生体内イメージングは、腫瘍微小環境内の生理学的相互作用を観察することを可能にします。そしてこの方法を使用することによって、観察される特定の動的挙動を、局所組織特徴を用いて区画化することができる。このプロトコルは、コラーゲン線維または自己蛍光代謝産物からのユビキタスな標識フリーシグナルのみを使用してTMEをセグメント化し、それによってマウスへの操作の量を最小限に抑えます。
この方法は、細胞外マトリックス構造または血管構造に対する動的相互作用の理解が必要とされるあらゆる生体内システムに広く適用可能である。この手順を実演するのは、上級研究スペシャリストのDave Inmanと、研究室の大学院生であるErica Hoffmannです。1.5 12ミリメートルの丸いカバーガラスを100%エタノールに10分間浸すことによって乳房イメージング窓カバーガラスの準備を開始し、次にヒートランプの下でカバーガラスを乾燥させ、シアノアクリレート接着剤を使用してガラスを金属乳房イメージング窓枠に固定する。
接着剤を一晩硬化させる。翌日、アセトンを浸した綿棒を使用して、余分な接着剤の組み立てられた乳房造影窓を洗浄してから、乳房造影窓を70%エタノールに少なくとも10分間沈めてクレンジングを補助する。乾燥後、洗浄した乳房画像窓を滅菌ペトリ皿に保管する。
窓移植の手術を開始する前に、手術器具をオートクレーブし、70%エタノールで表面を消毒する。滅菌フィールドで覆われた温かい毛布で手術のために消毒された卓上を準備します。滅菌フィールドの上部で測定された温度が摂氏40度になるように温め毛布をセットします。
外科手術には補助的な冷たい照明と虫眼鏡を使用してください。滅菌使い捨てのラボコート、手術用スリーブ、手袋、目の保護具、フェイスマスクからなるPPEを着用してください。次に、第4鼠径乳腺の麻酔マウスの毛皮を脱毛クリームで除去し、滅菌水浸しガーゼで手術部位をすすいだ。
次に、脱毛した手術部位を3つの交互のベタジンおよびエタノールスクラブで皮膚表面を消毒することによって手術用に準備する。完了したら、鉗子を使用して乳腺番号4の皮膚を優しく持ち上げます。皮膚が体壁から引き離されたら、外科用マイクロハサミで鉗子の先端にある真皮層の1ミリメートルの部分を取り除く。
下腺を切断することなく、10ミリメートルの切開を作成し、鉗子の穏やかな動きで真皮層から乳腺を解放する。PBSを追加して、露出した腺を覆います。5-0の絹編組縫合糸を使用して、開口部の周囲に沿って財布の紐縫合糸を作成し、真皮層が乳房画像窓の受容ノッチに係合するように乳房画像窓の端を挿入する。
乳房造影窓の反対側の端で上皮を伸ばしながら、真皮層が乳房造影窓周全体の周囲に受容ノッチを完全に係合するように金属製の乳房造影窓を所定の位置に押し込む。次に、財布の紐を締めて真皮層をノッチに引き込み、層を結び付けて窓を固定します。乳腺イメージングウィンドウの真皮層に局所抗生物質を塗布し、マウスを継続的に監視する。
胸骨臥位を維持するのに十分な意識を取り戻した後、ケージに入れたイグルーでマウスを柔らかい寝具に別々に移植した乳房イメージングウィンドウを収容し、マウスがイメージングする前に48時間回復できるようにします。イメージングには、摂氏 30 度に設定された強制空気システムを使用します。追加の対物ヒータを使用してZフォーカスのドリフトを回避し、イメージング前にシステムが摂氏30度で少なくとも1時間平衡状態になるようにします。
その後、顕微鏡ステージ上に加熱室を設置します。つま先ピンチ法で麻酔を確認した後、マウスに眼軟膏を加える。適切な水分補給を維持するために、イメージングセッションの間、2時間ごとに0.5ミリリットルのPBSを皮下に注入します。
