構造上類似したタンパク質の領域を交換してキメラを作り出すため、研究する分子の生物学的機能を担う領域の重要性を調べることができます。領域交換はタンパク質の一般的な二次構造を先取りし、その全体の構造に対する領域の重要な部分を生物学的機能を直接媒介するものと区別することができる。どの領域を置き換えるかを選択することができます。
大きな交換から始めることは、タンパク質の主要な機能を特定するのに役立ちます。手順を開始するには、テキストプロトコルに詳述されているように、関心のあるタンパク質と領域を交換するためのドナーとして適切なタンパク質を選択します。次に、先ずref seqウェブページの遺伝子セクションにアクセスすることにより、レシピエントおよびドナータンパク質のタンパク質アミノ酸配列を参照配列データベースから取得する。
検索ボックスに目的のタンパク質の名前を入力し、[検索] をクリックします。結果のリストで目的の種の遺伝子名をクリックします。ref seq セクションまでスクロールダウンして、文書化されているすべてのアイソフォームを表示します。
対象のアイソフォームのシーケンス識別子をクリックします。下にスクロールしてcdsをクリックして、遺伝子のタンパク質コード領域を強調します。画面右下でFAFSDAをクリックし、遺伝子配列をコピーします。
適切なDNA編集ソフトウェアを使用してDNA配列を保存します。自由に利用できる APE を使用する場合は、プログラムを開き、コピーしたシーケンスを空白のボックスに貼り付け、シーケンス名を選択して保存をクリックします。次に、別のキメラ構造で置換されるタンパク質領域を選択し、まず、別個の構造領域で目的とするタンパク質配列を分割します。
そのためには、PDBeウェブサイトから目的のタンパク質の構造データをダウンロードしてください。タンパク質のPDBeページにアクセスし、画面の右側にあるダウンロードをクリックしてPDBeファイルをダウンロードします。Pymolのような分子可視化システムでPDBeファイルを開きます。
Pymolでは、塩基配列を表示し、デフォルトの構造データを非表示にし、漫画のビューを選択して、タンパク質の構造特性を明確に視覚化します。画面の上部にある塩基配列をクリックして、分子の異なる部分を強調し、それぞれの特徴的な構造特徴に対応するアミノ酸を示します。次に、APEのDNA配列上の明確な構造領域にコメントを付け、DNA配列を開いて選択し、ORFをクリックして翻訳し、最初の領域の最後のアミノ酸をクリックしてDNA配列内の位置を強調し、その領域のヌクレオチドのコードを選択します。
選択を右クリックし、新しい機能を選択して名前と色を付けます。前の手順で特定した構造領域ごとに、この手順を繰り返します。2つのタンパク質の残基配列を整列させるには、まず、APE中のドナーおよび受容体タンパク質の完全なアミノ酸配列を得る。
以前と同様に、ドナーDNA配列を開いて選択し、ORFをクリックして翻訳します。次に、Clustal Ω ウェブページにアクセスし、2 つのタンパク質のアミノ酸配列を入れます。各配列は、適切に識別されるタンパク質名を持つテキスト行によって進める必要があります。
下にスクロールして[送信]をクリックします。[ダウンロードアライメント ファイル] タブをクリックして、アライメント ファイルを取得し、保存します。このファイルは、任意のテキスト編集プログラムで開くことができます。
アライメントファイルを基準として使用し、そのDNA配列内のドナータンパク質の対応する構造領域にアポイントメントを付ける。受容体タンパク質のアセトDNA配列のコピーを作成し、キメラタンパク質として名前を変更します。名前を変更した DNA 配列を APE で開きます。
ドナータンパク質で交換される領域を選択し、次に、リ名称変更された受容体タンパク質内の対応する領域を選択する。ドナータンパク質DNA配列を貼り付け、変更を保存します。APEなどのDNAエディタを使用して、末端プライマーを設計します。
新しいDNAファイルを作成し、リーダーシーケンスでエンドターミナルプライマーを開始します。その後、目的の遺伝子の初期18〜27塩基対においてMCSおよび任意のスペーサーのベクターで選択された第1の制限部位が続く。新しいDNAファイルでは、C末端プライマー配列を、対象遺伝子の最終的な18〜27塩基対から始め、その後にオプションのスペーサー、選択された2番目の制限部位、およびリーダー配列を設計する。
