何人かの人は、このホワイト·ペーパーで説明された仕事に貢献した。 CVGは、実験装置を構築し、LS、SHC、とCVGは、実験を行った。 CVGおよびSHCは原稿を書いている。すべての著者は、その後改訂プロセスに参加し、原稿の最後のコピーを承認した。我々はGCaMP株についてポールスタンバーグに感謝します。この作業で使用されるいくつかの線虫株は研究資源のためのNIHナショナルセンター（NCRR）によって運営されている線虫遺伝学センター（CGC）から提供された。 MATLABの画像解析プログラムを18で使われているから脚色したものです。著者はボストン大学、マサチューセッツ工科大学ライフサイエンスセンターではサポートされていた。

1。光学装置<ol><li>落射蛍光イメージング機能を備えた標準的な複式顕微鏡を使用しています。我々はIntensilight HGイルミとニコンの​​EclipseのTi-U倒立顕微鏡を使用しています。 </li><li>最高の画像と信号の品質確保のため、高倍率、高開口数の対物レンズを使用しています。我々は通常、ニコンX60 1.4のNA油浸対物レンズを使用しています。いくつかのケースでは、蛍光体の発現レベルと信号強度に応じて、低倍率（X40、X20）を使用することが可能です。 </li><li>このような画像の感度を最大にし、バックグラウンドノイズを最小限に抑えるためのアンドールクララカメラとしては、CCDカメラを冷却し、高感度を使用します。 </li><li>単一色の蛍光団は、蛍光体の特定の波長のために設計された標準的な顕微鏡の蛍光フィルターを使用してください。 GCaMPための標準的なGFPフィルターは525nmの488nmおよび発光の励起用に最適化された設定を使用します。それ以上の光学変更は必要ありません。 </li><li&gt;このようなカメレオンのようにレシオメトリック蛍光団については、同一の画像を同時に2つの別々の波長で捕捉することができるようなデュアルイメージングシステムを使用しています。これは、カメラにデュアル枚の画像を並べて投影することによって達成されます。光学グレードのブレッドボード上で基本的な光学部品を使用して、これを達成するための簡単なセットアップは、 図1に示されている。それは以下から成ります。 <ol class="ualpha"><li> 440±20 nmの励起フィルターと455 nmの設定顕微鏡フィルタが長いダイクロイックミラーを渡す。 </li><li>直ちに顕微鏡イメージングポート（カメラのCCDセンサーは通常座るところ）外初期像面に配置された画像のマスク。これは、カメラセンサーの半分だけがいっぱいになるような視野を制限します。 2つの画像を並べて投影されるシャープなイメージの枠の最初のイメージプレーンの結果とオーバーラップ無しでこのマスクを置く。 </li><li>第1リレーレンズは徒歩トンから1つの焦点距離を設定彼が光をコリメートするような初期のイメージプレーン。 </li><li> （&lt;515 nmであり、シアン）は、他の送信中に一つの色を（&gt; 515 nmであり、黄色）を反映し、2つの別々のイメージング波長またはチャネルに光を分割するダイクロイックミラー。 </li><li>さらに具体的なイメージング波長（485±535でシアンで40 nmと黄色の±30 nm）の透過光を制限する発光フィルター（バンドパスフィルタ） </li><li>それはCCDカメラでの第2像面に光をrefocusesような光路に配置され第2のリレーレンズ（各チャネルに1つ）。 </li><li>一対のミラーと第2のダイクロイックミラーは、2つの画像が再結合し、カメラのCCDセンサー上に横並びに投影されるようにビーム経路を指示します。 図4Aは、得られた画像の例を示す。 </li></ol></li><li>初期の光学的アライメント：高コントラストIMAGと光学系のセットアップとアライメントを開始低倍率レンズと送信広視野光照明を（顕微鏡スライド上に描かれた黒のシャーピーがうまく機能）を使用して電子メール。顕微鏡の接眼レンズを通して集中するイメージを持ってきて、次に使用する顕微鏡のポートに切り替えました。高い光照明で初期焦点面（顕微鏡の外部ポート数cm）で、インデックスカードに画像を表示します。それが最初の焦点面から1焦点距離であり、ビーム経路（ すなわち、直接のビーム経路の中央に配置されます）偏向しないながら光をコリメートするようなビーム経路に第1リレーレンズ（C）を配置します。第一焦点面にマスクを置き、視野の半分フィールドを制限したり、画像にシャープなボーダーを生成するように調整。 図1Bに示すように、ビーム経路は、テーブル面に対して平行のままで、2つのパラレルパスサイド·バイ·サイドで実行されるように、ミラーやフィルタ（A、D、E、G）を置きます。それぞれのビーム経路の中心2のリレーレンズ（F）とカメラのCCDセンサーが置かれていたであろうインデックスカードに焦点を当てて画像を持って来るためにパスに沿って前後に移動します。正しく行えば二つの画像は、顕微鏡接眼レンズと他のカメラのポートを持つ同焦点であるべきである。最後の位置にカメラを配置し、アライメントを微調整します。 </li><li>ファインチューニング光学的アライメント：微調整光学アライメントにCCDカメラによって見デュアルイメージを使用します。高コントラストの画像を使用して、最終的な位置合わせのための高倍率に切り替えて、低倍率で始まります。反射像（ 図1Bに黄色チャネル）のフィールドの残りの半分をカバーするために、XとYの位置にカメラを移動することによって、カメラの視野の半分をカバーするために送信された画像（ 図1B、シアンチャンネル）を置きそのビーム経路に最後の2ミラー（G）を調整することによって表示できます。ビーム経路に沿って前後に各チャンネルの第2リレーレンズを動かすことにより、フォーカスを最適化します。残した場合不変の光学構成は安定しており、唯一の珍しい微調整を必要とすべきである。 </li></ol> 2。サンプル調製とデータ収集。 <ol><li>線虫の遺伝学センター（CGC）や他のソースから目的のニューロンにおけるカルシウム感受性蛍光色素分子を発現する動物を取得します。あるいはトランスジェニック動物は、標準的なCを使用して構築することができる虫のテクニック。単一細胞の発現は、（時には望ましいものではない複数のニューロンが調査される場合は、12を参照）画像や複数のセルからの測定容易に分離できるものであれば必要ありません。フルオロフォア導入遺伝子がゲノムに組み込まれていない場合は、発現の有意な変化は、動物から動物に発生する可能性があります。この場合、蛍光解剖顕微鏡を使用して、より高い発現レベルを有する動物を事前に選択すると、信号対雑音比を向上させ、測定を向上させます。蛍光色素分子の発現レベル旧姓容易に実験が必要とする取得パラメータの下にカメラで撮像することにするのに十分でなければD。 </li><li>実験室でのテープを2枚を隔てた二つのガラススライド間の溶融アガロースの小滴を押して目的の固定化技術（下記2.3参照）に必要なアガロースパッドを作る。必要に応じて、アガロースパッドは動物をマウントする前にガラスカバースリップに転送することができます。 図2を参照してください。 </li><li> Cを固定する以下のいずれかの手法を用いた撮像用虫 ： <ol class="ualpha"><li>薬理学的な麻痺：2％アガロースパッド（2.2でパッドを作る前に溶融アガロースにそれを混合）に0.05％レバミゾールを追加します。パッドの上に5月10日の動物を選んで、カバースリップで覆う。所定の位置に保持するためのカバースリップの四隅にホットワックス混合物（50％パラフィンワックスおよび50％ワセリン）の少量を適用します。を有効にするにはレバミゾールとbに動物のための5〜10分を許可まだ完全ecome。 </li><li>スティッフアガロース固定化：C.エレガンスは、物理的に硬い10パーセントアガロースパッドと0.05μmの直径のポリスチレンナノ粒子を用いて固定することができる。 2.2と同様に10％のアガロースパッド（重量のNGMバッファの10％アガロース）を作る。パッドの上にビーズ溶液の〜3μlの（体積NGMに1時10ポリスチレン微小球）を追加します。迅速に、5月10日Cを選ぶパッドの上にビーズ溶液のプールに虫で、静かにカバースリップでカバーしています。その位置に保持するためにカバースリップの四隅に適用溶融ワックスを使用しています。 （この手法に関するその他の詳細については同様に以前のJoveの記事8と7を参照） </li><li>糊付け：C.虫は動物の一方の側に適用される獣医グレード接着剤の少量を使用して所定の位置に接着することができます。 </li><li>マイクロ流体デバイス：多数の微小流体デバイスは、物理的に温度を保持するように設計されていますイメージングのための場所でエレガンス 。 </li></ol> &lt;/ LI&gt; <li>顕微鏡にプレパラートを置き、希望のニューロンに焦点を当てています。これは C を見つけることが最も簡単な方法です明視野照明と低倍率を使用しエレガンス 。その後見つけ、特定のニューロンに焦点を当て、高倍率と蛍光イメージングに切り替える。 </li><li>刺激：特定の刺激に対するニューロンの応答（光、電場、味覚や嗅覚、温度など）を希望する場合は、刺激装置は、それがで動物に投与することができるように、顕微鏡のセットアップに設計しなければなりませんイメージングしながら試料調製。 </li><li>顕微鏡CCDカメラを用いて画像を取得する。露光時間と励起光レベルがconcordantly少ない時間分解能で長い露出時間を必要とする弱い信号と、基準信号と蛍光体の発現量に依存します。我々は通常、約300ミリ秒の露光時間を使用します。 </li><li>個別に、またはTiのような画像を取得映画を私タイムラプス。なぜならC.線虫の神経細胞は一般的に遅い活性化ダイナミクス（ すなわち、彼らはナトリウムベースの活動電位を欠いている）が表示され、約1秒の比較的遅いフレームレートは、しばしばニューロンダイナミクスを測定するのに十分である。集録レートまで〜これらは微弱な蛍光のために必要な積分時間によって制限されるかもしれませんが、毎秒90フレームが使用されている。固定化の準備が安定しており、フレームレートが比較的遅い場合は、単一ニューロンの個々のムービーが簡単に数分（5〜10分）以上拡張することができます。 </li></ol> 3。データ解析<ol><li> ImageJとNISの要素を含む動的およびレシオメトリック分析機能と利用可能な異なる蛍光イメージングソフトウェアパッケージは多数あります。我々は、関心のある選択された領域での平均蛍光シグナルを測定する簡単なカスタムMATLABプログラムを使用しています。 </li><li>個々の画像（またはままタイムラプスムービーの完全に静止）画像化されたニューロンとバックグラウンド測定用に別の近隣地域内の関心領域（ROI）を選択します。レシオメトリック画像の場合、デュアル画像ごとに類似したROIと背景領域を選択します。 </li><li>タイムラプスムービー内の画像化された神経細胞のわずかな動きを自動的に多数のオブジェクトトラッキング方式を使用して行うことができ、各フレーム内のROIを選択するには追加の分析が必要です。私たちのプログラムは、ラフの境界が（すべてのフレームに興味の対象を包含する）手動で選択し、独立したバックグラウンド領域が選択されているから、映画の中のすべての画像の圧縮された画像が表示されます。最初のフレームは、ROIが手動で境界領域内から選択されています。その後の各フレームについては、プログラムが正しいサイズ（ すなわちマニュアル最初のフレームのROIとして同じ画素数）のROIを生成する境界領域内から最も明るいピクセルを選択します。イメージのためどこ客観利益のトンは、このプロトコルは、各フレームのための合理的なROIを選択する境界領域内の周囲の背景その後十分に明るくなっています。 </li><li>各フレームの蛍光信号、Fは、ROI内の平均ピクセル強度マイナス背景領域の平均強度として計算されます。レシオメトリックの値が-0.65 / 2の信号の比（YFP-YFP 背景 ）（CFP-CFP 背景 ）として計算されます。 0.65倍は、フルオロフォアと同様に（この値は、通常、カメレオンのセットアップのための〜0.6である）を使用し、特定のフィルタセットに依存することになるのYFPチャンネルにCFPのチャネルを介してのブリードを補正します。 </li><li> 、ΔF/ F =（F（t）は、-F O）/ F○：各フレームの相対的なカルシウムレベルは、最初のフレーム（または一連のフレーム）から測定し、初期ベースライン値に正規化された強度の変化率として計算されF（t）は時間tとf oの蛍光である初期ベースライン値です。 </li><li>細胞体を選択するROIが最強で最も堅牢な信号を生成し、それが神経突起に沿ってROIからの信号を選択して測定することも可能である。 </li></ol> 4。問題解決<ol><li> 漂白 ：励起光への曝露は、フルオロフォアの漂白と暴露レベルに依存している信号の着実な減少によってマークされて発生することがあります。レシオメトリック測定は、これを補償するために役立ちます。 1波長の漂白しかし選択はまだ（速く次に、典型的にCFPの漂白YFP）が発生する可能性があります。漂白した場合は、（照明経路における中性密度フィルター付き）露光時間および/または励起強度を低減することにより、露光レベルを下げるに発生します。必要であれば、1はモック試験（同じ励起露出けどノー神経刺激）を実行すると、信号の減衰の時定数を定量することにより、漂白を補償することができます。 </li><li><stronグラム&gt;固定：それは動物が記録期間を通じて比較的残っ重要ですここで説明では、単純な画像解析のためのelegansは 、記録時に移動する彼らが最も可能性が高いこと、露光や実験刺激に応答する。軸索プロセスから測定時にわずかな動きが、特に測定に大きなノイズを導入することができます。レシオメトリック分析は、細胞体からある程度、測定値より堅牢なものにこれらの影響を軽減するのに役立ちます。固定化の手順を慎重に実行して細分化はまだ完全に動物になります。 </li><li> 背景の選択：背景領域を慎重に選択することに成功し、画像解析のために必要である。背景領域は、合理的に均一で画像化されたニューロンその後暗くなるはずです。それは十分に画像化されたニューロンからの散乱光（そして、その結果、ピックアップ信号）を避けるために削除する必要があります。我々は、均一領域20-5を見つけるROIから0μmでは、ほとんどの場合に適しています。 </li><li> レシオメトリック光学：結像光学系の正しいアライメントが明らかデュアル画像を生成するために重要です。レシオメトリックイメージングのための商業顕微鏡アタッチメントが用意されています。代替技術は、それぞれに別々の画像を記録しながら、急速に発光波長を切り替えることが高速フィルタホイールを使用して迅速な連続イメージングを用いることである。 </li><li> レシオメトリック分析：ここで説明した分析では、投資収益率を平均のおかげで堅牢な信号を生成し、比較的簡単なテクニックです。それは、ROIを選択するに分かる明るいオブジェクトが必要です。より洗練されたレシオメトリック分析が正確に整列させ、蛍光比は画素ごとに算出することができる、このような二重の画像をマッピングすることにより可能です。 </li></ol>

