著者は、サポートのためにTEDCO MSCRF（2009-MSCRFE-0098-00）およびNIH R21CA152473に感謝します。

1。細胞播種<ol><li>細胞はoverconfluencyに成長することはできません。初代細胞をトランスフェクション時の早期継代細胞を使用しています。 </li><li>トランスフェクションの前に二十四時間後に、細胞をトリプシン処理、血球計算盤を用いて細胞をカウントし、所望の細胞密度（細胞/ボリューム）を達成するためにメディアを細胞懸濁液を希釈します。貯水池とマルチチャンネルピペットを使用してクリア組織培養処理平底96ウェルプレートに種子細胞。選ばれた密度はトランスフェクション当日に密集度70-80％を与える必要があります。 表1に表示されているように、たとえば、細胞がここに示されているトランスフェクション·データ用25から50細胞/μlに希釈した。 </li></ol> 2。細胞トランスフェクション<ol><li>ポリマーとDNA株式の希釈。室温（RT）でポリマーとDNA原液を解凍します。 12チャンネルピペットを使用してクリア、96ウェルプレートで個別に、高分子原料溶液とDNA原液を希釈し、DNAの重量比（重量/重量）に所望のポリマーの重量を得るために必要な濃度に適切な溶媒で​​。この場合、選択された溶媒は、25mM酢酸ナトリウム緩衝液（pH = 5.2）である。 <ol><li> DNAの希釈。典型的には、1 mg / mlとなるように格納されたDNAは、非組織培養処理された透明な96ウェルプレート（単一製剤用井戸1）で0.03から0.06 mg / mlの濃度になるように酢酸ナトリウム緩衝液中で希釈されています。 表2に示すようにステップ1からの細胞を播種し、96ウェルプレートで4反復ウェルをトランスフェクトするために使用される単一の製剤のための典型的なDNA希釈プロトコル。 </li><li>ポリマー希釈。 100 mg / mlのポリマー/ DMSO溶液を、DNA重量/重量比を所望のポリマーを得るために必要な濃度に応じて酢酸ナトリウム緩衝液で希釈する。典型的に、ポリ（β-アミノエステル）（PBAEs）を用いた遺伝子送達のために使用重量/重量比の範囲は20から100です。 PBAEポリマーは、最初の希釈のp、続いて10 mg / mlに希釈されるrotocolは、 表3に示す。ポリマー希釈液をDNA希釈プレートの試料方位と一致する明確な非組織培養処理された96ウェルプレート中で行うことができる。 </li></ol></li><li>ナノ粒子形成。 12チャンネルピペットを用いてプラスミドDNA溶液を等量にPBAE溶液を加えて激しく混ぜる。自己組織化できるように、室温で10分間インキュベートして混合してみましょう。 </li><li>ナノ粒子のトランスフェクション。自己組織化の後、20μlのナノ粒子は、12チャンネルピペットを用いて培地に滴下して、ウェルあたり追加されます。複製ウェルは未処理のまま放置されるか、またはコントロールとして市販の試薬を用いてトランスフェクトされる。トランスフェクトした細胞を37℃でインキュベートする2〜4時間後、井戸のCは新鮮な培地（100μl/ウェル）に置き換えられます。インキュベーション時間の選択は、細胞株、培養条件、トランスフェクションシステムに依存します。トランスフェクションの違い潜伏期間を変化させた結果として、効率と細胞毒性は、ステップ3で説明した分析プロトコルによって定量化されます。 </li></ol> 3。トランスフェクション効率と細胞毒性の解析トランスフェクション効率を蛍光顕微鏡を用いて視覚的に分析して、四十八時間トランスフェクション後、フローサイトメーターを用いて定量する。細胞毒性は、蛍光顕微鏡を用いて視覚的に分析し、CellTiter 96水1つのアッセイ二十四時間後、トランスフェクションを用いて定量する。 <ol><li>蛍光顕微鏡。視覚的に適切な蛍光チャネルを使用してトランスフェクトされたレポーター遺伝子（例えば、EGFPまたはDsRed）を発現させるために井戸を分析します。適切に特定の製剤（ 図1）トランスフェクション効率を表すビューのフィールドを選択し、各ウェルのために画像を取得する。目視で観察し、任意の細胞毒性をメモしておきます。 </li><li>フローサイトメトリー。 <ol><li>フローサイトメトリー用の96ウェルプレートを準備するためにマルチチャンネルピペットを使用しています。エッジの周囲を含めて、各ウェルにピペッティングし、170μlのFACS緩衝液（PBS +2％FBS）を中和し、トリプシン/ EDTAの井戸/ 30μlをトリプシン処理し、PBSで洗浄し、全体の200μlのボリュームを転送丸底またはV底96ウェルプレート内の対応するウェルに各ウェル。 </li><li> 4℃で5分間、130×gでプレートを遠心</li><li>泡を避けながら、細胞を再懸濁するために各ウェルにピペットから170μlのメディアを取り出します。各ウェルに;生存率はヨウ化プロピジウム（PI）のように染色に使用するために、FACS緩衝液+ PI（PIのストック濃度1 mg / mlのPIの希釈は50:1 FACS緩衝液）の10μlを添加する。すぐに氷上に置き、光からカバーしています。 </li><li> C6 Accuriフローサイトメーター、96ウェルアタッチメントHyperCyt、とHyperViewソフトウェアを起動します。適切なpを選択するHyperViewはデザインとプロトコルタブを使用して、晩期型、プレートレイアウト、及びそのようなブレ/ SIP /振る/すすぎ時間などの他の設定。上記のプロトコルの場合は、以下のパラメータが1分、2400 rpmで30秒間プレプレートブレプレプライムプレートを使用した。一口時間は15 rpmで15秒に設定された、プローブは2秒ごとによくすすぎ、およびインターウェル2400 rpmで12秒ごとに12個のウェルを横に振る。間によく振って、細胞がウェルのグループ間のタイムアウトブレーク（この場合は12秒）を含めることにより、データを処理する能力の向上のためだけでなく、メディアに分散させておくことが重要です。 </li><li>適切なだけでなく（ 図2）にデータと独立を処理するためにHyperViewはまあ[識別情報]タブを使用します。個々のウェルを識別するためには、高度な設定の下でさえフィルターベースを含むだけでなく、ソフトウェアのノイズフィルタを使用するように助けることができます。 </li><li>別のポップアップを分離するために適切なゲーティングによって積極的にトランスフェクトされた生細胞の割合を定量化警告事項（ 図3）。最初の破片（ 図3A）から細胞を分離するために、FSC対SSCの散布図のフローデータを表示します。