この作品は、ヘルスリサーチ（CIHR）のカナダの研究所によってサポートされていました自然科学とカナダのディスカバリーの助成金とCRLへのヒューマン·フロンティア·サイエンス·プログラムの助成金の工学研究評議会、191597、299432と324265を付与します。 CRLはCIHR新しい研究者である。ギヨームディスはテオのフェローシップでサポートされています。サミュエル·ロシェットはNSERCとFRQNTフェローシップでサポートされています。

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我々は、高スループットでの任意のベイトタンパク質のための物理的な相互作用因子の系統的な同定を可能にするDHFR-PCAアッセイに基づくプロトコルを記載している。このプロトコルは、より多くの餌をスクリーニングすることによって適合され、この複製の任意の所望のレベルにすることができる。 Nup82：私たちは、核膜孔複合体に関与ベイトタンパク質のための物理的な相互作用パートナーの同定により、このプロトコルの信頼性を実証する。我々の分析は、酵母タンパク質のインタラクトームを研究する方法の能力を強調し、5以前に報告されたインターアクターと1以前に報告されていない相互作用因子（ 図3F＆3G）を見つけることができました。 ここで説明するプロトコルは、実験者が注意を払う必要があります先のいくつかの重要なステップを含む。私たちは、餌DHFR Fは[1,2]融合が（ 図1B）が正しいことを確認してください）1にお勧めします。これは、建設およびmeasurを配列決定することによって達成することができる抗DHFR F [1,2]または抗DHFR F [3]抗体を用いて、適切なタンパク質発現をる。 2）画面を開始する前に、それが関心のある任意の餌は、PCAの画面で無差別な相互作用を発揮するかどうかを確認することをお勧めします。これは、適切なL-DHFR制御または手動で適切なL-DHFRコントロールで餌を交配し、MTXの培地中での増殖アッセイを実行することによって交差餌とコントロール画面を実行することによって行うことができる。水分が印刷プロセス中に寒天表面上の細胞接着のために最適であるように、それらが使用される前に3）プレート日注がれるべきである。 4）ソースプレートは、先プレートに十分な細胞を転送するための4倍以上を使用すべきではない。目的プレートのコピー数の増加は、膨張の連続工程（ - &gt; 16コピー- &gt; 64コピー、例えば 4コピー）することによって行うことができる。あるいは、細胞は、芝生または複製の異なるラウンド間コロニーの異なる位置に撮像す​​ることができる。 5）もし、いくつかのpositionsは二倍体の選択（複数可）の後に不足している、ソースプレートは（4.5〜4.7ステップ）嵌合段階で何度も使用されなかったことを確認してください。 6）MTX媒体は右の濃度ですべての必須成分が含まれていることを確認。全く成長がMTX培地上で観察されていない場合には相互作用は、目的のタンパク質についてPCAによって検出されないため、またはMTX媒体が適切に準備されなかったため、実際には、のいずれかであり得る。媒体はDHFRが相補性断片を示す株の増殖を可能にすることを保証するために、構成的な相互作用は、コレクションの空の位置に追加され、そのようなロイシンジッパー部分33（ 図1C）に融合DHFR断片陽性対照として使用することができる。リンカ-DHFR断片またはジッパー - リンカー - DHFR断片を用いた並列テストがDESCRとして、偽陽性の相互作用をする傾向があるすべての細胞が成長することを可能にする条件（低MTX濃度またはベイトタンパク質を区別できるようになります全ての株（培地中に欠けているMTX濃度が高すぎるか、または本質的な成分）の増殖を防止するための条件は、以下アイベッド）;および例えば、ピンツールは、複製ラウンドおよび/または最後の水との間で適切に滅菌されていない、場合7）PCAを別の媒体から複製の連続ラウンドを介して行われることを考えると、異なるプレート間の株の間で交差汚染が発生することが滅菌手順のバス（ すなわちウェットステーション）は、前回の複製ラウンドのコロニーによって汚染されている。アレイ上のいくつかの位置は空であり、従って、全く成長が交差汚染を検出するために観察されないはずである制御位置として使用することができる。 画像解析は、いくつかの公開されたソフトウェア（プロトコルのセクション5を参照）、または任意のカスタムスクリプトを使用して行うことができる。本研究では、カスタムスクリプトは、次の手順を実行します。1）スクリプトが共存するために、各プレートの値をピクセルに空のプレートの画素値を減算し、照明バイアスを修正してください。 2）スクリプトがエッジコロニー上の矩形を重ねることによって決定された各プレートの各1536位置については、）10. 3の画素値のしきい値を使用してバイナリに各バックグラウンド補正画像に変換し、スクリプトはImageJのが「粒子を分析し実行します...円形の選択で」機能。円形の選択は、2つの位置の±10画素間の間隔に等しい半径が設定される。 4）スクリプトは、選択範囲の中心から最も近い粒子を選択し、その場所が離れて選択範囲の中心から2コロニー間の半分以上の間隔でない場合は植民地としてそれを確認する。 5）スクリプトは、バックグラウンド補正画像上の選択された粒子の画素値を測定する。 6）さらに、残りの背景照明の偏りを修正するには、スクリプトがコロニーの画素値に対する粒子の一部ではない円形選択からすべての画素の平均値を減算する。これらの補正画素値の和補足表1の欄「IntDenBackSub」に格納されているのは、コロニーの大きさの尺度として使用される。 解析部内の重要なステップは、有意性の閾値の選択である。ここでは、負のL-DHFR F [3]のコントロールの分布に基づいて閾値を選択したが、画面の目的に応じて、そのような閾値は、厳しすぎるかもしれない。相補的な断片は、自然発生的に互いに補完してもよく、これらは、このようにほとんどのタンパク質の発現を代表するものではないことを確かに、L-DHFR F [3]コントロールが過剰発現される（強いTEFプロモーター）など。これは、L-DHFR Fの分布は、[3]のコントロールは、バックグラウンド増殖（図3D）の平均値よりも高いという事実によって強調される。したがって、バックグラウンド増殖分布の外側に明確に定められているいくつかのこの厳しい閾値を下回るスコアを有する相互作用が、は、例えば、一過性または弱間を表すことが、推定ヒットとして考えることができるアクション。例えば、二つのタンパク質をL-DHFRのコントロールのようなDHFR断片の自発的な相補性を可能にすることができるレベルで発現されていない、場合は、これらをさらに研究し、クロス検証できます。別の方法として、1は偽陽性上の真陽性の割合を最大化するために、バイオグリッド35のようなデータベースで報告された物理的な相互作用因子との重複の割合に基づいて、有意性の閾値を設定することができます。例えば、既知の物理的な相互作用物質の数が十分に高くない場合は、L-DHFR分布の使用とは異なり、この代替は必ずしも可能でないかもしれません。また、有意な閾値の選択は、最終的なデータセットで偽陽性と偽陰性の割合に影響を与える。前述のように、例えば、タンパク質が非常に豊富である場合には確かに、他のPPI検出アッセイのように、偽陽性がDHFR融合タンパク質とのタンパク質の非特異的相互作用から生じ得る。このいくつかのプレイ体系PCA画面内のすべてのベイトタンパク質と相互作用し、従って、分析11（ 例えば、TEF2とAde17及び補足表2）から除去する必要があるという事実が挙げられる。 （[3] F [1,2]またはF）自発的なDHFRを呈する餌と獲物を識別するために、この問題は、適切なL-DHFRコントロールに対して2コレクションの制御PCA画面を回避するには、相補性は、特定の条件で行うことができ断片各画面の。与えられた餌の機能が分かっている場合、また、遺伝子オントロジー濃縮解析を行うことは、データの信頼性を高めることができる。一方、DHFR-PCAは、いくつかの理由のために偽陰性を生じさせることができる：1）全てのタンパク質は、これらのタンパク質を不安定化させる場合、または、例えば、それらの局在を変更することができるようにDHFR断片に融合させることができない、とDHFR融合C末端は、局在化シグナルと干渉する。いくつかの細胞区画メートルで2）DHFR再構成例えば、葉酸合成に必須の前駆体が利用できない場合などのy葉酸を生成しない。 DHFR相補11を発生するための8nmの距離内にあるように3）C末端の必要性。それらのC末端は、空間に十分近くに配置されていないこのように、よく知られた相互作用が検出されないことがある。これは、間接的であるほとんどがデータベースに報告Nup82物理的相互作用の大部分は、我々のアッセイでは検出されなかったという事実によってここで例示されている。同様に、C末端が膜に対してトランスであるための膜タンパク質間の相互作用は、DHFRにはつながらない相補性を断片化し、11が検出されることはありません。制限は、1）と3）は、タンパク質のN末端にDHFR断片を融合することにより、比較的簡単に回避することができる。そうするC末端の近くに局在化シグナルを妨害することが防止でき、NおよびC末端のシス相対している膜タンパク質の間の相互作用を検出することを可能にする膜へ。 いくつかの課題は、（2,3で検討）ピンの調査に残る。これまでに製造されたPINのマップは、主にそれぞれの種のための単一の実験条件に記載されて、したがって、タンパク質ネットワークが組織されることがありますどのように単一のスナップショットを提供しています。開発または以下の突然変異を横切って、PINが環境の変化に応じて再編成することができる方法を特定の刺激を見るために、他の実験条件の探索が必要とされている。これらの課題は、生細胞中で、彼らは研究室の大きなコミュニティによって使用できるように現在の技術を適合させることにより、リアルタイムでのPPIを問い合わせるための新しい技術の開発によって克服される。 DHFR相補複合体27の量の変化を検出することができる定量的な技術として、DHFR-PCAは、これらの課題を克服するために適合させることができるとのPPIは、DNA損傷剤22によってどのように影響されるかを研究するために使用されている</sup&gt;、化学剤25、遺伝子欠失23,26または他の酵母種およびそれらの混成33。これらの新しい次元を探るPINの動的を明らかにすることがますます重要になるであろう。