水の代わりに水性ゲルを対物レンズに塗布し、マウスを予め温めた顕微鏡ステージに移す前に、綿アプリケーターとガラスクリーナーで乳房イメージング窓ガラスの外側をきれいにする。顕微鏡ステージ上にマウスを置いた後、乳房撮像窓の襟をステージインサートの14ミリメートルの受け穴に押し込んで画像を安定させ、イソフルランホースをフィットさせる。その後、顕微鏡眼球とブライトフィールド照明を用いて撮像視野を合焦させ、血流を伴う血管系を観察した。
視野の安定性を確認します。呼吸運動アーチファクトが存在する場合は、小さなフォームブロックとチンキのような粘着テープで腺の裏側に穏やかな圧縮を適用します。圧縮を適用した後、視野全体で血流が維持されていることを確認します。
マウスを鎮静させ、倒立顕微鏡ステージ上にしっかりと配置したら、関心領域の位置決めを開始します。乳腺の画像化窓に向けられた光源を使用して、顕微鏡の眼球を使用して、調査のための潜在的な領域を特定する。焦点は血管系と血流を見ることであるべきです。
ソフトウェアにXY位置を追加して保存します。適切なパワーレベルを設定したら、Zスタックをセットアップし、乳房イメージングウィンドウのガラス表面下20〜50マイクロメートルで豊富なコラーゲン線維の外観を観察します。コラーゲンは、顕微鏡が腫瘍の奥深くに切片化するにつれて、り普及しなくなります。
第二高調波発生またはSHGの空隙は、腫瘍塊の位置を明らかにする。50〜100ミクロンで現れる最初のコラーゲン線維を有する孤立細胞の層の下に上部Zスライスを設定する。下部のZスライスを250マイクロメートルに設定し、ファイバがフェードアウトして信号不良が支配的になります。
次に、保存されたすべての XY ポジションに対してこの手順を繰り返します。Zスタック範囲を設定したら、滞留時間を8マイクロ秒に増やし、電力と検出器の設定を最適化します。各実験で組織を励起するために必要な電力レベルを最適化し、目標の背面開口部で750ナノメートルで最大90ミリワット、または890ナノメートルで70ミリワットの電力を使用します。
次に、ほとんどの重要内移行ムービーの収集ポイント間の 10 分間隔から開始し、実験目標に従って時間間隔を調整します。細胞のブレビングや自己蛍光の急激な増加、過剰なフォトブリーチングなどの光毒性の兆候が観察された場合は、条件が示すようにレーザー出力を減らすか、タイムラプス間隔を増やしてください。NADPHの蛍光寿命イメージングまたはFLIMの場合、プレビュースキャンを開始し、定分率弁別器またはCFDの読み出しが10〜5番目、10〜6番目になるまでレーザーパワーを調整します。
CFDを10を超えて6番目を超えると、光子の蓄積と全体的な結果が悪くなります。電力レベルを設定したら、積分時間を90~120秒に設定し、FLIMコレクションを開始して、割り当てられた時間の間、視野から光子を取得します。ラベルのない乳腺腫瘍内の典型的な視野は、窓の近くに豊富なコラーゲン線維および腫瘍の奥深くまでの存在量の減少を示した。
蛍光寿命またはNADPHの使用は、血管系の同定に役立った。画像内のいくつかの暗い領域は、腫瘍のひだまたは隣接する腫瘍葉の突き合わせであった。血管系を同定するために、NDPH FLIMを用いた合成画像を、蛍光デキストランの尾静脈注入前後の生体内スタックの最大強度投影を比較することによって検証した。
代表的な解析は、4匹のマウスの定量化と視野を示す。標識のない腫瘍塊の境界を描くために、NADPH自己蛍光が用いられた。画像は、細胞の代謝シグネチャと血管の位置を報告した。
AFDの自己蛍光はまた、マクロファージを同定した。セグメンテーションスキームを用いて、標識のない腫瘍を、SHGおよびNADPH自己蛍光のみを用いて腫瘍巣、間質、および血管系のための区画にセグメント化した。さらに、間質およびコラーゲン線維を、整列した線維の局所領域に分類することもできる。
このプロトコルで覚えておくべき最も重要なことは、視野がイメージングに対して安定したままであるように、マウスが適切に鎮静化および拘束されていることを確認することです。
