この作品は、NIH / NIGMS / MBRを（グラント58268）、NIH / NCRR / RCMI（グラントG12-RR03034）、ジョージアリサーチアライアンス資金助成GRA.VAC08.W、NIH / NIAID / NRSA助成F31AI091484、エモリーCFAR助成P30によってサポートされていましたA1050409。この調査はNIH / NCRRから研究設備整備グラント＃C06 RR18386からのサポートで構成施設で実施された。 Jurkat細胞を、20組のHIV-1 Nefのペプチド、ならびにウサギ抗HIV-1 Nefの抗血清は、NIH AIDSリサーチ＆文献試薬プログラム（ロックビル、MD）から入手した。

I.は、生物学的解析でショートペプチドの使用 I.1。ペプチドを用いて生物学的に機能モチーフのマッピング<ol><li> Nefの走査ペプチドで細胞を処理する<ol><li>関心領域を走査するペプチドのセットを調達。全体のHIV-1のNefタンパク質（205 AA）をまたがる10のアミノ酸重なると私たちの実験では、20merのペプチドについては、エイズ試薬プログラムから得られた。ペプチドは、次のように個別に分析しています： </li><li>細胞培養培地にペプチド10ngの/ mlを加える。 </li><li>細胞培養をジャーカットするプレートあたり培地10mlのを追加します。 </li><li> 37℃で24時間培養する℃に</li></ol></li><li>ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ媒介dUTPをビオチンニック末端標識（TUNEL）アポトーシスのアッセイ<ol><li> 1X PBSで細胞を洗浄し、1×PBS、pH7.4の中の4％パラホルムアルデヒドで室温で30分間固定する。 </li><li> 10 1X PBSで洗浄し、0.1％と透過性トリトンX-100室温で分。 </li><li> 1X PBSで2回細胞を洗浄します。 </li><li>コンピュータ制御顕微鏡システム上落射蛍光で染色された細胞をカウントします。 </li></ol></li></ol> I.2。ペプチドを用いた競合阻害分析<ol><li>チャリオットタンパク質デリバリー試薬キットを用いたペプチドの同時トランスフェクション<ol><li>トランスフェクション反応混合物につき、と100μlの最終容量を、wtNef-GFPプラスミドDNA1μgのとSMRモチーフ内の個々のアミノ酸のアラニン置換を含む野生型SMRドメイン由来のペプチド、またはペプチドどちら100ngのを希釈1X PBS。 </li><li>滅菌水で100μlの最終容量にチャリオット試薬の1/10に希釈6μLを希釈し、希釈したDNA-ペプチドミックスと組み合わせる。 </li><li>戦車/ DNA-ペプチド複合体の形成を可能にするために30分間室温でインキュベートする。 </li><li> 5分間600×gで遠心分離によってペレット3×10 5 Jurkat細胞。 </li><li> 1X PBSで2回細胞を洗浄し、チャリオット/ DNA-ペプチド複合体で再懸濁します。 </li><li>懸濁液に無血清RPMI1640培地400μlのを追加し、2時間37℃で培養プレートで細胞を培養する。 </li><li>各プレートに10％FBSを含む新鮮なRPMI 1640培地1mlを加え、37℃で48時間、細胞をインキュベート℃に</li><li>収穫細胞や蛍光顕微鏡法によるトランスフェクション効率を決定する。 </li></ol></li><li>ペプチド阻害のNEF-GFP分泌蛍光プレートリーダーアッセイ<ol><li>収穫された細胞からの無細胞馴化培地を収集し、96ウェル黒色マイクロタイタープレートの各ウェルに100μlのを転送します。 </li><li>励起波長485 nmおよび発光波長の相対蛍光単位で515 NmのテカンGENEiosの蛍光のメディアでGFPの蛍光を測定します。 </li><li>コントロールでGFP蛍光のレベルを設定する（セルからメディアがネフ-GFPとスクランブルペプチドと共トランスフェ）100％時。 </li><li>ネフ-GFPの分泌の変化を判断するために、様々なSMRペプチドを共トランスフェクトした細胞からメディアにおけるGFP蛍光のレベルにこれを比較してください。 </li></ol></li></ol> I.3。餌としてペプチドを用いMotifの結合パートナーを分離<ol><li> SMRのペプチドと免疫共沈降<ol><li> 37℃、10％FBSを含有するRPMI 1640培地中Jurkat細胞を成長さT-75組織培養フラスコ内℃、4℃で20分間、1,000×gで遠心分離によって細胞をペレット化℃でトランスフェクション効率を決定し、蛍光顕微鏡下でプレートを配置することにより、画像をキャプチャし、その後、合計と標識された細胞をカウントし、パーセント標識された細胞を決定します。 </li><li> 1ミリリットル1X PBSで細胞ペレットを再懸濁し、そして1.5 mlのエッペンドルフチュー​​ブに移す。 1分間、1,000×gで遠心。穏やかなピペッティングにより1ミリリットルα-FLAGの溶解バッファーでペレットを再懸濁します。