タンパク質相互作用ネットワーク（ピン）は、タンパク質が機能的にセル1に編成されている方法の低解像度マップを提供します。各物理的な2つのタンパク質間の接続、またはタンパク質 - タンパク質相互作用（PPI）は、そのようなタンパク質複合体の中に見られるように、時間的に安定して関連付けを表すことができ、それは細胞の構造的組織化に寄与する。これらの接続には、活性、安定性、局在化および2のパートナーの相互作用を調節する過渡関連を表すことができる。与えられたタンパク質の物理的相互作用パートナーを識別すること、したがってそのタンパク質2,3の機能と規制に関する豊富な情報を提供しています。これらの理由から、大きな努力が大腸菌 4-6、 シロイヌナズナ7、サッカロマイセス·セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）8-12、キイロショウジョウバエ&lt;などのモデル生物でのPINのマッピングに向けて置かれている/ em&gt;の13、線虫は、14と15 サピエンスホモエレガンス 。これらの研究は、タンパク質が細胞内で編成されているかを重要な洞察および未知の機能を有するタンパク質上のため、重要な情報を提供してきた。 いくつかの戦略は、ピンを研究するために長年にわたって開発されてきた。これらの技術は広く（16-18に概説）はPPIの上に提供する情報の種類に基づいて、三つのカテゴリーに分類することができる。最初の1は、酵母ツーハイブリッドおよびその誘導体19に基づいています。これらの技術は、バイナリのネットワークを構築することができ、タンパク質のペアの間の直接的な関連、上の情報を提供します。第二のファミリーは、ベイトタンパク質のアフィニティー精製および質量分析20に続くアフィニティー精製などのそれらの関連パートナーの同定に基づく。これらのアプローチは、直接であるタンパク質のグループを識別するまたは間接的に、一般的に安定した方法で、関連する、およびタンパク質複合体を同定するために非常に強力である。第三のアプローチは、タンパク質断片相補アッセイ（PCAは）11,21に基づいています。それは、タンパク質間の直接および近位の関連付けを検出することができますように、このアプローチは、二人の元のアプローチの解像度の中間レベルを提供します。最近18を見直しとして各技術は、独自の長所と短所があります。 そのプロテオームは、他のモデル真核生物のものよりも比較的複雑であるため、とのPPIを検出するためのハイスループットアッセイは、最初にアッセイされ、より効率的であるたために最善のような真核生物のPINは、部分的には、これまでで出芽酵母Saccharomyces cerevisiaeの一つですこのモデル生物9-12で実装。酵母系に特に強力な方法は、ジヒドロ葉酸還元酵素タンパク質断片相補アッセイ（DHFR-PCA）、されているアッセイである標準と摂動条件11,22-26における酵母PINを研究するために別のコンテキストで使用。この方法は、定量的に27で内因性発現レベルにおける所与のベイトタンパク質と相互作用パートナー11,21の天然の細胞内の局在化のための直接近直接PPIの検出を可能にする生存アッセイに依存している。このアッセイ（高密度コロニーアレイ上すなわちコロニーサイズ）を使用して得られた信号は、このように、野生型細胞のいずれかとほぼ同等の細胞環境におけるベイトとプレイとの間に形成されるタンパク質複合体の量を反映する。アッセイは、その2つのタンパク質が相互作用するときに目的の2つのタンパク質に融合されるDHFRの2つの相補断片が接近することにより、葉酸代謝に関与するレポーター酵素、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（DHFR）の再構成に基づいている今度は酵素活性1の可逆的再構成につながる1とメトトレキサート（MTX; 図1）を含む培地上で株の増殖。この化合物は、内因性DHFR酵素ではなく、アッセイ28で使用される突然変異したものを阻害する。 PCA株の二つのコレクションを含む1 マタで株〜4300 ORFはDHFR Fに融合した[1,2]フラグメントおよびORFはDHFR [3]断片に融合、に購入することができた株α〜4800 MATを含む1すべての実験室での小規模または大規模にDHFR-PCAを実装する。ここでは、1ベイトタンパク質と、このアッセイを用いて〜4800獲物タンパク質との間のPPIをスクリーニングするための一般的なが、詳細なプロトコルを記述します。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of Material/Equipement</td>
			<td>&#160;Company&#160;</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>&#160;Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BioMatrix Robot, Bench-top Configuration</td>
			<td>S&#38;P Robotics Inc.</td>
			<td>BM5-BC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-format Pin-tool</td>
			<td>S&#38;P Robotics Inc.</td>
			<td>PH-96-10</td>
			<td>Standard 96-format Pin-tool with 96 high-precision floating pins</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>384-format Pin-tool</td>
			<td>S&#38;P Robotics Inc.</td>
			<td>PH-384-10</td>
			<td>Standard 384-format Pin-tool with 384 high-precision floating pins</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1536-format Pin-tool</td>
			<td>S&#38;P Robotics Inc.</td>
			<td>PH-1536-05</td>
			<td>Custom 1536-format Pin-tool with 0.5mm high-precision floating pins</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automated imaging module&#160;</td>
			<td>S&#38;P Robotics Inc.</td>
			<td>IMG-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methotrexate&#160;</td>
			<td>Bioshop Canada Inc.</td>
			<td>MTX440&#160;</td>
			<td>CAUTION: toxic compound</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hygromycin B&#160;</td>
			<td>Bioshop Canada Inc.</td>
			<td>HYG003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nourseothricin dihydrogen sulfate</td>
			<td>Werner BioAgents</td>
			<td>5010000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast-Interactome Collection&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>YSC5849</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Omni Tray w/lid sterile&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>242811</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-DHFR F[1,2] antibody&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D1067</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-DHFR F[3] antibody&#160;&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D0942</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

