著者らは、生細胞イメージングへの彼の導入のための技術支援とマイケルリーガーためBofanウーとキリスト教Raithelに感謝したいと思います。 NCI、NIH RO1CA112176（PAF）は、NCI、NIHによってサポートされています。 R01CA89041-10S1（PAF）、ドイAkademischer Austaush DienstのeVのA/09/72227のRef。 316（REN）、国防総省W81XWH-11-1から0074（REN）、教育科学技術省（R31-10069）によって資金を供給され、韓国の国立研究財団を通じてWCU（ワールドクラスの大学）プログラム（PAF ）、NIH IG20 RR025828-01（げっ歯類のバリア設備機器）、およびNIH NCI 5P30CA051008（顕微鏡およびイメージング·アニマル共有リソース）。

<html> 1。全体的なスキーム<ol><li>遺伝子組み換えの乳腺から前腫瘍性乳腺上皮細胞の初代培養を生成し、野生型マウスを制御します。 </li><li> 15分毎に最大5日間までVolocity画像取得ソフトウェア（バージョン5.3.1、エルマー、マサチューセッツ州ウォルサム）を使用して生細胞の画像をキャプチャします。 </li><li>タイミングと上皮細胞のコロニー形成のメカニズム、アポトーシスの発生率、および形態学的変化の位相を評価するために直接タイムラプス画像を見ることができます。 </li><li> MetaMorph顕微鏡オートメーション＆画像解析ソフトウェア（Molecular Devices社、LLCはサニーベール、カリフォルニア州）を用いて、JPGファイルは生成された。TIFFスタックがVolocityに変換して、デジタル画像ファイルを（リネーム2.1.6、リネーム<a href="http://www.softpedia.com/get/System/File-Management/THE-Rename.shtml" target="_blank">http://www.softpedia.com/get /システム/ファイル管理/-Rename.shtml</a> Timmさんのトラッキングツールソフトウェア（TTT、との互換性を有効にする）tz-muenchen.de/en/isf/hematopoiesis/software-download/index.html &quot;ターゲット=&quot; _blank &quot;&gt; http://www.helmholtz-muenchen.de/en/isf/hematopoiesis/software-download/index。 html）を。 </li><li> TTT使用して、細胞分裂（細胞寿命）や細胞分裂のパターン（対称対非対称）の間の時間を測定するための細胞の運命マップを生成する。 </li><li>異なる遺伝子改変マウスモデルおよび/または野生型コントロールとの間に統計的に有意な差があるかどうかを判断するには、手順3と上記5からの定量的なデータを分析します。 </li></ol> 2。プライマリ乳腺上皮細胞培養の世代<ol><li>メーカーの指示の変動（EpiCult-Bマウスミディアムキット、Stemcellテクノロジーズ、バンクーバー、BC）に続く単一乳腺上皮細胞の単離のための完全なメディアを準備します。 450ミリリットルエピカルト-B培地、50ミリリットルエピカルトB増殖サプリメント、5％ウシ胎児血清（FBS）、50μg/ mlのペニシリン/ストレプトマイシン（PenStrを組み合わせるEP）および10 ng / mlの上皮増殖因子（EGF）。 </li><li> 2.1から9部完全メディアで10xのコラゲナーゼ/ヒアルロニダーゼ混合物の1部を組み合わせることにより、解離メディアを準備します。 </li><li>マウスを安楽死させると直ちに剖検に進みます。場所は発泡スチロールの剖検プラットフォーム上でその背中の上にマウスと腹側皮膚がピンと張っているように、すべての四肢を固定します。ことは、70％エタノールで、手足を覆うなど、腹側皮膚と髪を飽和させる。皮膚を通して正中切開を行うことで、＃2月3日（胸部）と＃4/5（鼠径）乳腺を公開（腹膜を入力しません）各前肢の内側の皮膚を介してY字切開に拡張されていると各後部肢の内側の皮膚を介してY切開逆さま。 </li><li>鈍的切開を使用して、underlyingperitoneumから皮膚を分離し、それがピンと張ったようになるまで皮膚の両側に引き戻すと、ピンを使って発泡スチロールの剖検プラットフォームに固定します。外側から始めて、disseの賢明な使用で鈍的切開を使用ctionはさみは無傷鼠径部および/または下層の結合組織や筋肉から胸部乳腺を単離する。 10センチメートル滅菌ペトリ皿に2つ以下の乳腺を置き、組織培養フードに移動します。 </li><li>組織培養フードでは、黄色がかった色で小さく、十分に限局性結節として識別され胸リンパ節のための腺を調べます。滅菌メスや鉗子を用いて周囲の腺からのリンパ節を切除する。 2つの滅菌メス、それぞれの手で1つを使用して、約1mm 3の立方体に乳腺組織をミンチ。 </li><li>場所は静かに10ミリリットルピペットを用いて2〜3回上下にピペッティングすることによって5ミリリットル解離メディア、ミックスの中で乳腺組織を細切し、5％CO 2で37℃のインキュベーター内（最大〜16時間）で一晩インキュベート緩めキャップ付50mlコニカルチューブ。 </li><li>翌朝、赤BLを促進する塩化アンモニウム溶液をバッファ2％FBS及び4部を含む1部ハンクス平衡塩類溶液（HBSS）の冷混合物を調製するOOD細胞溶解（HFAmCl）だけでなく、2％のFBS（HF）を補充した冷HBSS。プリ暖かい修正ハンクス平衡塩溶液中でトリプシン-EDTA（0.25％）、5 mg / mlのディスパーゼ、1 mg / mlのDNase Iを、そして完全メディア。 </li><li>インキュベーターと優しくパルス渦2〜3秒から乳腺組織で2回コニカル遠心チューブを外します。 5分（室温または4℃）、450×gでチューブを遠心し、上清を捨てる。 </li><li> 5分（室温または4℃）、450×gで10ミリリットルのHFAmClと遠心分離機の最小でペレットを再懸濁し、上清を捨てる。 </li><li>ペレットに3ミリリットルトリプシン-EDTAを加え、5ミリリットルピペットを用いて第一混合し、次いで糸状（1-3分）までP1000マイクロピペッターで。 5分（室温または4℃）、450×gで10ミリリットル、HF、遠心分離機を追加し、上清を捨てる。 </li><li>ペレットと1分間P1000マイクロピペッターとミックスに5 mg / mlのディスパーゼ2ml及び1 mg / mlのDNase Iを200μlを加える。サンプルはCLOであるべきudyはなく、糸のような。糸のような場合、DNアーゼI100μlを追加して再度混ぜる。 </li><li> 5分（室温または4℃）で450×gで10 mlの冷HF、40μmのセルストレーナーや遠心分離機を通して歪みを追加し、上清を捨てる。 </li><li>完全培地中最終ペレットを再懸濁します。セルの総数（血球計算盤またはコールターカウンターを用いて）を定量化。二つの乳腺は、約1×10 6〜1×10 7個の細胞を得ることができます。ウェル当たり1.5×10 5細胞の密度で平底6穴プレートにプレート一次上皮細胞。 </li></ol> 3。ライブセルイメージング<ol><li>すぐに細胞を播種後、5％CO 2 /飽和humidity/37℃の温度インキュベーションチャンバー内に確実に顕微鏡ステージ上6ウェルプレートを配置します。ケーラー照明および中心位相リング用のコンデンサを調整します。ここで紹介する実験では、ディスク共焦点スピニング反転ニコンエクリプスTE300/PerkinElmer10倍の対物レンズと広視野位相コントラストモードでの顕微鏡システムを用いた。 </li><li>開いている画像取得ソフトウェアは、作成してタイムラプス画像用ライブラリに名前を付けて、大容量のファイルのための十分なスペースを使っている場所に保存します。実験では、ここで用いVolocity画像取得ソフトウェア（バージョン5.3.1、エルマー、マサチューセッツ州ウォルサム）を提出した。 </li><li>プレートは15​​分の最低顕微鏡インキュベーター中で平衡化させます。ステージレンズの干渉を避けるためにレンズを下げます。 &quot;ステージ&quot;の見出しの下に、 &quot;ステージのキャリブレーション&quot;を選択します。 、焦点面を再取得 &quot;ステージ&quot;の見出しの下に &quot;追加点&quot;を選択することにより、集合Z =ゼロのx、y、z]タブおよびマークイメージングポイントの下にある。位相コントラストイメージングなどのイメージングのための6ウェルプレートの各ウェルの中央に置きポイントはプラスチック井戸の周囲近傍乱れることがあります。 4×4フィールド（650ミクロン×700ミクロンフィールド）、小さな重なり（約5％）とそれぞれの正方形内の点を配置​​します。クワガタ &quot;の下に選択した点を保存のe。 &quot; </li><li> &quot;ステージ&quot;の下に選択して &quot;フォーカスマップを作ってください&quot;と、各点のフォーカスを設定する指示に従います。時間あたり4枚（15分毎に）キャプチャする画像取得タイミングを設定します。これは、特定の実験の要件に応じて調整することができます。 &quot;ステージ&quot;の下にフォーカスマップを保存します。 </li><li>右右サイドツールバーの &quot;画像取得&quot;をクリックして、画像の設定を保存します。