をとります。 </li><li>励起フィルターセット：ブロック。 </li><li>発光フィルタを設定します。開いた。 </li><li>メディアにビニングを設定します。 </li><li> 1のF /停止を設定します。 </li><li>設定ステージレベルAに</li><li> 180秒に発光露光時間を設定します。 </li></ol></li><li>よりよいホタルルシフェラーゼの次DLIT設定を使用すると、正の子犬からエレクトロポレーションの領域を定量化するために3次元画像を作成するため。 <img alt="画面3" src="/files/ftp_upload/50146/50146screen3.jpg" /> <a href="http:///www.jove.com/files/ftp_upload/50146/50146screen3large.jpg" target="_blank">大きな画像を見るにはここをクリックしてください</a> 。 <ol><li>写真の上にチェックマークを設定し、カメラが測定を開始した後、上からの写真をとります。 </li><li>構造上のチェックマークを設定して、動物の表面は、IVIS前生物発光測定によりスキャンされる。 </li><li> Uそれ二週間の年齢まで、発光フィルタおよび露光時間の設定を、次 発光フィルター1：590nmで、露出時間300秒 発光フィルタ2：600nmの露光時間240秒 発光フィルター3：620nmの露光時間180秒 放射フィルタ4：640nmの露光時間120秒 P20より古いラット 発光フィルター1：600nmで、露出時間300秒 発光フィルタ2：620nmの露光時間300秒 発光フィルター3：640nmの露光時間300秒 <img alt="画面3" src="/files/ftp_upload/50146/50146screen3.jpg" /> <a href="http:///www.jove.com/files/ftp_upload/50146/50146screen3large.jpg" target="_blank">大きな画像を見るにはここをクリックしてください</a> 。 による高齢の動物における信号強度の減少に、露光時間は三大発光フィルタに拡大される。 </li><li>設定段階レベルB </li><li>メディアにビニングを設定します。 </li><li> 1のF /停止を設定</li></ol></li><li>測定後、月<html>互いに区別するために耳孔コードによってラットをkとIVISイメージングライブ画像にそれらを一致させる</li><li>そのケージに戻す前に、測定手順の最後に、イソフルラン流入をオフにして数分間温めプレートにラットを保つ。 </li></ol> 3。生物発光画像の解析 3D画像、3D映画、信号源の体積の定量化の発生をリビングImageソフトウェアIVISスペクトルにプリインストールすることによって行われる。 <ol><li> 3D画像の生成<ol><li>まず、表面形状を再構築する、そのため20から30パーセントの間の閾値を設定してください。 <img alt="画面4" src="/files/ftp_upload/50146/50146screen4.jpg" /> <a href="http:///www.jove.com/files/ftp_upload/50146/50146screen4large.jpg" target="_blank">大きな画像を見るにはここをクリックしてください</a> 。 <img alt="画面5" src="/files/ftp_upload/50146/50146screen5.jpg" /> EEN 6 &quot;SRC =&quot; / files/ftp_upload/50146/50146screen6.jpg &quot;/&gt; </li><li>波長ごとに10パーセントの画像閾値とDLIT 3D再構成を開始します。 <img alt="画面7" src="/files/ftp_upload/50146/50146screen7.jpg" /> <a href="http:///www.jove.com/files/ftp_upload/50146/50146screen7large.jpg" target="_blank">大きな画像を見るにはここをクリックしてください</a> 。 <img alt="画面8" src="/files/ftp_upload/50146/50146screen8.jpg" /> <a href="http:///www.jove.com/files/ftp_upload/50146/50146screen8large.jpg" target="_blank">大きな画像を見るにはここをクリックしてください</a> 。 <img alt="画面9" src="/files/ftp_upload/50146/50146screen9.jpg" /> <a href="http:///www.jove.com/files/ftp_upload/50146/50146screen9large.jpg" target="_blank">大きな画像を見るにはここをクリックしてください</a> 。 </li><li> 3Dツールバー内のアニメイトボタンを使用して3D映画を作成します。 </li><li> 3D画像の他の方向を選択するだけでなく、キーフレームなどのビューをズーム、 &#39;レコード＆＃を押してください39、ボタン、別の位置/方向からの切り替えを記録。 <img alt="画面10" src="/files/ftp_upload/50146/50146screen10.jpg" /> <a href="http:///www.jove.com/files/ftp_upload/50146/50146screen10large.jpg" target="_blank">大きな画像を見るにはここをクリックしてください</a> 。 </li></ol></li></ol> 4。行動実験行動試験は、ラットにおけるIUE媒介遺伝子操作は、成人期まで持続する長期的な効果を開始するかどうかを決定するために行った。存在する特定の場合、一過性の効果では、IUE後一方的な全長ヒトDISC1皮質過剰発現はドーパミン関連の具体的なテストとして、アンフェタミンの低用量とすることなく、（OF）オープンフィールドに移動をテストすることによって調べた行動24。丹羽らが行う。IUEマウスにおけるDISC1ノックダウン、IUEマウスではなく、コントロールを使用して、同様の手順で過敏症を示したアンフェタミン18。 子宮内で 、DISC1過剰発現ベクターを用いてエレクトロポレーションしたラットは、午後7時まで午前7時から12時間の明との実験室条件下で行われたと自由摂取を与えた。生後3ヶ月で、ラットは行動試験を受けた。 アンフェタミンの影響の読み出し、音と光隔離室に位置トゥルースキャン活性系のオープンフィールドとして移動を定量するために使用した。このシステムは、継続時間を測定し、オープンフィールドの余白やセンターで過ごした動物が移動し、時間と距離を距離だけでなく、行動25の飼育。 <ol><li>初日には、生理食塩水注射後の試験<ol><li>動物を秤量する。 </li><li>腹腔内に生理食塩水（1×PBS）を1μl/ g体重を注入する。 </li><li>右注射の後、オープンフィールドに動物を入れて、プロのシステムの測定を開始します。 15分ANのレコード3×5分間の部分にデータを細分dは。 </li><li>背中そのホームケージに動物を置く。 </li></ol></li><li>二日目、アンフェタミン注射でのテスト<ol><li>動物を秤量する。 </li><li> 0.5 mg / mlのアンフェタミン溶液の腹腔内に1μlの/ g体重を注入する。 </li><li>注射はオープンフィールドに動物を入れて、プロのシステムの測定を開始した直後。 15分間の記録と3×5分間の部分にデータを分割します。 </li><li>そのホームケージに動物を返します。 </li></ol></li><li>運動を分析し、特定のトゥルースキャンソフトウェアによって生成挙動を飼育。グラフパッド（プリズム）でグラフを作成し、SPSS Statisticsのソフトウェアで統計を計算します。 </li></ol>

