この作品は、パスツール研究所からの資金によっておよびリーグのnationale結界伤害防护结界ルがん（助成R05/75-129とRS07/75-75）、協会流動ラルシェルシュシュールルがん（/助成ARC A09からの補助金によって部分的にサポートされていました5031分の1と4867）、および通信社国立·デ·ラ·ルシェルシュ（ANR07 MIME 009 02とANR09 MIEN 026 01）。 MMはMENRTのフェローシップを受賞しました。

1。酵母ツーハイブリッドスクリーニング<ol><li>次の必要なソリューションを行います。 <ol><li>完全合成ドロップアウト（SD）は：水1 Lのグルコースと最小限のSDベースの26.7グラムを溶かす。 2グラムアデニンヘミ硫酸塩、2グラムアルギニン塩酸、2グラムヒスチジンHClで 、2グラムイソロイシン、4グラムロイシン 、2グラムリジン塩酸、2メチオニングラム、3グラムフェニルアラニン、2グラムL：次のように調製したアミノ酸混合物2gを追加する-セリン、2グラムのL-スレオニン、 トリプトファン 3グラム、2グラムのチロシン、1.2グラムのウラシル、9グラムバリン。 </li><li> SD-L/-W/-Hアウト選択ドロップ：SDは、指定されたものを除き、すべての必須アミノ酸が含まれている（-L：-ロイシン、-W：-トリプトファン、-H：-ヒスチジン）。 </li><li> YPGLU：L 1、重量酵母エキス、バクトペプトン10g及びグルコース20gを10gのために。固形培地のため25グラムバクト寒天で完了。 </li><li> YCM：YPGLUと同じですが、pHを4.5に調整した。 </li></ol></li><li>交配と拡散<ol><li>プレ変換の凍結アリコートを使用pACT2にクローニングしたcDNAライブラリーを含むED Y187酵母株（交配型α）。 SD-Lプレート上に連続希釈液をメッキすることによって、細胞の生存を確認してください。 </li><li> pGBKT7ベクターに病原体ORFのクローンを作成し、AH109酵母株（交配型）に標準的な手順を使用して組換えプラスミドを変換します。 </li><li>スプレッドSD-Wプレート上AH109酵母pGBKT7形質。加湿インキュベーター内で少なくとも2日30℃でインキュベートする。プレートを4℃で保存できますツーハイブリッドスクリーニングまでC。 </li><li>病原 &#39;タンパク質によってHIS3レポーター遺伝子の潜在的な自己トランスを打ち消すために3 - アミノトリアゾール（3-AT）、HIS3酵素の競合的阻害剤を使用します。 SD-W/-Hプレート上pGBKT7形質転換酵母の生育を妨げる3-ATの濃度を決定することにより、オートアクティベーションテストを実行します。 </li><li> pGBKT7形質AH109数コロニーとSD-Wのシード30ミリリットル。回転と30℃で30時間インキュベートする。 </li><li> 30mlでSD-Wの種子200ミリリットルAH109文化の。 30℃で20時間を中心とした回転でインキュベート℃に</li><li> 20ミリリットルYPGLU、30℃でインキュベート10分°回転、CでcDNAライブラリー形質転換Y187を解凍インキュベートする。 </li><li> 20℃で3,500 rpmで5分間実行可能なY187酵母細胞に相当量に対応pGBKT7形質AH109文化の音量を遠心慎重に10ミリリットルYPGLUで上清とペレットを再懸濁しを撤回。 </li><li> Y187含むライブラリで再懸濁したAH109酵母を混ぜる。を50mlチューブに移します。 20℃で3,500 rpmで5分間遠心°Cは、慎重に上清を取り下げる（壊れやすいペレット）。 </li><li> 1.5ミリリットルの合計を取得するYPGLUでペレットを再懸濁します。 </li><li>スプレッド酵母YCM-寒天3〜上の150ミリメートルプレート、0.5ミリリットル/プレート。 30℃で4.5時間インキュベートする℃に</li><li> SD-L/-W/-H 10mlにすくいガラスを削ってYCMプレートからの交配酵母を収集します。 5ミリリットルSD-L/-W/-H媒体とプールでプレートを2回すすいでください。 </li><li> 20、3,500 rpmで5分間遠心℃の上清を捨て、5ミリリットルSD-L/-W/-H培地で酵母ペレットを再懸濁します。 </li><li>オートアクティベーション試験で測定3 - アミノトリアゾール（3-AT）の適切な濃度で補充SD-L/-W/-H寒天の10プレート（0.5ミリリットル/プレート）の上に交配酵母を広げた。 6-10日間加湿雰囲気中30℃でインキュベートする。 </li><li> SD-L/-Wプレート上交配酵母懸濁液の連続希釈液を250μl（10 -6〜10 -4）を広めることで交配の効率性を評価するために、二倍体（2n個）比率を決定します。二日間30℃でプレートをインキュベートする。 SD-L/-Wに生育したコロニーをカウントし、交配酵母の初期体積中に存在する全二倍の数を推測する。二倍の速度を算出する実行可能なライブラリーを含有する酵母番号にこの二倍体番号を報告する。それは10-25％程度の範囲にする必要があります。 </li><li> 6-10日30℃インキュベーション後°C、新鮮SD-L/-W/-Hで交配酵母コロニー+プレート3-ATを選ぶ。 [ ヒント：オーダー酵母8のスキームでそれは]を配列するためのその後容易になりますように12ウエルのレーンは、96ウェルプレートを再現。酵母コロニー加湿雰囲気中30℃で4-5日°Cのために成長しましょう​​。 </li></ol></li><li> PCRおよび配列決定によりHIS3陽性クローンのスクリーニング 目標は、選択的なSD-L/-H/-Wプレート上で増殖させた酵母コロニーのpACT2ベクトルに含まれるORFをPCR増幅することです。 <ol><li>氷の上に96ウェルPCRプレートを置く。 </li><li>酵母細胞を溶解する、ザイモラーゼ20T溶液（10mMリンHEPES緩衝液pH 7.7で2.5 mg / ml）でのウェルあたり50μLを加える。 </li><li>優しくウェルあたり1コロニーを懸濁します。 </li><li> 37℃で15分間インキュベート℃、95℃で15分</li><li>氷の上にバックプレートを置く。ウェルあたりの蒸留水50μLを加える。ピペッティングでよく混ぜる。 </li><li> 3,500回転と4で5分間遠心℃、 </li><li> PCRは、pACT2ベクトル中のcDNA由来のORFのいずれかの側面をアニーリングするプライマーを使用して、挿入を検出するために、10μLを増幅する。プロトコルはgであるExTaqポリメラーゼで96溶解した酵母コロニーの増幅のためのiven。 525μlの10X ExTaqバッファー、420μLのdNTPミックス（2.5 mM）を、10.5μlのフォワードプライマー（1μgの/μL）、10.5μlのリバースプライマー（1μgの/μL）、31.5μlのExTaq（5 U /μL以下のミックスを調製）と3202.5μlのH 2 0。 96ウェルPCRプレートのウェルあたり40μlのミックスを配布します。ウェルあたり溶解酵母液10μlを追加します。 7分間の1で4分間分、72℃、および72で終わる℃で30秒、60℃で94℃で、その後3分、35サイクル°C、94°C以下のように増幅を行う。 PCR陽性クローンを検出するために、1.2％アガロースゲル上でPCR産物の3μLを実行します。使用してプレキャスト96ウェルアガロースゲルが推奨されることに注意してください。 [ヒント板は、数ヶ月間-20℃で保存して、新しいPCRのために再使用することができる] </li><li> HIS3陽性クローンから単離し、PCR増幅断片の配列。細胞のORFを同定するためにBLAST分析を実行します。低信頼アライメント（E値＆GT、10 -10、アイデンティティ&lt;80％、ペプチド長&lt;20アミノ酸）が同様frameshiftedと配列を含む未成熟終止コドンとして破棄されます。 </li></ol></li></ol> 2。 HT-GPCAためのマトリックスビル HT-GPCAは両方の病原体と宿主のタンパク質を一過スプリットガウヨモギルシフェラーゼの相補的な断片に融合発現している哺乳類の細胞ベースのアッセイである。パートナーの相互作用時に、この酵素は、その酵素活性の測定を可能にする再構成される。相互作用の強さは、このように正規化された発光比（下記参照、 図1）から推定される<ol start="4"><li>宿主細胞パートナーの選択<ol><li>データセットの信頼9を高めるために、哺乳動物細胞におけるさらなる検証のためY2Hスクリーニング以上の三回識別されたタンパク質を選択する。 </li><li> POSITIとして病原体タンパク質の既知の相互作用パートナーを追加コントロールをVEの。 </li></ol></li><li> HT-GPCA互換ベクターに移す<ol><li>アミノ酸ルシフェラーゼそれらのN末端 ​​（GL2-病原体タンパク質融合）で融合ヒトガウのヨモギの110から185と病原体のタンパク質を生成するpSPICA-N2ベクトルの各病原体タンパク質ORFのクローンを作成します。 </li><li> PCRは、ORF直接Y2H陽性クローンからまたは他のORFのリソース（ヒトORFeomeのから細胞タンパク質を増幅<a href="http://horfdb.dfci.harvard.edu/" target="_blank">http://horfdb.dfci.harvard.edu/</a>とN末端 ​​に融合したタンパク質を生成する）とpSPICA-N1ベクターに移すアミノ酸はヒトガウヨモギルシフェラーゼ（GL1ホストタンパク質融合）の18から109。 [ヒント：大規模クローニングについては、ゲートウェイクローニングシステムが推奨されます。その場合、PCR増幅のために、ゲートウェイと互換性部位を含むように設計されたプライマーを使用し]。 </li><li>シーケンスのすべての発現ベクターを。 pSPICA-N1とpSPICA-N2の配列文献8に記載されています。 </li></ol></li></ol>プラスミド構築がpSPICA-N1で、 すなわち病原体タンパク質を反転し、ホストタンパク質pSPICA-N2にできることに注意してください。 3。ハイスループットガウヨモギルシフェラーゼベースのタンパク質相補アッセイ（HT-GPCA） <ol start="6"><li>細胞トランスフェクション<ol><li>抗生物質なしで、10％ウシ胎児血清（FBS）を含むDMEM 35万細胞/ mlでシード293T細胞。を100μl/ウェル無菌白培養プレートで配布します。単一の実験で10皿を超えないようにしてください。細胞は5％CO 2で37℃で24時間成長させて。 [ ヒント：pSPICAプラスミドは、SV40起点を含んでいるので、293T細胞の使用は、トランスフェクションした細胞での複製を可能にするため、2ルシフェラーゼ断片の過剰発現につながる] </li><li>翌日、任意の適切なトランスフェクションのプロトコルを用いてトランスフェクト細胞。 NU、特定のトランスフェクション試薬のためにあることに注意してください播種した細胞のmberは、適合させる必要があります。 100ngのウェル当たりの病原体と宿主ORFプラスミド構築の両方を使用します。コ·トランスフェ10 ngのウェルあたりのトランスフェクション効率のために正規化するプラスミドCMV-ホタルルシフェラーゼの。各点は3回テストされます。 [ ヒント：DNAミックスを粘着シールでトランスフェクションの前日を行い、-20℃で保存することができます] </li><li>培養された293T細胞のプレートにトランスフェクション混合物を転送します。 293Tは強く付着ではなく、簡単に井戸の底から切り離すように、優しく細胞にDNAミックスを堆積するように注意してください。 5％CO 2、37℃で24-30時間、細胞培養インキュベーター中でインキュベートする。 </li></ol></li></ol><ol start="7"><li>細胞溶解とガウルシフェラーゼ用量<ol><li> PBS（100μL/ウェル）で細胞を洗浄します。 40μlの1X ウミ溶解バッファーを追加します。撹拌しながら室温で30分間インキュベートする。 </li><li>別の白のプラットフォームで細胞溶解液10μlを救うホタルルシフェラーゼ活性を、その後の投与量の電子。 4℃で保存または代わりに-20℃で密閉したC。 </li><li> ウミシイタケルシフェラーゼアッセイ試薬100μlのを追加し、ルミノメーターで10秒間の発光をカウントすることによって、細胞溶解物の残りの30μlの上のガウの活性を測定する。 96ウェルプレートの用量は、半時間ほどかかります。凍結または長期保管は、インタラクション媒介ガウの活動に影響を及ぼす可能性があるので、新鮮な細胞抽出と測定を行います。 </li></ol></li></ol><ol start="8"><li>ホタル活性の測定<ol><li>ホタルルシフェラーゼアッセイ試薬を50μlを添加し、10秒間の発光をカウントすることにより細胞溶解物の保存された10μlの上ホタル活性を測定する。 96ウェルプレートの用量は、半時間ほどかかります。 [ ヒント：ホタルルシフェラーゼの投与量は、凍結したライセートた日後に行うことができます。] </li></ol></li></ol><ol start="9"><li> NLRの計算<ol><li&gt;各相互作用のために、アカウントトランスフェクション効率と細胞生存率を考慮して正規化されたガウの発光値を得るためにガウルシフェラーゼ活性およびホタルルシフェラーゼ活性の比を算出する。三重の平均値を計算します。 </li><li>相互作用を監視するには、それぞれの病原体 - 宿主ペアの正規ルミネッセンス比（NLR）を推定。そうするには、コントロールウェルで測定された活動の和（参照8から適応図1）により、病原体と宿主タンパク質の両方の存在下で検出され、正規化ガウの発光活性を分割。肯定的な相互作用のためNLRカットオフ値は、3.5 8の周囲と推定されている。 </li></ol></li></ol><ol start="10"><li>データ分析<ol><li> R統計パッケージを使用して階層的クラスタリングを実行します。まず、カテゴリにグループNLRデータは、その後、完全な連携方式を使用して相互作用系統樹を計算します。これを視覚化JavaTreeView 10と樹。ピアソンの相関係数を用いた相互作用系統樹と系統樹の間の距離を計算します。 </li><li>相互作用ネットワークを生成するには、HT-GPCAデータセットからの肯定的な相互作用を選択して、Cytoscapeソフトウェア1を使用しています。宿主タンパク質の程度を抽出し、ネットワークのローカルダイナミクスにアクセスし、その分布をプロットします。ホスト病原体ネットワークはホスト、セルラーネットワークにおける病原体タンパク質の世界的な影響の評価を提供するために、ホストのインタラクトームに重ね合わせることができる。 </li><li> GO（遺伝子オントロジー）データセットの機能の充実を評価するDAVIDバイオインフォマティクスデータベース12と、標的細胞因子に関連付けられている用語を抽出。 </li></ol></li></ol>