イメージングを開始するには、録音ボタンを押します。 1時間後、任意の調整が必要であるかどうかを確認するために、画像のフォーカスを確認してください。 </li><li>監視し、細胞がコンフルエントになったときに終了し、5日間のライブイメージングを続ける。 </li></ol> 4。形態学的変化のタイミングと初期上皮細胞コロニー形成のメカニズム、アポトーシスの発生率、フェーザーを評価するためのタイムラプス画像を直接見る<ol><li>タイムラプス画像の直接観察は、互換性のある任意のビデオ視聴ソフトウェア（ 例えば使用して行うことができます<a href="http://www.real.com/" target="_blank">httpを：</a>/ / www.real.com/ RealPlayerまたは他のフリーウェアまたは市販ソフト）。画像は、この段階で、または。JPGファイル（ステップ5を参照）に変換した後。TIFF形式で表示することができます。 </li><li>初期のコロニー形成のメカニズムを決定するために、プレート上の1つの撮像部位を表す単一イメージのスタックで始まります。最初のフレームでは、細胞はフローティングになります。第一上皮細胞がプレートに付着したときを決定する連続画像に従ってください。このステップでは、上皮細胞を識別することができ、彼らのより立方形態によって線維芽細胞から分化した。シリアル画像を通して、この単一の上皮細胞に従い、後続の24時間かけてその運命に従ってください。それは追加の上皮細胞に囲まれた、または細胞分裂やアポトーシスを受けるとなった場合、記録します。上皮細胞に囲まれている場合は、コロニー形成のメカニズムは、周囲の細胞は、または初期接着細胞（s）と、集約浮遊細胞に由来している場合は表示することによって直接決定することができる初期接着細胞の分裂から。最初の24時間中に細胞凝集対細胞分裂によって形成されたコロニー数を記録します。 </li><li>特定の期間にわたってアポトーシスを最初に接着した細胞の数を決定するために、接着されているセルに発展アポトーシスの古典的な機能の外観の連続画像に従う（ <a href="http://www.alsa.org/research/about-als-research/cell-death-and-apoptosis.html" target="_blank">http://www.alsa.org/research/about -als-research/cell-death-and-apoptosis.html</a> ）、およびイメージングの全期間中、または記録された特定の時間枠内で識別されたアポトーシス細胞の数。 </li><li>時間が経つにつれて、培養中の上皮細胞は、EMTと一貫性より細長い外観に初期直方体形状からその形態を変化させる。これが発生した場合、メッキ後の日/時間を決定するために、連続画像に従ってください。 </li></ol> 5。イメージファイルの修正<ol><li&gt;はVolocity·ソフトウェアを使用して、TIFFスタックに画像ファイルをエクスポートします。ここMetaMorph顕微鏡オートメーション＆画像解析ソフトウェア（Molecular Devices社、LLCはカリフォルニア州サニーベール）は、TIFFスタック、ファイルを開くために使用され、彼らは、単一の。JPG画像としてMetaMorphに保存されていました。 </li><li>ティムの追跡ツールソフトウェアの必要条件に応じて画像のフォルダやファイルの名前を変更名前の変更2.1.6（のようなフリーウェアのプログラム使用<a href="http://www.softpedia.com/get/System/File-Management/THE-Rename.shtml" target="_blank">http://www.softpedia.com/get/System/File-Management/THE-Rename.shtmlを</a>グループ内のファイルの名前を変更する）。実験のすべてのフォルダとファイルを含むフォルダを1つ作成します（ 例えば、フォルダに名前を付ける</eM&gt; EXPERIMENTNAME）。 </li><li>文化が撮像された各点/位置のサブフォルダを作成します。 EXPERIMENTNAME_pPOSITIONNUMBER：サブフォルダの名前を付けます。位置番号は、3桁の数字を持っている必要があります。例：072511RN_p001。サブフォルダ内の個々の位置のすべての画像ファイルを入れてください。 </li><li>この形式で、それぞれのファイル名の末尾の時点（5桁を使用）とチャンネル番号（1つだけの明視野チャンネルがあるので、 &quot;0&quot;を使用）を追加します。 EXPERIMENTNAME_pPOSITIONNUMBER_tTIMEPOINT_wCHANNELNUMBER.jpgExample：072511RN_p001_t00001_w0.jpg </li><li>第一TTTのWebサイトから無料でプログラムTTTlogfileconverterをダウンロードすることにより、各位置のためのログファイルを生成します。 TTTlogfileconverter·プログラムを開始して、実験のフォルダを選択します。入力画像の間隔（秒単位）。 15分毎に撮影した写真については、900秒を入力します。次に緑色隠密ログファイルボタンを押します。 </li></ol> 6。 TTTを用いた単一細胞の細胞運命マップの生成<ol><li> C言語TTTexportというフォルダとすべてのセルの追跡データはTTTのソフトウェア命令に続いて格納されるTTTfilesという名前のサブフォルダをreate </li><li> TTTプログラムを起動し、ユーザーのイニシャルを選択し、 &quot;続ける&quot;をクリックします。 </li><li>押して &quot;設定NASを&quot;、 &quot;TTTexport&quot;フォルダを作成したユーザーを選択し、[OK]をクリックします。ブラウザで、キーを押して &quot;ロード位置&quot;ボタンを位置のフォルダを選択し、実験のフォルダを選択し、。 </li><li>眼に係数を設定した &quot;10倍。&quot;必要なイメージの数を読み込む（すべてのイメージのロードが初めてのために推薦されています）。 </li><li>セルエディタ]ウィンドウで、[ファイル]メニューの下に &quot;新植民地&quot;を選択します。ムービーウィンドウでは、セルのトラッキングを開始する &quot;トラックセル&quot;またはF2キーを押します。 </li><li> M内のセルを識別OVIEウィンドウとセルの上にカーソルを配置するために、マウスを使用しています。 F2キーがクリックされた後のセルの数とサークルが表示されるはずです。次の画像にセルと事前の位置を追跡するために、キーボードのテンキーの &quot;0&quot;キーを使用します。各フレームを介して各セルの配置に従うようにカーソルを移動します。トラックを削除して、テンキーの前の画像を押して &quot;デル&quot;に戻ります。 &quot;、3&quot;セルプレスを追跡することなく、フレームを転送移動するとテンキーのEnterキーを押し &quot;1&quot;を追跡することなく後方へ移動する。 </li><li>細胞分裂をマークするには、ムービーウィンドウの &quot;分割&quot;ボタンをクリックしてください。細胞死をマークするには、ムービーウィンドウの &quot;細胞死&quot;ボタンをクリックしてください。除算が発生した後、娘細胞は、自動的にモードの追跡を開始するには、セルエディタウィンドウ内の指定された娘細胞の円形の記号を右クリックして、同じ細胞の運命マップ内で追跡することができます。 </li><li>木を保存するには、F10を押します。各ツリーには、指定された出力倍で保存されますER（TTTExport）。新しい細胞の運命マップを起動するには、セルエディタウィンドウの &quot;ファイル&quot;→ &quot;開く&quot;メニューの下に &quot;新植民地&quot;を選択します。 </li><li>セルエディタウィンドウで &quot;セル·データ&quot;タブから収集した後、細胞寿命データを集計。 </li></ol> 7。統計分析<ol><li>異なる遺伝子型間のEMTの出現まで、そのような初期細胞コロニー、細胞の寿命や時間数などのパラメトリックデータの違いは統計的にあるかどうかを判断するためにどちらかのスチューデントのt検定を（2つの遺伝子型を比較した場合）を使用するか、またはANOVA（&gt; 2つの遺伝子型を比較した場合）著しい。アポトーシスの周波数は数/スチューデントのt検定またはANOVAを用い総数播種した細胞として、または付着細胞の割合（％）として導出マン·ホイットニーまたはKruskal-Wallisと比較することができます。 </li><li>実行され、細胞の運命マップが適切sの各反復から生成する必要がありますどのように多くの実験が複製を決定するために、初期の実験の分析からのデータを使用して電源のテストを実行利用可能なフリーウェアを使用してtatistical電力（ 例えば <a href="http://statpages.org/" target="_blank">http://statpages.org/</a> ）。ここで紹介する実験では、遺伝子型ごとに3つのマウス由来の細胞培養では、特定の遺伝子改変がなされた時、細胞コロニー形成と細胞寿命の統計的に有意な違いがあったかどうかを判断するのに十分であった。 </li></ol>