もしプロピジウムアイオダイド（PI）は、死んだ細胞やゲート生細胞から生細胞を分離するために、FSC対FL3のプロット上のデータは、そのゲート個々の細胞集団およびビューを使用した。適切なチャネルでライブ細胞集団を表示するには、トランスフェクトされた細胞の数を定量するために、例えば、GFPは、FL1で見ることができます。ゲートはバックグラウンド信号（ 図3B）を識別するために、未処理人口は、未処理の細胞を使用して。積極的にトランスフェクトされた細胞は、その後、散布図と等高線プロット（ 図3Cおよび3D）の両方を使用してトランスフェクトされた集団を表示することによって、このゲートを用いて単離することができる。異なる細胞が蛍光の異なる程度にトランスフェクトされるように、積極的にトランスフェクトされた細胞の連続があるかもしれません。 </li></ol></li><html><li> CellTiter 96水1つのアッセイ<ol><li>細胞毒性測定用とまったく同じ方法で、別のプレートをトランスフェクトする。 </li><li> 10ミリリットル新鮮なメディアとのCellTiter 96水相アッセイ溶液のプレミックス1ミリリットル。細胞から培地を取り除き、予混合溶液を110μL+ウェルごとにメディアを追加するには、マルチチャンネルピペットを使用しています。 </li><li>未治療の状態でよくから吸光度がアッセイの直線範囲になるまで、1〜4時間毎に1時間間隔490 nmで吸光度を測定します。唯一の解決策+バックグラウンドの吸光度の読み取りのためにメディアを持つ4つのコントロールウェルを含む。 </li><li>条件ごとに4つの複製ウェルの平均吸光度値を、それぞれの平均から平均バックグラウンドの吸光度を差し引きます。 ％の細胞生存率を決定するために、未処理の状態の補正後平均的に各処理条件の補正平均値を正規化します。 </li></ol></li></ol>NTAとプラスミドパーティクル単位の計算とサイジング_title &quot;&gt; 4。ナノ<ol><li>約5分の1、最大速度と最大速度の約10分の1で後方サンプルポンプで前方希釈剤ポンプを実行することにより、NanosightのNS500の総理流体システム。流体工学システムは希釈液でフラッシュされるまで継続する。 </li><li>分析するためにナノ粒子を準備します。 PBAEsの場合、別々のエッペンドルフチュー​​ブ中の酢酸ナトリウム緩衝液（25mM、pHは5）に株式プラスミドDNA（1 mg / ml）と株式PBAE（100 mg / ml）を希釈してください。 </li><li> 0.06 mg / mlにプラスミドDNA濃度を希釈します。ポリマー濃度は、DNA（例えば、60重量/重量粒子に対しては、ポリマーは3.6 mg / mlに希釈される）へのポリマーの所要重量対重量比に応じて変えることができる。 </li><li>プラスミドDNA溶液を等量にポリマー溶液を加えて激しく混ぜる。自己組織化を可能にするために10分間、室温で混合物をインキュベートする。 </li><li>ディリュートナノ粒子濃度のために、100倍にPBSにナノ粒子溶液は、国税庁の適切な範囲にあることが、少なくとも500μlの最終容量を取得する。 </li><li>サンプルエッペンドルフチューブ（ 図4A）にロードチューブを配置することによってNanosightにサンプルをロードします。気泡を導入しないことを確認してください。 </li><li>粒子が見られるまで、キャプチャモードでは、カメラのレベルを上げる。粒子（ 図4Aおよび4B）滑らかに見えるようにピントを合わせてください。 </li><li>標準モードでは、すべての粒子が画面上に示されている点を過ぎて、カメラのレベルを調整します。その後、粒子はすべてまだ観察することができるような最低レベルにカメラのレベルを減少させる。中間のカメラのレベルが必要な場合は、高度なモードにし、適切なレベルにカメラのシャッターとゲインを変更します。 </li><li>視覚的に20の間にあるかどうかを確認してください - S上の100個の粒子をcreen。ナノ粒子の追跡のための理想的な数は、約50個の粒子である。多すぎたり少なすぎたりがある場合は、NS500をフラ​​ッシュPBSに希釈を調整したり、サンプルを再ロードします。 </li><li>標準モードの表に従ってキャプチャ時間を調整します。一般的に30から60秒は、適切なキャプチャ長（ 図4B）です。 </li><li>次のサンプルをロードするには、再ロード新しいサンプルその後、システムをフラッシュします。 </li><li>かつてビデオがキャプチャされ、ビデオファイルを開くことによって、処理の段階に進みます。 </li><li>最高の（ 図4C）ビデオを処理するために調整することができるパラメータの数があります。目標は最高のようにそれぞれの粒子（ 図5）上の画面に赤い十字マークで示され、画面上の各粒子を捕捉するパラメータを選択することです。 </li><li>より良い粒子を表示するには、画面のゲインを上げます。標準または高度モードでは、オートにClickInすることにより、パラメータを調整する]を選択グラム適切なボックス。自動設定が適切に、unclickボックスを粒子を選択し、手動でパラメータを指定します（ 図4C）を設定しない場合であって、 </li><li>一度、すべての粒子が画面上に拾われ、ビデオファイルを処理するためのソフトウェア（ 図4C）のプロセス]ボタンをクリックします。これは、粒度分布、大きさの平均値だけでなく、粒子濃度を提供しています。 </li><li>粒子濃度が正確であることを確実にするためには、2倍に希釈を増やすことにより、PBS希釈などを変更し、上記の手順を繰り返します。同じサンプルの複数の希釈液の測定は、試料の濃度測定が正確であることを確認することをお勧めします。測定のための適切な範囲は10 7〜10 9個/ mlである。 </li><li>すべてのプラスミドは、ナノ粒子のゲル電気泳動を実行し、任意の遊離DNAが存在するかどうかを評価することにより、ナノ粒子に組み込まれていることを確認します。すべてではないプラスミドがカプセル化されている場合は、合計カプセル化プラスミドを定量化するために、DNAの吸光度を測定するための標準的な技術を使用しています。 </li><li>粒子当たりのプラスミドの平均数を計算するには、国税庁測定粒子濃度によってカプセル化された合計プラスミド濃度を分割します。プラスミドパーティクル単位のサンプルの分布を推定するためには、まず粒子の各1 nmのビンの体積分率を計算するために国税庁の粒度のヒストグラムを使用しています。各ビンにプラスミドの数を取得するために全プラスミド量によって、この体積分率分布を掛けます。各粒度のためのプラスミド当たりの粒子（ 図6）の数を取得するには、各ビン内の粒子の数でこれらの番号を割ります。 </li></ol>