genome-wide protein-protein interaction screening by protein-fragment complementation assay (pca) in living cells

Proteins are the building blocks, effectors and signal mediators of cellular processes. A protein&#8217;s function, regulation and localization often depend on its interactions with other proteins. Here, we describe a protocol for the yeast protein-fragment complementation assay (PCA), a powerful method to detect direct and proximal associations between proteins in living cells. The interaction between two proteins, each fused to a dihydrofolate reductase (DHFR) protein fragment, translates into growth of yeast strains in presence of the drug methotrexate (MTX). Differential fitness, resulting from different amounts of reconstituted DHFR enzyme, can be quantified on high-density colony arrays, allowing to differentiate interacting from non-interacting bait-prey pairs. The high-throughput protocol presented here is performed using a robotic platform that parallelizes mating of bait and prey strains carrying complementary DHFR-fragment fusion proteins and the survival assay on MTX. This protocol allows to systematically test for thousands of protein-protein interactions (PPIs) involving bait proteins of interest and offers several advantages over other PPI detection assays, including the study of proteins expressed from their endogenous promoters without the need for modifying protein localization and for the assembly of complex reporter constructs.

補足表2は、Nup82はDHFR F餌として[1,2]断片に融合した酵母タンパク質を用いて得られた代表的な結果の一例である。 L-DHFR Fで定義されたしきい値は、[3]のコントロールは、高い信頼ヒット（ 図3Dおよび3E）を決定するために経験的な閾値として使用することができる。代替的に、スコアランキングは、遺伝子オントロジー濃縮度を実行するために使用することができ、または他の機能は、金基準37に基づいて、36を解析する。餌の既知の物理的相互作用因子はバイオグリッド35のようなデータベースから検索したデータ（ 図3E＆3F）に重ね合わせることができる。この例では、5つの8のうち、高い信頼のヒットは、以前にNup82の相互作用因子として報告されていると2はNup82の複体、Nup116とNup159（ 図3F＆3G）の一部である。複雑な、NSP1の他のメンバーは、すべてのインタラックが表示されない我々の実験でる。二つの餌食、Ade17とTEF2（ 図3Fには示されていない）が、ハード閾値以上のスコアが適用されていたが、これらは、彼らが我々は（未発表の結果）を行っているPCAの画面のほぼすべての餌タンパク質と相互作用するように偽陽性である可能性が高い。一方、Pex30はNup82の新規物理的相互作用因子を表すことができ、我々は、低スループット（ 図3G）でのDHFR-PCAを使用して、この相互作用を確認することができました。 Pex30はペルオキシソーム膜タンパク質であり、数の直接的な相互作用は、核膜孔複合体（NPC）とこの細胞小器官の間で報告されている。ツーハイブリッドスクリーンはPex30 38の物理的な相互作用因子として、他の二つのNPCタンパク質、Nup53とAsm4（Nup59）を同定し、そしてPex30とNup170間の遺伝的相互作用は、39を報告されている。他の二つの相互作用パートナーは、検出されNup120とNup85（ 図3F＆3G）、能力を示す、Nup82サブ複合体の一部ではありませんDHFR-PCAの中で、より大きな複合体11でsubcomplexes間の相互作用を検出する。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/52255/52255fig1highres.jpg" /> 図1：半数体のMATaマットα株のハイスループットDHFR-PCAのためのエンジニアリング酵母株（。Leducqらから適応図2012 33）（A）建設は、DHFRとGene1（G1）とGene2（G2）を融合させF [1,2] -NatMXおよびDHFR F [3] -HPHカセット 、それぞれ。カセットは、その後、[3]の順方向でG1-5」とG2-5を&#39;プライマープラスミドpAG25-DHFR F [1,2]とpAG32-DHFR Fから増幅、およびリバースプライマーG1-3&#39;とG2-3」、とされている相同組換えにより標的遺伝子の3 &#39;末端のゲノムに挿入する。得られたタンパク質は、P1及びP2は、それぞれDに融合されるHFR F [1,2]断片（ のMATa）と柔軟なリンカーを介してDHFR F [3]断片（MATα）。（B）構造の検証中（A）はGene1のとGene2者のORFとの間の接合部を配列決定することにより行われるDHFRカセット。接合型の対向構築PCA株はその後、二倍体を形成するために交配させる。二つの相補的DHFR断片がDHFR酵素の活性を再構成P1とP2との間の相互作用によって近接させている場合、二倍体株は、MTX培地上で成長する。（C）建設管理の二倍体PCAは、DHFR-PCAスクリーニングのため株。陰性対照（L-DHFR）は、プラスミドP41リンカーDHFR F [1,2]およびP41リンカーDHFR F [3] 11のそれぞれに別々に半数体のMATa及びMATα株を形質転換することによって構築される。 