溶解バッファー：ミックス50mMトリス•HClでpHは7.4、150mMのナトリウムCHLoride [塩化ナトリウム]、1mMのEDTA、1％トリトンX-100、1mMのフェニルメチルスルホニルフッ化[PMSF]、および哺乳動物細胞や組織抽出物で使用するために10ミリリットル/μlのプロテ​​アーゼインヒビターカクテル[PIC;シグマ]。使用する前に、すぐに確認します。 </li><li>差動で5分間2,000 xgで遠心懸濁液を、ペレットに10分、細胞破片やDNA、それぞれ13,000 xgで。上清（以下、​​ &quot;溶解物&quot;ともいう）を収集。 </li><li>ライセートタンパク質1mgのとSMRwtまたはSMRmutペプチド抗FLAG M2アフィニティーゲル（;シグマ以下 &quot;樹脂&quot;と呼ばれる）20μlのいずれかに1μgのを追加します。ここで使用SMRwtとSMRmut両方がペプチドに埋め込まFLAGタグ配列を持っていることに注意してください。共同IP緩衝液中で1ミリリットル（α-FLAG溶解バッファーマイナスPMSFとPIC）の最終体積に混合物を持参してください。転倒回転に4℃で一晩混合物をインキュベートする。陰性対照として、いずれかのペプチドの非存在下での樹脂との溶解液をインキュベート。 </li><li>ペレT 5,000で微量遠心により樹脂 - 30秒8,000×gで。樹脂サンプルを取り扱う前に2分のために解決することを許可した後、上清を吸引。任意の樹脂を転送しないように注意しながら、先端の細いピペットチップ、またはハミルトンシリンジで上清を取り除きます。先端の細いピペットチップは、それが部分的に閉じられるまでプラスチックピペットチップの開口部を挟持する鉗子を用いて作製することができる。洗浄バッファーを500μl（50mMトリス•塩酸pH7.4の、および150mMのNaCl）で樹脂を4回洗浄します。室温で30分間ロッカー/シェーカー上洗浄バッファーとインキュベート50μlの3X FLAGペプチド15μgの（シグマ）と結合した細胞タンパク質を溶出。 </li><li>レムリ試料緩衝液（Bio-Rad社）で沸騰、続いてアセトン沈殿により溶出液を濃縮する。 4〜20％のTris-HCl基準プレキャストゲル（Bio-Rad社）のSDS-PAGEでタンパク質を分離します。クーマシーブリリアントブルーR-250（Bio-Rad社）を用いてゲルを染色。注：質量分析同定実験のために（ <stronG&gt;図4A）、各条件（SMRwt、SMRmut、あるいは全くペプチドとの共-IP）は4連で行われ、4つのすべての溶出液は複製/総タンパク入力4mgの合計前アセトン沈殿にプールしていた条件）。 </li></ol></li><li>ネフ-GFPタンパク質と共免疫沈降<ol><li> 0.02％のTween 20（PBS-T）で1X PBS 1mlに抗GFPマウスモノクローナル2μgのとのDynabeadsプロテインG磁気ビーズ（Invitrogen社）を50μlを混ぜる。 4で1時間1.5 mlのエッペンドルフチュー​​ブに転倒回転との混合物をインキュベート℃に</li><li>上清を除去し、磁気プルダウンを許可する1.5 mlのMagnaSphereテクノロジー磁気分離スタンド（プロメガ社、マディソン、WI）にチューブを配置することによって、バッファからビーズを分離する。穏やかにピペッティングを用いたPBS-T 1mlの抗GFP被覆ビーズを洗浄してください。 </li><li> 1X RIPA 1mLでネフ-GFPトランスフェJurkat細胞+ 15メートルのために穏やかにピペッティングし、インキュベーションによってバッファを溶解氷の上である。 RIPA +バッファ：10X RIPA溶解緩衝液、pH7.4 [ミリポア、ベッドフォード、MA]滅菌水で1:10に希釈、0.02％アジ化ナトリウム[シグマ]、および0.1％ドデシル硫酸ナトリウム[SDS]、1mMのPMSF及び10μlのと/ mlのPICは、使用する前に、すぐに追加された。 </li><li>ペレットを10分間、2,000×gで微量遠心により細胞破片。上清（以下、​​ &quot;溶解物&quot;ともいう）を収集。 </li><li>抗GFP被覆ビーズに溶菌タンパク質1mgのを追加し、1X RIPA +バッファーが付いている1 mlに最終的なボリュームをもたらす、と4℃で1時間転倒回転との混合をインキュベート注：ペプチド競合研究のために、溶解物タンパク質1mgのは1X RIPAを1ml +バッファー、前抗GFP被覆ビーズに追加されるにSMRwtまたはSMRmutペプチド2μgのと共にプレインキュベートすることもできる。 </li><li>洗浄緩衝液1ml（50mMトリス•HClでpHを7.4、150mMのNaCl、および0.1％のTween 20）で再懸濁を通してビーズを洗浄。 4℃で5分のために転倒回転と共にインキュベートビーズfを分離ロム磁気分離スタンドを使用して洗浄します。それぞれ250ミリと300のNaClを含む洗浄バッファーでビーズ第二と第三の時間を洗ってください。 </li><li> 200μlのPBSにビーズを再懸濁し、きれいなチューブに混合物を転送し、磁気スタンドに洗浄からビーズを分離する。 95℃のLaemmliサンプル緩衝液で5分間°C、混合物を室温で10分間冷却し、次いで分離用マグネットスタンド上に混合物を配置し、上清を回収することができ（ &quot;溶出&quot;）50μlのビーズを沸騰。 </li><li> 8から16パーセントのトリス-HCl基準プレキャストゲルでSDS-PAGEによって溶出液のタンパク質を分離します。 </li></ol></li><li>質量分析<ol><li>物品税クマシー染色ゲルから目的のタンパク質バンド。 </li><li> 37で45分間℃で10mMの1,4 - ジチオスレイトール（DTT）のサンプルを減らす</li><li> 25℃で45分間、55 mMのヨードアセトアミド、℃でサンプルをアルキル化</li><li>試しグレードシングで一晩サンプルを消化37℃PSIN（Promega社）°C. </li><li> C-18 ZipTip（ミリポア社）で試料ペプチドを脱塩。 α-CHCマトリックス（Agilent Technologiesは、カリフォルニア州サンタクララ）でサンプルペプチドを混合し、MTPターゲットフレームIII（ブルカーダルト社、ビレリカ、MA）にそれらを見つける。 </li><li>タンデムマトリックス支援レーザー脱離/イオン化ブルカーダルトULTRAFLEX III TOF / TOFを使用して（MALDI-TOF/TOF）質量分析·飛行時間行う。 </li><li>マスコットアルゴリズム（使用してNCBI非冗長とスイス- ProtのデータベースへのMS / MSデータ比較<a href="http://www.matrixscience.com" target="_blank">www.matrixscience.comを</a> ）。 </li></ol></li><li>イムノブロット解析<ol><li> 4〜20％または8から16パーセントのトリス-HCl基準プレキャストゲル（Bio-Rad社）のSDS-PAGEによってタンパク質サンプルを分離する。ニトロセルロース膜に電気泳動バンドを転送します。 </li><li> 5分間;トリスでメンブレンを洗浄する（Bio-Rad社TBS）緩衝生理食塩水。 TTBSの5％脱脂乳を持つブロック（TBS 0.1％トゥイーン20）を、室温で振盪することによって1時間。 </li><li> 4℃で一晩振とうしながら、5％脱脂乳に特異的な一次抗体を用いたイムノブロッティング用膜を処理します。室温で1時間5％脱脂乳で二次HRPコンジュゲートのIgG（H + L）抗体、続いて20分間TTBSで洗ってください。 30-60分間TTBSで洗ってください。 </li><li>ウェスタンブロッティングルミノール試薬（サンタクルズ社、サンタクルーズ、カリフォルニア州）によってタンパク質バンドを検出します。写真フィルムにフィルタを公開します。注：いくつかの実験において、ストリッピング試薬は、異なる一次および二次抗体とのその後のハイブリダイゼーションメンブレン（ピアース、ロックフォード、IL）を除去するために使用された。 </li><li> Adobe Photoshopの5.0.2にX線フィルムをスキャンします。 ImageJのソフトウェア（国立衛生研究所、ベセスダ、MD）を使用して、デンシトメトリー分析を行う。 </li></ol></li></ol> II。機能解析で抗体阻害の利用 II.1。不格好なやつのコトランスフェクションチャリオットタンパク質デリバリー試薬キットを使用するIES <ol><li>トランスフェクション反応混合物につき、1X PBSで100μlの最終容量に、wtNef-GFPプラスミドDNA1μgのと抗モータリン抗体または抗α-チューブリン抗体のどちらか1μgのを希釈。注：これは、以前は、抗α-チューブリン抗体の同時トランスフェクションは、exNef分泌に検出可能な影響を与えず、従って、それはこれらの実験において有効陰性対照として役立つことが分かった。 </li><li>滅菌水で100μlの最終容量に原液チャリオット試薬の6μlの希釈し、希釈したDNA-抗体ミックスと組み合わせる。 </li><li>戦車/ DNA-抗体複合体の形成を可能にするために30分間室温でインキュベートする。 </li><li> 5分間600×gで遠心分離によってペレット3×10 5 Jurkat細胞。 </li><li> 1X PBSで2回細胞を洗浄し、チャリオット/ DNA-抗体複合体に再懸濁します。 </li><li>懸濁液に無血清RPMI1640培地400μlのを追加し、Cをインキュベート37℃で培養プレートでエルボで2時間C。 </li><li>各プレートに10％FBSを含む新鮮なRPMI 1640培地1mlを加え、37℃で48時間、細胞をインキュベート℃に</li></ol> II.2。抗体阻害のNEF-GFP分泌蛍光プレートリーダーアッセイ<ol><li>収穫された細胞からの無細胞馴化培地を収集し、96ウェル黒色マイクロタイタープレートの各ウェルに100μlのを転送します。 </li><li>励起波長485 nmおよび発光波長の相対蛍光単位で515 NmのテカンGENEiosの蛍光のメディアでGFPの蛍光を測定します。 </li><li>コントロールにおけるGFP蛍光のレベル（セルからメディアがネフ-GFPと抗α-チューブリン抗体で同時トランスフェクト）の100％に設定してください。 </li><li>ネフ-GFPの分泌の変化を判断するために抗モータリン抗体を共トランスフェクトした細胞からメディアにおけるGFP蛍光のレベルにこれを比較してください。 </li></ol>