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P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissociating+effects+of+cocaine+and+d-amphetamine+on+dopamine+and+serotonin+in+the+perirhinal,+entorhinal,+and+prefrontal+cortex+of+freely+moving+rats.">Dissociating effects of cocaine and d-amphetamine on dopamine and serotonin in the perirhinal, entorhinal, and prefrontal cortex of freely moving rats.</a> Psychopharmacology. 193, 375-390 (2007).</li><li>dal Maschio, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-performance+and+site-directed+in+utero+electroporation+by+a+triple-electrode+probe.">High-performance and site-directed in utero electroporation by a triple-electrode probe.</a> Nature Communications. 3, 960 (2012).</li></ol>

この研究の著者らは、この研究では経済的利害関係を持っていないと、この研究のために産業界が主催されていない。オープンアクセス料はパーキンエルマー社のポスト出版物によって寄与された。

我々の研究は、この介入の結果として、これらの動物が行わ操作の機能性を示す行動の変化を示し、IUEは、選択脳の領域と、その中で導入遺伝子を発現する神経細胞と成体ラットを生成するのに適していることを示している。本研究では、一例として、前頭前皮質の小部分に一方的にDISC1を過剰発現するラットは、アンフェタミン（ 図9）に向かって過敏症を示した。 in vivoでの生物発光イメージングによるエレクトロポレーションの成功のためにラットを選択すると、IUE細胞トランスフェクションの固有の可変性を制御するのに有効であったと、後の調査のための低被験者間変動の均質IUE面積を持つグループを生成するために適用した。 本研究では、新生児動物における共エレクトロポレーション、GFP誘起蛍光を検出することによってゴミからエレクトロポ子犬を選択することができなかったとしてもカントーぐふ同時に同じ動物でも同様に共同エレクトロポレーションルシフェラーゼの生物発光シグナルはルシフェリン注射（ 図6）後に検出することができ、神経細胞をGFPを発現は、6ヶ月齢ではまだ、脳内に存在していた。我々は、ラットにおいて、ルシフェラーゼ/ルシフェリン反応が成功したエレクトロポレーションの脳（ 図3）で動物を区別するために非常に適している、と結論付けている。 IUE成功の定量的モニタリングは、同じ露光時間（ 図3）内の光子の計数によって測定し、共発現ルシフェラーゼの酵素活性に対応する生物発光信号の強度に関する。小さ ​​な生物発光シグナルは、6ヶ月のラット脳内の組織学における〜1×10 4の光子/秒/ cm 2 /ステラジアンショー1,000-2,000 GFP染色細胞の輝きで、光子の100〜200カウントによって検出可能である、と。最高の信号DISPの輝きをレイアウトさ〜5×10 6の光子/秒/ cm 2 /ステラジアンと〜64,000カウントまで。 使用のSprague Dawleyラット系統では、加齢に伴って縦方向に生物発光信号の弱体化を観察し、信号がP35の年齢（ 図4）を超えて姿を消した。この時点で、我々はルシフェラーゼの一過性のプラスミドベクターベースの式のどちらかが減少、または生物発光信号が原因で増加し、脳の質量、またはその両方が消え信号の原因であるに下落した場合かどうかわからない。成体ラット中に存在する機能的アッセイのために、行動研究のための選択は、単に信号の位置に基づいて行わはなく、生物発光信号強度によるした。 3D量的生物発光の監視は、異なる電気穿孔した領域（ 図5）との間の区別を可能にしたにもかかわらず、その正確性、深さDIMEに位置するセルのために制限されていました脳のnsion。 図6は、2Dと3D映像での生物発光測定は、エレクトロポレーションの良いポジショニングを示した海馬エレクトロポレーションの例を示しています。解剖死後脳において、GFP-蛍光シグナルが海馬の正しい標的化を示す、生物発光信号と同じ位置を中心に検出された。しかし、組織学はまた、海馬の皮質背側の細胞は（ 図7）目標としていたことを示しています。これは生物発光アッセイが正、IUE子犬を検出し、また、エレクトロポレーション領域のアイデアを持っていることではなく、最終的には、画像が正確に積極的に標的細胞をローカライズするために死後の組織像を置き換えることはできません便利なツールであることを示している。 私たちのデモでは、C言語でaberrancesをシミュレートするために、皮質や海馬の脳領域の微妙なターゲット操作を生成するために、IUE技術の応用のための約束を示しているortical移行または成体動物に影響を与える可能性が他の神経発達の欠陥。二国間の電気穿孔26が行動にそう大きな効果を利用したが、胚のより死亡率もあります。一方的なエレクトロポレーションは、内部対照として、ならびに片側、小領域内であってもIUE操作が動作を変更するのに十分であることを示すものと二つの半球を比較するために選択した。ニューロン間の接続やアーキテクチャのIUEによる変化は、このように、病変し、適切な行動試験で被IUE-操作さ領域が、科学的な疑問に依存しているのに必要な一致を想起させることなく誘導することができる。 トラブルシューティング 縮小産子数 IUE仔の生存率を増加に関するいくつかの提案があります。まず、組織を最小限に抑えるために、エレクトロポレーションの間に非常に薄いガラスキャピラリーの使用lesionがお勧めします。第2に、各子宮角の膣終わりに最初の胚をエレクトロポレーションしない：最初の生まれの胚の死は、他のすべての胚の中止の可能性が高くなります。第三に、出産後、母親ラットは、しばしば周産期のストレスにその子孫の一部を殺す。追加のストレスを低減するためには、右生後ライブイメージングで始まっていませんが、7日間を待つ。 仔のGFP-蛍光検出 生後一週間で、どちらかIVISスペクトルとライブ双眼蛍光顕微鏡イメージングまたは蛍光イメージング使用して蛍光の無信号（エピ蛍光とtransfluorescenceモードを、GFPの励起/発光のために：520分の465 nmおよび540分の500 nm）を。それは、皮膚の頭蓋骨と高い自己蛍光の背景のような組織を通る短い波長の励起および発光光の限られた伝送がお得！の下で蛍光を用いないように、両方の可能性がありますラットの条件をribed。 図6に示すように、生きている動物におけるルシフェラーゼシグナルはまた、（頭蓋骨なし）に解剖脳において検出することができ、そこに、また蛍光シグナル（ 図6D）検出可能である。 密集した脳領域における生物発光の分化 でも、3Dイラスト生物発光領域の位置は、100％に予測することはできません。特に、予測領域の上または下に細胞はまた誤って標的とトランスフェクトすることができる。正確な位置は、死後（蛍光）組織学（ 図7参照）によって制御されなければならない。