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著者らは、彼らが競合する経済的利益を持っていないことを宣言します。

遺伝的にコードされたカルシウム指示薬は広く、Cで利用されてきたelegansの神経生物学。多数のグループが電界にASJ応答でここで示すよう外部刺激に対する一次感覚ニューロンの応答を研究するために、これらの技術を採用してきた。顕著な例は、機械的なタッチの感覚、特定の化学物質、温度、電界12、16から19が含まれています。介在ニューロンと筋細胞の活?...

ここでは、Cの生体内カルシウムイメージングのための実用的な方法を提示する線虫の神経細胞。高い信号対雑音比を持つ遺伝的にコードされたカルシウム感受性蛍光色素の開発は、Cを作る神経生理学および活性の測定のために比較的簡単で費用対効果の高いシステムをエレガンス 。当社のイメージングは​​、一般的に利用可能な蛍光団の広視野蛍光イメージングを用いた標準的な複式顕微鏡を使って行われます。我々は、それぞれの長所と短所を議論し、様々なフルオロフォアおよび異なる試料調製を採用するいくつかのテクニックを紹介します。その後、データは2つの例の実験から示されている。ここに記載されている技術上の優れた追加のリソースがWormBook &quot;イメージング神経細胞や筋肉の活性&quot; R. Kerrによる、（記載されています<a href="http://www.wormbook.org" target="_blank">http://www.wormbook.org</a> ）3。 genetiの2つの主要なクラス的にエンコードされた蛍光カルシウム記者は、一般的にC言語で使用されているエレガンス ：単一チャネルのGCaMPとFRETベースのカメレオン。我々は方法を説明し、それぞれによって生成されるデータの例を示します。 GCaMPは、周囲のカルシウム濃度に敏感で修正された緑色蛍光タンパク質（GFP）に基づいています。これは、カルモジュリンによるカルシウムの結合が効率蛍光確認2にGFP分子をもたらすように、GFPの融合と高カルシウム親和性タンパク質カルモジュリンによって達成される。これらのフルオロフォアの最近の進歩は、カルシウム濃度の生理的範囲と合理的に高速〜95ミリ秒の立ち上がり時間の動態および〜650ミリ秒の減衰時間が4以上の蛍光強度の最大500％増加と優れた信号の大きさを生成します。比較的短い期間（分）をかけて、これらの大規模な信号は低解像度のイメージングを可能にする（低倍率）と、行儀のinitが与えられたことができますIALベースライン測定、連続ラインまたは比較測定の必要性を否定する。 カメレオンは、2つの独立したチャンネルまたは波長1を比較するレシオメトリック測定を生成FRETベースの蛍光団であるという利点があります。それはカルモジュリンタンパクによって連結された2つの別々の蛍光色素分子（水色と黄色発光蛍光タンパク質、CFPとYFP）で構成されています。錯体は、CFPを励起する青色光（440 nm）を照射する。カルシウムの結合はYFP（アクセプター）へCFP（ドナー）からの蛍光共鳴エネルギー移動（FRET）を増加させるとCFPの発光（480 nm）は減少とYFP発光（535 nm）を増加させることを引き起こして、より緊密フルオロフォアをもたらし。相対的なカルシウムレベルがYFP / CFP強度の比として測定されます。カメレオン動態は〜1秒、3秒〜5の減衰時間の立ち上がり時間を持つようにインビボで測定GCaMPのそれよりも遅いです。しかし、逆に信号を移動の比率は、信号の大きさを増大させ、蛍光物質濃度、動きやフォーカスドリフトと漂白の変化による可能アーティファクトの数を補正します。 遺伝的にコードされた蛍光レポーターは、外因的に投与されたプローブとCで必要な試料調製の大半を否定elegansの小さな透明の本体はシンプルな広視野蛍光を用いて無傷動物内の撮像を可能にします。試料調製における主要な技術的課題は、安全に動物を固定することである。それぞれの長所と短所とは異なる一般的に使用される技術が数多くあります。動物を麻痺させる薬剤を使用することで、実装が容易であり、1つの準備（レバミゾール、つかむために筋肉組織を引き起こしコリン作動薬は一般的に6を使用されている）上に複数の動物の取付けができます。Cで虫も、物理的にマウントすることによって、固定化することができる堅い10パーセントアガロース7,8で。動物生理学上の影響を最小限に抑えることは、長期的なイメージング（時間）と、複数の動物の回復が可能になりますが、より技術的に困難である。これらの手法の両方は、動物への物理的アクセスを制限（カバースリップの下にある）、したがって、唯一の特定の実験刺激（光、温度、電界やレーザー損傷など）で使用することができます。そのような化学物質のタッチや管理などの物理的なアクセスが必要な刺激は、多くの研究では、正常にCをくぎ付けにしている代わりに虫 （獣医グレード接着剤を使用して）9。これは技術的に困難である、単一の動物の準備であり、動物の回復を許可していません。最後に、多数の微小流体デバイスは、物理的に温度を抑えることが採用されてきた虫 、動物の生理機能を維持する刺激のほとんどのタイプ（装置設計に依存します）への暴露を可能と動物の迅速な交換とリカバリを有効にすることができます<sup&gt; 10、11。しかしマイクロフルイディクスは、設計、製造、実装に追加の技術的なスキルや能力を必要とします。固定化された動物では、アクティビティと刺激応答は一般的感覚と介在ニューロンで測定することができます。運動ニューロンの活動は、移動動物におけるイメージングのための、より高度な技術を必要とします。ここでは、薬理学的な麻痺と硬いアガロースと固定化の二つの最も簡単な手法を採用する詳細な方法を紹介します。 ここで紹介する方法はCの神経活性および細胞生理機能を測定するために用いることができるエレガンス 。我々は、それぞれの例を参考にしてください外部電場にASJニューロンの感覚応答を測定するGCaMP使用しており、ニューロンのレーザー損傷に対する生理カルシウム応答を測定するためにカメレオンを使用しています。これらの例は、蛍光色素分子の2つのタイプの利点と欠点を示しており、システムで可能なことを示しています。

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Name of Reagent/Material</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalog Number</td>
 <td>Comments</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Eclipse Ti-U inverted 
 microscope</td>
 <td>Nikon</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Intensilight HG Illuminator</td>
 <td>Nikon</td>
 <td>C-HGFI</td>
 <td>Fluorescent light source</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>CFI Plan Apo VC 60X Oil</td>
 <td>Nikon</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Optical table or 3'X3' optical 
 grade breadboard</td>
 <td>Thor Labs</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>If an optical table is not used an 
 optical grade breadboard on a 
 solid laboratory bench should 
 suffice.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Clara Interline Camera</td>
 <td>Andor 
 Technology</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>High-sensitivity CCD camera</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>wtGFP Longpass Emission</td>
 <td>Chroma Technology 
 Corp.</td>
 <td>41015</td>
 <td>GFP filter set for imaging GCaMP</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Filter 440 +/- 10 nm</td>
 <td>Chroma</td>
 <td>D440/20x EX</td>
 <td>excitation filter for cameleon</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Dichroic mirror &gt; 455 nm 
 longpass</td>
 <td>Chroma</td>
 <td>455DCLP BS</td>
 <td>microscope dichroic for cameleon 
 imaging</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Dichroic mirror &gt; 515 nm 
 longpass</td>
 <td>Chroma</td>
 <td>515DCLP BS</td>
 <td>dichroic mirror for cameleon 
 imaging</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Filter 535 +/- 15 nm</td>
 <td>Chroma</td>
 <td>D535/30m EM</td>
 <td>YFP emission filter</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Filter 480 +/- 20 nm</td>
 <td>Chroma</td>
 <td>D485/40m EM</td>
 <td>CFP emission filter</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Lens, 200 mm, Achromat</td>
 <td>Thor Labs</td>
 <td>AC508-200-A1</td>
 <td>Relay lens for FRET optics (3)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Silver broadband mirror</td>
 <td>Thor Labs</td>
 <td>ME2S-P01</td>
 <td>FRET optics (2)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>NGM buffer</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Levamisole</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>&nbsp;</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Polybead Microspheres</td>
 <td>Polysciences, Inc.</td>
 <td>08691-10, 2.5% by 
 volume, 50 nm 
 diameter</td>
 <td>polystyrene nanoparticles for C. 
 elegans immobilization</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Transgenic strain, Strain 
 gpa-9::GCaMP3(in pha-1; 
 him-5 bkg) </td>
 <td>Sternberg Lab</td>
 <td>Strain PS6388</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Transgenic strain, mec- 
 4::YC3.60</td>
 <td>Gabel Lab</td>
 <td>Strain CG1B</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