<ol>
	<li>Jones, L. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+estrogen+signaling+pathways+collaborates+with+loss+of+Brca1+to+promote+development+of+ERalpha-negative+and+ERalpha-positive+mammary+preneoplasia+and+cancer.">Activation of estrogen signaling pathways collaborates with loss of Brca1 to promote development of ERalpha-negative and ERalpha-positive mammary preneoplasia and cancer.</a> Oncogene. 27, 794-802 (2008).</li><li>Burga, L. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altered+proliferation+and+differentiation+properties+of+primary+mammary+epithelial+cells+from+BRCA1+mutation+carriers.">Altered proliferation and differentiation properties of primary mammary epithelial cells from BRCA1 mutation carriers.</a> Cancer Res. 69, 1273-1278 (2009).</li><li>Li, M., Wagner, K., Furth, P. A., Ip, M., Asch, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+primary+mammary+epithelial+cells+and+transfection+by+viral+and+nonviral+methods.">Preparation of primary mammary epithelial cells and transfection by viral and nonviral methods.</a> Methods in Mammary Gland Biology and Breast Cancer. , (2000).</li><li>Schroeder, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+stem-cell-driven+regeneration+in+mammals.">Imaging stem-cell-driven regeneration in mammals.</a> Nature. 453, 345-351 (2008).</li><li>Schroeder, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+single-cell+imaging+of+mammalian+stem+cells.">Long-term single-cell imaging of mammalian stem cells.</a> Nature Methods. 8, S30-S35 (2011).</li><li>Eilken, H. M., Nishikawa, S. -. I., Schroeder, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Continuous+single-cell+imaging+of+blood+generation+from+haemogenic+endothelium.">Continuous single-cell imaging of blood generation from haemogenic endothelium.</a> Nature. 457, 896-900 (2009).</li><li>Kokkaliaris, K. D., Loeffler, D., Schroeder, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+tracking+hematopoiesis+at+the+single-cell+level.">Advances in tracking hematopoiesis at the single-cell level.</a> Current opinion in hematology. , (2012).</li><li>Rieger, M. A., Hoppe, P. S., Smejkal, B. M., Eitelhuber, A. C., Schroeder, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hematopoietic+cytokines+can+instruct+lineage+choice.">Hematopoietic cytokines can instruct lineage choice.</a> Science. 325, 217-218 (2009).</li><li>Rieger, M. A., Schroeder, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Instruction+of+lineage+choice+by+hematopoietic+cytokines.">Instruction of lineage choice by hematopoietic cytokines.</a> Cell Cycle. 8, 4019-4020 (2009).</li><li>Heinrich, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+subtype-specific+neurons+from+postnatal+astroglia+of+the+mouse+cerebral+cortex.">Generation of subtype-specific neurons from postnatal astroglia of the mouse cerebral cortex.</a> Nat. Protoc. 6, 214-228 (2011).</li></ol>