<ol>
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Protoc. 4, 44-57 (2009).</li><li>Muller, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large+scale+genotype+comparison+of+human+papillomavirus+E2-host+interaction+networks+provides+new+insights+for+e2+molecular+functions.">Large scale genotype comparison of human papillomavirus E2-host interaction networks provides new insights for e2 molecular functions.</a> PLoS Pathog. 8, e1002761 (2012).</li><li>Neveu, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+analysis+of+virus-host+interactomes+with+a+mammalian+high-throughput+protein+complementation+assay+based+on+Gaussia+princeps+luciferase.">Comparative analysis of virus-host interactomes with a mammalian high-throughput protein complementation assay based on Gaussia princeps luciferase.</a> Methods. , (2012).</li><li>Braun, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+experimentally+derived+confidence+score+for+binary+protein-protein+interactions.">An experimentally derived confidence score for binary protein-protein interactions.</a> Nat. Methods. 6, 91-97 (2009).</li></ol>

著者は、彼らが競合する経済的利益を持っていないことを宣言します。

独立して、例えば、GSTプルダウンLUMIER又はMAPPITなどの酵母ツーハイブリッドおよび哺乳類相互作用アッセイは、タンパク質 - タンパク質相互作用を検出するための効果的なツールであることが証明されているが、偽陽性および偽陰性率の高さによって制限される相互作用は、これらの技術15に関連付けられている。また、証拠は直交の方法を組み合わせると得られた相互作用データセ...