2株はDHFR断片ができないもので、陰性対照二倍体株ではその結果交配するお互いに（上）を補完する。ポジティブコントロールは、ネガティブコントロールの場合と同じアプローチを使用して構築されているが、プラスミドは、一倍体株（P41-ジッパー-リンカー-DHFR F [1,2]（P41-ZL-DHFR F [1,2]）とP41で変換リンカー-DHFR--zipper F [3]（P41-ZL-DHFR F [3]））、底部（DHFR活性の再構成に強力かつ構成的な相互作用をもたらす、相補的DHFR断片に融合した2 GCN4平行ロイシンジッパーフラグメントを含む）。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52255/52255fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/52255/52255fig2highres.jpg" /> 図2：ハイスループットDHFR-PCA手順（Leducq らから適応図33。）（A）MATαDHFR F [3]コレクション。<html>結露の2つの連続ラウンドを1536形式で凝縮されている。まず、グリセロールストックプレート96、ピンツールを使用して、384フォーマットで選択的YPD + HygB媒体上の4つの基によって結合される。第二に、384のアレイ384のピンツールを使用して、1536形式の選択YPD + HygB媒体上の4つの基によって結合される。 のMATa PCAベイト株（B）細胞芝生はベイト株の飽和培養物を増殖させることによって調製されるYPD +ナットomnitray。（C）これらの芝生で培養めっき選択YPD +ナット媒体とは、YPD培地上DHFR F [3]コレクションとベイト株を交配するために使用される。細胞は、連続して二倍体を選択し、二回MTX媒体にPCAを実行するためにYPD + HygB +ナット媒体に二回転送されます。 DHFR断片をベイトおよびプレイタンパク質との間の相互作用の後、お互いを補完した場合、成長は、MTX媒体上に観察される。e.jpg「ターゲット= &quot;_空白&quot;&gt;この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。 <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/52255/52255fig3highres.jpg" /> 図3：各画像の中央値によるデータは、正規化の工程を経て正の相互作用の有意性閾値と識別の決定を分析する（A）は 、各プレート上のコロニーの大きさの密度分布（2ログ）（B）正規化は、バイアスを補正するプレート間の副作用を伴う。（C）ヒートマップは、手順の再現性を確認し、プレート間のスピアマンの相関係数を示す。テストのPPIのスコアの（D）の分布とL-DHFR F [3]を制御する。ハード閾値は点線の垂直表される（[3]の分布の高い信頼性のPPIを識別するためにL-DHFR Fの95 パーセンタイル値に設定することができ各獲物の平均スコアの行）。（E）順位分布。バイオグリッド35 Nup82pの以前に報告され、物理的相互作用パートナーは、円によって識別され、この研究で報告されたものは赤い点で識別されます。 （D）で定義された閾値は点線で示されている。この研究で同定高い組み合わせのPPIを示した（F）ネットワーク。ブルーエッジが以前に報告されたショーの物理的相互作用因子（バイオグリッド35）、イエローエッジがPex30と以前に報告されていない相互作用を示す。（G）Nup82-DHFR F [1,2]と獲物-DHFR F [3を含むPCA二倍体株のスポット希釈アッセイ]ペアは、本研究におけるNup82pの物理的な相互作用因子として同定した。増殖アッセイは、DMSO媒体（MTX溶媒、左パネル）およびMTX培地（右パネル）で行った。 [3]とリンカ-DHFR F [1,2]リンカ-DHFR F - - [1,2] Nup82-DHFR Fからなる負の対照リンカ-DHFR F [3]及びTからなるポジティブコントロール2ロイシンジッパー部分間の彼の強力な相互作用（ジッパー-DHFR F [1,2] - ジッパー-DHFR F [3]）が含まれていた。 MTX培地でネガティブコントロールに優れた細胞増殖を、物理的相互作用として解釈されるべきである。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52255/52255fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> アミノ酸 </td><td> 量（g）に </td></tr><tr><td>アデニン硫酸塩* </td><td> 0.2 </td></tr><tr><td> L-トリプトファン</td><td> 0.4 </td></tr><tr><td> L-チロシン</td><td> 0.3 </td></tr><tr><td> L-フェニルアラニン</td><td> 0.5 </td></tr><tr><td> Lグルタミン酸（ナトリウム塩） </td><td> 1.0 </td></tr><tr><td> L-アスパラギン</td><td> 1.0 </td></tr><tr><td> Lバリン</td><td> 1.5 </td></tr><tr><td> L-スレオニン</td><td> 2.0 </tD&gt; </tr><tr><td> Lセリン</td><td> 3.75 </td></tr><tr><td>ウラシル</td><td> 0.2 </td></tr><tr><td> L-ヒスチジン塩酸</td><td> 0.2 </td></tr><tr><td> L-アルギニン塩酸</td><td> 0.2 </td></tr><tr><td> L-メチオニン* </td><td> 0.2 </td></tr><tr><td> L-リジン* </td><td> 0.2 </td></tr><tr><td> L-ロイシン</td><td> 0.6 </td></tr><tr><td colspan="2"> *（このプロトコルのように）標準的なPCAを実行する際に廃止が、他の目的のために添加することができる。 </td></tr></tbody></table> 表1：MTX培地で10倍-Lys / MET / ADEドロップアウトの構成数量は10倍、ドロップアウトの1リットル用です。アスタリスクは、標準的なMTX媒体として引き出されるべき化合物を示すが、それは、他の目的のために添加することができる。 補足表1：12試験板から合成されたデータは、表1に連結されたDAが含まれていますImageJの解析からのTAは、各行がそれぞれ1536アレイ上の単一の位置に対応するカスタムImageJのスクリプトを使用して実行。また、各行は、画像ファイル、DHFR収集プレート、複製、ORFおよびタンパク質名に関する情報で注釈されている。 補足表2：菌株ごとの平均正規化された成長表2は、標準偏差と一緒に、コレクションの各株についての平均対数2正規化された成長が含まれています。フィルタ処理餌食、ヒットと既知の物理的相互作用因子は、別の列で識別されている。