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著者は、彼らが競合する経済的利益を持っていないことを宣言します。

エキソソーム売買経路がexNef分泌のエンジニアリング小説の阻害に有用であろう操作するネフの能力のメカニズムを理解する。 exNef分泌の阻害は、CD4 T細胞の枯渇とCIAそのドライブHIV / AIDSの病因を減少させる必要があります。この目標に向かって、私たちは、私たちがexNef分泌の遺伝学を分析し、関与する細胞タンパク質を決定するために開始するために許可された斬新な試薬および方法論の...

抗レトロウイルス療法の出現により、西部の世界のエイズ流行は鈍化したが、縮小しない、そしてHIVの蔓延は、世界中の主要な健康上の負担であり続けてきた。わずかに効果的なRV144タイ裁判を除いて、HIVワクチンは、これまで感染から守るための失敗を示している。したがって、追加の、潜在的な治療標的の研究はまだ保証されています。 CD4 T細胞枯渇とともに、永続的な一般的な免疫活性化は、HIV感染症の特徴です。この慢性的な免疫活性化（CIA）は、細胞の代謝回転、活性化され、差別化リンパ球亜集団、細胞の枯渇や老化、及び活性化誘導細胞死（AICD）1,2,3を経由してT細胞とB細胞の殺害の増加につながり、それはよく病気の進行4,5,6,7,8,9,10,11,12最強の予測因子の一つとして確立されています。しかし、メカニズムはCIAとCD4の基礎となるHIV感染T細胞枯渇は完全に解明されていない。 私たちの研究室や他の人からの証拠は、HIVタンパク質ネフは（負の調節因子）HIV-1感染細胞13,14からエキソソームでその分泌を誘導する前記疾患の進行のためのモデル（ 図1）に私たちを導いた。これらネフ含有エキソソーム（exNef）が感染していないCD4 T細胞15,16を含む細胞系統数のアポトーシスを誘導する。あるいは、単球/マクロファージexNefを変化させる遺伝子の発現パターン、 例えば、サイトカイン発現、およびスケジュールされていない免疫活性化状態を誘導すると思われる。証拠のこのボディは、CIAとCD4 T細胞枯渇exNefための重要な役割を示唆している。 エキソソーム売買経路がexNef分泌のエンジニアリング小説の阻害に有用であろう操作するネフの能力のメカニズムを理解する。 exNef分泌の阻害は、CD4 T細胞の枯渇を減少させるべきであるそしてCIAそのドライブHIV / AIDS発病。 HIV / AIDS疾患の進行と、このモデルの上に構築され、その後のデータのための我々のモデルにつながった証拠を集めるために、私たちは私たちがexNef分泌の遺伝学を分析するために許可された斬新な試薬および方法論の数を開発し、決定するために開始細胞タンパク質が関与。初期の研究では、Nefのタンパク質が、バイスタンダー細胞のアポトーシスを誘導し、Nefのトランスフェクトし、HIV感染細胞から細胞外に15を解放していることがわかった。 SDF-1α由来のペプチドは、（選択的スプライシングアルファ因子-1由来間質細胞、）以前に、完全長分子17の結合およびシグナル伝達活性の多くを保持することが示されていた。我々はNefとのペプチドは、完全なタンパク質のアポトーシス活性の一部、及びこれらのペプチドは、必ずしもNefのアポトーシスのドメインを含むであろうことを保持するかもしれないと推測した。これらのペプチドを同定し、その結果のNefするにはアポトーシスドメイン（s）は、私たちは、NIH AIDS研究およびリファレンス試薬プログラムからの20 HIV-1 Nefのスキャニングペプチドのセットを取得しました。これらの20-AAペプチド、その隣人の各重複10アミノ酸は、彼らの最後のアミノ酸、 すなわち N20スパンネフアミノ酸1-20、N30スパンネフアミノ酸11-30、など16の数で名前が付けられています。我々は、これらの細胞のアポトーシスを誘導したフルレングスのNefタンパク質に二つの異なる10-AAドメインを重複特定のペプチドに細胞外にT細胞を露出することがわかった。これらネフ由来アポトーシスペプチドのその後の分析は、物理的にこれらのペプチドが競争CXCR4とその天然のリガンドがSDF-1αの間の結合を阻害するために許可された結合動態とT細胞の表面上のケモカイン受容体CXCR4と相互作用する能力を明らかにした。最後に、CXCR4とNefのアポトーシス誘導ペプチド &#39;相互作用は、アポトーシスをもたらすこれらのT-細胞におけるストレス応答を誘導することが見出された。この証拠はQUICに私たちを許さKLYマップネフの機能ドメイン、例えばアラニンスキャニング変異誘発のような標準的なDNA変異誘発技術を使用して、はるかに長い時間かかったでしょうプロセス。また、これらの短いNefの由来ペプチドは、全長タンパク質におけるアポトーシスドメインの生物学的機能を保持することを示した。 外ネフ、T細胞、すなわちアポトーシスの役割を同定したので、私たちは、ネフは細胞から分泌されたかの理解を求めた。変異ネフコンストラクトのシリーズを使用して、我々は、HIV Nefの両方のN末端 ​​領域で高度に保存されたのNefタンパク質モチーフにマッピングされ、exNef分泌13のために重要であるそのアカゲザル同等SIV マック （サル免疫不全ウイルス）ネフ、。これらのモチーフの一つで、分泌の変更地域（SMR、66VGFPV70）は、どちらか大幅に削減または廃止exNef分泌その5つのアミノ酸のうちのいずれかのアラニン置換として、特に重要でした。アクティブなモチーフのCを介して細胞に送達する場合hariotタンパク質デリバリー試薬、FLAGペプチド配列（SMRwt）に取り付けられたSMRを含むペプチドは、両方のNefのトランスフェクトし、HIV感染細胞18からexNef分泌を阻害することが見出された。ペプチドと私たちのこれまでの経験に基づいて、我々は、分子やexNef分泌のネフSMRの役割のメカニズムを解明するために、このペプチドを使用することを決めた。 私達の&quot;baitタンパク質&quot;としてSMRwtペプチドを使用して、我々は非感染T細胞溶解物18からSMRの細胞結合パートナーを共同免疫沈降。 FLAGペプチド配列は、抗FLAGアフィニティー樹脂を用いSMRwtペプチドを捕捉するための便利なハンドルを提供した。 SMRwtペプチドの変異をアラニンに単一のバリンがexNef分泌の阻害を廃止するために十分であることが我々の以前の発見は、私たちがSMRに特異的ではないの共免疫沈降したタンパク質を排除するために使用する便利な、非常に特異的なコントロールペプチド（SMRmut）を同定した。 sのペプチドを用いpecific興味のあるドメインではなく、全長タンパク質は、私たちは、ネフ19内の他のドメインに結合する細胞因子の数十のスクリーニングをバイパスすることができました。 かつて我々はSMR-結合パートナーを同定し、論理的な次のステップは、同定された細胞の結合パートナーは、生物学的機能18のために重要であることを示すことだった。これを実現するための標準的な手順は、標的タンパク質に特異的なmiRNA又はsiRNA、および生物学的機能に続いてアッセイを用いてノックダウン効果のタンパク質レベルである。我々は、この場合には、SMR結合タンパク質をそのターゲットの産生を減少させる、標的mRNAの翻訳を阻害する、miRNAのノックダウンを行う。標的タンパク質のこの減少は、間接的な効果であり、おそらく標的タンパク質が入っ従って、我々はまた、活性を直接破壊することかどうかを判断するために、あまり一般的抗体阻害技術を用い役割を果たしている生物学的機能で遅延効果を有する標的タンパク質は、生物学的機能を低減または排除する。この手順では、標的タンパク質に対して惹起された抗体は、戦車試薬を用いて細胞にトランスフェクトされ、その関数のサイトから標的タンパク質と直接相互作用のいずれか封鎖、またはその関連結合ドメインを遮断する。この手順を介して標的タンパク質の阻害は、直接その機能を破壊し、さらに生物学的機能に標的タンパク質の重要性を確認することにより、RNAのノックダウン手順を補完することができる。 戦車試薬は、細胞にペプチドおよびタンパク質を送達するのに有効であるが、このプロセスは時間がかかると、実験の種類を制限するなどの長時間または繰り返し暴露およびインビボ動物試験で行うことができる。したがって、我々は、受動的に細胞に取り込まれる可能性ペプチドを生成するためにSMRwtペプチド（CPP-SMRwt）18細胞透過性ペプチド（CPP）シーケンスを添加培地から。このバージョンでは、阻害exNef分泌の元と同じくらい効果的であった。 これらの公表の実験から得られた証拠は、競争力の阻害を介して、全長タンパク質の機能に拮抗し、これらのモチーフを結合するタンパク質を分離するために、特定の機能的なモチーフを含む小さなペプチドの能力を示しています。一つは、これらの技術は、多くの実験プロトコルに有用であることを期待する。また、多くの細胞プロセスの工学新規なペプチド阻害するのに有効であるべきである。CPPの配列への結合によってさらに向上させることができる機能。