それが比較的容易に神経発達を研究する有効以来発達中の脳における遺伝子発現の調節を可能にする子宮内電気穿孔（IUE）方法の開発が、ブレークスルーとなっている。における標的遺伝子の発現レベルの1-7の変更げっ歯類における胚および/ ​​または周産期開発中に特定の脳領域が影響神経細胞増殖、遊走、樹枝状分岐、および接続性を批判的することが実証された。8月10日 統合失調症は、神経発達異常を11に関連している急性および慢性症状を伴う複雑な精神疾患である12と統合失調症の同定された候補遺伝子のため、多くが中断·イン·統合失調症などのように、神経発達上の潜在的な調節効果を調べた-1（DISC1）遺伝子13〜15。 脳の発達はregulatです前、閉経および出生後発育期において役割を果たす遺伝的要因と環境との相互作用によって編様々な行動障害のための一つの主要な遺伝的危険因子は、マウス13、17にある移行欠陥にDISC1 16遺伝子。DISC1ノックダウンリードであり、IUEによって現像皮質におけるDISC1の発現操作は、成体マウス18の動作に影響を与えることが示されている。 IUEによる操作脳遺伝子発現は、トランスジェニック動物株の生成19に対していくつかの利点を有する。まず、関心領域内の遺伝子発現は、ヶ月ではなく、トランスジェニックげっ歯類系統育種、数世代に数週間以内に達成される。第二に、生殖細胞工学動物20の表現型をシールドすることが初期の開発時に代償機構が回避される。特定の細胞集団または脳の特定の領域、migratiをターゲットを通じて、第三上または増殖の違いが直接非変異と比較して、または一方的なエレクトロポレーションが選択された場合、反対側を制御することができます。一方、IUEはプロモーター駆動CRE / LOX誘導発現のタイミングや特定の地域での細胞の唯一の亜集団の遺伝子発現パターンのモザイク種類につながるターゲットにしての精度を持っていません。 安定な、生殖細胞系列トランスジェニックげっ歯類の主な利点が無視できるように、成体げっ歯類における多くの実験用途のために、脳領域における細胞の限られた数の一過性トランスフェクションは、十分な、または所望であり得る。実際には、IUEは、いくつかの異常に開発された細胞が、細胞や回路のネットワーク全体に影響を与える可能性かどうかを調査することは有用である。もう一つの利点は、ヒットのモザイク性質による遺伝子の非細胞自律的な効果を発揮する機能があります。さらに、トランスジェニックおよびノックアウトラットの世代は、まだ初期段階にまだ使用中です異常な脳の発達への影響を研究するためのこの種ではIUE高い関心がある。 今のところ、成人としてこれらの動物における介入の影響を調査するためIUEを使用する主な障害は、エレクトロポレーションの成功を監視するの欠如である。これまで、生新生児ラット仔好適双眼蛍光顕微鏡下またはIVISスペクトルの蛍光イメージングを用いて検出することができなかった蛍光ニューロンをGFP-同時トランスフェクトした。 この障害を克服するために、我々はルシフェラーゼレポーター遺伝子を同時トランスフェクトし、IUE脳領域の3次元（3D）定量により仔の生物発光ライブイメージングを行った。 神経発達遺伝子操作、ラットの胚の側脳室に人間のDISC1、ルシフェラーゼ、およびGFPを含むプラスミドの同時注入をテストし、後で機能アッセイにおいて、この方法の適用可能性を実証するための例として<suピンセット電極とエレクトロポレーションに続いたp&gt; 3を行った。蛍光シグナルが、インビボで出生後の段階で検出することができなかった一方で、同時トランスフェクトし、ルシフェラーゼ遺伝子によってルシフェリン代謝に由来する固体生物発光信号は、出生後5週間までに検出された。低変動性の一致したエレクトロポレーションの脳領域で実験群と3D-測定のエレクトロポレーション脳領域許可定量化の不十分または見当違いのエレクトロポレーションとの仔がIUE動物の割り当てを可能にする、このようにして、最初から同定されたことにより、（目的の遺伝子と制御をスクランブル） 。行動パラダイムにおける成人IUEラットの使用は、このプロトコルの有用性の例として示された。

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Reagent name</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Phosphate-Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>14190-250</td>
			<td>without calcium, without magnesium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-luciferin, sodium salt</td>
			<td>SynChem OHG, Germany</td>
			<td>BC218</td>
			<td>CAS number: 103404-75-7 substrate for firefly-luciferase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fast Green FCF</td>
			<td>Sigma Aldrich, USA</td>
			<td>F7258-25G</td>
			<td>CAS: 2353-45-9</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Amphetamine</td>
			<td>Sigma Aldrich, USA</td>
			<td>A 5880</td>
			<td>CAS: 51-63-8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>kodan Tinktur forte</td>
			<td>Sch&#252;lke &#38; Mayr GmbH, Germany</td>
			<td>104 005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Material / product</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass capillaries</td>
			<td>Sutter Instrument</td>
			<td>Novato, California, USA</td>
			<td>borosilicate glass O.D.:1 mm, I.D.: 0.78 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle Pipette Puller</td>
			<td>David Kopf Instruments</td>
			<td>Tujunga, California, USA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezer electrode</td>
			<td>Nepa Gene CO., LTD.</td>
			<td>Shioyaki, Ichikawa, Chiba, Japan</td>
			<td>7 mm in diameter platinum disc electrodes (<a href="http://www.sonidel.com/product_info.php?products_id=129" target="_blank">CUY650P7</a>)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Scissors - sharp</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>Heidelberg, Germany</td>
			<td>Straight, 12 cm (14002-12)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ring Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>Heidelberg, Germany</td>
			<td>2.2 mm ID, 3 mm OD (11021-12)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Square wave pulse electroporator (CUY21SC)</td>
			<td>Nepa Gene CO., LTD.</td>
			<td>Shioyaki, Ichikawa, Chiba, Japan</td>
			<td>(CUY21SC)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vicryl surgical suture material</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td>Norderstedt, Germany</td>
			<td>3-0; 2 Ph. Eur;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wound Clip Applicator</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>Heidelberg, Germany</td>
			<td>Reflex 9 mm (12032-09)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe filter</td>
			<td>VWR</td>
			<td>Darmstadt, Germany</td>
			<td>0.45 &#956;m cellulose acetate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IVIS Spectrum</td>
			<td>Caliper Life Science / PerkinElmer</td>
			<td>Waltham, MassachusettsUSA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XGI-8 Gas Anesthesia System</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>Waltham, Massachuset tsUSA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Open-field</td>
			<td>Coulbourn Instruments</td>
			<td>Allentown, USA</td>
			<td>(40 x 40 x 39 cm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tru Scan activity system</td>
			<td>Coulbourn Instruments</td>
			<td>Allentown, USA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>
			<table border="1">
				<tbody>
					<tr>
						<td colspan="4">Table of recipes</td>
					</tr>
					<tr>
						<td>Number</td>
						<td>Buffer name</td>
						<td>Content</td>
						<td>Comments </td>
					</tr>
					<tr>
						<td>1</td>
						<td>DNA-Mixture for DISC-1 overexpressing</td>
						<td>1.5 &#956;g/&#956;l pCAX humanDISC-1, 
						0.5 &#956;g/&#956;l pCAX-luciferase, 
						10x PBS (10%) Fast Green Dye (0.5%) add H2O</td>
						<td>100 &#956;l of the mixture are enough for ~5 IUE</td>
					</tr>
					<tr>
						<td>2</td>
						<td>DNA-Mixure for control</td>
						<td>0,75 &#956;g/&#956;l control shRNA1, 0,75 &#956;g/&#956;l control shRNA2, 0.5 &#956;g/&#956;l pCAX-luciferase, 0.5 &#956;g/&#956;l pCAGGS-GFP 10x PBS (10%) Fast Green Dye (0.5%) add H2O</td>
						<td>100 &#956;l of the mixure are enough for ~5 IUE</td>
					</tr>
					<tr>
						<td>3</td>
						<td>Fast green Dye</td>
						<td>10 mg/ml Fast Green FCF in ddH2O</td>
						<td></td>
					</tr>
					<tr>
						<td>4</td>
						<td>D-luciferin solution</td>
						<td>15 mg/ml D-luciferin, sodium salt in PBS</td>
						<td></td>
					</tr>
					<tr>
						<td>5</td>
						<td>Amphetamine solution</td>
						<td>0.5 mg/ml D-Amphetamine in PBS</td>
						<td></td>
					</tr>
				</tbody>
			</table>
			</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of topically transgenic rats by in utero electroporation and in vivo bioluminescence screening