in vivo neuronal calcium imaging in c. elegans

線虫C. elegansは、in vivoで比較的簡単、低コスト神経イメージングのための理想的なモデル生物である。その小さな透明なボディとシンプルな、よく特徴付けられた神経系が無傷動物内の任意のニューロンの同定および蛍光イメージングを可能にします。動物の生理機能への影響を最小限に抑えてシンプルな固定化技術は、拡張タイムラプスイメージングを可能にする。そのようなカメレオン1とGCaMP 2として遺伝的にコード化されたカルシウム感受性蛍光色素の開発は、細胞生理学と神経活動の両方に関係する神経細胞のカルシウムのin vivoイメージングが可能です。特定のニューロンにこれら蛍光体を発現している多数のトランスジェニック系統は、容易に入手可能であるか、十分に確立された技術を用いて構築することができる。ここでは、GCaMPとカメレオンの両方を使用して、in vivoでの単一ニューロン内のカルシウム動態を測定するための詳細な手順について説明します。我々は、利点とdisadvantを議論両方の年齢だけでなく、試料調製（動物固定化）と画像解析の様々な方法。外傷性のレーザー損傷にニューロンの生理的カルシウム応答を測定するためにカメレオンを使用した外部電場と2に特有のニューロンの感覚反応）を測定するGCaMPを使用した：1）最後に、我々は2つ​​の実験の結果を提示する。これらのようなカルシウムイメージング技術は、C で広く使用されていますエレガンスとは、遺伝的背景を越えて自由に移動する動物は、同時に複数のニューロンと比較して、測定値に拡張されました。Cでelegansは技術的シンプルさとコストで他のモデルシステムを超える利点を用いた in vivo神経イメージングのための堅牢で柔軟なシステムを提示する。

ここでは、2つの独立した実験の結果を提示する。最初は蛍光カルシウム記者が光学的に無傷での神経活動を監視するために使用できる方法の良い例を与えて、定義された外部の刺激に対して特定の感覚ニューロンの応答を測定することがGCaMP採用エレガンス 。第二は、カメレオンが一時的細胞内カルシウムは、このようにカルシウムの生理機能が生体内での単一セル内で...

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In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans

その小さな透明体、定評の神経解剖学と従順な遺伝学的手法および試薬のホストと、<em&gt; Cエレガンス</em&gt;のための理想的なモデル生物を作る<em生体内で&gt;</em比較的シンプルで低コストな技術を使用して&gt;神経イメージング。ここでは、遺伝的にコードされた蛍光カルシウムインジケーターを使用してそのまま成体内の単一ニューロン画像法を説明します。

Cの生体内神経カルシウムイメージングでエレガンス

The nematode worm C. elegans is an ideal model organism  for relatively simple, low cost neuronal imaging in vivo. Its small transparent body and simple, ...

in-vivo-neuronal-calcium-imaging-in-c-elegans

Research

JoVE Journal

Neuroscience

In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans

24.8K ビュー.  Boston University School of Medicine. その小さな透明体、定評の神経解剖学と従順な遺伝学的手法および試薬のホストと、 Cエレガンスのための理想的なモデル生物を作る神経イメージング。ここでは、遺伝的にコードされた蛍光カルシウムインジケーターを使用してそのまま成体内の単一ニューロン画像法を説明し...

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Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

The targeting and refinement of RGC projections to the midbrain is a popular and powerful model system for studying how precise patterns of neural connectivity form during development. In mice, retinofugal projections are arranged in a topographic manner and form eye-specific layers in the Lateral Geniculate Nucleus (dLGN) of the thalamus and the Superior Colliculus (SC). The development of these precise patterns of retinofugal projections has typically been studied by labeling populations of RGCs with fluorescent dyes and tracers, such as horseradish peroxidase1-4. However, these methods are too coarse to provide insight into developmental changes in individual RGC axonal arbor morphology that are the basis of retinotopic map formation. They also do not allow for the genetic manipulation of RGCs.
Recently, electroporation has become an effective method for providing precise spatial and temporal control for delivery of charged molecules into the retina5-11. Current retinal electroporation protocols do not allow for genetic manipulation and tracing of retinofugal projections of a single or small cluster of RGCs in postnatal mice. It has been argued that postnatal in vivo electroporation is not a viable method for transfecting RGCs since the labeling efficiency is extremely low and hence requires targeting at embryonic ages when RGC progenitors are undergoing differentiation and proliferation6. 
In this video we describe an in vivo electroporation protocol for targeted delivery of genes, shRNA, and fluorescent dextrans to murine RGCs postnatally. This technique provides a cost effective, fast and relatively easy platform for efficient screening of candidate genes involved in several aspects of neural development including axon retraction, branching, lamination, regeneration and synapse formation at various stages of circuit development. In summary we describe here a valuable tool which will provide further insights into the molecular mechanisms underlying sensory map development.

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

We demonstrate an in vivo electroporation protocol for transfecting single or small clusters of retinal ganglion cells (RGCs) and other retinal cell types in postnatal mice over a wide range of ages. The ability to label and genetically manipulate postnatal RGCs in vivo is a powerful tool for developmental studies.

によるマウス網膜神経節細胞のトランスフェクション in vivoでエレクトロポレーション

The targeting and refinement of RGC projections to the midbrain is a popular and powerful model system for studying how precise patterns of neural ...