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Name of the reagent </td>
 <td>Company </td>
 <td>Catalogue number</td>
 <td>Comments (optional)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>20mer peptide set with 10 amino acid overlap</td>
 <td>NIH AIDS Research and Reference Reagent Program</td>
 <td>4641</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>TUNEL Assay</td>
 <td>Roche</td>
 <td>11 684 809 910</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Chariot Protein Delivery Reagent</td>
 <td>Active Motif</td>
 <td>30100</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Tecan GENEios fluorimeter</td>
 <td> (Tecan Group, Switzerland)</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>96-well black microtiter plate</td>
 <td>Corning</td>
 <td>3792</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>anti-FLAG M2 Affinity Gel</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>A2220</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Dynabeads Protein G magnetic beads </td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>100.03D</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>MagnaSphere Technology Magnetic Separation Stand (two position)</td>
 <td>Promega Corp., Madison, WI</td>
 <td>Z5332</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>C-18 ZipTip </td>
 <td>Millipore</td>
 <td>ZTC18S096</td>
 <td>C18 Resin (0.6 &mu;l or 0.2 &mu;l bed volumes). Oligonucleotides or small (&lt;50 kDa) proteins/ peptides in aqueous solution</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>MALDI TOF/TOF</td>
 <td>Bruker Daltonics ultraflex III TOF/TOF</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

peptide-based identification of functional motifs and their binding partners

我々の場合、HIV-1 Nefので、全長タンパク質で見つかったモチーフ由来特有の短いペプチドは、その生物学的機能を保持するだけでなく、競争力のある、全長タンパク質の機能を阻害することができるだけでなく。 20のNef走査ペプチドは、各々がその隣の10アミノ酸が重複する長さが20アミノ酸のセットは、アポトーシスの誘導のための責任のNefでモチーフを同定した。これらのアポトーシスモチーフを含むペプチドは、完全長のNef蛋白質に匹敵するレベルでアポトーシスを誘導した。ネフの分泌の変更地域（SMR）から派生した第二のペプチドは、エキソソームにネフの分泌（exNef）に関与する細胞のタンパク質と相互作用する能力を保持した。このSMRwtペプチドはNefのSMRのモチーフに特異的に結合する細胞タンパク質を単離するために、共免疫沈降実験で &quot;餌&quot;タンパク質として使用した。タンパク質のトランスフェクションおよび抗体阻害は、物理的に相互作用ベットを破壊するために使用された予期するとNefのモータリン、単離されたSMR結合タンパク質の一つであり、効果は、蛍光ベースのexNef分泌アッセイを用いて測定した。 SMRモチーフをバインド細胞タンパク質の完全長のネフをoutcompeteするSMRwtペプチドの能力、それexNef分泌の最初阻害する。このように、完全長のタンパク質に見出さモチーフ由来特定の短いペプチドのユニークな特性を利用してここに記載された技術を採用することにより、一つのタンパク質における機能モチーフの同定と病原性機能のペプチド系阻害剤の開発を加速させる可能性があります。

ペプチドを用いた生物学的に機能モチーフのマッピング。二つの領域は、アポトーシスを誘導するのNefタンパク質で同定された。ペプチド主導アポトーシスはN60（AA40-60）とN70（aa50-70）でピークに達し、そしてペプチドN100（AA80-100）でのバックグラウンドレベルに減少、ペプチドN50（aa30-50）を用いて（ 図2）先頭を観察された。 aa50-60を中心とした主要なモチーフ1（...

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Peptide-based Identification of Functional Motifs and their Binding Partners | Immunology and Infection | Video

Peptide-based Identification of Functional Motifs and their Binding Partners

エキソソームにおけるHIV-1 Nefの分泌のメカニズムを分析するための技術が記載されている。ネフとタンパク質トランスフェクション由来特有の短いペプチドは、構造、機能、ネフの分泌の変更地域の結合パートナーを決定するために悪用された。これらの手順は、多くの機械論的研究で一般的な関連性を持っている。

機能的モチーフとその結合パートナーのペプチドベース識別

Specific short  peptides derived from motifs found in full-length proteins, in our case HIV-1  Nef, not only retain their biological function, but can ...