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	<li>Putnam, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polymers+for+gene+delivery+across+length+scales.">Polymers for gene delivery across length scales.</a> Nature Materials. 5, 439-451 (2006).</li><li>Sheyn, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetically+modified+cells+in+regenerative+medicine+and+tissue+engineering.">Genetically modified cells in regenerative medicine and tissue engineering.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 62, 683-698 (2010).</li><li>Boussif, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+versatile+vector+for+gene+and+oligonucleotide+transfer+into+cells+in+culture+and+in+vivo:+polyethylenimine.">A versatile vector for gene and oligonucleotide transfer into cells in culture and in vivo: polyethylenimine.</a> Proc. 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J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+assay+for+quantifying+the+number+of+plasmids+encapsulated+by+polymer+nanoparticles.">A novel assay for quantifying the number of plasmids encapsulated by polymer nanoparticles.</a> Small. 8, 367-373 (2012).</li><li>Yu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+induced+pluripotent+stem+cells+free+of+vector+and+transgene+sequences.">Human induced pluripotent stem cells free of vector and transgene sequences.</a> Science. 324, 797-801 (2009).</li><li>Ho, Y. P., Chen, H. H., Leong, K. W., Wang, T. 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著者らは、利害の対立が報告されていない。

プロトコルは、上記のナノ粒子製剤のトランスフェクション効率だけでなく、ナノ粒子の粒径およびDNAロードを特徴付けるための方法を評価する方法について説明します。粒子あたりのプラスミド数は、粒子の有効性を予測するのを助けることができる重要なパラメータであり、また、線量測定のために使用することができます。ナノ粒子トラッキング解析は、塩濃度の異なるものなど、さ?...