神経科学

In vivo Laser Axotomy in C. elegans

Neurons communicate with other cells via axons and dendrites, slender membrane extensions that contain pre- or post-synaptic specializations. If a neuron is damaged by injury or disease, it may regenerate. Cell-intrinsic and extrinsic factors influence the ability of a neuron to regenerate and restore function. Recently, the nematode C. elegans has emerged as an excellent model organism to identify genes and signaling pathways that influence the regeneration of neurons1-6. The main way to initiate neuronal regeneration in C. elegans is laser-mediated cutting, or axotomy. During axotomy, a fluorescently-labeled neuronal process is severed using high-energy pulses. Initially, neuronal regeneration in C. elegans was examined using an amplified femtosecond laser5. However, subsequent regeneration studies have shown that a conventional pulsed laser can be used to accurately sever neurons in vivo and elicit a similar regenerative response1,3,7.
We present a protocol for performing in vivo laser axotomy in the worm using a MicroPoint pulsed laser, a turnkey system that is readily available and that has been widely used for targeted cell ablation. We describe aligning the laser, mounting the worms, cutting specific neurons, and assessing subsequent regeneration. The system provides the ability to cut large numbers of neurons in multiple worms during one experiment. Thus, laser axotomy as described herein is an efficient system for initiating and analyzing the process of regeneration.

In vivo Laser Axotomy in C. elegans

A protocol to cut neurons in C. elegans with a MicroPoint pulsed laser is presented. We describe setting up the system, immobilizing worms, and severing labeled neurons. Advantages include a relatively low-cost system and the ability to sever neuronal processes or ablate cells in vivo.

Cの生体レーザー軸索切断にエレガンス

Neurons communicate with other cells via axons and dendrites, slender membrane extensions that contain pre- or post-synaptic specializations. If a neuron ...

Imaging Neuronal Responses in Slice Preparations of Vomeronasal Organ Expressing a Genetically Encoded Calcium Sensor

The vomeronasal organ (VNO) detects chemosensory signals that carry information about the social, sexual and reproductive status of the individuals within the same species 1,2. These intraspecies signals, the pheromones, as well as signals from some predators 3, activate the vomeronasal sensory neurons (VSNs) with high levels of specificity and sensitivity 4. At least three distinct families of G-protein coupled receptors, V1R, V2R and FPR 5-14, are expressed in VNO neurons to mediate the detection of the chemosensory cues. To understand how pheromone information is encoded by the VNO, it is critical to analyze the response profiles of individual VSNs to various stimuli and identify the specific receptors that mediate these responses.
The neuroepithelia of VNO are enclosed in a pair of vomer bones. The semi-blind tubular structure of VNO has one open end (the vomeronasal duct) connecting to the nasal cavity. VSNs extend their dendrites to the lumen part of the VNO, where the pheromone cues are in contact with the receptors expressed at the dendritic knobs. The cell bodies of the VSNs form pseudo-stratified layers with V1R and V2R expressed in the apical and basal layers respectively 6-8. Several techniques have been utilized to monitor responses of VSNs to sensory stimuli 4,12,15-19. Among these techniques, acute slice preparation offers several advantages. First, compared to dissociated VSNs 3,17, slice preparations maintain the neurons in their native morphology and the dendrites of the cells stay relatively intact. Second, the cell bodies of the VSNs are easily accessible in coronal slice of the VNO to allow electrophysiology studies and imaging experiments as compared to whole epithelium and whole-mount preparations 12,20. Third, this method can be combined with molecular cloning techniques to allow receptor identification.
Sensory stimulation elicits strong Ca2+ influx in VSNs that is indicative of receptor activation 4,21. We thus develop transgenic mice that express G-CaMP2 in the olfactory sensory neurons, including the VSNs 15,22. The sensitivity and the genetic nature of the probe greatly facilitate Ca2+ imaging experiments. This method has eliminated the dye loading process used in previous studies 4,21. We also employ a ligand delivery system that enables application of various stimuli to the VNO slices. The combination of the two techniques allows us to monitor multiple neurons simultaneously in response to large numbers of stimuli. Finally, we have established a semi-automated analysis pipeline to assist image processing.

The vomeronasal organ (VNO) detects intraspecies chemical signals that convey social and reproductive information. We have performed Ca2+ imaging experiments using transgenic mice expressing G-CaMP2 in VNO tissue. This approach allows us to analyze the complicated response patterns of the vomeronasal neurons to large numbers of pheromone stimuli.

遺伝的にコードされたカルシウムセンサーを発現する鋤鼻器のスライス標本のイメージング神経細胞応答

The vomeronasal organ (VNO) detects chemosensory signals that carry information about the social, sexual and reproductive status of the individuals within ...

Automated Quantification of Synaptic Fluorescence in C. elegans

Synapse strength refers to the amplitude of postsynaptic responses to presynaptic neurotransmitter release events, and has a major impact on overall neural circuit function. Synapse strength critically depends on the abundance of neurotransmitter receptors clustered at synaptic sites on the postsynaptic membrane. Receptor levels are established developmentally, and can be altered by receptor trafficking between surface-localized, subsynaptic, and intracellular pools, representing important mechanisms of synaptic plasticity and neuromodulation. Rigorous methods to quantify synaptically-localized neurotransmitter receptor abundance are essential to study synaptic development and plasticity. Fluorescence microscopy is an optimal approach because it preserves spatial information, distinguishing synaptic from non-synaptic pools, and discriminating among receptor populations localized to different types of synapses. The genetic model organism Caenorhabditis elegans is particularly well suited for these studies due to the small size and relative simplicity of its nervous system, its transparency, and the availability of powerful genetic techniques, allowing examination of native synapses in intact animals.
Here we present a method for quantifying fluorescently-labeled synaptic neurotransmitter receptors in C. elegans. Its key feature is the automated identification and analysis of individual synapses in three dimensions in multi-plane confocal microscope output files, tabulating position, volume, fluorescence intensity, and total fluorescence for each synapse. This approach has two principal advantages over manual analysis of z-plane projections of confocal data. First, because every plane of the confocal data set is included, no data are lost through z-plane projection, typically based on pixel intensity averages or maxima. Second, identification of synapses is automated, but can be inspected by the experimenter as the data analysis proceeds, allowing fast and accurate extraction of data from large numbers of synapses. Hundreds to thousands of synapses per sample can easily be obtained, producing large data sets to maximize statistical power. Considerations for preparing C. elegans for analysis, and performing confocal imaging to minimize variability between animals within treatment groups are also discussed. Although developed to analyze C. elegans postsynaptic receptors, this method is generally useful for any type of synaptically-localized protein, or indeed, any fluorescence signal that is localized to discrete clusters, puncta, or organelles.
The procedure is performed in three steps: 1) preparation of samples, 2) confocal imaging, and 3) image analysis. Steps 1 and 2 are specific to C. elegans, while step 3 is generally applicable to any punctate fluorescence signal in confocal micrographs.