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Genome-wide Protein-protein Interaction Screening by Protein-fragment Complementation Assay PCA in Living Cells

Proteins interact with each other and these interactions determine in a large part their functions. Protein interaction partners can be identified at high-throughput in vivo using a yeast fitness assay based on the dihydrofolate reductase protein-fragment complementation assay (DHFR-PCA).

生細胞内のタンパク質断片相補アッセイ（PCA）によるゲノムワイドなタンパク質間相互作用のスクリーニング

Proteins are the building blocks, effectors and signal mediators of cellular processes. A protein&#8217;s function, regulation and localization often ...

genome-wide-protein-protein-interaction-screening-protein-fragment

Research

JoVE Journal

Biology

Genome-wide Protein-protein Interaction Screening by Protein-fragment Complementation Assay (PCA) in Living Cells

13.2K ビュー.  Université Laval. Proteins interact with each other and these interactions determine in a large part their functions. Protein interaction partners can be identified at high-throughput in vivo using a yeast fitness assay based on the dihydrofolate reductase protein-fragment complementation assay (DHFR-PCA). 

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Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) Assay for Protein-Protein Interaction in Onion Cells Using the Helios Gene Gun

Investigation of gene function in diverse organisms relies on knowledge of how the gene products interact with each other in their normal cellular environment. The Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) Assay1 allows researchers to visualize protein-protein interactions in living cells and has become an essential research tool. This assay is based on the facilitated association of two fragments of a fluorescent protein (GFP) that are each fused to a potential interacting protein partner. The interaction of the two protein partners would facilitate the association of the N-terminal and C-terminal fragment of GFP, leading to fluorescence. For plant researchers, onion epidermal cells are an ideal experimental system for conducting the BiFC assay because of the ease in obtaining and preparing onion tissues and the direct visualization of fluorescence with minimal background fluorescence. The Helios Gene Gun (BioRad) is commonly used for bombarding plasmid DNA into onion cells. We demonstrate the use of Helios Gene Gun to introduce plasmid constructs for two interacting Arabidopsis thaliana transcription factors, SEUSS (SEU) and LEUNIG HOMOLOG (LUH)2 and the visualization of their interactions mediated by BiFC in onion epidermal cells.

Bimolecular Fluorescence Complementation BiFC Assay for Protein-Protein Interaction in Onion Cells Using the Helios Gene Gun

This article illustrates how to properly use the BioRad Helios Gene Gun to introduce plasmid DNA into onion epidermal cells and how to test for protein-protein interactions in onion cells based on the principle of Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC)

ヘリオス遺伝子銃を用いたタマネギの細胞における蛋白質 - 蛋白質相互作用のための二分子蛍光相補（BiFC）アッセイ

Investigation of gene function in diverse organisms relies on knowledge of how the gene products interact with each other in their normal cellular ...

生物学

Quantitative and Automated High-throughput Genome-wide RNAi Screens in C. elegans