ナノ粒子あたりの複合体化プラスミドの数の決定は、特に同じ細胞標的に多数のプラスミドの共同配信のための効果的なナノ粒子ベースの遺伝子送達戦略を設計することが重要である、などがしばしば研究12を再プログラム幹細胞が必要である。単一ナノ粒子に関連付けられたプラスミドの数を計算するためのいくつかのアプローチについて説明し、それぞれのアプローチは、推定13から16に用いられる技術の欠点を持っているされています。 TEMと組み合わせ量子ドット（QD）標識は、キトサンをベースとしたナノ粒子の粒子あたりのプラスミドを推定するために使用されています。カプセル化された非標識のDNAを直接検出されていない可能性;、この量子ドット技術を用いた推定が原因で、その自己アセンブリのプロパティを変更することができるDNAを標識する必要に複雑になる可能性のある粒子の2次元TEM像でプラスミドおよび量子ドットの重複、および他の単純な仮定13。ある代替的アプローチpplicable命じたマイクロドメインは、粒子内に存在する場合は低温透過型電子顕微鏡（クライオTEM）、X線散乱、動的光散乱（DLS）14,15を介して、リポ-DNA複合体を研究するために使用されています。残念ながら、そのようなここで検討高分子ナノ粒子などの材料は、このメソッドを使用して適用されません。別の研究では、Collins らが勉強するために、フロー式粒子像分析技術（Lys）の16含有ペプチド/ DNA複合体を用いているが、それらの方法は、大きく、ミクロンサイズの粒子16を評価することができます。したがって、我々は最近、ナノ粒子あたり11プラスミドの数を定量化するための斬新かつ柔軟なアッセイを開発した。

<table border="1"><tbody><tr><td></td><td></td><td></td><td> 試薬 </td></tr><tr><td>リン酸塩は、1x（PBS）を緩衝生理食塩水</td><td>インビトロジェン</td><td> 10010 </td><td></td></tr><tr><td> EGM-2MV BulletKit </td><td>ロンザ</td><td> CC-3202 </td><td></td></tr><tr><td>トリプシン</td><td>インビトロジェン</td><td> 25300 </td><td></td></tr><tr><td>酢酸ナトリウム緩衝液</td><td>シグマアルドリッチ</td><td> S7899 </td><td>脱イオン水中で25mmまで薄める</td></tr><tr><td>ジメチルスルホキシド</td><td>シグマアルドリッチ</td><td> 276855 </td><td></td></tr><tr><td> pEGFPをDNA </td><td>エリムバイオ医薬品</td><td> NA </td><td></td></tr><tr><td> DsRedのDNA </td><td> Addgene </td><td> 21718 </td><td></td></tr><tr><td> PEIは、分岐した</td><td>シグマアルドリッチ</td><td> 408727 </td> &lt;TD&gt; </td></tr><tr><td> CellTiter 96水性一</td><td>プロメガ</td><td> G3580 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> 材料 </td></tr><tr><td>明確な平底96ウェルプレート、滅菌</td><td>ザルスタット</td><td> 82.1581.001 </td><td></td></tr><tr><td>明確な丸底96ウェルプレート、滅菌</td><td>ザルスタット</td><td> 82.1582.001 </td><td></td></tr><tr><td> 12チャンネルのフィンピペット</td><td>サーモサイエンティフィック</td><td> NA </td><td> 5から50と50から300μlを</td></tr><tr><td>蛍光顕微鏡</td><td>ツァイス</td><td> NA </td><td>モデル番号：AX10 </td></tr><tr><td> C6 Accuriフローサイトメーター</td><td> BD Biosciences社</td><td> NA </td><td></td></tr><tr><td> HyperCytアタッチメント</td><td> Intellicyt </td><td> NA </td><td></td></tr><tr><td> NS500</td><td> Nanosight </td><td> NA </td><td></td></tr></tbody></table>

evaluation of polymeric gene delivery nanoparticles by nanoparticle tracking analysis and high-throughput flow cytometry

高分子ナノ粒子を用いた非ウイルス遺伝子送達は、遺伝性疾患1、再生医療2技術としての治療に遺伝子治療のための魅力的なアプローチとして浮上している。重大な安全上の問題を抱えているウイルスとは異なり、高分子ナノ粒子を化学的、多目的な大きな核酸貨物を運ぶことができるし、生分解性および/または環境対応、合成するために、非毒性、非免疫原性、非変異原性、より簡単になるように設計することができます。カチオン性ポリマーは、一般に高分子ナノ粒子と呼ばれる100nmのオーダーで複合体を形成するために、静電相互作用を介して、負に荷電したDNAを用いて自己組織化する。ナノスケールポリカチオン性遺伝子送達ナノ粒子を形成するために用いられる生体材料の例としては、ポリリジン、polyphosphoesters、ポリ（アミドアミン）sと一般的に核酸送達1,3に使用される非分解既製のカチオン性ポリマーであるポリエチレンイミン（PEI）を含む。ポリ（β-アミノエステル）（PBAEs）は、5,6加水分解性であり、そのような人間の網膜血管内皮細胞（HRECs）7などのハードへのトランスフェクション細胞型への遺伝子送達に有効であることが示されているカチオン性ポリマー4の新しいクラスであるマウス乳腺上皮細胞8、人間の脳のがん細胞9および10の大血管障害（ヒト臍帯静脈、HUVECを）内皮細胞。 ナノ粒子トラッキング解析（NTA）を利用した高分子ナノ粒子を特徴付けるための新しいプロトコルが記載されている。このアプローチでは、粒度分布と粒子あたりのプラスミドの数の分布の両方が11を得られる。さらに、ポリマーナノ粒子のトランスフェクション効率の迅速なスクリーニングのためのハイスループットの96ウェルプレートのトランスフェクションアッセイが提示される。このプロトコルでは、ポリ（β-アミノエステル）（PBAEs）をモデルポリマーおよびヒト網膜内皮細胞（HRECs）として使用されているMOとして使用されているデルヒト細胞。このプロトコルは、簡単に任意の高分子ナノ粒子およびマルチウェルプレートフォーマットの関心の任意の細胞型を評価するために適合させることができます。

図1は 、EGFPプラスミドとHRECsの成功したトランスフェクションの例の蛍光顕微鏡像を示す。明視野像は、細胞が通常の形態を維持することを保証するために役立ちます。さらに、このようなMTSまたは類似のアッセイとして細胞生存率アッセイは、ナノ粒子の毒性7を評価するために使用することができます。フローサイトメトリーは、説明したように、トランスフェクシ?...