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12.3K ビュー.  Morehouse School of Medicine. エキソソームにおけるHIV-1 Nefの分泌のメカニズムを分析するための技術が記載されている。ネフとタンパク質トランスフェクション由来特有の短いペプチドは、構造、機能、ネフの分泌の変更地域の結合パートナーを決定するために悪用された。これらの手順は、多くの機械論的研究で一般的な関連性を持っている。

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Particle Agglutination Method for Poliovirus Identification

In the Global Polio Eradication Initiative, laboratory diagnosis plays a critical role by isolating and identifying PV from the stool samples of acute flaccid paralysis (AFP) cases. In the World Health Organization (WHO) Global Polio Laboratory Network, PV isolation and identification are currently being performed by using cell culture system and real-time RT-PCR, respectively. In the post-eradication era of PV, simple and rapid identification procedures would be helpful for rapid confirmation of polio cases at the national laboratories. In the present study, we will show the procedure of novel PA assay developed for PV identification. This PA assay utilizes interaction of PV receptor (PVR) molecule and virion that is specific and uniform affinity to all the serotypes of PV. The procedure is simple (one step procedure in reaction plates) and rapid (results can be obtained within 2 h of reaction), and the result is visually observed (observation of agglutination of gelatin particles).

A recently developed novel particle agglutination (PA) assay utilizing virus receptor molecule allowed a rapid and easy identification of poliovirus (PV). In this article, we will show the procedure for the PA assay for PV identification.

ポリオウイルスの同定のための粒子凝集法

In the Global Polio Eradication Initiative, laboratory diagnosis plays a critical role by isolating and identifying PV from the stool samples of acute ...

免疫・感染学

Isolation of Functional Cardiac Immune Cells

Cardiac immune cells are gaining interest for the roles they play in the pathological remodeling in many cardiac diseases.1-5 These immune cells, which include mast cells, T-cells and macrophages; store and release a variety of biologically active mediators including cytokines and proteases such as tryptase.6-8 These mediators have been shown to be key players in extracellular matrix metabolism by activating matrix metalloproteinases or causing collagen accumulation by modulating the cardiac fibroblasts' function.9-11 However, available techniques for isolating cardiac immune cells have been problematic because they use bacterial collagenase to digest the myocardial tissue. This technique causes activation of the immune cells and thus a loss of function. For example, cardiac mast cells become significantly less responsive to compounds that cause degranulation.12 Therefore, we developed a technique that allows for the isolation of functional cardiac immune cells which would lead to a better understanding of the role of these cells in cardiac disease.13, 14
This method requires a familiarity with the anatomical location of the rat's xiphoid process, axilla and falciform ligament, and pericardium of the heart. These landmarks are important to increase success of the procedure and to ensure a higher yield of cardiac immune cells. These isolated cardiac immune cells can then be used for characterization of functionality, phenotype, maturity, and co-culture experiments with other cardiac cells to gain a better understanding of their interactions.

This method for isolating functional immune cells from the heart provides an alternative to the conventional methods of collagenase digestion, which causes unwanted immune cell activation, resulting in a decreased responsiveness of these cells. Our method of isolation yields functional cardiac immune cells by avoiding problems associated with enzymatic digestion.

機能心臓の免疫細胞の単離

Cardiac immune cells are gaining interest for the roles they play in the pathological remodeling in many cardiac diseases.1-5  These immune cells, which ...

Following in Real Time the Impact of Pneumococcal Virulence Factors in an Acute Mouse Pneumonia Model Using Bioluminescent Bacteria

Pneumonia is one of the major health care problems in developing and industrialized countries and is associated with considerable morbidity and mortality. Despite advances in knowledge of this illness, the availability of intensive care units (ICU), and the use of potent antimicrobial agents and effective vaccines, the mortality rates remain high1. Streptococcus pneumoniae is the leading pathogen of community-acquired pneumonia (CAP) and one of the most common causes of bacteremia in humans. This pathogen is equipped with an armamentarium of surface-exposed adhesins and virulence factors contributing to pneumonia and invasive pneumococcal disease (IPD). The assessment of the in vivo role of bacterial fitness or virulence factors is of utmost importance to unravel S. pneumoniae pathogenicity mechanisms. Murine models of pneumonia, bacteremia, and meningitis are being used to determine the impact of pneumococcal factors at different stages of the infection. Here we describe a protocol to monitor in real-time pneumococcal dissemination in mice after intranasal or intraperitoneal infections with bioluminescent bacteria. The results show the multiplication and dissemination of pneumococci in the lower respiratory tract and blood, which can be visualized and evaluated using an imaging system and the accompanying analysis software.

Streptococcus pneumoniae is the leading pathogen causing severe community-acquired pneumonia and responsible for over 2&#160;million deaths worldwide. The impact of bacterial factors implicated in fitness or virulence can be monitored in real-time in an acute mouse pneumonia or bacteremia model using bioluminescent bacteria.

生物発光細菌を使用してリアルタイムに急性肺炎のマウスモデルにおける肺炎球菌の毒性因子の影響を以下の

Pneumonia is one of the major health care problems in developing and industrialized countries and is associated with considerable morbidity and mortality. ...

Real-time Imaging of Myeloid Cells Dynamics in ApcMin/+ Intestinal Tumors by Spinning Disk Confocal Microscopy

Myeloid cells are the most abundant immune cells within tumors and have been shown to promote tumor progression. Modern intravital imaging techniques enable the observation of live cellular behavior inside the organ but can be challenging in some types of cancer due to organ and tumor accessibility such as intestine. Direct observation of intestinal tumors has not been previously reported. A surgical procedure described here allows direct observation of myeloid cell dynamics within the intestinal tumors in live mice by using transgenic fluorescent reporter mice and injectable tracers or antibodies. For this purpose, a four-color, multi-region, micro-lensed spinning disk confocal microscope that allows long-term continuous imaging with rapid image acquisition has been used. ApcMin/+ mice that develop multiple adenomas in the small intestine are crossed with c-fms-EGFP mice to visualize myeloid cells and with ACTB-ECFP mice to visualize intestinal epithelial cells of the crypts. Procedures for labeling different tumor components, such as blood vessels and neutrophils, and the procedure for positioning the tumor for imaging through the serosal surface are also described. Time-lapse movies compiled from several hours of imaging allow the analysis of myeloid cell behavior in situ in the intestinal microenvironment.

