トランスジェニック動物は、生物の遺伝子機能の研究を可能にする現代の生物医学研究の基礎です。遺伝子改変の様々な方法が動物実験に適用されている。ここでは、ラット胚のゲノムへの導入遺伝子の組み込みのためのツールとしてレンチウイルスベクターを用いた広くアクセス可能で効果的な技術を提示する。
ヒト絨毛性ゴナドトロピン投与後、5週齢のウィスター雌ラットを1対1で性的に肥沃な3〜10ヶ月のウィスターオスと交尾する。翌朝8時から10時.m時に、膣プラグの有無をメスに確認し、交配プラグを持つ女性から卵管を10.mまでに収穫する。
あらかじめ温めたM2培地を含むコレクション皿に。すべての卵性が採取されたら、牛の精巣からヒアルロニダーゼのミリリットル当たり0.5ミリグラムを補った事前に温められたM2培地を含む35ミリメートル皿に組織を移し、皿を立体顕微鏡の下に置きます。卵管の壁を開くために細かい鉗子を使用し、胚が解放されるまでアンペアを押します。
cumulus細胞からの胚の放出を容易にするために、口で作動する吸引器管に接続されたガラス伝達ピペットを使用して、胚を上下に穏やかにピペット化する。すべての胚が放出されたら、新鮮なM2培地で細胞を数回洗浄してヒアルロンジダーゼおよび細胞残骸を除去する。胚を60ミリメートル皿の鉱物油で覆われた平衡化されたM16培地の個々の50マイクロリットルの滴に移す。
その後、注入するまで5%の二酸化炭素雰囲気を有する加湿37度摂氏インキュベーターに皿を入れます。一細胞段階胚の透明帯下でのレンチウイルスベクターマイクロインジェクションの場合、ピペットプーラーを使用してフィラメントを用いたマイクロインジェクションホウケイ酸ガラス毛細血管を調製する。フィラメントが変更されるか、新しいガラスキャピラリーが使用されるたびに、ランプテストを実行して最適なパラメータを設定します。
次に、マイクロローダーチップを使用して、バイオセーフティ層流フードの下でマイクロインジェクションピペットあたり解凍したレンチウイルス溶液の約2マイクロリットルをロードします。60ミリメートルのペトリ皿から蓋の中央にM2培地の100マイクロリットルの滴を追加します。ミネラルオイルで媒体を覆い、保持ピペットとウイルスがマイクロマニピュレータにマイクロインジェクション毛細管をロードして取り付けます。
マイクロインジェクション皿を逆顕微鏡の下に置き、15〜20個の1細胞段階胚をマイクロインジェクション皿のM2ドロップに移します。保持ピペットで1つの胚を捕獲し、400倍の倍率とガラス毛細管を使用して、ウイルスが送達された後、一瞬、ソナ透明体の下の毛細管を保持する腹腔内空間に透明帯下のレンチウイルス溶液を注入する。すべての胚が注入されたら、細かいピペットを使用して注入された細胞を培養皿に戻し、その注入まで培養インキュベーターに皿を戻します。
胚移植のために里親を準備するために、精管切除された男性と性的に成熟したスプレイグ・ドーリーの女性を仲間にし、翌朝女性に膣プラグをチェックする。実行可能なプラグを持つ麻酔をかけた雌のペダル反射への応答の欠如を確認した後、動物の目に軟膏を適用し、各動物の後ろから毛皮を剃る。手術用顕微鏡下の加熱パッドのきれいな表面に、最初のラットを起こしやすい位置に置きます。
下背部に小さな穴を開けて無菌ドレープでラットを覆い、腰椎柱に平行に約2センチメートルの皮膚切開を行います。鋭利なはさみを使用して腹壁に切り傷を付け、鉗子を使用して卵巣脂肪パッドをつかむ。腹腔から卵巣と卵管を0.9%塩化ナトリウム浸しガーゼの一部に引き出します。
M2培地、空気の3つの気泡、および胚を転写毛細管にロードする。マイクロシザーを使用して、インファンディブラムとアンプラの間の卵管に小さな切開を行い、切開管に移管ピペットの先端を挿入します。胚と気泡を卵管に静かに排出し、鈍い鉗子を使用して生殖管を腹腔に戻します。
腹壁をポリグリコール酸吸収性縫合糸で縫合し、創傷クリップで皮膚切開を閉じ、動物を完全な再発まで監視する温暖化プレートのきれいなケージに入れます。潜在的な仲間を精管切除するには、実証されているように手術のために雄のラットを準備した後、70%エタノールと外科スクラブを使用して精巣の上に皮膚を消毒する。腹部を静かに押して陰嚢嚢の精巣を露出させ、ラットを手術部位の上に小さな穴で無菌ドレープで覆い、陰嚢はさみを使用して嚢の真ん中に0.5センチメートルの切開を行います。
慎重に精巣を左に押し、精巣と正中線の間の精巣を単一の血管を持つ白い管として見つけます。時計職人の鉗子を使用して、陰嚢嚢からゆっくりと蒸気を引き出し、鉗子で容器を保持し、細かいはさみを使用してダクトから1センチメートルの断片を取り除きます。ちょうど実証したように2番目の精巣の手順を繰り返し、ポリグリコール酸吸収性縫合糸で皮膚を閉じます。
その後、完全な再実行まで監視と温暖化プレート上のきれいなケージにラットを置きます。単一胚を複数回注入したこの代表的な実験では、2回注射された胚から8匹のラットが生まれ、そのうちの3匹が遺伝子導入を担うことが確認された。創設者の一人は、子孫にトランスジーンを転送しませんでしたし、3人の里親女性が各実験セットアップに使用されました。
選択されたアプローチは、中枢神経系全体の1つのプロモーターにおけるニューロンシナプスの制御下でTDP-43-eGFP融合タンパク質を発現する安定したトランスジェニックラット株の生成を可能にした。レンチウイルス系トランスジェネシスは、定量PCRによって示されるように、トランスジーンの単一コピー挿入をもたらした。この方法を他のレンチウイルスベクターに使用した場合、約90%の生存率が観察された。
前核注射を生き延びた胚の割合は有意に低かった。全体として、これらの結果は、妊娠中の女性ラットが同等の効率を持つ里親として使用できることを示唆している。特に、マイクロインジェクションの個々のラウンドについて分析された数値データは、移植の有効性が1つの胚への注射の数に直接依存し、間接的にウイルス負荷に依存することを示した。
レンチウイルスベクターの使用は、遺伝子導入遺伝子のゲノム統合および伝達を保証し、複数の皮下注射が行われる場合でも、マイクロ操作胚の高い生存率を促進する。この手順は、他の種に効果的に適用され得るし、従来のトランスジェネシスの代替と考えることができる。