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Evaluation of Polymeric Gene Delivery Nanoparticles by Nanoparticle Tracking Analysis and High-throughput Flow Cytometry

ナノ粒子トラッキング解析（NTA）とポリマー遺伝子送達ナノ粒子を評価するためのハイスループットフローサイトメトリーのためのプロトコルが記載されている。国税庁は、ナノ粒子の粒度分布およびプラスミド当たり粒子分布を特徴付けるために利用される。ハイスループットフローサイトメトリーは、遺伝子送達バイオマテリアルのライブラリの定量的なトランスフェクション効率の評価を可能にします。

ナノ粒子トラッキング分析とハイスループットフローサイトメトリーによる高分子遺伝子デリバリーナノ粒子の評価

Non-viral gene delivery using polymeric nanoparticles has emerged as an attractive approach for gene therapy to treat genetic diseases1 and as a ...

evaluation-polymeric-gene-delivery-nanoparticles-nanoparticle

Research

JoVE Journal

Bioengineering

15.7K ビュー.  Johns Hopkins University School of Medicine. ナノ粒子トラッキング解析（NTA）とポリマー遺伝子送達ナノ粒子を評価するためのハイスループットフローサイトメトリーのためのプロトコルが記載されている。国税庁は、ナノ粒子の粒度分布およびプラスミド当たり粒子分布を特徴付けるために利用される。ハイスループットフローサイトメトリーは、遺伝子送達バイオマテリアルのライブラリの定?...

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Formulation of Diblock Polymeric Nanoparticles through Nanoprecipitation Technique

Nanotechnology is a relatively new branch of science that involves harnessing the unique properties of particles that are nanometers in scale (nanoparticles). Nanoparticles can be engineered in a precise fashion where their size, composition and surface chemistry can be carefully controlled. This enables unprecedented freedom to modify some of the fundamental properties of their cargo, such as solubility, diffusivity, biodistribution, release characteristics and immunogenicity. Since their inception, nanoparticles have been utilized in many areas of science and medicine, including drug delivery, imaging, and cell biology1-4. However, it has not been fully utilized outside of "nanotechnology laboratories" due to perceived technical barrier. In this article, we describe a simple method to synthesize a polymer based nanoparticle platform that has a wide range of potential applications. 
The first step is to synthesize a diblock co-polymer that has both a hydrophobic domain and hydrophilic domain. Using PLGA and PEG as model polymers, we described a conjugation reaction using EDC/NHS chemistry5 (Fig 1). We also discuss the polymer purification process. The synthesized diblock co-polymer can self-assemble into nanoparticles in the nanoprecipitation process through hydrophobic-hydrophilic interactions.
The described polymer nanoparticle is very versatile. The hydrophobic core of the nanoparticle can be utilized to carry poorly soluble drugs for drug delivery experiments6. Furthermore, the nanoparticles can overcome the problem of toxic solvents for poorly soluble molecular biology reagents, such as wortmannin, which requires a solvent like DMSO. However, DMSO can be toxic to cells and interfere with the experiment. These poorly soluble drugs and reagents can be effectively delivered using polymer nanoparticles with minimal toxicity. Polymer nanoparticles can also be loaded with fluorescent dye and utilized for intracellular trafficking studies. Lastly, these polymer nanoparticles can be conjugated to targeting ligands through surface PEG. Such targeted nanoparticles can be utilized to label specific epitopes on or in cells7-10.

This article describes a nanoprecipitation method to synthesize polymer-based nanoparticles using diblock co-polymers. We will discuss the synthesis of diblock co-polymers, the nanoprecipitation technique, and potential applications.

ナノ析出法を通じて、ジブロック高分子ナノ粒子の製剤

Nanotechnology is a relatively new branch of science that involves harnessing the unique properties of particles that are nanometers in scale ...

生物工学

Polymer Microarrays for High Throughput Discovery of Biomaterials

The discovery of novel biomaterials that are optimized for a specific biological application is readily achieved using polymer microarrays, which allows a combinatorial library of materials to be screened in a parallel, high throughput format1. Herein is described the formation and characterization of a polymer microarray using an on-chip photopolymerization technique 2. This involves mixing monomers at varied ratios to produce a library of monomer solutions, transferring the solution to a glass slide format using a robotic printing device and curing with UV irradiation. This format is readily amenable to many biological assays, including stem cell attachment and proliferation, cell sorting and low bacterial adhesion, allowing the ready identification of 'hit' materials that fulfill a specific biological criterion3-5. Furthermore, the use of high throughput surface characterization (HTSC) allows the biological performance to be correlated with physio-chemical properties, hence elucidating the biological-material interaction6. HTSC makes use of water contact angle (WCA) measurements, atomic force microscopy (AFM), X-ray photoelectron spectroscopy (XPS) and time-of-flight secondary ion mass spectrometry (ToF-SIMS). In particular, ToF-SIMS provides a chemically rich analysis of the sample that can be used to correlate the cell response with a molecular moiety. In some cases, the biological performance can be predicted from the ToF-SIMS spectra, demonstrating the chemical dependence of a biological-material interaction, and informing the development of hit materials5,3.