Automated Quantification of Synaptic Fluorescence in C. elegans

The abundance of neurotransmitter receptors clustered at synapses strongly influences synaptic strength. This method quantifies fluorescently-labeled neurotransmitter receptors in three dimensions with single-synapse resolution in C. elegans, allowing hundreds of synapses to be rapidly characterized within a single sample without distortions introduced by z-plane projection.

シナプス蛍光の自動定量<em&gt; C.エレガンス</em

Synapse strength refers to the amplitude of postsynaptic responses to presynaptic neurotransmitter release events, and has a major impact on overall ...

In Vivo Imaging of Dauer-specific Neuronal Remodeling in C. elegans

The mechanisms controlling stress-induced phenotypic plasticity in animals are frequently complex and difficult to study in vivo. A classic example of stress-induced plasticity is the dauer stage of C. elegans. Dauers are an alternative developmental larval stage formed under conditions of low concentrations of bacterial food and high concentrations of a dauer pheromone. Dauers display extensive developmental and behavioral plasticity. For example, a set of four inner-labial quadrant (IL2Q) neurons undergo extensive reversible remodeling during dauer formation. Utilizing the well-known environmental pathways regulating dauer entry, a previously established method for the production of crude dauer pheromone from large-scale liquid nematode cultures is demonstrated. With this method, a concentration of 50,000 - 75,000 nematodes/ml of liquid culture is sufficient to produce a highly potent crude dauer pheromone. The crude pheromone potency is determined by a dose-response bioassay. Finally, the methods used for in vivo time-lapse imaging of the IL2Qs during dauer formation are described.

In Vivo Imaging of Dauer-specific Neuronal Remodeling in C. elegans

Following exposure to specific environmental stressors, the nematode Caenorhabditis elegans undergoes extensive phenotypic plasticity to enter into a stress-resistant &#8216;dauer&#8217; juvenile stage. We present methods for the controlled induction and imaging of neuroplasticity during dauer.

CのDauer固有の神経リモデリングのin vivoイメージングエレガンス

The mechanisms controlling stress-induced phenotypic plasticity in animals are frequently complex and difficult to study in vivo. A classic example of ...

In Vivo Functional Brain Imaging Approach Based on Bioluminescent Calcium Indicator GFP-aequorin

Functional in vivo imaging has become a powerful approach to study the function and physiology of brain cells and structures of interest. Recently a new method of Ca2+-imaging using the bioluminescent reporter GFP-aequorin (GA) has been developed. This new technique relies on the fusion of the GFP and aequorin genes, producing a molecule capable of binding calcium and&#160;&#8212; with the addition of its cofactor coelenterazine &#8212; emitting bright light that can be monitored through a photon collector. Transgenic lines carrying the GFP-aequorin gene have been generated for both mice and Drosophila. In Drosophila, the GFP-aequorin gene has been placed under the control of the GAL4/UAS binary expression system allowing for targeted expression and imaging within the brain. This method has subsequently been shown to be capable of detecting both inward Ca2+-transients and Ca2+-released from inner stores. Most importantly it allows for a greater duration in continuous recording, imaging at greater depths within the brain, and recording at high temporal resolutions (up to 8.3 msec). Here we present the basic method for using bioluminescent imaging to record and analyze Ca2+-activity within the mushroom bodies, a structure central to learning and memory in the fly brain.

In Vivo Functional Brain Imaging Approach Based on Bioluminescent Calcium Indicator GFP-aequorin

Here we present a novel Ca2+-imaging approach using a bioluminescent reporter. This approach uses a fused construct GFP-aequorin which binds to Ca2+ and emits light, eliminating the need for light excitation. Significantly this method permits long continuous imaging, access to deep brain structures and high temporal resolution.

生物発光カルシウムインジケーター、GFPエクオリンに基づいて生体内脳機能イメージングのアプローチで

Functional in vivo imaging has become a powerful approach to study the function and physiology of brain cells and structures of interest. Recently a new ...

Using an Adapted Microfluidic Olfactory Chip for the Imaging of Neuronal Activity in Response to Pheromones in Male C. Elegans Head Neurons

The use of calcium indicators has greatly enhanced our understanding of neural dynamics and regulation. The nematode Caenorhabditis elegans, with its completely mapped nervous system and transparent anatomy, presents an ideal model for understanding real-time neural dynamics using calcium indicators. In combination with microfluidic technologies and experimental designs, calcium-imaging studies using these indicators are performed in both free-moving and trapped animals. However, most previous studies utilizing trapping devices, such as the olfactory chip described in Chronis et al., have devices designed for use in the more common hermaphrodite, as the less common male is both morphologically and structurally dissimilar. An adapted olfactory chip was designed and fabricated for increased efficiency in male neuronal imaging with using young adult animals. A turn was incorporated into the worm loading port to rotate the animals and to allow for the separation of the individual neurons within a bilateral pair in 2D imaging. Worms are exposed to a controlled flow of odorant within the microfluidic device, as described in previous hermaphrodite studies. Calcium transients are then analyzed using the open-source software ImageJ. The procedure described herein should allow for an increased amount of male-based C. elegans calcium imaging studies, deepening our understanding of the mechanisms of sex-specific neuronal signaling.

Using an Adapted Microfluidic Olfactory Chip for the Imaging of Neuronal Activity in Response to Pheromones in Male C. Elegans Head Neurons

The use of an adapted &#34;olfactory chip&#34; for the efficient calcium imaging of C. elegans males is described here. Studies of male exposure to glycerol and a pheromone are also shown.