RNA interference is a powerful method to understand gene function, especially when conducted at a whole-genome scale and in a quantitative context. In C. elegans, gene function can be knocked down simply and efficiently by feeding worms with bacteria expressing a dsRNA corresponding to a specific gene 1. While the creation of libraries of RNAi clones covering most of the C. elegans genome 2,3 opened the way for true functional genomic studies (see for example 4-7), most established methods are laborious. Moy and colleagues have developed semi-automated protocols that facilitate genome-wide screens 8. The approach relies on microscopic imaging and image analysis. 
	Here we describe an alternative protocol for a high-throughput genome-wide screen, based on robotic handling of bacterial RNAi clones, quantitative analysis using the COPAS Biosort (Union Biometrica (UBI)), and an integrated software: the MBioLIMS (Laboratory Information Management System from Modul-Bio) a technology that provides increased throughput for data management and sample tracking. The method allows screens to be conducted on solid medium plates. This is particularly important for some studies, such as those addressing host-pathogen interactions in C. elegans, since certain microbes do not efficiently infect worms in liquid culture.
	We show how the method can be used to quantify the importance of genes in anti-fungal innate immunity in C. elegans. In this case, the approach relies on the use of a transgenic strain carrying an epidermal infection-inducible fluorescent reporter gene, with GFP under the control of the promoter of the antimicrobial peptide gene nlp 29 and a red fluorescent reporter that is expressed constitutively in the epidermis. The latter provides an internal control for the functional integrity of the epidermis and nonspecific transgene silencing9. When control worms are infected by the fungus they fluoresce green. Knocking down by RNAi a gene required for nlp 29 expression results in diminished fluorescence after infection. Currently, this protocol allows more than 3,000 RNAi clones to be tested and analyzed per week, opening the possibility of screening the entire genome in less than 2 months.

Quantitative and Automated High-throughput Genome-wide RNAi Screens in C. elegans

We describe a protocol using C. elegans and RNAi feeding libraries that allows automated measurement of multiple parameters such as fluorescence, size and opacity of individual worms in a population. We give one example of a screen to identify genes involved in anti-fungal innate immunity in C. elegans.

の定量と自動ハイスループットゲノムワイドRNAiスクリーニング C.エレガンス</em

RNA interference is a powerful method to understand gene function, especially when conducted at a whole-genome scale and in a quantitative context. In C. ...

A Liquid Phase Affinity Capture Assay Using Magnetic Beads to Study Protein-Protein Interaction: The Poliovirus-Nanobody Example

In this article, a simple, quantitative, liquid phase affinity capture assay is presented. Provided that one protein can be tagged and another protein labeled, this method can be implemented for the investigation of protein-protein interactions. It is based on one hand on the recognition of the tagged protein by cobalt coated magnetic beads and on the other hand on the interaction between the tagged protein and a second specific protein that is labeled. First, the labeled and tagged proteins are mixed and incubated at room temperature. The magnetic beads, that recognize the tag, are added and the bound fraction of labeled protein is separated from the unbound fraction using magnets. The amount of labeled protein that is captured can be determined in an indirect way by measuring the signal of the labeled protein remained in the unbound fraction. The described liquid phase affinity assay is extremely useful when conformational conversion sensitive proteins are assayed. The development and application of the assay is demonstrated for the interaction between poliovirus and poliovirus recognizing nanobodies1. Since poliovirus is sensitive to conformational conversion2 when attached to a solid surface (unpublished results), the use of ELISA is limited and a liquid phase based system should therefore be preferred. An example of a liquid phase based system often used in polioresearch3,4 is the micro protein A-immunoprecipitation test5. Even though this test has proven its applicability, it requires an Fc-structure, which is absent in the nanobodies6,7. However, as another opportunity, these interesting and stable single-domain antibodies8 can be easily engineered with different tags. The widely used (His)6-tag shows affinity for bivalent ions such as nickel or cobalt, which can on their turn be easily coated on magnetic beads. We therefore developed this simple quantitative affinity capture assay based on cobalt coated magnetic beads. Poliovirus was labeled with 35S to enable unhindered interaction with the nanobodies and to make a quantitative detection feasible. The method is easy to perform and can be established with a low cost, which is further supported by the possibility of effectively regenerating the magnetic beads.

In this article, a simple, quantitative, liquid phase affinity capture assay is presented. It is a reliable technique based on the interaction between magnetic beads and tagged proteins (e.g. nanobodies) on one hand and the affinity between the tagged protein and a second, labeled protein (e.g. poliovirus) on the other.

タンパク質 - タンパク質相互作用を研究するために磁気ビーズを用いて液相アフィニティキャプチャーアッセイ：ポリオ-nanobodyの例

In this article, a simple, quantitative, liquid phase affinity capture assay is presented. Provided that one protein can be tagged and another protein ...

Genome-wide Gene Deletions in Streptococcus sanguinis by High Throughput PCR

Transposon mutagenesis and single-gene deletion are two methods applied in genome-wide gene knockout in bacteria 1,2. Although transposon mutagenesis is less time consuming, less costly, and does not require completed genome information, there are two weaknesses in this method: (1) the possibility of a disparate mutants in the mixed mutant library that counter-selects mutants with decreased competition; and (2) the possibility of partial gene inactivation whereby genes do not entirely lose their function following the insertion of a transposon. Single-gene deletion analysis may compensate for the drawbacks associated with transposon mutagenesis. To improve the efficiency of genome-wide single gene deletion, we attempt to establish a high-throughput technique for genome-wide single gene deletion using Streptococcus sanguinis as a model organism. Each gene deletion construct in S. sanguinis genome is designed to comprise 1-kb upstream of the targeted gene, the aphA-3 gene, encoding kanamycin resistance protein, and 1-kb downstream of the targeted gene. Three sets of primers F1/R1, F2/R2, and F3/R3, respectively, are designed and synthesized in a 96-well plate format for PCR-amplifications of those three components of each deletion construct. Primers R1 and F3 contain 25-bp sequences that are complementary to regions of the aphA-3 gene at their 5' end. A large scale PCR amplification of the aphA-3 gene is performed once for creating all single-gene deletion constructs. The promoter of aphA-3 gene is initially excluded to minimize the potential polar effect of kanamycin cassette. To create the gene deletion constructs, high-throughput PCR amplification and purification are performed in a 96-well plate format. A linear recombinant PCR amplicon for each gene deletion will be made up through four PCR reactions using high-fidelity DNA polymerase. The initial exponential growth phase of S. sanguinis cultured in Todd Hewitt broth supplemented with 2.5% inactivated horse serum is used to increase competence for the transformation of PCR-recombinant constructs. Under this condition, up to 20% of S. sanguinis cells can be transformed using ~50 ng of DNA. Based on this approach, 2,048 mutants with single-gene deletion were ultimately obtained from the 2,270 genes in S. sanguinis excluding four gene ORFs contained entirely within other ORFs in S. sanguinis SK36 and 218 potential essential genes. The technique on creating gene deletion constructs is high throughput and could be easy to use in genome-wide single gene deletions for any transformable bacteria.