タンパク質 - タンパク質相互作用マップを生成するために収集されるデータ量の増加はさらに、病原体感染を理解するための視点を開く。病原体感染症の世界的な理解が出現し始めると、それは人間のプロテオーム1を接続する場合は病原タンパク質によって誘導された摂動の範囲へのアクセスを提供します。それにより病原体が宿主細胞機械を操作する方法理解する方法を提供します。特に、いくつかのウイルス宿主相互作用ネットワークのマッピングは、ウイルスタンパク質が優先的に非常に（ハブ）セルラーネットワークに接続されている、またはネットワーク（ボトルネックタンパク質）2-4の多くのパスの中心とその宿主タンパク質を標的とすることを明らかにした。これらの相互作用は、感染性の子孫を複製し、生成する楽器である、ウイルスが重要な細胞プロセスを操作することができます。比較の相互作用のマッピングは最近に関連する情報を抽出することを目標に関連したウイルスで実施されました病因4。さらに、ホスト病原体の相互作用の風景の研究は、多くの病原体5に拡張されました。標的細胞因子の同定は、細胞に感染する病原体によって使用される戦略に洞察を提供し、潜在的な病原性マーカーの検出を可能にする。 酵母ツーハイブリッドシステムは、遺伝スクリーニングがタンパク質 - タンパク質相互作用のハイスループットマッピングのための効率的かつ高感度なツールであるため、バイナリの相互作用を同定するための最も一般的な方法である。さらにここで提案手法は、このようにして、病原体宿主タンパク質 - タンパク質相互作用の比較概要へのアクセスを提供する、複数の病原菌株変異体の蛋白質を評価することによって、個々のY2Hの上映を向上させることができる。それは全体の相互作用6の約20％を回収するため、また、酵母ツーハイブリッドスクリーニングの主な制限は、高い偽陰性率にある。これは、相互作用が病態のサブセットのみで検出されたことを意味します氏族バリアントは他の人と検出を免れたかもしれない。したがって、すべてのツーハイブリッドスクリーニングから出てくる個々のパートナーは、さらに比較の相互作用データセットを提供し、研究した株の完全な範囲との相互作用のために挑戦されています。それは別の手法を組み合わせることが強くタンパク質-タンパク質相互作用データセット7のロバスト性を増加させることが実証されたので、この検証は、HT-GPCA 8と呼ばれる新しく開発されたタンパク質断片相補アッセイにより、哺乳動物細胞中で行われる。このセルベースのシステムでは、 ガウヨモギの補完によるタンパク質相互作用の検出はルシフェラーゼを分割し、ハイスループットフォーマットと互換性があるように設計されていることができます。その発光ベースの技術のおかげで、その低バックグラウンドノイズは、他の蛍光ベースのアッセイと比較して、HT-GPCAは著しく高い感度を示しています。 全体として、このアプローチは、効率的となるハイジャックされた宿主細胞の国際理解の第一歩を表しホスト病原体のinterplaysの包括的なマッピングを生成するツール。

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of Reagent/Material</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast strains</td>
			<td>Clontech</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minimal SD base</td>
			<td>US biological</td>
			<td>D9500</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amino acids</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-amino-1,2,4-Triazole (3-AT)</td>
			<td>Acros organics</td>
			<td>264571000</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zymolase</td>
			<td>Seikagaku</td>
			<td>120491</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Gibco-Life Technologies</td>
			<td>31966</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>BioWest</td>
			<td>S1810</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffer Saline (PBS)</td>
			<td>Gibco-Life Technologies</td>
			<td>14190</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Gibco-Life Technologies</td>
			<td>15140</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA</td>
			<td>Gibco-Life Technologies</td>
			<td>25300</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Renilla luciferase assay</td>
			<td>Promega</td>
			<td>E2820</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>White culture plate</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>655083</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-wellPCR plates</td>
			<td>4titude</td>
			<td>4t-i0730/C</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator (30 &deg;C)</td>
			<td>Memmert</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator (37 &deg;C)</td>
			<td>Heraeus</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luminometer</td>
			<td>Berthold</td>
			<td>Centro XS-LB 960</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a comparative approach to characterize the landscape of host-pathogen protein-protein interactions