適応マイクロ嗅覚を用いた男性c. の Elegans頭ニューロンのフェロモン応答における神経活動のイメージング

The use of calcium indicators has greatly enhanced our understanding of neural dynamics and regulation. The nematode Caenorhabditis elegans, with its ...

Two-photon Calcium Imaging in Neuronal Dendrites in Brain Slices

Calcium (Ca2+) imaging is a powerful tool to investigate the spatiotemporal dynamics of intracellular Ca2+ signals in neuronal dendrites. Ca2+ fluctuations can occur through a variety of membrane and intracellular mechanisms and play a crucial role in the induction of synaptic plasticity and regulation of dendritic excitability. Hence, the ability to record different types of Ca2+ signals in dendritic branches is valuable for groups studying how dendrites integrate information. The advent of two-photon microscopy has made such studies significantly easier by solving the problems inherent to imaging in live tissue, such as light scattering and photodamage. Moreover, through combination of conventional electrophysiological techniques with two-photon Ca2+ imaging, it is possible to investigate local Ca2+ fluctuations in neuronal dendrites in parallel with recordings of synaptic activity in soma. Here, we describe how to use this method to study the dynamics of local Ca2+ transients (CaTs) in dendrites of GABAergic inhibitory interneurons. The method can be also applied to studying dendritic Ca2+ signaling in different neuronal types in acute brain slices.

We present a method combining whole-cell patch-clamp recordings and two-photon imaging to record Ca2+ transients in neuronal dendrites in acute brain slices.

脳スライスにおける神経樹状突起における 2 光子カルシウム イメージング

Calcium (Ca2+) imaging is a powerful tool to investigate the spatiotemporal dynamics of intracellular Ca2+ signals in neuronal dendrites. Ca2+ ...

Ratiometric Calcium Imaging of Individual Neurons in Behaving Caenorhabditis Elegans

It has become increasingly clear that neural circuit activity in behaving animals differs substantially from that seen in anesthetized or immobilized animals. Highly sensitive, genetically encoded fluorescent reporters of Ca2+ have revolutionized the recording of cell and synaptic activity using non-invasive optical approaches in behaving animals. When combined with genetic and optogenetic techniques, the molecular mechanisms that modulate cell and circuit activity during different behavior states can be identified.
Here we describe methods for ratiometric Ca2+ imaging of single neurons in freely behaving Caenorhabditis elegans worms. We demonstrate a simple mounting technique that gently overlays worms growing on a standard Nematode Growth Media (NGM) agar block with a glass coverslip, permitting animals to be recorded at high-resolution during unrestricted movement and behavior. With this technique, we use the sensitive Ca2+ reporter GCaMP5 to record changes in intracellular Ca2+ in the serotonergic Hermaphrodite Specific Neurons (HSNs) as they drive egg-laying behavior. By co-expressing mCherry, a Ca2+-insensitive fluorescent protein, we can track the position of the HSN within ~ 1 &#181;m and correct for fluctuations in fluorescence caused by changes in focus or movement. Simultaneous, infrared brightfield imaging allows for behavior recording and animal tracking using a motorized stage. By integrating these microscopic techniques and data streams, we can record Ca2+ activity in the C. elegans egg-laying circuit as it progresses between inactive and active behavior states over tens of minutes.

Ratiometric Calcium Imaging of Individual Neurons in Behaving Caenorhabditis Elegans

This protocol describes the use of genetically encoded Ca2+ reporters to record changes in neural activity in behaving Caenorhabditis elegans worms. &#8195;

線虫の行動で個々 のニューロンのレシオ メトリック カルシウム イメージング

It has become increasingly clear that neural circuit activity in behaving animals differs substantially from that seen in anesthetized or immobilized ...

Quantitative Approaches for Scoring in vivo Neuronal Aggregate and Organelle Extrusion in Large Exopher Vesicles in C. elegans

Toxicity of misfolded proteins and mitochondrial dysfunction are pivotal factors that promote age-associated functional neuronal decline and neurodegenerative disease across species. Although these neurotoxic challenges have long been considered to be cell-intrinsic, considerable evidence now supports that misfolded human disease proteins originating in one neuron can appear in neighboring cells, a phenomenon proposed to promote pathology spread in human neurodegenerative disease.
C. elegans adult neurons that express aggregating proteins can extrude large (~4 &#181;m) membrane-surrounded vesicles that can include the aggregated protein, mitochondria, and lysosomes. These large vesicles are called &#8220;exophers&#8221; and are distinct from exosomes (which are about 100x smaller and have different biogenesis). Throwing out cellular debris in exophers may occur by a conserved mechanism that constitutes a fundamental, but formerly unrecognized, branch of neuronal proteostasis and mitochondrial quality control, relevant to processes by which aggregates spread in human neurodegenerative diseases.
While exophers have been mostly studied in animals that express high copy transgenic mCherry within touch neurons, these protocols are equally useful in the study of exophergenesis using fluorescently tagged organelles or other proteins of interest in various classes of neurons.
Described here are the physical features of C. elegans exophers, strategies for their detection, identification criteria, optimal timing for quantitation, and animal growth protocols that control for stresses that can modulate exopher production levels. Together, details of protocols outlined here should serve to establish a standard for quantitative analysis of exophers across laboratories. This document seeks to serve as a resource in the field for laboratories seeking to elaborate molecular mechanisms by which exophers are produced and by which exophers are reacted to by neighboring and distant cells.

Quantitative Approaches for Scoring in vivo Neuronal Aggregate and Organelle Extrusion in Large Exopher Vesicles in C. elegans

This protocol describes approaches for detection and quantitation of large aggregate and/or organelle extrusions (~4 &#181;m) produced by C. elegans cells in the form of membrane-bound exophers. We describe strains, growth conditions, scoring criteria, timing, and microscopy considerations needed to facilitate dissection of this debris expulsion mechanism.