Real-time Imaging of Myeloid Cells Dynamics in ApcMin/+ Intestinal Tumors by Spinning Disk Confocal Microscopy

By using transgenic reporter mice and injectable fluorescent labels, long-term intravital spinning disk confocal microscopy enables direct visualization of myeloid cell behavior into intestinal adenoma in the ApcMin/+ colorectal cancer model.

における骨髄細胞ダイナミクスのリアルタイムイメージング<em&gt;のApc<sup&gt;最小/ +</sup</em&gt;腸腫瘍ディスク共焦点顕微鏡スピニングすることにより

Myeloid cells are the most abundant immune cells within tumors and have been shown to promote tumor progression. Modern intravital imaging techniques ...

Detecting Glycogen in Peripheral Blood Mononuclear Cells with Periodic Acid Schiff Staining

Periodic acid Schiff (PAS) staining is an immunohistochemical technique used on muscle biopsies and as a diagnostic tool for blood samples. Polysaccharides such as glycogen, glycoproteins, and glycolipids stain bright magenta making it easy to enumerate positive and negative cells within the tissue. In muscle cells PAS staining is used to determine the glycogen content in different types of muscle cells, while in blood cell samples PAS staining has been explored as a diagnostic tool for a variety of conditions. Blood contains a proportion of white blood cells that belong to the immune system. The notion that cells of the immune system possess glycogen and use it as an energy source has not been widely explored. Here, we describe an adapted version of the PAS staining protocol that can be applied on peripheral blood mononuclear immune cells from human venous blood. Small cells with PAS-positive granules and larger cells with diffuse PAS staining were observed. Treatment of samples with amylase abrogates these patterns confirming the specificity of the stain. An alternate technique based on enzymatic digestion confirmed the presence and amount of glycogen in the samples. This protocol is useful for hematologists or immunologists studying polysaccharide content in blood-derived lymphocytes.

Periodic acid Schiff staining is a technique that visualizes the polysaccharide content of tissues. This article demonstrates periodic acid Schiff staining protocol adapted for use on peripheral blood mononuclear cells purified from human venous blood. Such samples are enriched for lymphocytes and other white blood cells of the immune system.

過ヨウ素酸シッフ染色で末梢血単核細胞中のグリコーゲンの検出

Periodic acid Schiff (PAS) staining is an immunohistochemical technique used on muscle biopsies and as a diagnostic tool for blood samples. ...

Visualization of HIV-1 Gag Binding to Giant Unilamellar Vesicle (GUV) Membranes

The structural protein of HIV-1, Pr55Gag (or Gag), binds to the plasma membrane in cells during the virus assembly process. Membrane binding of Gag is an essential step for virus particle formation, since a defect in Gag membrane binding results in severe impairment of viral particle production. To gain mechanistic details of Gag-lipid membrane interactions, in vitro methods based on NMR, protein footprinting, surface plasmon resonance, liposome flotation centrifugation, or fluorescence lipid bead binding have been developed thus far. However, each of these in vitro methods has its limitations. To overcome some of these limitations and provide a complementary approach to the previously established methods, we developed an in vitro assay in which interactions between HIV-1 Gag and lipid membranes take place in a &#34;cell-like&#34; environment. In this assay, Gag binding to lipid membranes is visually analyzed using YFP-tagged Gag synthesized in a wheat germ-based in vitro translation system and GUVs prepared by an electroformation technique. Here we describe the background and the protocols to obtain myristoylated full-length Gag proteins and GUV membranes necessary for the assay and to detect Gag-GUV binding by microscopy.

Visualization of HIV-1 Gag Binding to Giant Unilamellar Vesicle GUV Membranes

We illustrate here an in vitro membrane binding assay in which interactions between HIV-1 Gag and lipid membranes are visually analyzed using YFP-tagged Gag synthesized in a wheat germ-based in vitro translation system and GUVs prepared by an electroformation technique.

巨大単層ベシクル（GUV）膜への結合HIV-1のGagの可視化

The structural protein of HIV-1, Pr55Gag (or Gag), binds to the plasma membrane in cells during the virus assembly process. Membrane binding of Gag is an ...

Unravelling the Function of a Bacterial Effector from a Non-cultivable Plant Pathogen Using a Yeast Two-hybrid Screen

Unravelling the molecular mechanisms of disease manifestations is important to understand pathologies and symptom development in plant science. Bacteria have evolved different strategies to manipulate their host metabolism for their own benefit. This bacterial manipulation is often coupled with severe symptom development or the death of the affected plants. Determining the specific bacterial molecules responsible for the host manipulation has become an important field in microbiological research. After the identification of these bacterial molecules, called &#34;effectors,&#34; it is important to elucidate their function. A straightforward approach to determine the function of an effector is to identify its proteinaceous binding partner in its natural host via a yeast two-hybrid (Y2H) screen. Normally the host harbors numerous potential binding partners that cannot be predicted sufficiently by any in silico algorithm. It is thus the best choice to perform a screen with the hypothetical effector against a whole library of expressed host proteins. It is especially challenging if the causative agent is uncultivable like phytoplasma. This protocol provides step-by-step instructions for DNA purification from a phytoplasma-infected woody host plant, the amplification of the potential effector, and the subsequent identification of the plant&#39;s molecular interaction partner with a Y2H screen. Even though Y2H screens are commonly used, there is a trend to outsource this technique to biotech companies that offer the Y2H service at a cost. This protocol provides instructions on how to perform a Y2H in any decently equipped molecular biology laboratory using standard lab techniques.

Bacterial effector proteins are important for establishing successful infections. This protocol describes the experimental identification of proteinaceous binding partners of a bacterial effector protein in its natural plant host. Identifying these effector interactions via yeast two-hybrid screens has become an important tool in unravelling molecular pathogenicity strategies.