多大な努力は、大規模な総合タンパク質 - タンパク質相互作用ネットワークマップを生成するために集まっていた。これは、病原体 - 宿主の関係を理解することが尽力され、本質的に、酵母ツーハイブリッドシステムを遺伝的スクリーニングにより行った。 ガウルシフェラーゼベース断片相補アッセイによるタンパク質間相互作用検出の最近の改善は今厳格細胞因子の共通のセットに対して異なる病原体の歪み変種からのタンパク質の相互作用プロファイルを比較するために必要な統合的な比較interactomicアプローチを開発する機会を提供しています。 本稿では、具体的には、タンパク質-タンパク質相互作用データセットを生成するために2つの直交方法を組み合わせるの有用性に焦点を当て酵母ツーハイブリッド（Y2H）と新しいアッセイ、哺乳動物細胞において行わハイスループットガウヨモギタンパク質相補アッセイ（HT-GPCA）。 NTが &quot;病原体タンパク質の細胞パートナーの&gt;大規模同定は、複数の病原体の歪みバリアントを使用してcDNAライブラリーの交配ベース酵母ツーハイブリッドスクリーニングによって実行されます。高い信頼統計的スコアで選択パートナー相互作用のサブセットがさらにあるHT-GPCAを用いた病原体の変異体タンパク質のセット全体でペアワイズ相互作用のため、哺乳動物細胞で検証。二つの相補的な方法の組み合わせは、相互作用データセットの堅牢性を向上させ、厳格な比較相互作用解析のパフォーマンスが可能になります。このような比較interactomicsは解読任意の病原体 - 宿主interplaysに信頼性が高く、強力な戦略を構成する。

図2のHPV E2タンパク質（参照13から適応）が偽陽性と偽陰性率の評価で示されるようにHT-GPCAの主要な強さは、その高感度にある。偽陰性率を決定するために、HPV16からE2の既知の相互作用は、HT-GPCA（ 図2A）により評価した。 18の相互作用のうち、4つは（22％偽陰性率に相当）を回収していませんでした。偽陽性の対話は、細胞タンパク質のランダムセット（ 図2B...

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A Comparative Approach to Characterize the Landscape of Host-Pathogen Protein-Protein Interactions

この記事では、ホストと二つの直交の方法を組み合わせて使用​​して病原体のタンパク質間の高い自信インタラクションデータセットの識別に焦点を当てています：酵母ツー​​ハイブリッドHT-GPCA呼ばれる哺乳動物細胞におけるハイスループット相互作用アッセイが続く。

ホスト病原体のタンパク質 - タンパク質相互作用の風景を特徴づけるために比較的アプローチ

Significant efforts were gathered to generate  large-scale comprehensive protein-protein interaction network maps. This is  instrumental to understand the ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

11.1K ビュー.  Institut Pasteur. この記事では、ホストと二つの直交の方法を組み合わせて使用​​して病原体のタンパク質間の高い自信インタラクションデータセットの識別に焦点を当てています：酵母ツー​​ハイブリッドHT-GPCA呼ばれる哺乳動物細胞におけるハイスループット相互作用アッセイが続く。

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Comparative in vivo Study of gp96 Adjuvanticity in the Frog Xenopus laevis

We have developed in the amphibian Xenopus laevis a unique non-mammalian model to study the ability of certain heat shock proteins (hsps) such as gp96 to facilitate cross-presentation of chaperoned antigens and elicit innate and adaptive T cell responses. Xenopus skin graft rejection provides an excellent platform to study the ability of gp96 to elicit classical MHC class Ia (class Ia) restricted T cell responses. Additionally, the Xenopus model system also provides an attractive alternative to mice for exploring the ability of gp96 to generate responses against tumors that have down-regulated their class Ia molecules thereby escaping immune surveillance. Recently, we have developed an adoptive cell transfer assay in Xenopus clones using peritoneal leukocytes as antigen presenting cells (APCs), and shown that gp96 can prime CD8 T cell responses in vivo against minor histocompatibility skin antigens as well as against the Xenopus thymic tumor 15/0 that does not express class Ia molecules. We describe here the methodology involved to perform these assays including the elicitation, pulsing and adoptive transfer of peritoneal leukocytes, as well as the skin graft and tumor transplantation assays. Additionally we are also describing the harvesting and separation of peripheral blood leukocytes used for flow cytometry and proliferation assays which allow for further characterization of the effector populations involved in skin rejection and anti-tumor responses.

Comparative in vivo Study of gp96 Adjuvanticity in the Frog Xenopus laevis

The frog Xenopus laevis provides an attractive alternative non-mammalian model for exploring the ability of heat shock protein such as gp96 to promote antigen-specific CD8 T cell responses. We present methods to study in vivo facilitation of cross-presentation of skin and tumor antigens by gp96.

比較 in vivoで</emカエルのgp96アジュバント活性の>研究アフリカツメガエル</em

We have developed in the amphibian Xenopus laevis a unique non-mammalian model to study the ability of certain heat shock proteins (hsps) such as gp96 to ...

免疫・感染学

Use of an Optical Trap for Study of Host-Pathogen Interactions for Dynamic Live Cell Imaging