著者らは、彼らが競合する経済的利益を持っていないことを宣言します。

重要なステップそれは乳腺が乳腺上皮細胞の挙動の加齢変動を制御するために、同じ年齢のマウスから採取されていることを確認することが重要です。細胞をプレーティングするときに、同じセルの数は、すべての実験のために、各ウェルに播種しなければならない。文化はそれが可能な連続画像を使用して複数のセルを個別にフォローすることが早すぎるコンフルエント...

遺伝子改変マウスモデルは、異なる遺伝的病変は、乳がんの発症リスクに寄与する方法を勉強し、理解するためのツールです。例えば、遺伝子組み換えマウスは3つの要因の組み合わせが示されている：完全長乳がん1、乳腺上皮細胞における早期発症（BRCA1）遺伝子、腫瘍タンパク質p53（TP53）生殖系列ハプロ不全、および乳腺上皮の損失をセル（f）は11/f11/Mouse乳腺腫瘍ウイルス（MMTV）-Cre/p53 + / -/tetracycline-operator（BRCA1フロックス化の100％で乳腺癌の開発においてアップレギュレートエストロゲン受容体α（ERA）式の結果を標的TET-op）が-ER/MMTV-reverseテトラサイクリントランスアクチベーター（BRCA1 f11/f11/MMTV-Cre/p53で報告された低い割合と比較して、生後12ヶ月rtTAマウスが+ - / - （〜50過剰発現時代を持たないマウスTP53 haploinsufなし60％）、BRCA1 f11/f11/MMTV-CreマウスFICIENCY（&lt;5％）。1 前癌一次乳腺上皮細胞の挙動の動的タイムラプスイメージングが少なく簡単に静的な組織切片で高く評価されている細胞の挙動の違いを明らかにする。増殖と分化の変化はヒトBRCA1変異保因者からの主な乳腺細胞で観察されています。正常及び遺伝子改変マウスからプライマリ乳腺上皮細胞の単一細胞懸濁液の2作成は切除乳腺組織の酵素的解離によって生成されます。3タイムラプス画像は、細胞コロニーの外観と上皮間葉移行（EMT）とアポトーシスを含む細胞の形態学的変化の発生のメカニズムとタイミングを評価するために見ている。細胞の運命マップの生成が、細胞分裂（細胞寿命）と、細胞分裂のパターンの決定の間の時間の長さの定量化は、単一セルの追跡の使用によって促進されています。ティムのトラッキングツール（TTT）は、単一セルの運命マップを生成するために使用される公に利用可能にするソフトウェアです。細胞の運命決定のメカニズムの解明にその有用性は、通常の造血幹細胞の発達6-9およびニューロンの生成を調べる4,5確立されています10