子宮内電気穿孔（IUE） で神経発達を調査するため、脳内の細胞の遺伝子改変を可能にする技術である。これまでのところ、成体の脳での行動や神経病理を調査するためのIUEの使用は、出生後の動物での非侵襲的技術によるIUEトランスフェクションの成功を監視するには不十分な方法で制限されています。 本研究のために、E16ラットをIUEのために使用した。胚への核酸の室内注射した後、ピンセット電極の配置は、発展途上皮質や海馬のいずれかを標的とするための重要でした。 3D定量化ソフトウェアでIVISスペクトル装置を用いて、出生後のin vivo生物発光によって麻酔されたライブP7の仔におけるルシフェリンの腹腔内注射後のトランスフェクトされた細胞のルシフェラーゼ遺伝子許可監視の同時注入およびエレクトロポレーション心室。 <p生物発光によるクラス= &quot;jove_content&quot;&gt;エリア定義を明確に皮質および海馬エレクトロ区別し、生後5週間まで時間をかけて縦方向に信号を検出することができた。このイメージング技術は、私たちは生後3ヶ月での行動調査を行うために、その後、生物学的効果をトリガーとするために必要と想定トランスフェクトされた細胞の十分な数の子犬を選択することができました。一例として、本研究では、ラット大脳皮質へのヒト完全長DISC1遺伝子とIUEはアンフェタミン過敏症につながったことを示している。同時トランスフェクトGFPは生後≥6ヶ月で現在の遺伝子発現を示す凍結切片で死後 、蛍光顕微鏡によって神経細胞で検出することができた。 私たちは、出生後の生物発光イメージングは​​、ラットにおいてIUEと一過性トランスフェクションの成功を評価することができますことを結論付けている。 neurodevelopmen中の局所遺伝子操作の影響に関する調査成人の脳とその接続性Tが大幅に容易になる。多くの科学的な質問については、この技術は補完、あるいはトランスジェニックラットの使用を交換し、行動神経科学のための新規な技術を提供することができます。

<html> 図3は 150mgのルシフェリン/ kg体重を注射した後、P7で3ラットの子のイメージング測定を住んでいます。 IUEの効率の変動を示す信号強度の違いが見える。強い生物発光シグナルを、P36（ 図4）まで記録した。 図5において、生物発光イメージングにより皮質（ 図5Aおよび5C）および海馬（ 図5Bおよび5D）エレクトロポレーションを定義することが示されている。頭蓋骨を除去した後、その蛍光シグナルと生物発光信号（ 図7a）の相関（ 図7B）とP14での凍結切片脳内の対応するGFP-エレクトロポレーションした細胞（ 図8）は図6〜図8に示す。注目すべきは、ないていたいずれの時点でも生きたラットにおける蛍光シグナルの検出。 10トン&quot;&gt; インビボ生物発光イメージングは、図示例では、2次元だけ異なるエレクトロポ脳領域のおおよその判別大きく3D画像（ 図5Cおよび5D）を生成IVIS SpectrumソフトウェアのDLITプログラムを用いて改善される（ 図5Aおよび5B）を可能に、前頭前皮質と海馬のエレクトロポレーションを識別することができた。これは、海馬をエレクトロポレーションを目指しながら、海馬の皮質横たわっ背部のためのいくつかの前駆細胞はまた、（ 図7）を打つことができることに留意すべきである。 一方的に子宮内でラットの大脳皮質にpCAXベクターでエレクトロポレーションし、その後、完全長ヒトDISC1を過剰発現しているが、成人としての自発的およびアンフェタミン誘発多動の両方について調査した。 pCAX-DISC1でエレクトロラットはアンフェタミンの低用量に過敏であった。これらのラットは大幅にMOを移動対照動物（ 図10）しなかった、生理食塩水注入の後よりもアンフェタミン治療後の再。 <img alt="図1" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50146/50146fig1.jpg" /> 図1。 A）皮質エレクトロポレーションおよびB）海馬エレクトロポレーション用電極位置の方式は、緑=心室内のDNAミックスを注入した。 <img alt="図2" fo:content-width="4in" src="/files/ftp_upload/50146/50146fig2.jpg" /> 図2。ルシフェラーゼ反応。 <img alt="図3" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50146/50146fig3.jpg" /> 図3。 150 mg / kg体重のルシフェリンの注射後P7ラットの発光測定、露出時間180秒、無発光信号A）ラット; B）ラット<html>弱い生物発光信号に、強い発光信号とC）のラット。 <img alt="図4" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50146/50146fig4.jpg" /> 図4。 IUE成功を検出することができる大きな時間窓を実証150 mg / kgのルシフェリンの注射後の同じラットの連続した生物発光測定のタイムライン。 <img alt="図5" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50146/50146fig5.jpg" /> 図5 P7 Aでの皮質と海馬のエレクトロポレーションの違いイラスト）とB）の2D写真】。C）＆D）3D画像を、A）およびC）皮質から、B）＆D）海馬から。files/ftp_upload/50146/50146fig5highres.jpg &quot;&gt;大きな画像を見るにはここをクリックしてください。 <img alt="図6" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50146/50146fig6.jpg" /> 図6。 P14 Aのラットの子犬のE16海馬エレクトロポレーション）生物発光Bの2Dピクチャ）生物発光信号Cの3Dイラスト）の図は、生物発光信号D）は、脳のGFPエピ蛍光シグナルと、脳を解剖した。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50146/50146fig6large.jpg" target="_blank">大きな画像を見るにはここをクリックしてください</a> 。 <img alt="図7" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50146/50146fig7.jpg" /> 図7。 GFPを含むプラスミドおよびルシフェラーゼでエレクトロ同じP14のラット脳の20ミクロンの低温部分からの蛍光画像の詳細ベクトル、DAPIで核染色、CA1-3 =アンモン角1-3、DG =歯状回、FCは= Fasciolarum cinereum。 ビデオ1。海馬の3Dアニメーションは、P14のラットをエレクトロポレーション。 <img alt="図8" fo:content-width="4in" src="/files/ftp_upload/50146/50146fig8.jpg" /> 図8。オープンフィールドチャンバーでテストする前に、15分のトライアルの前の最初の日の生理食塩水注射、24時間後にアンフェタミン注入：アンフェタミンテストスキーム。 <img alt="図9" fo:content-width="4in" src="/files/ftp_upload/50146/50146fig9.jpg" /> 図9。アンフェタミンテスト。 15分かけてTrueScanシステムによって記録動物の（cm単位）の移動距離を示す棒グラフで白バー=対照群;。灰色のバー= DISC1過剰発現しているグループ、対照群はn = 10、DISC1の過剰発現のグループN = 11; ANOVA：GENO *トリートメントP = 0.043、T-テストアンフェタミンNS =有意ではなかっpcontrol対総時間の食塩水= 0.172、pDISC1 = 0.001。