Genome-wide Gene Deletions in Streptococcus sanguinis by High Throughput PCR

An efficient genome-wide single gene mutation method has been established using Streptococcus sanguinis as a model organism. This method has achieved via high throughput recombinant PCRs and transformations.

ゲノムワイドな遺伝子欠失で<em&gt;ストレプトコッカス血統</em&gt;ハイスループットPCRによる

Transposon  mutagenesis and single-gene deletion are two methods applied in genome-wide  gene knockout in bacteria 1,2. Although transposon mutagenesis is ...

Flow Cytometric Analysis of Bimolecular Fluorescence Complementation: A High Throughput Quantitative Method to Study Protein-protein Interaction

Among methods to study protein-protein interaction inside cells, Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) is relatively simple and sensitive. BiFC is based on the production of fluorescence using two non-fluorescent fragments of a fluorescent protein (Venus, a Yellow Fluorescent Protein variant, is used here). Non-fluorescent Venus fragments (VN and VC) are fused to two interacting proteins (in this case, AKAP-Lbc and PDE4D3), yielding fluorescence due to VN-AKAP-Lbc-VC-PDE4D3 interaction and the formation of a functional fluorescent protein inside cells.
BiFC provides information on the subcellular localization of protein complexes and the strength of protein interactions based on fluorescence intensity. However, BiFC analysis using microscopy to quantify the strength of protein-protein interaction is time-consuming and somewhat subjective due to heterogeneity in protein expression and interaction. By coupling flow cytometric analysis with BiFC methodology, the fluorescent BiFC protein-protein interaction signal can be accurately measured for a large quantity of cells in a short time. Here, we demonstrate an application of this methodology to map regions in PDE4D3 that are required for the interaction with AKAP-Lbc. This high throughput methodology can be applied to screening factors that regulate protein-protein interaction.

Flow cytometric analysis of Bimolecular Fluorescence Complementation provides a high throughput quantitative method to study protein-protein interaction. This methodology can be applied to mapping protein binding sites and for screening factors that regulate protein-protein interaction.

二分子蛍光相補のフローサイトメトリー分析：タンパク質 - タンパク質相互作用を研究するためのハイスループット定量法

Among methods to study protein-protein interaction inside cells, Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) is relatively simple and sensitive. BiFC ...

Identifying Protein-protein Interaction in Drosophila Adult Heads by Tandem Affinity Purification (TAP)

Genetic screens conducted using Drosophila melanogaster (fruit fly) have made numerous milestone discoveries in the advance of biological sciences. However, the use of biochemical screens aimed at extending the knowledge gained from genetic analysis was explored only recently. Here we describe a method to purify the protein complex that associates with any protein of interest from adult fly heads. This method takes advantage of the Drosophila GAL4/UAS system to express a bait protein fused with a Tandem Affinity Purification (TAP) tag in fly neurons in vivo, and then implements two rounds of purification using a TAP procedure similar to the one originally established in yeast1 to purify the interacting protein complex. At the end of this procedure, a mixture of multiple protein complexes is obtained whose molecular identities can be determined by mass spectrometry. Validation of the candidate proteins will benefit from the resource and ease of performing loss-of-function studies in flies. Similar approaches can be applied to other fly tissues. We believe that the combination of genetic manipulations and this proteomic approach in the fly model system holds tremendous potential for tackling fundamental problems in the field of neurobiology and beyond.

Identifying Protein-protein Interaction in Drosophila Adult Heads by Tandem Affinity Purification TAP

Drosophila is famous for its powerful genetic manipulation, but not for its suitability of in-depth biochemical analysis. Here we present a TAP-based procedure to identify interacting partners of any protein of interest from the fly brain. This procedure can potentially lead to new avenues of research.

中のタンパク質 - タンパク質相互作用を特定する<em&gt;ショウジョウバエ</emタンデムアフィニティー精製（TAP）による&gt;アダルトヘッド

Genetic screens conducted using Drosophila melanogaster (fruit fly) have made numerous milestone discoveries in the advance of biological sciences. ...

Protein-protein Interactions Visualized by Bimolecular Fluorescence Complementation in Tobacco Protoplasts and Leaves

Many proteins interact transiently with other proteins or are integrated into multi-protein complexes to perform their biological function. Bimolecular fluorescence complementation (BiFC) is an in vivo method to monitor such interactions in plant cells. In the presented protocol the investigated candidate proteins are fused to complementary halves of fluorescent proteins and the respective constructs are introduced into plant cells via agrobacterium-mediated transformation. Subsequently, the proteins are transiently expressed in tobacco leaves and the restored fluorescent signals can be detected with a confocal laser scanning microscope in the intact cells. This allows not only visualization of the interaction itself, but also the subcellular localization of the protein complexes can be determined. For this purpose, marker genes containing a fluorescent tag can be coexpressed along with the BiFC constructs, thus visualizing cellular structures such as the endoplasmic reticulum, mitochondria, the Golgi apparatus or the plasma membrane. The fluorescent signal can be monitored either directly in epidermal leaf cells or in single protoplasts, which can be easily isolated from the transformed tobacco leaves. BiFC is ideally suited to study protein-protein interactions in their natural surroundings within the living cell. However, it has to be considered that the expression has to be driven by strong promoters and that the interaction partners are modified due to fusion of the relatively large fluorescence tags, which might interfere with the interaction mechanism. Nevertheless, BiFC is an excellent complementary approach to other commonly applied methods investigating protein-protein interactions, such as coimmunoprecipitation, in vitro pull-down assays or yeast-two-hybrid experiments.

Formation of protein complexes in vivo can be visualized by bimolecular fluorescence complementation. Interaction partners are fused to complementary parts of fluorescent tags and transiently expressed in tobacco leaves, resulting in a reconstituted fluorescent signal upon close proximity of the two proteins.