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬の名称 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td><td> 注釈 </td></tr><tr><td> EpiCult-Bの基本培地マウス</td><td> StemCellテクノロジーズ</td><td> 05610 </td><td></td></tr><tr><td> EpiCult-Bの増殖サプリメントマウス</td><td> StemCellテクノロジーズ</td><td> 05612 </td><td></td></tr><tr><td>組換えヒト上皮成長因子（rhEGF） </td><td> StemCellテクノロジーズ</td><td> 02633 </td><td></td></tr><tr><td>コラゲナーゼ/ヒアルロニダーゼ</td><td> StemCellテクノロジーズ</td><td> 07912 </td><td></td></tr><tr><td>使い捨てScapels </td><td>フェザー</td><td> 2975＃10 </td><td></td></tr><tr><td>ハンクス平衡塩溶液</td><td> StemCellテクノロジーズ</td><td> 37150 </td><td></td></tr><tr><td> Ammonium塩化</td><td> StemCellテクノロジーズ</td><td> 07800 </td><td></td></tr><tr><td> Tryspin-EDTA </td><td> StemCellテクノロジーズ</td><td> 07901 </td><td></td></tr><tr><td>ディスパーゼ</td><td> StemCellテクノロジーズ</td><td> 07913 </td><td></td></tr><tr><td> DNase Iを</td><td> StemCellテクノロジーズ</td><td> 07900 </td><td></td></tr><tr><td> 40μmのセルストレーナー</td><td> StemCellテクノロジーズ</td><td> 27305 </td><td></td></tr><tr><td> FBS </td><td> StemCellテクノロジーズ</td><td> 06100 </td><td></td></tr><tr><td> PenStrep </td><td>ギブコ</td><td> 15140 </td><td></td></tr></tbody></table>

time-lapse imaging of primary preneoplastic mammary epithelial cells derived from genetically engineered mouse models of breast cancer

タイムラプスイメージングは​​、乳がんのさまざまな遺伝子改変マウスモデル由来初代培養前腫瘍性乳腺上皮細胞の挙動を比較するために使用できます。例えば、細胞分裂（細胞寿命）、アポトーシス細胞数、形態学的変化の進化、およびコロニー形成のメカニズムの間の時間を定量することができるし、特定の遺伝子損傷を持つ細胞で比較。プライマリ乳腺上皮細胞培養物は、触知可能な腫瘍なし乳腺から生成されます。腺が慎重に周囲の筋肉から明確に分離することで切除され、リンパ節を除去し、濃縮された乳腺上皮細胞の単一細胞懸濁液は、酵素的解離と濾過に続いミンチ乳腺組織によって生成されます。単細胞懸濁液は、ライブセルイメージングのためのインキュベーターチャンバー内に播種し、顕微鏡下に直接配置されます。各ワットから4x4の構成で16 650ミクロン×700μmのフィールド6ウェルプレートのエルは、5日間の15分ごとに結像される。タイムラプス画像は、直接最初の24セルのめっき時間（集計対細胞増殖）、アポトーシスの発生率、および形態学的変化の位相の中で細胞コロニー形成のメカニズムと周波数を含めることができます携帯電話の行動を測定するために検査されます。単一セルのトラッキングは、個々の細胞の寿命と細胞分裂パターンの調査の測定のための細胞運命のマップを生成するために使用されます。定量的なデータは統計的に特定の遺伝子損傷と相関行動の大きな違いを評価するために分析される。

上皮細胞と線維芽細胞は、細胞の形態によって区別す​​ることができる。上皮細胞は立方形の形状（ 図1A-B）とフォーム細胞コロニー（ 図1A）を持っています。線維芽細胞、間質細胞の種類は、細長い形態（ 図1C）を持っています。 細胞は丸く、イメージングの開始（ 図2A-D）に浮かんでいた?...

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Time-lapse Imaging of Primary Preneoplastic Mammary Epithelial Cells Derived from Genetically Engineered Mouse Models of Breast Cancer

タイムラプスイメージングは​​、特定の行動のパラメータと異なる遺伝的病変の間に相関があるかどうかを判断するために乳癌リスクの遺伝子改変モデルマウス由来の初代前腫瘍性乳腺上皮細胞の挙動を評価するために使用される。

乳がんの遺伝子改変マウスモデル由来の初代前癌乳腺上皮細胞のタイムラプスイメージング

Time-lapse  imaging can be used to compare behavior of cultured primary preneoplastic  mammary epithelial cells derived from different genetically ...

time-lapse-imaging-primary-preneoplastic-mammary-epithelial-cells

Research

JoVE Journal

Medicine

11.8K ビュー.  Georgetown University. タイムラプスイメージングは​​、特定の行動のパラメータと異なる遺伝的病変の間に相関があるかどうかを判断するために乳癌リスクの遺伝子改変モデルマウス由来の初代前腫瘍性乳腺上皮細胞の挙動を評価するために使用される。

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In vivo Bioluminescence Imaging of Tumor Hypoxia Dynamics of Breast Cancer Brain Metastasis in a Mouse Model

It is well recognized that tumor hypoxia plays an important role in promoting malignant progression and affecting therapeutic response negatively. There is little knowledge about in situ, in vivo, tumor hypoxia during intracranial development of malignant brain tumors because of lack of efficient means to monitor it in these deep-seated orthotopic tumors. Bioluminescence imaging (BLI), based on the detection of light emitted by living cells expressing a luciferase gene, has been rapidly adopted for cancer research, in particular, to evaluate tumor growth or tumor size changes in response to treatment in preclinical animal studies. Moreover, by expressing a reporter gene under the control of a promoter sequence, the specific gene expression can be monitored non-invasively by BLI. Under hypoxic stress, signaling responses are mediated mainly via the hypoxia inducible factor-1&alpha; (HIF-1&alpha;) to drive transcription of various genes. Therefore, we have used a HIF-1&alpha; reporter construct, 5HRE-ODD-luc, stably transfected into human breast cancer MDA-MB231 cells (MDA-MB231/5HRE-ODD-luc). In vitro HIF-1&alpha; bioluminescence assay is performed by incubating the transfected cells in a hypoxic chamber (0.1% O2) for 24 hr before BLI, while the cells in normoxia (21% O2) serve as a control. Significantly higher photon flux observed for the cells under hypoxia suggests an increased HIF-1&alpha; binding to its promoter (HRE elements), as compared to those in normoxia. Cells are injected directly into the mouse brain to establish a breast cancer brain metastasis model. In vivo bioluminescence imaging of tumor hypoxia dynamics is initiated 2 wks after implantation and repeated once a week. BLI reveals increasing light signals from the brain as the tumor progresses, indicating increased intracranial tumor hypoxia. Histological and immunohistochemical studies are used to confirm the in vivo imaging results. Here, we will introduce approaches of in vitro HIF-1&alpha; bioluminescence assay, surgical establishment of a breast cancer brain metastasis in a nude mouse and application of in vivo bioluminescence imaging to monitor intracranial tumor hypoxia.