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Generation of Topically Transgenic Rats by In utero Electroporation and In vivo Bioluminescence Screening

遺伝子は、成体動物における行動や神経病のその後の研究のために、神経細胞の接続性における迅速かつターゲットの変更を可能にするために、E16での子宮内電気穿孔（IUE） ビア皮質またはラットの海馬の開発中に操作することができます。 IUE成功を制御するためのインビボイメージングにおける出生後の共トランスフェクトし、ルシフェラーゼの生物発光を活性化することによって行われる。

局所トランスジェニックラットの発生により<em&gt;子宮内</em&gt;エレクトロポレーションおよび<em&gt;インビボ</em&gt;生物発光スクリーニング

 In utero electroporation (IUE) is a technique which allows genetic modification of cells in the brain for investigating neuronal development. So far, the ...

generation-topically-transgenic-rats-utero-electroporation-vivo

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Generation of Topically Transgenic Rats by In utero Electroporation and In vivo Bioluminescence Screening

13.4K ビュー.  Medical School Düsseldorf. 遺伝子は、成体動物における行動や神経病のその後の研究のために、神経細胞の接続性における迅速かつターゲットの変更を可能にするために、E16での子宮内電気穿孔（IUE） ビア皮質またはラットの海馬の開発中に操作することができます。 IUE成功を制御するためのインビボイメージングにおける出生後の共トランスフェクト...

ビデオ: Generation of Topically Transgenic Rats by In utero Electroporation and In vivo Bioluminescence Screening

In utero Electroporation followed by Primary Neuronal Culture for Studying Gene Function in Subset of Cortical Neurons

In vitro study of primary neuronal cultures allows for quantitative analyses of neurite outgrowth. In order to study how genetic alterations affect neuronal process outgrowth, shRNA or cDNA constructs can be introduced into primary neurons via chemical transfection or viral transduction. However, with primary cortical cells, a heterogeneous pool of cell types (glutamatergic neurons from different layers, inhibitory neurons, glial cells) are transfected using these methods. The use of in utero electroporation to introduce DNA constructs in the embryonic rodent cortex allows for certain subsets of cells to be targeted: while electroporation of early embryonic cortex targets deep layers of the cortex, electroporation at late embryonic timepoints targets more superficial layers. Further, differential placement of electrodes across the heads of individual embryos results in the targeting of dorsal-medial versus ventral-lateral regions of the cortex. Following electroporation, transfected cells can be dissected out, dissociated, and plated in vitro for quantitative analysis of neurite outgrowth. Here, we provide a step-by-step method to quantitatively measure neuronal process outgrowth in subsets of cortical cells.
The basic protocol for in utero electroporation has been described in detail in two other JoVE articles from the Kriegstein lab 1, 2. We will provide an overview of our protocol for in utero electroporation, focusing on the most important details, followed by a description of our protocol that applies in utero electroporation to the study of gene function in neuronal process outgrowth.

In utero Electroporation followed by Primary Neuronal Culture for Studying Gene Function in Subset of Cortical Neurons

In utero electroporation is a valuable method for transfecting neuronal progenitor cells in vivo. Depending upon the placement of the electrodes and the developmental timepoint of electroporation, certain subsets of cortical cells can be targeted. Targeted cells can then be analyzed in vivo or in vitro for effects of genetic alteration.

子宮内エレクトロポレーションは、皮質ニューロンのサブセットで、遺伝子機能の研究のために初代神経培養した

In vitro study of primary neuronal cultures allows for quantitative analyses of neurite outgrowth. In order to study how genetic alterations affect ...

神経科学

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

The targeting and refinement of RGC projections to the midbrain is a popular and powerful model system for studying how precise patterns of neural connectivity form during development. In mice, retinofugal projections are arranged in a topographic manner and form eye-specific layers in the Lateral Geniculate Nucleus (dLGN) of the thalamus and the Superior Colliculus (SC). The development of these precise patterns of retinofugal projections has typically been studied by labeling populations of RGCs with fluorescent dyes and tracers, such as horseradish peroxidase1-4. However, these methods are too coarse to provide insight into developmental changes in individual RGC axonal arbor morphology that are the basis of retinotopic map formation. They also do not allow for the genetic manipulation of RGCs.
Recently, electroporation has become an effective method for providing precise spatial and temporal control for delivery of charged molecules into the retina5-11. Current retinal electroporation protocols do not allow for genetic manipulation and tracing of retinofugal projections of a single or small cluster of RGCs in postnatal mice. It has been argued that postnatal in vivo electroporation is not a viable method for transfecting RGCs since the labeling efficiency is extremely low and hence requires targeting at embryonic ages when RGC progenitors are undergoing differentiation and proliferation6. 
In this video we describe an in vivo electroporation protocol for targeted delivery of genes, shRNA, and fluorescent dextrans to murine RGCs postnatally. This technique provides a cost effective, fast and relatively easy platform for efficient screening of candidate genes involved in several aspects of neural development including axon retraction, branching, lamination, regeneration and synapse formation at various stages of circuit development. In summary we describe here a valuable tool which will provide further insights into the molecular mechanisms underlying sensory map development.