酵母ツーハイブリッドスクリーンを用いた非耕作植物病原体から細菌のエフェクターの機能をUnravelling

Unravelling the molecular mechanisms of disease manifestations is important to understand pathologies and symptom development in plant science. Bacteria ...

Identification of Plasmodesmal Localization Sequences in Proteins In Planta

Plasmodesmata (Pd) are cell-to-cell connections that function as gateways through which small and large molecules are transported between plant cells. Whereas Pd transport of small molecules, such as ions and water, is presumed to occur passively, cell-to-cell transport of biological macromolecules, such proteins, most likely occurs via an active mechanism that involves specific targeting signals on the transported molecule. The scarcity of identified plasmodesmata (Pd) localization signals (PLSs) has severely restricted the understanding of protein-sorting pathways involved in plant cell-to-cell macromolecular transport and communication. From a wealth of plant endogenous and viral proteins known to traffic through Pd, only three PLSs have been reported to date, all of them from endogenous plant proteins. Thus, it is important to develop a reliable and systematic experimental strategy to identify a functional PLS sequence, that is both necessary and sufficient for Pd targeting, directly in the living plant cells. Here, we describe one such strategy using as a paradigm the cell-to-cell movement protein (MP) of the Tobacco mosaic virus (TMV). These experiments, that identified and characterized the first plant viral PLS, can be adapted for discovery of PLS sequences in most Pd-targeted proteins.

Identification of Plasmodesmal Localization Sequences in Proteins In Planta

Plant intercellular connections, the plasmodesmata (Pd), play central roles in plant physiology and plant-virus interactions. Critical to Pd transport are sorting signals that direct proteins to Pd. However, our knowledge about these sequences is still in its infancy. We describe a strategy to identify Pd localization signals in Pd-targeted proteins.

タンパク質Planta Plasmodesmal ローカリゼーション シーケンスの同定

Plasmodesmata (Pd) are cell-to-cell connections that function as gateways through which small and large molecules are transported between plant cells. ...

Isolation of Peritoneum-derived Mast Cells and Their Functional Characterization with Ca2+-imaging and Degranulation Assays

Mast cells (MCs), as a part of the immune system, play a key role in defending the host against several pathogens and in the initiation of the allergic immune response. The activation of MCs via the cross-linking of surface IgE bound to high affinity IgE receptor (Fc&#949;RI), as well as through the stimulation of several other receptors, initiates the rise of the free intracellular Ca2+ level ([Ca2+]i) that promotes the release of inflammatory and allergic mediators. The identification of molecular constituents involved in these signaling pathways is crucial for understanding the regulation of MC function. In this article, we describe a protocol for the isolation of murine connective tissue type MCs by peritoneal lavage and cultivation of peritoneal MCs (PMCs). Cultures of MCs from various knockout mouse models by this methodology represent a useful approach to the identification of proteins involved in MC signaling pathways. In addition, we also describe a protocol for single cell Fura-2 imaging as an important technique for the quantification of Ca2+ signaling in MCs. Fluorescence-based monitoring of [Ca2+]i is a reliable and commonly used approach to study Ca2+ signaling events, including store-operated calcium entry, which is of utmost importance for MC activation. For the analysis of MC degranulation, we describe a &#946;-hexosaminidase release assay. The amount of &#946;-hexosaminidase released into the culture medium is considered as a degranulation marker for all three different secretory subsets described in MCs. &#946;-hexosaminidase can easily be quantified by its reaction with a colorigenic substrate in a microtiter plate colorimetric assay. This highly reproducible technique is cost-effective and requires no specialized equipment. Overall, the provided protocol demonstrates a high yield of MCs expressing typical MC surface markers, displaying typical morphological and phenotypic features of MCs, and demonstrating highly reproducible responses to secretagogues in Ca2+-imaging and degranulation assays.

Isolation of Peritoneum-derived Mast Cells and Their Functional Characterization with Ca2+-imaging and Degranulation Assays

Here, we present a protocol to isolate and cultivate murine peritoneal mast cells. We also describe two protocols for their functional characterization: a fluorescent imaging of intracellular free Ca2+ concentration and a degranulation assay based on colorimetric quantification of the released &#946;-hexosaminidase.

腹膜由来マスト細胞とその機能特性と Ca2 +の単離-イメージングと脱顆粒の試金

Mast cells (MCs), as a part of the immune system, play a key role in defending the host against several pathogens and in the initiation of the allergic ...

Assays for the Specific Growth Rate and Cell-binding Ability of Rotavirus

Rotavirus is the main etiological factor for infantile diarrhea. It is a double-stranded (ds) RNA virus and forms a genetically diverse population, known as quasispecies, owing to their high mutation rate. Here, we describe how to measure the specific growth rate and the cell-binding ability of rotavirus as its phenotypes. Rotavirus is treated with trypsin to recognize the cell receptor and then inoculated into MA104 cell culture. The supernatant, including viral progenies, is collected intermittently. The plaque assay is used to confirm the virus titer (plaque-forming unit: pfu) of each collected supernatant. The specific growth rate is estimated by fitting time-course data of pfu/mL to the modified Gompertz model. In the assay of cell-binding, MA104 cells in a 24-well plate are infected with rotavirus and incubated for 90 min at 4 &#176;C for rotavirus adsorption to cell receptors. A low temperature restrains rotavirus from invading the host cell. After washing to remove unbound virions, RNA is extracted from virions attached to cell receptors followed by cDNA synthesis and reverse-transcription quantitative PCR (RT-qPCR). These protocols can be applied for investigating the phenotypic differences among viral strains.

Here we present two protocols, one for measuring the specific growth rate and the other for the cell-binding ability of rotavirus using the plaque assay and RT-qPCR. These protocols are available for confirming the differences in phenotypes between rotavirus strains.

比増殖速度とロタウイルスのセル結合の能力のための試金

Rotavirus is the main etiological factor for infantile diarrhea. It is a double-stranded (ds) RNA virus and forms a genetically diverse population, known ...