Dynamic live cell imaging allows direct visualization of real-time interactions between cells of the immune system1, 2; however, the lack of spatial and temporal control between the phagocytic cell and microbe has rendered focused observations into the initial interactions of host response to pathogens difficult. Historically, intercellular contact events such as phagocytosis3 have been imaged by mixing two cell types, and then continuously scanning the field-of-view to find serendipitous intercellular contacts at the appropriate stage of interaction. The stochastic nature of these events renders this process tedious, and it is difficult to observe early or fleeting events in cell-cell contact by this approach. This method requires finding cell pairs that are on the verge of contact, and observing them until they consummate their contact, or do not. To address these limitations, we use optical trapping as a non-invasive, non-destructive, but fast and effective method to position cells in culture.
Optical traps, or optical tweezers, are increasingly utilized in biological research to capture and physically manipulate cells and other micron-sized particles in three dimensions4. Radiation pressure was first observed and applied to optical tweezer systems in 19705, 6, and was first used to control biological specimens in 19877. Since then, optical tweezers have matured into a technology to probe a variety of biological phenomena8-13.
We describe a method14 that advances live cell imaging by integrating an optical trap with spinning disk confocal microscopy with temperature and humidity control to provide exquisite spatial and temporal control of pathogenic organisms in a physiological environment to facilitate interactions with host cells, as determined by the operator. Live, pathogenic organisms like Candida albicans and Aspergillus fumigatus, which can cause potentially lethal, invasive infections in immunocompromised individuals15, 16 (e.g. AIDS, chemotherapy, and organ transplantation patients), were optically trapped using non-destructive laser intensities and moved adjacent to macrophages, which can phagocytose the pathogen. High resolution, transmitted light and fluorescence-based movies established the ability to observe early events of phagocytosis in living cells. To demonstrate the broad applicability in immunology, primary T-cells were also trapped and manipulated to form synapses with anti-CD3 coated microspheres in vivo, and time-lapse imaging of synapse formation was also obtained. By providing a method to exert fine spatial control of live pathogens with respect to immune cells, cellular interactions can be captured by fluorescence microscopy with minimal perturbation to cells and can yield powerful insight into early responses of innate and adaptive immunity.

A method is described to individually select, manipulate, and image live pathogens using an optical trap coupled to a spinning disk microscope. The optical trap provides spatial and temporal control of organisms and places them adjacent to host cells. Fluorescence microscopy captures dynamic intercellular interactions with minimal perturbation to cells.

動的な生細胞イメージングのための宿主 - 病原体相互作用の研究のための光トラップの使用

Dynamic live cell imaging allows direct visualization of real-time interactions between cells of the immune system1, 2; however, the lack of spatial and ...

Use of the EpiAirway Model for Characterizing Long-term Host-pathogen Interactions

Nontypeable Haemophilus influenzae (NTHi) are human-adapted Gram-negative bacteria that can cause recurrent and chronic infections of the respiratory mucosa 1; 2. To study the mechanisms by which these organisms survive on and inside respiratory tissues, a model in which successful long-term co-culture of bacteria and human cells can be performed is required. We use primary human respiratory epithelial tissues raised to the air-liquid interface, the EpiAirway model (MatTek, Ashland, MA). These are non-immortalized, well-differentiated, 3-dimensional tissues that contain tight junctions, ciliated and nonciliated cells, goblet cells that produce mucin, and retain the ability to produce cytokines in response to infection. 
This biologically relevant in vitro model of the human upper airway can be used in a number of ways; the overall goal of this method is to perform long-term co-culture of EpiAirway tissues with NTHi and quantitate cell-associated and internalized bacteria over time. As well, mucin production and the cytokine profile of the infected co-cultures can be determined. This approach improves upon existing methods in that many current protocols use submerged monolayer or Transwell cultures of human cells, which are not capable of supporting bacterial infections over extended periods3. For example, if an organism can replicate in the overlying media, this can result in unacceptable levels of cytotoxicity and loss of host cells, arresting the experiment. The EpiAirway model allows characterization of long-term host-pathogen interactions. Further, since the source for the EpiAirway is normal human tracheo-bronchial cells rather than an immortalized line, each is an excellent representation of actual human upper respiratory tract tissue, both in structure and in function4.
For this method, the EpiAirway tissues are weaned off of anti-microbial and anti-fungal compounds for 2 days prior to delivery, and all procedures are performed under antibiotic-free conditions. This necessitates special considerations, since both bacteria and primary human tissues are used in the same biosafety cabinet, and are co-cultured for extended periods.

This method allows characterization of extended bacterial co-culture with EpiAirways, primary human respiratory epithelial tissue grown at the air-liquid interface, a biologically relevant in vitro model. The approach can be used with any microbe that is amenable to long-term co-culture.

長期宿主 - 病原体相互作用を特徴付けるためのEpiAirwayモデルの利用

Nontypeable Haemophilus influenzae  (NTHi) are human-adapted Gram-negative bacteria that can cause recurrent and chronic infections of the respiratory ...

Phage Phenomics: Physiological Approaches to Characterize Novel Viral Proteins

Current investigations into phage-host interactions are dependent on extrapolating knowledge from (meta)genomes. Interestingly, 60 - 95% of all phage sequences share no homology to current annotated proteins. As a result, a large proportion of phage genes are annotated as hypothetical. This reality heavily affects the annotation of both structural and auxiliary metabolic genes. Here we present phenomic methods designed to capture the physiological response(s) of a selected host during expression of one of these unknown phage genes. Multi-phenotype Assay Plates (MAPs) are used to monitor the diversity of host substrate utilization and subsequent biomass formation, while metabolomics provides bi-product analysis by monitoring metabolite abundance and diversity. Both tools are used simultaneously to provide a phenotypic profile associated with expression of a single putative phage open reading frame (ORF). Representative results for both methods are compared, highlighting the phenotypic profile differences of a host carrying either putative structural or metabolic phage genes. In addition, the visualization techniques and high throughput computational pipelines that facilitated experimental analysis are presented.