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

We demonstrate an in vivo electroporation protocol for transfecting single or small clusters of retinal ganglion cells (RGCs) and other retinal cell types in postnatal mice over a wide range of ages. The ability to label and genetically manipulate postnatal RGCs in vivo is a powerful tool for developmental studies.

によるマウス網膜神経節細胞のトランスフェクション in vivoでエレクトロポレーション

The targeting and refinement of RGC projections to the midbrain is a popular and powerful model system for studying how precise patterns of neural ...

Efficient Gene Delivery into Multiple CNS Territories Using In Utero Electroporation

The ability to manipulate gene expression is the cornerstone of modern day experimental embryology, leading to the elucidation of multiple developmental pathways. Several powerful and well established transgenic technologies are available to manipulate gene expression levels in mouse, allowing for the generation of both loss- and gain-of-function models. However, the generation of mouse transgenics is both costly and time consuming. Alternative methods of gene manipulation have therefore been widely sought. In utero electroporation is a method of gene delivery into live mouse embryos1,2 that we have successfully adapted3,4. It is largely based on the success of in ovo electroporation technologies that are commonly used in chick5. Briefly, DNA is injected into the open ventricles of the developing brain and the application of an electrical current causes the formation of transient pores in cell membranes, allowing for the uptake of DNA into the cell. In our hands, embryos can be efficiently electroporated as early as embryonic day (E) 11.5, while the targeting of younger embryos would require an ultrasound-guided microinjection protocol, as previously described6. Conversely, E15.5 is the latest stage we can easily electroporate, due to the onset of parietal and frontal bone differentiation, which hampers microinjection into the brain. In contrast, the retina is accessible through the end of embryogenesis. Embryos can be collected at any time point throughout the embryonic or early postnatal period. Injection of a reporter construct facilitates the identification of transfected cells.
To date, in utero electroporation has been most widely used for the analysis of neocortical development1,2,3,4. More recent studies have targeted the embryonic retina7,8,9 and thalamus10,11,12. Here, we present a modified in utero electroporation protocol that can be easily adapted to target different domains of the embryonic CNS. We provide evidence that by using this technique, we can target the embryonic telencephalon, diencephalon and retina. Representative results are presented, first showing the use of this technique to introduce DNA expression constructs into the lateral ventricles, allowing us to monitor progenitor maturation, differentiation and migration in the embryonic telencephalon. We also show that this technique can be used to target DNA to the diencephalic territories surrounding the 3rd ventricle, allowing the migratory routes of differentiating neurons into diencephalic nuclei to be monitored. Finally, we show that the use of micromanipulators allows us to accurately introduce DNA constructs into small target areas, including the subretinal space, allowing us to analyse the effects of manipulating gene expression on retinal development.

Efficient Gene Delivery into Multiple CNS Territories Using In Utero Electroporation

In utero electroporation allows for rapid gene delivery in a spatially- and temporally-controlled manner in the developing central nervous system (CNS). Here we describe a highly adaptable in utero electroporation protocol that can be used to deliver expression constructs into multiple embryonic CNS domains, including the telencephalon, diencephalon and retina.

使用した複数のCNS準州への効率的な遺伝子送達子宮内でエレクトロポレーション

The ability to manipulate gene expression is the cornerstone of modern day experimental embryology, leading to the elucidation of multiple developmental ...

Mouse in Utero Electroporation: Controlled Spatiotemporal Gene Transfection

In order to understand the function of genes expressed in specific region of the developing brain, including signaling molecules and axon guidance molecules, local gene transfer or knock- out is required. Gene targeting knock-in or knock-out into local regions is possible to perform with combination with a specific CRE line, which is laborious, costly, and time consuming. Therefore, a simple transfection method, an in utero electroporation technique, which can be performed with short time, will be handy to test the possible function of candidate genes prior to the generation of transgenic animals 1,2. In addition to this, in utero electroporation targets areas of the brain where no specific CRE line exists, and will limit embryonic lethality 3,4. Here, we present a method of in utero electroporation combining two different types of electrodes for simple and convenient gene transfer into target areas of the developing brain. First, a unique holding method of embryos using an optic fiber optic light cable will make small embryos (from E9.5) visible for targeted DNA solution injection into ventricles and needle type electrodes insertion to the targeted brain area 5,6. The patterning of the brain such as cortical area occur at early embryonic stage, therefore, these early electroporation from E9.5 make a big contribution to understand entire area patterning event. Second, the precise shape of a capillary prevents uterine damage by making holes by insertion of the capillary. Furthermore, the precise shape of the needle electrodes are created with tungsten and platinum wire and sharpened using sand paper and insulated with nail polish 7, a method which is described in great detail in this protocol. This unique technique allows transfection of plasmid DNA into restricted areas of the brain and will enable small embryos to be electroporated. This will help to, open a new window for many scientists who are working on cell differentiation, cell migration, axon guidance in very early embryonic stage. Moreover, this technique will allow scientists to transfect plasmid DNA into deep parts of the developing brain such as thalamus and hypothalamus, where not many region-specific CRE lines exist for gain of function (GOF) or loss of function (LOF) analyses.

Mouse in Utero Electroporation: Controlled Spatiotemporal Gene Transfection

A gene transfer method into the developing mouse brain is described by using a unique surgical method and special shape of electrodes. This unique technique allows transfection of plasmid DNA temporally and spatially, which will aid many neuroscientists in studying brain development.

マウス子宮内でエレクトロポレーション：制御時空間遺伝子導入

In order to understand the function of genes expressed in specific region of the developing brain, including signaling molecules and axon guidance ...

Functional Neuroimaging Using Ultrasonic Blood-brain Barrier Disruption and Manganese-enhanced MRI

Although mice are the dominant model system for studying the genetic and molecular underpinnings of neuroscience, functional neuroimaging in mice remains technically challenging. One approach, Activation-Induced Manganese-enhanced MRI (AIM MRI), has been used successfully to map neuronal activity in rodents 1-5. In AIM MRI, Mn2+ acts a calcium analog and accumulates in depolarized neurons 6,7. Because Mn2+ shortens the T1 tissue property, regions of elevated neuronal activity will enhance in MRI. Furthermore, Mn2+ clears slowly from the activated regions; therefore, stimulation can be performed outside the magnet prior to imaging, enabling greater experimental flexibility. However, because Mn2+ does not readily cross the blood-brain barrier (BBB), the need to open the BBB has limited the use of AIM MRI, especially in mice.
One tool for opening the BBB is ultrasound. Though potentially damaging, if ultrasound is administered in combination with gas-filled microbubbles (i.e., ultrasound contrast agents), the acoustic pressure required for BBB opening is considerably lower. This combination of ultrasound and microbubbles can be used to reliably open the BBB without causing tissue damage 8-11.
Here, a method is presented for performing AIM MRI by using microbubbles and ultrasound to open the BBB. After an intravenous injection of perflutren microbubbles, an unfocused pulsed ultrasound beam is applied to the shaved mouse head for 3 minutes. For simplicity, we refer to this technique of BBB Opening with Microbubbles and UltraSound as BOMUS 12. Using BOMUS to open the BBB throughout both cerebral hemispheres, manganese is administered to the whole mouse brain. After experimental stimulation of the lightly sedated mice, AIM MRI is used to map the neuronal response.
To demonstrate this approach, herein BOMUS and AIM MRI are used to map unilateral mechanical stimulation of the vibrissae in lightly sedated mice 13. Because BOMUS can open the BBB throughout both hemispheres, the unstimulated side of the brain is used to control for nonspecific background stimulation. The resultant 3D activation map agrees well with published representations of the vibrissae regions of the barrel field cortex 14. The ultrasonic opening of the BBB is fast, noninvasive, and reversible; and thus this approach is suitable for high-throughput and/or longitudinal studies in awake mice.