A description of the formation of a polymer microarray using an on-chip photopolymerization technique. The high throughput surface characterization using atomic force microscopy, water contact angle measurements, X-ray photoelectron spectroscopy and time of flight secondary ion mass spectrometry and a cell attachment assay is also described.

バイオマテリアルのハイスループット検出用高分子マイクロアレイ

The discovery of novel biomaterials that are optimized for a specific biological application is readily achieved using polymer microarrays, which allows a ...

Combinatorial Synthesis of and High-throughput Protein Release from Polymer Film and Nanoparticle Libraries

Polyanhydrides are a class of biomaterials with excellent biocompatibility and drug delivery capabilities. While they have been studied extensively with conventional one-sample-at-a-time synthesis techniques, a more recent high-throughput approach has been developed enabling the synthesis and testing of large libraries of polyanhydrides1. This will facilitate more efficient optimization and design process of these biomaterials for drug and vaccine delivery applications. The method in this work describes the combinatorial synthesis of biodegradable polyanhydride film and nanoparticle libraries and the high-throughput detection of protein release from these libraries. In this robotically operated method (Figure 1), linear actuators and syringe pumps are controlled by LabVIEW, which enables a hands-free automated protocol, eliminating user error. Furthermore, this method enables the rapid fabrication of micro-scale polymer libraries, reducing the batch size while resulting in the creation of multivariant polymer systems. This combinatorial approach to polymer synthesis facilitates the synthesis of up to 15 different polymers in an equivalent amount of time it would take to synthesize one polymer conventionally. In addition, the combinatorial polymer library can be fabricated into blank or protein-loaded geometries including films or nanoparticles upon dissolution of the polymer library in a solvent and precipitation into a non-solvent (for nanoparticles) or by vacuum drying (for films). Upon loading a fluorochrome-conjugated protein into the polymer libraries, protein release kinetics can be assessed at high-throughput using a fluorescence-based detection method (Figures 2 and 3) as described previously1. This combinatorial platform has been validated with conventional methods2 and the polyanhydride film and nanoparticle libraries have been characterized with 1H NMR and FTIR. The libraries have been screened for protein release kinetics, stability and antigenicity; in vitro cellular toxicity, cytokine production, surface marker expression, adhesion, proliferation and differentiation; and in vivo biodistribution and mucoadhesion1-11. The combinatorial method developed herein enables high-throughput polymer synthesis and fabrication of protein-loaded nanoparticle and film libraries, which can, in turn, be screened in vitro and in vivo for optimization of biomaterial performance.

This method describes the combinatorial synthesis of biodegradable polyanhydride film and nanoparticle libraries and the high-throughput detection of protein release from these libraries.

組合せの合成と高分子膜とナノ粒子のライブラリからのハイスループットタンパクリリース

Polyanhydrides are a class of biomaterials with excellent biocompatibility and drug delivery capabilities. While they have been studied extensively with ...

Analyzing Cellular Internalization of Nanoparticles and Bacteria by Multi-spectral Imaging Flow Cytometry

Nanoparticulate systems have emerged as valuable tools in vaccine delivery through their ability to efficiently deliver cargo, including proteins, to antigen presenting cells1-5. Internalization of nanoparticles (NP) by antigen presenting cells is a critical step in generating an effective immune response to the encapsulated antigen. To determine how changes in nanoparticle formulation impact function, we sought to develop a high throughput, quantitative experimental protocol that was compatible with detecting internalized nanoparticles as well as bacteria. To date, two independent techniques, microscopy and flow cytometry, have been the methods used to study the phagocytosis of nanoparticles. The high throughput nature of flow cytometry generates robust statistical data. However, due to low resolution, it fails to accurately quantify internalized versus cell bound nanoparticles. Microscopy generates images with high spatial resolution; however, it is time consuming and involves small sample sizes6-8. Multi-spectral imaging flow cytometry (MIFC) is a new technology that incorporates aspects of both microscopy and flow cytometry that performs multi-color spectral fluorescence and bright field imaging simultaneously through a laminar core. This capability provides an accurate analysis of fluorescent signal intensities and spatial relationships between different structures and cellular features at high speed.
	Herein, we describe a method utilizing MIFC to characterize the cell populations that have internalized polyanhydride nanoparticles or Salmonella enterica serovar Typhimurium. We also describe the preparation of nanoparticle suspensions, cell labeling, acquisition on an ImageStreamX system and analysis of the data using the IDEAS application. We also demonstrate the application of a technique that can be used to differentiate the internalization pathways for nanoparticles and bacteria by using cytochalasin-D as an inhibitor of actin-mediated phagocytosis.

In this article, we describe a method utilizing multi-spectral imaging flow cytometry to quantify the internalization of polyanhydride nanoparticles or bacteria by RAW 264.7 cells.