In vivo Bioluminescence Imaging of Tumor Hypoxia Dynamics of Breast Cancer Brain Metastasis in a Mouse Model

Bioluminescence imaging of hypoxia inducible factor-1&alpha; activity is applied to monitor intracranial tumor hypoxia development in a breast cancer brain metastasis mouse model.

マウスモデルにおける乳がんの脳転移の腫瘍の低酸素動態の in vivo生物発光イメージングに

It is well recognized that tumor hypoxia plays an important role in promoting malignant progression and affecting therapeutic response negatively. There ...

医学

Experimental Generation of Carcinoma-Associated Fibroblasts (CAFs) from Human Mammary Fibroblasts

Carcinomas are complex tissues comprised of neoplastic cells and a non-cancerous compartment referred to as the 'stroma'. The stroma consists of extracellular matrix (ECM) and a variety of mesenchymal cells, including fibroblasts, myofibroblasts, endothelial cells, pericytes and leukocytes 1-3.
The tumour-associated stroma is responsive to substantial paracrine signals released by neighbouring carcinoma cells. During the disease process, the stroma often becomes populated by carcinoma-associated fibroblasts (CAFs) including large numbers of myofibroblasts. These cells have previously been extracted from many different types of human carcinomas for their in vitro culture. A subpopulation of CAFs is distinguishable through their up-regulation of &alpha;-smooth muscle actin (&alpha;-SMA) expression4,5. These cells are a hallmark of 'activated fibroblasts' that share similar properties with myofibroblasts commonly observed in injured and fibrotic tissues 6. The presence of this myofibroblastic CAF subset is highly related to high-grade malignancies and associated with poor prognoses in patients.
Many laboratories, including our own, have shown that CAFs, when injected with carcinoma cells into immunodeficient mice, are capable of substantially promoting tumourigenesis 7-10. CAFs prepared from carcinoma patients, however, frequently undergo senescence during propagation in culture limiting the extensiveness of their use throughout ongoing experimentation. To overcome this difficulty, we developed a novel technique to experimentally generate immortalised human mammary CAF cell lines (exp-CAFs) from human mammary fibroblasts, using a coimplantation breast tumour xenograft model.
In order to generate exp-CAFs, parental human mammary fibroblasts, obtained from the reduction mammoplasty tissue, were first immortalised with hTERT, the catalytic subunit of the telomerase holoenzyme, and engineered to express GFP and a puromycin resistance gene. These cells were coimplanted with MCF-7 human breast carcinoma cells expressing an activated ras oncogene (MCF-7-ras cells) into a mouse xenograft. After a period of incubation in vivo, the initially injected human mammary fibroblasts were extracted from the tumour xenografts on the basis of their puromycin resistance 11.
We observed that the resident human mammary fibroblasts have differentiated, adopting a myofibroblastic phenotype and acquired tumour-promoting properties during the course of tumour progression. Importantly, these cells, defined as exp-CAFs, closely mimic the tumour-promoting myofibroblastic phenotype of CAFs isolated from breast carcinomas dissected from patients. Our tumour xenograft-derived exp-CAFs therefore provide an effective model to study the biology of CAFs in human breast carcinomas. The described protocol may also be extended for generating and characterising various CAF populations derived from other types of human carcinomas.

Experimental Generation of Carcinoma-Associated Fibroblasts CAFs from Human Mammary Fibroblasts

Carcinoma-associated fibroblasts (CAFs) rich in myofibroblasts present within the tumour stroma, play a major role in driving tumour progression. We developed a coimplantation tumour xengraft model for experimentally generating CAFs from human mammary fibroblasts. The protocol describes how to establish CAF myofibroblasts that acquire an ability to promote tumourigenesis.

ヒト乳腺線維芽細胞からの癌関連線維芽細胞の実験的生成（CAFS）

Carcinomas are complex tissues comprised of neoplastic cells and a non-cancerous compartment referred to as the 'stroma'. The stroma consists of ...

Live Imaging of Drug Responses in the Tumor Microenvironment in Mouse Models of Breast Cancer

The tumor microenvironment plays a pivotal role in tumor initiation, progression, metastasis, and the response to anti-cancer therapies. Three-dimensional co-culture systems are frequently used to explicate tumor-stroma interactions, including their role in drug responses. However, many of the interactions that occur in vivo in the intact microenvironment cannot be completely replicated in these in vitro settings. Thus, direct visualization of these processes in real-time has become an important tool in understanding tumor responses to therapies and identifying the interactions between cancer cells and the stroma that can influence these responses. Here we provide a method for using spinning disk confocal microscopy of live, anesthetized mice to directly observe drug distribution, cancer cell responses and changes in tumor-stroma interactions following administration of systemic therapy in breast cancer models. We describe procedures for labeling different tumor components, treatment of animals for observing therapeutic responses, and the surgical procedure for exposing tumor tissues for imaging up to 40 hours. The results obtained from this protocol are time-lapse movies, in which such processes as drug infiltration, cancer cell death and stromal cell migration can be evaluated using image analysis software.

We describe a method for imaging response to anti-cancer treatment in vivo and at single cell resolution.

乳癌のマウスモデルにおいて腫瘍微小環境における薬剤応答のイメージングを生きる

The tumor microenvironment plays a pivotal role in tumor initiation, progression, metastasis, and the response to anti-cancer therapies. Three-dimensional ...