タバコプロトプラストと葉で二分子蛍光相補性によって可視化し、タンパク質間相互作用

Many proteins interact transiently with other proteins or are integrated into multi-protein complexes to perform their biological function. Bimolecular ...

Identifying Protein-protein Interaction Sites Using Peptide Arrays

Protein-protein interactions mediate most of the processes in the living cell and control homeostasis of the organism. Impaired protein interactions may result in disease, making protein interactions important drug targets. It is thus highly important to understand these interactions at the molecular level. Protein interactions are studied using a variety of techniques ranging from cellular and biochemical assays to quantitative biophysical assays, and these may be performed either with full-length proteins, with protein domains or with peptides. Peptides serve as excellent tools to study protein interactions since peptides can be easily synthesized and allow the focusing on specific interaction sites. Peptide arrays enable the identification of the interaction sites between two proteins as well as screening for peptides that bind the target protein for therapeutic purposes. They also allow high throughput SAR studies. For identification of binding sites, a typical peptide array usually contains partly overlapping 10-20 residues peptides derived from the full sequences of one or more partner proteins of the desired target protein. Screening the array for binding the target protein reveals the binding peptides, corresponding to the binding sites in the partner proteins, in an easy and fast method using only small amount of protein.
In this article we describe a protocol for screening peptide arrays for mapping the interaction sites between a target protein and its partners. The peptide array is designed based on the sequences of the partner proteins taking into account their secondary structures. The arrays used in this protocol were Celluspots arrays prepared by INTAVIS Bioanalytical Instruments. The array is blocked to prevent unspecific binding and then incubated with the studied protein. Detection using an antibody reveals the binding peptides corresponding to the specific interaction sites between the proteins.

Peptide array screening is a high throughput assay for identifying protein-protein interaction sites. This allows mapping multiple interactions of a target protein and can serve as a method for identifying sites for inhibitors that target a protein. Here we describe a protocol for screening and analyzing peptide arrays.

ペプチド配列の使用タンパク質間相互作用部位を同定

Protein-protein interactions mediate most of the processes in the living cell and control homeostasis of the organism. Impaired protein interactions may ...

Genome-wide Mapping of Drug-DNA Interactions in Cells with COSMIC (Crosslinking of Small Molecules to Isolate Chromatin)

The genome is the target of some of the most effective chemotherapeutics, but most of these drugs lack DNA sequence specificity, which leads to dose-limiting toxicity and many adverse side effects. Targeting the genome with sequence-specific small molecules may enable molecules with increased therapeutic index and fewer off-target effects. N-methylpyrrole/N-methylimidazole polyamides are molecules that can be rationally designed to target specific DNA sequences with exquisite precision. And unlike most natural transcription factors, polyamides can bind to methylated and chromatinized DNA without a loss in affinity. The sequence specificity of polyamides has been extensively studied in vitro with cognate site identification (CSI) and with traditional biochemical and biophysical approaches, but the study of polyamide binding to genomic targets in cells remains elusive. Here we report a method, the crosslinking of small molecules to isolate chromatin (COSMIC), that identifies polyamide binding sites across the genome. COSMIC is similar to chromatin immunoprecipitation (ChIP), but differs in two important ways: (1) a photocrosslinker is employed to enable selective, temporally-controlled capture of polyamide binding events, and (2) the biotin affinity handle is used to purify polyamide&#8211;DNA conjugates under semi-denaturing conditions to decrease DNA that is non-covalently bound. COSMIC is a general strategy that can be used to reveal the genome-wide binding events of polyamides and other genome-targeting chemotherapeutic agents.

Genome-wide Mapping of Drug-DNA Interactions in Cells with COSMIC Crosslinking of Small Molecules to Isolate Chromatin

Identifying the direct targets of genome-targeting molecules remains a major challenge. To understand how DNA-binding molecules engage the genome, we developed a method that relies on crosslinking of small molecules to isolate chromatin (COSMIC).

COSMICと細胞の薬剤-DNA相互作用のゲノムワイドなマッピング（小分子の架橋は、クロマチンを分離するために）

The genome is the target of some of the most effective chemotherapeutics, but most of these drugs lack DNA sequence specificity, which leads to ...

DamID-seq: Genome-wide Mapping of Protein-DNA Interactions by High Throughput Sequencing of Adenine-methylated DNA Fragments

The DNA adenine methyltransferase identification (DamID) assay is a powerful method to detect protein-DNA interactions both locally and genome-wide. It is an alternative approach to chromatin immunoprecipitation (ChIP). An expressed fusion protein consisting of the protein of interest and the E. coli DNA adenine methyltransferase can methylate the adenine base in GATC motifs near the sites of protein-DNA interactions. Adenine-methylated DNA fragments can then be specifically amplified and detected. The original DamID assay detects the genomic locations of methylated DNA fragments by hybridization to DNA microarrays, which is limited by the availability of microarrays and the density of predetermined probes. In this paper, we report the detailed protocol of integrating high throughput DNA sequencing into DamID (DamID-seq). The large number of short reads generated from DamID-seq enables detecting and localizing protein-DNA interactions genome-wide with high precision and sensitivity. We have used the DamID-seq assay to study genome-nuclear lamina (NL) interactions in mammalian cells, and have noticed that DamID-seq provides a high resolution and a wide dynamic range in detecting genome-NL interactions. The DamID-seq approach enables probing NL associations within gene structures and allows comparing genome-NL interaction maps with other functional genomic data, such as ChIP-seq and RNA-seq.

We describe herein an assay by coupling DNA adenine methyltransferase identification (DamID) to high throughput sequencing (DamID-seq). This improved method provides a higher resolution and a wider dynamic range, and allows analyzing DamID-seq data in conjunction with other high throughput sequencing data such as ChIP-seq, RNA-seq, etc.

DamID-配列：アデニンメチル化DNA断片のハイスループットシークエンシングによるタンパク質-DNA相互作用のゲノムワイドなマッピング

The DNA adenine methyltransferase identification (DamID) assay is a powerful method to detect protein-DNA interactions both locally and genome-wide. It is ...