マルチスペクトルイメージングフローサイトメトリーによるナノ粒子と細菌の細胞内在化を分析する

Nanoparticulate  systems have emerged as valuable tools in vaccine delivery through their  ability to efficiently deliver cargo, including proteins, to ...

High-throughput Synthesis of Carbohydrates and Functionalization of Polyanhydride Nanoparticles

Transdisciplinary approaches involving areas such as material design, nanotechnology, chemistry, and immunology have to be utilized to rationally design efficacious vaccines carriers. Nanoparticle-based platforms can prolong the persistence of vaccine antigens, which could improve vaccine immunogenicity1. Several biodegradable polymers have been studied as vaccine delivery vehicles1; in particular, polyanhydride particles have demonstrated the ability to provide sustained release of stable protein antigens and to activate antigen presenting cells and modulate immune responses2-12.
The molecular design of these vaccine carriers needs to integrate the rational selection of polymer properties as well as the incorporation of appropriate targeting agents. High throughput automated fabrication of targeting ligands and functionalized particles is a powerful tool that will enhance the ability to study a wide range of properties and will lead to the design of reproducible vaccine delivery devices.
The addition of targeting ligands capable of being recognized by specific receptors on immune cells has been shown to modulate and tailor immune responses10,11,13 C-type lectin receptors (CLRs) are pattern recognition receptors (PRRs) that recognize carbohydrates present on the surface of pathogens. The stimulation of immune cells via CLRs allows for enhanced internalization of antigen and subsequent presentation for further T cell activation14,15. Therefore, carbohydrate molecules play an important role in the study of immune responses; however, the use of these biomolecules often suffers from the lack of availability of structurally well-defined and pure carbohydrates. An automation platform based on iterative solution-phase reactions can enable rapid and controlled synthesis of these synthetically challenging molecules using significantly lower building block quantities than traditional solid-phase methods16,17.
Herein we report a protocol for the automated solution-phase synthesis of oligosaccharides such as mannose-based targeting ligands with fluorous solid-phase extraction for intermediate purification. After development of automated methods to make the carbohydrate-based targeting agent, we describe methods for their attachment on the surface of polyanhydride nanoparticles employing an automated robotic set up operated by LabVIEW as previously described10. Surface functionalization with carbohydrates has shown efficacy in targeting CLRs10,11 and increasing the throughput of the fabrication method to unearth the complexities associated with a multi-parametric system will be of great value (Figure 1a).

In this article, a high throughput method is presented for the synthesis of oligosaccharides and their attachment to the surface of polyanhydride nanoparticles for further use in targeting specific receptors on antigen presenting cells.

無水物ナノ粒子のハイスループット糖鎖の合成と機能化

Transdisciplinary approaches involving areas such as material design, nanotechnology, chemistry, and immunology have to be utilized to rationally design ...

Polymeric Microneedle Array Fabrication by Photolithography

This manuscript describes the fabrication of polymeric microneedle (MN) arrays by photolithography. It involves a simple mold-free process by using a photomask consisting of embedded micro-lenses. Embedded micro-lenses were found to influence MN geometry (sharpness). Robust MN arrays with tip diameters ranging between 41.5 &#181;m &#177; 8.4 &#181;m and 71.6 &#181;m &#177; 13.7 &#181;m, with two different lengths (1,336 &#181;m &#177; 193 &#181;m and 957 &#181;m &#177; 171 &#181;m) were fabricated. These MN arrays may provide potential applications in delivery of low molecular and macromolecular therapeutic agents through skin.

Here, we present a protocol describing a mold-free fabrication process of the polymeric microneedles by photolithography.

フォトリソグラフィ法により高分子マイクロニードルアレイの作製

This manuscript describes the fabrication of polymeric microneedle (MN) arrays by photolithography. It involves a simple mold-free process by using a ...

Manufacture and Drug Delivery Applications of Silk Nanoparticles

Silk is a promising biopolymer for biomedical and pharmaceutical applications due to its outstanding mechanical properties, biocompatibility and biodegradability, as well its ability to protect and subsequently release its payload in response to a trigger. While silk can be formulated into various material formats, silk nanoparticles are emerging as promising drug delivery systems. Therefore, this article covers the procedures for reverse engineering silk cocoons to yield a regenerated silk solution that can be used to generate stable silk nanoparticles. These nanoparticles are subsequently characterized, drug loaded and explored as a potential anticancer drug delivery system. Briefly, silk cocoons are reverse engineered first by degumming the cocoons, followed by silk dissolution and clean up, to yield an aqueous silk solution. Next, the regenerated silk solution is subjected to nanoprecipitation to yield silk nanoparticles &#8211; a simple but powerful method that generates uniform nanoparticles. The silk nanoparticles are characterized according to their size, zeta potential, morphology and stability in aqueous media, as well as their ability to entrap a chemotherapeutic payload and kill human breast cancer cells. Overall, the described methodology yields uniform silk nanoparticles that can be readily explored for a myriad of applications, including their use as a potential nanomedicine.

Nanoparticles are emerging as promising drug delivery systems for a broad range of indications. Here, we describe a simple yet powerful method to manufacture silk nanoparticles using reverse engineered Bombyx mori silk. These silk nanoparticles can be readily loaded with a therapeutic payload and subsequently explored for drug delivery applications.