A technique is described for broadly opening the blood-brain barrier in the mouse using microbubbles and ultrasound. Using this technique, manganese can be administered to the mouse brain. Because manganese is an MRI contrast agent that accumulates in depolarized neurons, this approach enables imaging of neuronal activity.

超音波血液脳関門の破壊とマンガン増強MRIを用いた脳機能イメージングの試み

Although mice are the dominant model system for studying the genetic and molecular underpinnings of neuroscience, functional neuroimaging in mice remains ...

Expansion of Embryonic and Adult Neural Stem Cells by In Utero Electroporation or Viral Stereotaxic Injection

Somatic stem cells can divide to generate additional stem cells (expansion) or more differentiated cell types (differentiation), which is fundamental for tissue formation during embryonic development and tissue homeostasis during adulthood 1. Currently, great efforts are invested towards controlling the switch of somatic stem cells from expansion to differentiation because this is thought to be fundamental for developing novel strategies for regenerative medicine 1,2. However, a major challenge in the study and use of somatic stem cell is that their expansion has been proven very difficult to control.
Here we describe a system that allows the control of neural stem/progenitor cell (altogether referred to as NSC) expansion in the mouse embryonic cortex or the adult hippocampus by manipulating the expression of the cdk4/cyclinD1 complex, a major regulator of the G1 phase of the cell cycle and somatic stem cell differentiation 3,4. Specifically, two different approaches are described by which the cdk4/cyclinD1 complex is overexpressed in NSC in vivo. By the first approach, overexpression of the cell cycle regulators is obtained by injecting plasmids encoding for cdk4/cyclinD1 in the lumen of the mouse telencephalon followed by in utero electroporation to deliver them to NSC of the lateral cortex, thus, triggering episomal expression of the transgenes 5-8. By the second approach, highly concentrated HIV-derived viruses are stereotaxically injected in the dentate gyrus of the adult mouse hippocampus, thus, triggering constitutive expression of the cell cycle regulators after integration of the viral construct in the genome of infected cells 9. Both approaches, whose basic principles were already described by other video protocols 10-14, were here optimized to i) reduce tissue damage, ii) target wide portions of very specific brain regions, iii) obtain high numbers of manipulated cells within each region, and iv) trigger high expression levels of the transgenes within each cell. Transient overexpression of the transgenes using the two approaches is obtained by different means i.e. by natural dilution of the electroporated plasmids due to cell division or tamoxifen administration in Cre-expressing NSC infected with viruses carrying cdk4/cyclinD1 flanked by loxP sites, respectively 9,15.
These methods provide a very powerful platform to acutely and tissue-specifically manipulate the expression of any gene in the mouse brain. In particular, by manipulating the expression of the cdk4/cyclinD1 complex, our system allows the temporal control of NSC expansion and their switch to differentiation, thus, ultimately increasing the number of neurons generated in the mammalian brain. Our approach may be critically important for basic research and using somatic stem cells for therapy of the mammalian central nervous system while providing a better understanding of i) stem cell contribution to tissue formation during development, ii) tissue homeostasis during adulthood, iii) the role of adult neurogenesis in cognitive functions, and perhaps, iv) better using somatic stem cells in models of neurodegenerative diseases.

Expansion of Embryonic and Adult Neural Stem Cells by In Utero Electroporation or Viral Stereotaxic Injection

Controlling the expansion of somatic stem cells is a major factor hampering their study and use in therapy. Here we describe a system to temporally control neural stem cells expansion during development and adulthood, which can be used to increase the number of neurons generated in the mouse brain.

によって胚および成体神経幹細胞の拡大<em&gt;子宮内</em&gt;エレクトロポレーションまたはウイルス定位注射

Somatic stem cells can divide to generate additional stem cells (expansion) or more differentiated cell types (differentiation), which is fundamental for ...

Visualization and Genetic Manipulation of Dendrites and Spines in the Mouse Cerebral Cortex and Hippocampus using In utero Electroporation

In utero electroporation (IUE) has become a powerful technique to study the development of different regions of the embryonic nervous system 1-5. To date this tool has been widely used to study the regulation of cellular proliferation, differentiation and neuronal migration especially in the developing cerebral cortex 6-8. Here we detail our protocol to electroporate in utero the cerebral cortex and the hippocampus and provide evidence that this approach can be used to study dendrites and spines in these two cerebral regions.
Visualization and manipulation of neurons in primary cultures have contributed to a better understanding of the processes involved in dendrite, spine and synapse development. However neurons growing in vitro are not exposed to all the physiological cues that can affect dendrite and/or spine formation and maintenance during normal development. Our knowledge of dendrite and spine structures in vivo in wild-type or mutant mice comes mostly from observations using the Golgi-Cox method 9. However, Golgi staining is considered to be unpredictable. Indeed, groups of nerve cells and fiber tracts are labeled randomly, with particular areas often appearing completely stained while adjacent areas are devoid of staining. Recent studies have shown that IUE of fluorescent constructs represents an attractive alternative method to study dendrites, spines as well as synapses in mutant / wild-type mice 10-11 (Figure 1A). Moreover in comparison to the generation of mouse knockouts, IUE represents a rapid approach to perform gain and loss of function studies in specific population of cells during a specific time window. In addition, IUE has been successfully used with inducible gene expression or inducible RNAi approaches to refine the temporal control over the expression of a gene or shRNA 12. These advantages of IUE have thus opened new dimensions to study the effect of gene expression/suppression on dendrites and spines not only in specific cerebral structures (Figure 1B) but also at a specific time point of development (Figure 1C).
Finally, IUE provides a useful tool to identify functional interactions between genes involved in dendrite, spine and/or synapse development. Indeed, in contrast to other gene transfer methods such as virus, it is straightforward to combine multiple RNAi or transgenes in the same population of cells. 
In summary, IUE is a powerful method that has already contributed to the characterization of molecular mechanisms underlying brain function and disease and it should also be useful in the study of dendrites and spines.