Here, we present phenomic approaches for the functional characterization of putative phage genes. Techniques include a developed assay capable of monitoring host anabolic metabolism, the Multi-phenotype Assay Plates (MAPs), in addition to the established method of metabolomics, capable of measuring effects to catabolic metabolism.

ファージフェノミクス：小説のウイルスタンパク質を特徴づけるために、生理的アプローチ

Current investigations into phage-host interactions are dependent on extrapolating knowledge from (meta)genomes. Interestingly, 60 - 95% of all phage ...

Biomimetic Materials to Characterize Bacteria-host Interactions

Bacterial attachment to host cells is one of the earliest events during bacterial colonization of host tissues and thus a key step during infection. The biochemical and functional characterization of adhesins mediating these initial bacteria-host interactions is often compromised by the presence of other bacterial factors, such as cell wall components or secreted molecules, which interfere with the analysis. This protocol describes the production and use of biomimetic materials, consisting of pure recombinant adhesins chemically coupled to commercially available, functionalized polystyrene beads, which have been used successfully to dissect the biochemical and functional interactions between individual bacterial adhesins and host cell receptors. Protocols for different coupling chemistries, allowing directional immobilization of recombinant adhesins on polymer scaffolds, and for assessment of the coupling efficiency of the resulting &#8220;bacteriomimetic&#8221; materials are also discussed. We further describe how these materials can be used as a tool to inhibit pathogen mediated cytotoxicity and discuss scope, limitations and further applications of this approach in studying bacterial - host interactions.

Bacterial attachment to host cells is a key step during host colonization and infection. This protocol describes the generation of polymer-coupled recombinant adhesins as biomimetic materials which allow analysis of the contribution of individual adhesins to these processes, independent of other bacterial factors.

細菌 - 宿主相互作用を特徴づけるために、バイオミメティック材料

Bacterial attachment to host cells is one of the earliest events during bacterial colonization of host tissues and thus a key step during infection. The ...

Retroviral Transduction of Helper T Cells as a Genetic Approach to Study Mechanisms Controlling their Differentiation and Function

Helper T cell development and function must be tightly regulated to induce an appropriate immune response that eliminates specific pathogens yet prevents autoimmunity. Many approaches involving different model organisms have been utilized to understand the mechanisms controlling helper T cell development and function. However, studies using mouse models have proven to be highly informative due to the availability of genetic, cellular, and biochemical systems. One genetic approach in mice used by many labs involves retroviral transduction of primary helper T cells. This is a powerful approach due to its relative ease, making it accessible to almost any laboratory with basic skills in molecular biology and immunology. Therefore, multiple genes in wild type or mutant forms can readily be tested for function in helper T cells to understand their importance and mechanisms of action. We have optimized this approach and describe here the protocols for production of high titer retroviruses, isolation of primary murine helper T cells, and their transduction by retroviruses and differentiation toward the different helper subsets. Finally, the use of this approach is described in uncovering mechanisms utilized by microRNAs (miRNAs) to regulate pathways controlling helper T cell development and function.

Many experimental systems have been utilized to understand the mechanisms regulating T cell development and function in an immune response. Here a genetic approach using retroviral transduction is described, which is economic, time efficient, and most importantly, highly informative in identifying regulatory pathways.

遺伝的分化を制御するメカニズムを研究するためのアプローチと機能などのヘルパーT細胞のレトロウイルス形質導入

Helper T cell development and function must be tightly regulated to induce an appropriate immune response that eliminates specific pathogens yet prevents ...

A Protocol to Characterize the Morphological Changes of Clostridium difficile in Response to Antibiotic Treatment

Assessment of antibiotic action with new drug development directed towards anaerobic bacteria is difficult and technically demanding. To gain insight into possible MOA, morphologic changes associated with antibiotic exposure can be visualized using scanning electron microscopy (SEM). Integrating SEM imaging with traditional kill curves may improve our insight into drug action and advance the drug development process. To test this premise, kill curves and SEM studies were conducted using drugs with known but different MOA (vancomycin and metronidazole). C. difficile cells (R20291) were grown with or without the presence of antibiotic for up to 48 h. Throughout the 48 h interval, cells were collected at multiple time points to determine antibiotic efficacy and for imaging on the SEM. Consistent with previous reports, vancomycin and metronidazole had significant bactericidal activity following 24 h of treatment as measured by colony-forming unit (CFU) counting. Using SEM imaging we determined that metronidazole had significant effects on cell length (&#62; 50% reduction in cell length for each antibiotic; P&#60; 0.05) compared to controls and vancomycin. While the phenotypic response to drug treatment has not been documented previously in this manner, they are consistent with the drug&#39;s MOA demonstrating the versatility and reliability of the imaging and measurements and the application of this technique for other experimental compounds.

A Protocol to Characterize the Morphological Changes of Clostridium difficile in Response to Antibiotic Treatment

Antibiotic efficacy is most commonly determined by conducting killing kinetic studies and measuring colony forming units (CFUs). By integrating scanning electron microscopy (SEM) with these standard methods, we can distinguish the pharmacological effects of treatment between different antibiotics.

形態変化を特徴付けるプロトコル<em&gt;クロストリジウム・ディフィシル</em&gt;抗生物質治療に対する反応

Assessment of antibiotic action with new drug development directed towards anaerobic bacteria is difficult and technically demanding. To gain insight into ...

