この方法は、細胞ラインの特性評価および仲介およびプロセス最適化の側面に関するバイオプロセス製造の分野における重要な質問のいくつかに答える助けとなる。この技術の利点は、揺れフラスコの制御を強化し、迅速なデータ生成のための多数の小規模研究の自動化とパフォーマンスを可能にすることです。この手順を実証する,サイ・ラシュミカ・ヴェリューグラとケイシー・コーンホルスト,私の研究室の研究員。
37°Cの水浴で凍結培地のミリリットル当たり3倍の10倍の在庫vileを浸すことから始めます。氷の小さな断片だけが残っているとき、急速に解凍した細胞懸濁液を数回穏やかにピペットし、29ミリリットルのOptiCHO培地を含む無菌125ミリリットルのベントシェイクフラスコに1ミリリットルの細胞を移す。フラスコを細胞培養インキュベーターに摂氏37度、8%CO2に入れ、130RPMで振ります。
125ミリリットルのスピナーフラスコで新鮮な37度の培地の100ミリリットルで72ミリリットル後に細胞を下塗りし、摂氏37度でさらに72時間、70 RPMで攪拌して8%CO2を培養する。サブカルチャーの3日目に、新鮮な事前温め培地をスピナーフラスコに加えて、細胞を少なくとも90%の生存率で維持し、最後の24時間培養を行う。翌朝、リモートデスクトップアイコンをクリックし、[接続]をクリックします。
リモートデスクトップが接続されたら、セルカウンタソフトウェアを開き、新しい試薬Pakをインストールします。その後、トリパンブルー廃棄物を空にし、システムをプライミングします。次に、リモート接続を最小限に抑え、既存の実験をテンプレートとして使用してマイクロバイオリアクターソフトウェアを開き、新しい実験を作成します。
実行を開始する前に、ソフトウェアの模倣セクションで実行中に使用されるプレートを定義し、各培養ステーションに12の無菌培養容器を配置します。容器の上にオートクレーブクランププレートを置き、各ピンがしっかりと挿入されていることを確認するためにクランププレートの上に攪拌プレートを置きます。次に、クランププレートをネジとノブで固定します。
システムを起動するには、各培養容器に備えたバーコードをスキャンします。システムは、適切な容器の存在を初期化し、チェックします。温度制御を摂氏37度に設定し、撹拌を1,000RPMに設定し、溶存酸素PHモニタをオンにします。
次に、中程度の充電プログラムを実行します。すべての培地がロードされると、35マイクロリットルのEX-CELL消泡体が消泡プレートから培養容器に添加されます。30分後に、培養培地内で溶存酸素とPHを記録し始め、溶存酸素が50%の設定点に達することを可能にし、すべての培養容器に対して7.1のPHセットポイントを達成するために背景ベースの添加をオンにする。
翌朝、一時停止したPHステップを実行し、スピナーフラスコの内容物全体を無菌250ミリリットルの円錐管に移して遠心分離します。培養容器に接種液を加えた後、最終密度がミリリットル当たり6番目のCHO細胞に10倍となるほど新鮮な培地でペレットを再懸濁し、浮遊細胞を滅菌蓋付き24ウェルプレートの適切なウェルに加える。各井戸に3ミリリットルの接種を加え、フード内の指定された机の上に接種プレートを置きます。
次に、培養容器を少なくとも1時間平衡化させ、プログラム内の5つのEX-CELLカウントステップを開始します。2日目の毎日の栄養素と代謝産物の分析のために、サンプルチューブホルダープレートを指定されたデッキに置き、開いたマイクロ遠心チューブを適切なホルダーにロードします。次いで、検体を分析トレイに入れ、栄養分析を行う。
ランを終了するには、まず温度制御をオフにし、その後に攪拌を行います。溶存酸素PHコントロールとバックグラウンドベースの追加、その他すべてのコントロール、およびシステムモニタを停止します。クランプを緩めてプレートをかき混ぜ、培養容器を取り外し、乾燥プレートを培養ステーションにねじ込みます。
次に、プログラム上で2時間の乾燥サイクルを実行し、乾燥サイクルが終了したらバイオリアクターソフトウェアで停止をクリックします。細胞を収穫するために、細胞培養液を原子炉容器から遠心分離のための対応する円錐形の管に移し、無菌0.22マイクロメートルPVDHフィルターを介して上清をろ過する。次いで、各滅菌細胞培養上清の1ミリリットルを、価価分析までマイナス20°Cの貯蔵用の個々の1.5ミリリットルのマイクロ遠心分離管に移す。
サンプルのIgGの上昇を測定するには、まずタンパク質補助バイオセンサーシステムをオンにします。ランプが少なくとも1時間温まった後、サンプルを室温まで平衡化し、サンプルごとに1つのタンパク質補助チップを少なくとも30分間新鮮な細胞媒体にプレソースします。その後、プレート温度を摂氏26度に設定します。
サンプルをシステムにロードし、データ取得ソフトウェアで再生成されたデフォルトの高感度アッセイを使用してアッセイを実行します。統合細胞カウンターを使用して、平均生存細胞密度および生存率は、すべての培養条件について毎日得ることができる。栄養分析装置を用いて、マイクロバイオリアクターシステムにおけるこれらの属性のモニタリングの実現可能性を示す栄養素および副産物プロファイルを得ることもできます。
また、目的とする種々の培養条件下での細胞培養の総生産性は、実証したタンパク質補助バイオセンサシステムを用いて定量することができる。この手順を試みる際は、プログラミングが正しく行われた場合にのみプロトコルが機能し、最小限のエラーでプロトコルステップをタイムリーに実行することを忘れないでください。この手順に従って、液体クロマトグラフィー、質量分析、および多角光散乱は、製造された製品の物理的および化学的特性に関する追加の質問に答えるために実行することができます。