シルクナノ粒子の製造および薬物送達アプリケーション

Silk is a promising biopolymer for biomedical and pharmaceutical applications due to its outstanding mechanical properties, biocompatibility and ...

Isolation of Primary Murine Retinal Ganglion Cells (RGCs) by Flow Cytometry

Neurodegenerative diseases often have a devastating impact on those affected. Retinal ganglion cell (RGC) loss is implicated in an array of diseases, including diabetic retinopathy and glaucoma, in addition to normal aging. Despite their importance, RGCs have been extremely difficult to study until now due in part to the fact that they comprise only a small percentage of the wide variety of cells in the retina. In addition, current isolation methods use intracellular markers to identify RGCs, which produce non-viable cells. These techniques also involve lengthy isolation protocols, so there is a lack of practical, standardized, and dependable methods to obtain and isolate RGCs. This work describes an efficient, comprehensive, and reliable method to isolate primary RGCs from mice retinae using a protocol based on both positive and negative selection criteria. The presented methods allow for the future study of RGCs, with the goal of better understanding the major decline in visual acuity that results from the loss of functional RGCs in neurodegenerative diseases.

Isolation of Primary Murine Retinal Ganglion Cells RGCs by Flow Cytometry

Millions of people suffer from retinal degenerative diseases that result in irreversible blindness. A common element of many of these diseases is the loss of retinal ganglion cells (RGCs). This detailed protocol describes the isolation of primary murine RGCs by positive and negative selection with flow cytometry.

フローサイトメトリーによる一次マウス網膜神経節細胞（RGCs）の単離

Neurodegenerative diseases often have a devastating impact on those affected. Retinal ganglion cell (RGC) loss is implicated in an array of diseases, ...

Use of High-Throughput Automated Microbioreactor System for Production of Model IgG1 in CHO Cells

Automated microscale bioreactors (15 mL) can be a useful tool for cell culture engineers. They facilitate the simultaneous execution of a wide variety of experimental conditions while minimizing potential process variability. Applications of this approach include: clone screening, temperature and pH shifts,&#160;media and supplement optimization. Furthermore, the small reactor volumes are conducive to large Design of Experiments that investigate a wide range of conditions. This allows upstream processes to be significantly optimized before scale-up where experimentation is more limited in scope due to time and economic constraints. Automated microscale bioreactor systems offer various advantages over traditional small scale cell culture units, such as shake flasks or spinner flasks. However, during pilot scale process development&#160;significant care must be taken to ensure that these advantages are realized. When run with care, the system can enable high level automation, can be programmed to run DOE&#39;s with a higher number of variables&#160;and can reduce sampling time when integrated with a nutrient analyzer or cell counter. Integration of the expert-derived heuristics presented here, with current automated microscale bioreactor experiments can minimize common pitfalls that hinder meaningful results. In the extreme, failure to adhere to the principles laid out here can lead to equipment damage that requires expensive repairs. Furthermore, the microbioreactor systems have small culture volumes&#160;making characterization of cell culture conditions difficult. The number and amount of samples taken in-process in batch mode culture is limited as operating volumes cannot fall below 10 mL. This method will discuss the benefits and drawbacks of microscale bioreactor systems.

A detailed protocol for the concurrent operation of 48 parallel cell cultures under varied conditions in a microbioreactor system is presented. Cell culture process, harvest and subsequent antibody titer analysis are described.

高スループットの自動モデル IgG1 CHO 細胞での生産のための Microbioreactor システム

Automated microscale bioreactors (15 mL) can be a useful tool for cell culture engineers. They facilitate the simultaneous execution of a wide variety of ...

Flash NanoPrecipitation for the Encapsulation of Hydrophobic and Hydrophilic Compounds in Polymeric Nanoparticles

The formulation of a therapeutic compound into nanoparticles (NPs) can impart unique properties. For poorly water-soluble drugs, NP formulations can improve bioavailability and modify drug distribution within the body. For hydrophilic drugs like peptides or proteins, encapsulation within NPs can also provide protection from natural clearance mechanisms. There are few techniques for the production of polymeric NPs that are scalable. Flash NanoPrecipitation (FNP) is a process that uses engineered mixing geometries to produce NPs with narrow size distributions and tunable sizes between 30 and 400 nm. This protocol provides instructions on the laboratory-scale production of core-shell polymeric nanoparticles of a target size using FNP. The protocol can be implemented to encapsulate either hydrophilic or hydrophobic compounds with only minor modifications. The technique can be readily employed in the laboratory at milligram scale to screen formulations. Lead hits can directly be scaled up to gram- and kilogram-scale. As a continuous process, scale-up involves longer mixing process run time rather than translation to new process vessels. NPs produced by FNP are highly loaded with therapeutic, feature a dense stabilizing polymer brush, and have a size reproducibility of &#177; 6%.

Flash NanoPrecipitation (FNP) is a scalable approach to produce polymeric core-shell nanoparticles. Lab-scale formulations for the encapsulation of hydrophobic or hydrophilic therapeutics are described.

高分子ナノ粒子の疎水性および親水性化合物のカプセル化のため NanoPrecipitation をフラッシュします。

The formulation of a therapeutic compound into nanoparticles (NPs) can impart unique properties. For poorly water-soluble drugs, NP formulations can ...