Visualization and Genetic Manipulation of Dendrites and Spines in the Mouse Cerebral Cortex and Hippocampus using In utero Electroporation

This article describes in detail a protocol to electroporate in utero the cerebral cortex and the hippocampus at E14.5 in mice. We also show that this is a valuable method to study dendrites and spines in these two cerebral regions.

使用して、マウス大脳皮質および海馬における可視化と樹状突起と棘の遺伝子操作<em&gt;子宮内で</em&gt;エレクトロポレーション

In utero electroporation (IUE) has become a powerful technique to study the development of different regions of the embryonic nervous system 1-5. To date ...

Genetic Manipulation of the Mouse Developing Hypothalamus through In utero Electroporation

Genetic modification of specific regions of the developing mammalian brain is a very powerful experimental approach. However, generating novel mouse mutants is often frustratingly slow. It has been shown that access to the mouse brain developing in utero with reasonable post-operatory survival is possible. Still, results with this procedure have been reported almost exclusively for the most superficial and easily accessible part of the developing brain, i.e. the cortex. The thalamus, a narrower and more medial region, has proven more difficult to target. Transfection into deeper nuclei, especially those of the hypothalamus, is perhaps the most challenging and therefore very few results have been reported. Here we demonstrate a procedure to target the entire hypothalamic neuroepithelium or part of it (hypothalamic regions) for transfection through electroporation. The keys to our approach are longer narcosis times, injection in the third ventricle, and appropriate kind and positioning of the electrodes. Additionally, we show results of targeting and subsequent histological analysis of the most recessed hypothalamic nucleus, the mammillary body.

Genetic Manipulation of the Mouse Developing Hypothalamus through In utero Electroporation

Despite the functional and medical importance of the hypothalamus, in utero genetic manipulation of its development has rarely been attempted. We show a detailed procedure for in utero electroporation into the mouse hypothalamus and show representative results of total and partial (regional) hypothalamic transfection.

マウスの遺伝子操作は、視床下部を介して開発<em&gt;子宮内</em&gt;エレクトロポレーション

Genetic  modification of specific regions of the developing mammalian brain is a very  powerful experimental approach. However, generating novel mouse ...

Simultaneous ex vivo Functional Testing of Two Retinas by in vivo Electroretinogram System

An In vivo electroretinogram (ERG) signal is composed of several overlapping components originating from different retinal cell types, as well as noise from extra-retinal sources. Ex vivo ERG provides an efficient method to dissect the function of retinal cells directly from an intact isolated retina of animals or donor eyes. In addition, ex vivo ERG can be used to test the efficacy and safety of potential therapeutic agents on retina tissue from animals or humans. We show here how commercially available in vivo ERG systems can be used to conduct ex vivo ERG recordings from isolated mouse retinas. We combine the light stimulation, electronic and heating units of a standard in vivo system with custom-designed specimen holder, gravity-controlled perfusion system and electromagnetic noise shielding to record low-noise ex vivo ERG signals simultaneously from two retinas with the acquisition software included in commercial in vivo systems. Further, we demonstrate how to use this method in combination with pharmacological treatments that remove specific ERG components in order to dissect the function of certain retinal cell types.

Simultaneous ex vivo Functional Testing of Two Retinas by in vivo Electroretinogram System

Ex vivo ERG can be used to record electrical activity of retinal cells directly from isolated intact retinas of animals or humans. We demonstrate here how common in vivo ERG systems can be adapted for ex vivo ERG recordings in order to dissect the electrical activity of retinal cells.

同時<em&gt; ex vivoで</emによる二つの網膜の&gt;機能テスト<em&gt; in vivoで</em&gt;電図システム

An In vivo electroretinogram (ERG) signal is composed of several overlapping components originating from different retinal cell types, as well as noise ...

Bioluminescence Imaging of Neuroinflammation in Transgenic Mice After Peripheral Inoculation of Alpha-Synuclein Fibrils

To study the prion-like behavior of misfolded alpha-synuclein, mouse models are needed that allow fast and simple transmission of alpha-synuclein prionoids, which cause neuropathology within the central nervous system (CNS). Here we describe that intraglossal or intraperitoneal injection of alpha-synuclein fibrils into bigenic Tg(M83+/-:Gfap-luc+/-) mice, which overexpress human alpha-synuclein with the A53T mutation from the prion protein promoter and firefly luciferase from the promoter for glial fibrillary acidic protein (Gfap), is sufficient to induce neuropathologic disease. In comparison to homozygous Tg(M83+/+) mice that develop severe neurologic symptoms beginning at an age of 8 months, heterozygous Tg(M83+/-:Gfap-luc+/-) animals remain free of spontaneous disease until they reach an age of 22 months. Interestingly, injection of alpha-synuclein fibrils via the intraperitoneal route induced neurologic disease with paralysis in four of five Tg(M83+/-:Gfap-luc+/-) mice with a median incubation time of 229 &#177;17 days. Diseased animals showed severe deposits of phosphorylated alpha-synuclein in their brains and spinal cords. Accumulations of alpha-synuclein were sarkosyl-insoluble and colocalized with ubiquitin and p62, and were accompanied by an inflammatory response resulting in astrocytic gliosis and microgliosis. Surprisingly, inoculation of alpha-synuclein fibrils into the tongue was less effective in causing disease with only one of five injected animals showing alpha-synuclein pathology after 285 days. Our findings show that inoculation via the intraglossal route and more so via the intraperitoneal route is suitable to induce neurologic illness with relevant hallmarks of synucleinopathies in Tg(M83+/-:Gfap-luc+/-) mice. This provides a new model for studying prion-like pathogenesis induced by alpha-synuclein prionoids in greater detail.

Peripheral injection of alpha-synuclein fibrils into the peritoneum or tongue of Tg(M83+/-:Gfap-luc+/-) mice, which express human alpha-synuclein with the familial A53T mutation and firefly luciferase, can induce neuropathology, including neuroinflammation, in their central nervous system.

局所トランスジェニックラットの発生により

要約

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子宮内エレクトロポレーションは、皮質ニューロンのサブセットで、遺伝子機能の研究のために初代神経培養した

によるマウス網膜神経節細胞のトランスフェクション in vivoでエレクトロポレーション

使用した複数のCNS準州への効率的な遺伝子送達子宮内でエレクトロポレーション

マウス子宮内でエレクトロポレーション：制御時空間遺伝子導入

超音波血液脳関門の破壊とマンガン増強MRIを用いた脳機能イメージングの試み

によって胚および成体神経幹細胞の拡大

使用して、マウス大脳皮質および海馬における可視化と樹状突起と棘の遺伝子操作

マウスの遺伝子操作は、視床下部を介して開発

同時

α-シヌクレイン線維の末梢接種後のトランスジェニックマウスにおける神経炎症の生物発光イメージング