Patient Derived Cell Culture and Isolation of CD133+ Putative Cancer Stem Cells from Melanoma

Despite improved treatments options for melanoma available today, patients with advanced malignant melanoma still have a poor prognosis for progression-free and overall survival. Therefore, translational research needs to provide further molecular evidence to improve targeted therapies for malignant melanomas. In the past, oncogenic mechanisms related to melanoma were extensively studied in established cell lines. On the way to more personalized treatment regimens based on individual genetic profiles, we propose to use patient-derived cell lines instead of generic cell lines. Together with high quality clinical data, especially on patient follow-up, these cells will be instrumental to better understand the molecular mechanisms behind melanoma progression.
Here, we report the establishment of primary melanoma cultures from dissected fresh tumor tissue. This procedure includes mincing and dissociation of the tissue into single cells, removal of contaminations with erythrocytes and fibroblasts as well as primary culture and reliable verification of the cells' melanoma origin.
Recent reports revealed that melanomas, like the majority of tumors, harbor a small subpopulation of cancer stem cells (CSCs), which seem to exclusively fuel tumor initiation and progression towards the metastatic state. One of the key markers for CSC identification and isolation in melanoma is CD133. To isolate CD133+ CSCs from primary melanoma cultures, we have modified and optimized the Magnetic-Activated Cell Sorting (MACS) procedure from Miltenyi resulting in high sorting purity and viability of CD133+ CSCs and CD133- bulk, which can be cultivated and functionally analyzed thereafter.

Patient Derived Cell Culture and Isolation of CD133+ Putative Cancer Stem Cells from Melanoma

This article describes the preparation of freshly obtained melanoma tissue into primary cell cultures, and how to remove contaminations of erythrocytes and fibroblasts from the tumor cells. Finally, we describe how CD133+ putative melanoma stem cells are sorted from the CD133- bulk using Magnetic Activated Cell Sorting (MACS).

CD133の患者由来の細胞培養および分離<sup&gt; +</supメラノーマから&gt;推定されるがん幹細胞

Despite improved treatments options for melanoma available today, patients with advanced malignant melanoma still have a poor prognosis for ...

Profiling of Estrogen-regulated MicroRNAs in Breast Cancer Cells

Estrogen plays vital roles in mammary gland development and breast cancer progression. It mediates its function by binding to and activating the estrogen receptors (ERs), ER&#945;, and ER&#946;. ER&#945; is frequently upregulated in breast cancer and drives the proliferation of breast cancer cells. The ERs function as transcription factors and regulate gene expression. Whereas ER&#945;&#39;s regulation of protein-coding genes is well established, its regulation of noncoding microRNA (miRNA) is less explored. miRNAs play a major role in the post-transcriptional regulation of genes, inhibiting their translation or degrading their mRNA. miRNAs can function as oncogenes or tumor suppressors&#160;and are also promising biomarkers. Among the miRNA assays available, microarray and quantitative real-time polymerase chain reaction (qPCR) have been extensively used to detect and quantify miRNA levels. To identify miRNAs regulated by estrogen signaling in breast cancer, their expression in ER&#945;-positive breast cancer cell lines were compared before and after estrogen-activation using both the &#181;Paraflo-microfluidic microarrays and Dual Labeled Probes-low density arrays. Results were validated using specific qPCR assays, applying both Cyanine dye-based and Dual Labeled Probes-based chemistry. Furthermore, a time-point assay was used to identify regulations over time. Advantages of the miRNA assay approach used in this study is that it enables a fast screening of mature miRNA regulations in numerous samples, even with limited sample amounts. The layout, including the specific conditions for cell culture and estrogen treatment, biological and technical replicates, and large-scale screening followed by in-depth confirmations using separate techniques, ensures a robust detection of miRNA regulations,&#160;and eliminates false positives and other artifacts. However, mutated or unknown miRNAs, or regulations at the primary and precursor transcript level, will not be detected. The method presented here represents a thorough investigation of estrogen-mediated miRNA regulation.

Molecular signaling through both estrogen and microRNAs are critical in breast cancer development and growth. Estrogen activates the estrogen receptors, which are transcription factors. Many transcription factors can regulate the expression of microRNAs, and estrogen-regulated microRNAs can be profiled using different large-scale techniques.

乳癌細胞におけるエストロゲン調節マイクロRNAのプロファイリング

Estrogen plays vital roles in mammary gland development and breast cancer progression. It mediates its function by binding to and activating the estrogen ...

Method for Obtaining Primary Ovarian Cancer Cells From Solid Specimens

Reliable tools for investigating ovarian cancer initiation and progression are urgently needed. While the use of ovarian cancer cell lines remains a valuable tool for understanding ovarian cancer, their use has many limitations. These include the lack of heterogeneity and the plethora of genetic alterations associated with extended in vitro passaging.&#160;Here we describe a method that allows for rapid establishment of primary ovarian cancer cells form solid clinical specimens collected at the time of surgery. The method consists of subjecting clinical specimens to enzymatic digestion for 30 min. The isolated cell suspension is allowed to grow and can be used for downstream application including drug screening. The advantage of primary ovarian cancer cell lines over established ovarian cancer cell lines is that they are representative of the original specific clinical specimens they are derived from and can be derived from different sites whether primary or metastatic ovarian cancer.

This study describes a detailed method for isolation and characterization of primary ovarian cancer cells from solid clinical specimens. Ovarian cancer clinical specimens are subjected to enzymatic digestion to obtain viable, fibroblast-free epithelial ovarian cancer (EOC) cells highly suitable for downstream applications.

ソリッド検体からの原発性卵巣癌細胞を得る方法

Reliable tools for investigating ovarian cancer initiation and progression are urgently needed. While the use of ovarian cancer cell lines remains a ...

Orthotopic Injection of Breast Cancer Cells into the Mammary Fat Pad of Mice to Study Tumor Growth.

Breast cancer growth can be studied in mice using a plethora of models. Genetic manipulation of breast cancer cells may provide insights into the functions of proteins involved in oncogenic progression or help to discover new tumor suppressors. In addition, injecting cancer cells into mice with different genotypes might provide a better understanding of the importance of the stromal compartment. Many models may be useful to investigate certain aspects of disease progression but do not recapitulate the entire cancerous process. In contrast, breast cancer cells engraftment to the mammary fat pad of mice better recapitulates the location of the disease and presence of the proper stromal compartment and therefore better mimics human cancerous disease. In this article, we describe how to implant breast cancer cells into mice orthotopically and explain how to collect tissues to analyse the tumor milieu and metastasis to distant organs. Using this model, many aspects (growth, angiogenesis, and metastasis) of cancer can be investigated simply by providing a proper environment for tumor cells to grow.