シーケンス全体をハイライト表示し、右クリックして逆補完を選択してリバースプライマーを取得します。さて、キメリ構造の境界領域ごとにプライマーを設計します。キメラの DNA 配列で、元の配列と挿入された配列が接触しているゾーンで、30 個の塩基対領域をハイライトします。
これは、各シーケンスの15塩基対で構成されています。領域をコピーし、新しい DNA ファイルに貼り付けます。このシーケンスは、フォワードプライマーになります。
前の手順で生成されたフォワード プライマーのコピーを作成し、リバース プライマーとして名前を変更します。プライマー シーケンスをハイライト表示し、右クリックして、逆の補間を選択して、逆プライマー シーケンスを生成します。キメラDNA配列の接触ゾーンごとにこれらの手順を繰り返します。
一般的に、N端子またはC末端領域で置換が行われない限り、1つのキメラを生成するために2組のフォワードリバースプライマーが必要です。キメラタンパク質を構成する各フラグメントについて、個々のPCR反応混合物を調製します。まず、1ポイント5ミリリットルマイクロフューズチューブを氷上にセットし、テキストプロトコルに記載されている順序でPCR混合物の異なる試薬をピペットします。
PCR反応ごとに正しいプライマーとテンプレートが採用されていることを確認します。各反応に対して2つの薄い壁面ゼロ点2ミリリットルPCRチューブをラベル付けし、各チューブに対応するPCR混合物の20マイクロリットルを転写します。PCR チューブを PCR サーモサイクラーに移し、テキスト プロトコルで詳細に説明されているようにプロトコルを開始します。
PCR反応が完了したら、各チューブに6個のxDNAローディングバッファーを4マイクロリットルずつ加えます。1%のアガロスゲルを電気泳動ユニットに挿入し、TAEバッファーでカバーします。慎重に分子量後者と一緒にゲルにサンプルをロードします。
80~120ボルトで20~45分間ゲルを動かした後、電気泳動部の電源を切り、アゴロスゲルを取り外します。UV光の下で増幅されたDNAバンドを視覚化します。カミソリの刃を使用して、ゲルから個々のDNA断片を切り取り、それらを2つのミリリットルマイクロフューズチューブに転写する。
PCRクリーンアップキットを使用してDNA断片を精製した後、分光フェトメーターで260ナノメートルと340ナノメートルのサンプルの吸光度を測定することによって回収されたDNAの量を定量化します。ここで、キメラDNA配列を生成するためにPCR増幅を行う。まず、50マイクロリットルのPCR反応を設定し、キメラの別々の成分を以前のように融合します。
N末端およびC末端プライマーを、増幅されたDNA断片のそれぞれ10ナノグラムと共に採用する。精製されたDNA断片を、30マイクロリットルの核自由水で回収し定量化する。この断片は、末端プライマーに含まれる制限部位によって横たわるキメラDNA配列を含む。
キメラタンパク質の生成は、2つの中間ルークと6つのシトカインファミリーのメンバーと一緒に例示される。白血病抑制因子におけるオンコスタテンM.OSMリフトキメラは、OSMのBCループ領域を対応するリフトシーケンスと交換した結果です。
最初のPCR増幅ステップは、3つの別々の反応で構成されていました。N末端 OSM フラグメントは、N 端末 OSM フォワードおよび BC 起動リバースプライマーを必要とし、OSM をテンプレートとして使用しました。LIF BCループは、テンプレートとしてLIFを使用してBC開始フォワードとBC Nリバースプライマーを介して得られました。
C 端末 OSM フラグメントは、テンプレートとして BC エンドフォワードと C 端末 OSM リバースプライマーと同様に OSM を使用しました。これらの精製フラグメントは、次に、N末端OSMフォワードおよびC末端OSMリバースプライマーとともに第2のPCR反応の鋳式として使用され、対応するOSM LIF BCループ遺伝子配列を増幅した。精製および大腸菌への変換の後、個々のプラスミドを単離し、DNA断片を適切に挿入するための制限酵素消化によってスクリーニングした。
ゲル電気泳動は、シーケンス検証のために送られた正のヒットを明らかにした。キメラタンパク質は、完全な派閥系で測定し、活性を生成する必要があります。その特定の派閥の置き換えられた地域の重要性を判断するために。
この技術は、非常に有用であり、頻繁に適用され、主要な機能ドメインおよび受容体認識部位を同定するためにシグナル受容体の干渉を受けている。DNA電気泳動に使用する番号は、使い捨て手袋、実験室用コート、保護眼鏡を使用して処理する必要があります。