Evaluation of Host-Pathogen Responses and Vaccine Efficacy in Mice

Vaccines are a 20th century medical marvel. They have dramatically reduced the morbidity and mortality caused by infectious diseases and contributed to a striking increase in life expectancy around the globe. Nonetheless, determining vaccine efficacy remains a challenge. Emerging evidence suggests that the current acellular vaccine (aPV) for Bordetella pertussis (B. pertussis) induces suboptimal immunity. Therefore, a major challenge is designing a next-generation vaccine that induces protective immunity without the adverse side effects of a whole-cell vaccine (wPV). Here we describe a protocol that we used to test the efficacy of a promising, novel adjuvant that skews immune responses to a protective Th1/Th17 phenotype and promotes a better clearance of a B. pertussis challenge from the murine respiratory tract. This article describes the protocol for mouse immunization, bacterial inoculation, tissue harvesting, and analysis of immune responses. Using this method, within our model, we have successfully elucidated crucial mechanisms elicited by a promising, next-generation acellular pertussis vaccine. This method can be applied to any infectious disease model in order to determine vaccine efficacy.

Here we present an elegant protocol for in vivo evaluation of vaccine effectiveness and host immune responses. This protocol can be adapted for vaccine models that study viral, bacterial, or parasitic pathogens.

宿主-病原体応答とマウスでワクチンの有効性の評価

Vaccines are a 20th century medical marvel. They have dramatically reduced the morbidity and mortality caused by infectious diseases and contributed to a ...

Infection of Zebrafish Larvae with Aspergillus Spores for Analysis of Host-Pathogen Interactions

Invasive aspergillosis (IA) is one of&#160;the most common fungal infections among immunocompromised individuals. Despite the availability of antifungal drugs, IA can cause &#62;50% mortality in infected immunocompromised patients. It is crucial to determine both host and pathogen factors that contribute to infection susceptibility and low survival rates in infected patients in order to develop novel therapeutics. Innate immune responses play a pivotal role in recognition and clearance of Aspergillus spores, though little is known about the exact cellular and molecular mechanisms. Reliable models are required to investigate detailed mechanistic interactions between the host and pathogen. The optical clarity and genetic tractability of zebrafish larvae make them an intriguing model&#160;to study host-pathogen interactions of multiple human bacterial and fungal infections in a live and intact host. This protocol describes a larval zebrafish Aspergillus infection model. First, Aspergillus spores are isolated and injected into the zebrafish hindbrain ventricle via microinjection. Then, chemical inhibitors such as immunosuppressive drugs are added directly to the larval water. Two methods to monitor the infection in injected larvae are described, including the 1) homogenization of larvae for colony forming unit (CFU) enumeration and 2) a repeated, daily live imaging setup. Overall, these techniques can be used to mechanistically analyze the progression of Aspergillus infection in vivo and can be applied to different host backgrounds and Aspergillus strains to interrogate host-pathogen interactions.

Infection of Zebrafish Larvae with Aspergillus Spores for Analysis of Host-Pathogen Interactions

This protocol describes an Aspergillus infection model in zebrafish larvae. Aspergillus spores are microinjected into the hindbrain of larvae, and chemical treatment is used to induce immunosuppression. Infection progression is monitored via a daily imaging setup to monitor fungal growth and immune responses as well as enumeration of live spores by colony forming unit plating.

宿主と病原体の相互作用の解析のためのゼブラフィッシュ幼虫のア スペルギルス 胞子の感染

Invasive aspergillosis (IA) is one of&#160;the most common fungal infections among immunocompromised individuals. Despite the availability of antifungal ...

Label-Free Quantitative Proteomics Workflow for Discovery-Driven Host-Pathogen Interactions

The technological achievements of mass spectrometry (MS)-based quantitative proteomics opens many undiscovered avenues for analyzing an organism&#8217;s global proteome under varying conditions. This powerful strategy applied to the interactions of microbial pathogens with the desired host comprehensively characterizes both perspectives towards infection. Herein, the workflow describes label-free quantification (LFQ) of the infectome of Cryptococcus neoformans, a fungal facultative intracellular pathogen that is the causative agent of the deadly disease cryptococcosis, in the presence of immortalized macrophage cells. The protocol details the proper protein preparation techniques for both pathogen and mammalian cells within a single experiment, resulting in appropriate peptide submission for liquid-chromatography (LC)-MS/MS analysis. The high throughput generic nature of LFQ allows a wide dynamic range of protein identification and quantification, as well as transferability to any host-pathogen infection setting, maintaining extreme sensitivity. The method is optimized to catalogue extensive, unbiased protein abundance profiles of a pathogen within infection-mimicking conditions. Specifically, the method demonstrated here provides essential information on C. neoformans pathogenesis, such as protein production necessary for virulence and identifies critical host proteins responding to microbial invasion.

Here, we present a protocol to profile the interplay between host and pathogen during infection by mass spectrometry-based proteomics. This protocol uses label-free quantification to measure changes in protein abundance of both host (e.g., macrophages) and pathogen (e.g., Cryptococcus neoformans) in a single experiment.

発見駆動型宿主間相互作用のためのラベルフリー定量プロテオミクスワークフロー

The technological achievements of mass spectrometry (MS)-based quantitative proteomics opens many undiscovered avenues for analyzing an organism&#8217;s ...