Cancer is a complex disease that is influenced by the tissue surrounding the tumor as well as local pro- and anti-inflammatory mediators. Therefore, orthotropic injection models, rather than subcutaneous models may be useful to study cancer progression in a manner that better mimics human pathology.

腫瘍増殖を研究するためにマウスの乳房脂肪パッド中に乳癌細胞の同所注入。

Breast cancer growth can be studied in mice using a plethora of models. Genetic manipulation of breast cancer cells may provide insights into the ...

Tracking the Mammary Architectural Features and Detecting Breast Cancer with Magnetic Resonance Diffusion Tensor Imaging

Breast cancer is the most common cause of cancer among women worldwide. Early detection of breast cancer has a critical role in improving the quality of life and survival of breast cancer patients. In this paper a new approach for the detection of breast cancer is described, based on tracking the mammary architectural elements using diffusion tensor imaging (DTI). 
The paper focuses on the scanning protocols and image processing algorithms and software that were designed to fit the diffusion properties of the mammary fibroglandular tissue and its changes during malignant transformation. The final output yields pixel by pixel vector maps that track the architecture of the entire mammary ductal glandular trees and parametric maps of the diffusion tensor coefficients and anisotropy indices. 
The efficiency of the method to detect breast cancer was tested by scanning women volunteers including 68 patients with breast cancer confirmed by histopathology findings. Regions with cancer cells exhibited a marked reduction in the diffusion coefficients and in the maximal anisotropy index as compared to the normal breast tissue, providing an intrinsic contrast for delineating the boundaries of malignant growth. Overall, the sensitivity of the DTI parameters to detect breast cancer was found to be high, particularly in dense breasts, and comparable to the current standard breast MRI method that requires injection of a contrast agent. Thus, this method offers a completely non-invasive, safe and sensitive tool for breast cancer detection.

We describe how to obtain parametric and vector maps of the diffusion tensor of the breast using magnetic resonance imaging. The protocol and final output following imaging processing are tailored for tracking breast architectural features and detecting breast malignancy.

乳腺アーキテクチャの特長を追跡し、磁気共鳴拡散テンソルイメージングと乳がんの検出

Breast cancer is the most common cause of cancer among women worldwide. Early detection of breast cancer has a critical role in improving the quality of ...

High-frequency Ultrasound Imaging of Mouse Cervical Lymph Nodes

High-frequency ultrasound (HFUS) is widely employed as a non-invasive method for imaging internal anatomic structures in experimental small animal systems. HFUS has the ability to detect structures as small as 30 &#181;m, a property that has been utilized for visualizing superficial lymph nodes in rodents in brightness (B)-mode. Combining power Doppler with B-mode imaging allows for measuring circulatory blood flow within lymph nodes and other organs. While HFUS has been utilized for lymph node imaging in a number of mouse&#160; model systems, a detailed protocol describing HFUS imaging and characterization of the cervical lymph nodes in mice has not been reported. Here, we show that HFUS can be adapted to detect and characterize cervical lymph nodes in mice. Combined B-mode and power Doppler imaging can be used to detect increases in blood flow in immunologically-enlarged cervical nodes. We also describe the use of B-mode imaging to conduct fine needle biopsies of cervical lymph nodes to retrieve lymph tissue for histological&#160; analysis. Finally, software-aided steps are described to calculate changes in lymph node volume and to visualize changes in lymph node morphology following image reconstruction. The ability to visually monitor changes in cervical lymph node biology over time provides a simple and powerful technique for the non-invasive monitoring of cervical lymph node alterations in preclinical mouse models of oral cavity disease.

This protocol describes the application of high-frequency ultrasound (HFUS) for imaging mouse cervical lymph nodes. This technique optimizes visualization and quantification of cervical lymph node morphology, volume and blood flow. Image-guided biopsy of cervical lymph nodes and processing of lymph tissue for histological evaluation is also demonstrated.

マウス子宮頸部リンパ節の高周波超音波イメージング

High-frequency ultrasound (HFUS) is widely employed as a non-invasive method for imaging internal anatomic structures in experimental small animal ...

An Organotypic High Throughput System for Characterization of Drug Sensitivity of Primary Multiple Myeloma Cells

In this work we describe a novel approach that combines ex vivo drug sensitivity assays and digital image analysis to estimate chemosensitivity and heterogeneity of patient-derived multiple myeloma (MM) cells. This approach consists in seeding primary MM cells freshly extracted from bone marrow aspirates into microfluidic chambers implemented in multi-well plates, each consisting of a reconstruction of the bone marrow microenvironment, including extracellular matrix (collagen or basement membrane matrix) and stroma (patient-derived mesenchymal stem cells) or human-derived endothelial cells (HUVECs). The chambers are drugged with different agents and concentrations, and are imaged sequentially for 96 hr through bright field microscopy, in a motorized microscope equipped with a digital camera. Digital image analysis software detects live and dead cells from presence or absence of membrane motion, and generates curves of change in viability as a function of drug concentration and exposure time. We use a computational model to determine the parameters of chemosensitivity of the tumor population to each drug, as well as the number of sub-populations present as a measure of tumor heterogeneity. These patient-tailored models can then be used to simulate therapeutic regimens and estimate clinical response.

We describe a high-throughput drug sensitivity assay for primary multiple myeloma cells. It consists of a reconstruction of the bone marrow microenvironment (including extracellular matrix and stroma) in multi-well plates, and a non-invasive method for longitudinal quantification of cell viability.

一次多発性骨髄腫細胞の薬剤感受性の特徴付けのための器官のハイスループットシステム

In this work we describe a novel approach that combines ex vivo drug sensitivity assays and digital image analysis to estimate chemosensitivity and ...