The OPPF-UK is funded by the Medical Research Council, UK (grant MR/K018779/1) and the Membrane Protein Laboratory by the Wellcome Trust (grant 099165/Z/12/Z).

発現ベクターの1の構築<ol><li>使用するPCR輸液配列13それぞれに切断可能なC末端またはN末端 ​​のHis6-GFP融合物のいずれかを追加するベクターpOPINE-3C-GFPとPOPIN-N-GFPを用いて、並列に96発現プラスミドまで構築するためにクローニング。 注：GFPは細胞質ゾル中で発現する必要があるので、ベクターの選択は、タンパク質のトポロジーによって決定され、したがって、細胞質N末端 ​​および細胞外C末端を有するタンパク質を我々はPOPIN-N-GFPとのために使用し細胞外のN末端および細胞質C末端は、年にはpOPINE-3C-GFPを使用します。両方の末端が細胞質ゾルであるがC末端にタグ付けしない機能的な理由がない限り、我々はpOPINE-3C-GFPを使用します。 </li><li>示され、以下の拡張機能を組み込んだプライマーを用いて膜タンパク質をコードするDNA配列を増幅する。 pOPINE-3C-GFP（フォワードプライマー - AGGAGATATACCATG、プライマーリバース - CAGAACTTCCAGTTT）とPOPIN-N-GFP（フォワードプライマー - AAGTTCTGTTTCAGGGCCCG、プライマーリバース - ATGGTCTAGAAAGCTTTA）。 </li><li>アガロースゲル電気泳動によるPCR反応を分析します。一度きれいなPCR産物が得られている、（1×をDpnI反応緩衝液5μlで構成する）を各ウェルに5 UのDpnIを追加します。 96ウェル形式で、磁気ビーズを使用してPCR産物を精製する。 注：DpnIをテンプレートベクトルを除去するために添加される。ゲノムDNAを鋳型として使用される場合は、このステップは不要である。 </li><li> PCRプレートの各ウェルに、適切な線状化ベクターを1μl（100ngの）を追加します。 </li><li>マルチチャンネルピペッターを使用して、精製したPCRのμlの追加x PCRプレートの適切なウェルに挿入します。すべての製品が10〜250 ngの範囲内にあることを確認してください。 </li><li>ウェルに水の（9-X）μLを加え、ドライダウンで融合試薬を含むチューブに全体の10μLを転送する。 30秒間のままにしておきます。 </li><li>ピペッティングにより簡単に内容物を混合。転送元のPCRプレートシールに対する反応。 </li><li>サーモサイクラー中で42℃で30分間インキュベートする。 </li><li>とすぐ反応が完了すると、氷に反応を転送し、40μlのTE（10mMトリス、pH8.0,1mMのEDTA）を添加する。 </li><li>一度にフリーズしたり、テント細胞に形質転換する。形質転換のために、高い能力の50μlのアリコート当たり希釈した反応の3μL（&gt; 5×10 9の形質転換体/μgの）テントE.を使用coli細胞 。 </li><li> （クローニングのために、構築物2 x個、ウェルを調製）を、24​​ウェル組織培養プレートのウェルを50μg/ mlのカルベニシリン当たり添加したLB寒天培地を1ml加える。 </li><li>成長板の後、成長を次のうち25μlを、24ウェル組織培養プレートを含む寒天上に培養の1~5倍希釈液25μl。 </li><li>優しくプレートを傾けることによって、細胞を広げた。 </li><li> 37℃でのまたはフロで10-15分間、蓋をオフにして、プレートを乾燥させる室温でWフード。 </li><li>蓋を交換し、逆さまにプレートを回し、37℃で一晩インキュベートする。 </li><li> 2コロニーとミニプレップのベクトルを選択してください。 </li><li> PCRは、構造物の特定のリバースプライマーとベクター特異的フォワードプライマー（ 例えば pOPIN_FOR GAC CGA AAT TAA TAC GAC TCA CTAタグのGG）を使用して、構文を確認してください。 </li></ol> E. 2.変容大腸菌のE XPRESSION株 注：前にこのプロトコルを実行するには、E。大腸菌コンピテント細胞を作製等分し、以前に記載13のように-80℃で凍結保存される。膜タンパク質の発現は、日常的に二つの株、Lemo21（DE3）およびC41（DE3）pLysS中でスクリーニングされる。結果の解釈を支援するためには、陽性対照、 例えば 、GFPを発現するプラスミドまたは発現することが知られているGFPに融合した膜タンパク質と空のベクターネガティブコントロールを含むように役立ちます。 <ol><li>アリを解凍quotted E.氷の上で大腸菌 。コンピテント細胞の各アリコートにミニプレップ発現プラスミドの3を添加する。 </li><li> 30分間氷上でミックスをインキュベートします。 </li><li> 42℃で30秒間の細胞を熱ショック。 </li><li>細胞は2分間氷上で回復した後、各チューブに電力ブロス300μlのを追加することができます。 </li><li> 37℃の静的なインキュベーター中で1時間インキュベートする。 </li><li> 50μg/ mlのカルベニシリンおよび35μgの/ mlのクロラムフェニコールを補充した、24ウェル組織培養プレートにLB寒天を準備する。 Lemo21（DE3）を含むウェルに0.25 mMの最終濃度にラムノースを追加します。 注：製品はC41（DE3）pLysS株を含有するウェルを1％（w / v）のグルコースを補充することができる毒性である可能性がある場合。 </li><li> LB寒天プレート上に形質転換混合物からの細胞の30μlのを転送します。 1.13から1.15に記載されているようにプレートを広げ、乾燥させます。 </li></ol>一晩スターター培養物の調製注：常に古い形質転換プレートから変換後に一日一晩培養を決して準備していない。 <ol><li> 50μg/ mlのカルベニシリンおよび35μgの/ mlのクロラムフェニコールを補充した96ウェルディープウェルプレートの各ウェルに0.7ミリリットル電力ブロスを加える。 0.25mmの最終濃度にLemo21（DE3）を含むウェルにラムノースを追加します。必要に応じて、1％（w / v）のグルコースC41（DE3）pLysS株を補完する。上記（2.6注）を参照してください。 </li><li>各ウェルに一晩形質転換プレートから1コロニーを採取。ガス透過性のシールでブロックをシール。 </li><li> 37℃で一晩小投（ 例えば 4.3ミリメートル軌道）で大投（ 例えば 25ミリメートル軌道）で、またはインキュベーターで600rpmでインキュベーター中で250rpmでブロックを振る。 </li></ol> 4.成長と文化の誘導<ol><li>電力ブロス3mlを各50μg/ mlのカルベニシリンおよび35μgの/ mlのクロラムフェニコールワットを補充追加24ウェルディープウェルプレートのエル。セクション3.1で説明したようにL-ラムノース（およびグルコース）を追加します。重複して収穫を可能にするために培養物を3mlを使用して、ガス透過性シールを通る水の一部の蒸発を可能にする。 </li><li> 24ウェルディープウェルブロックの各ウェルにLemo21（DE3）またはC41（DE3）pLysSを一晩培養の150μlのを追加することによって、発現培養を設定します。 </li><li> 595nmの平均ODがプレートを通して〜0.5になるまで37℃でブロックを振る。 </li><li> 1.0mMのIPTGの最終濃度まで培養物にIPTGを添加することにより発現を誘導する。 </li><li> 20℃で振とうしながら一晩培養物（18〜20時間）成長。 </li></ol>ゲル内蛍光によって発現の5.分析<ol><li>重複して収穫。平方よく、円錐底、96ウェルディープウェルブロックに、各ウェルからの培養の譲渡1ミリリットル。 注：収穫ブロックの破損の場合は、二重にまたはalternatiのテストを可能にする必要に応じて洗剤VEの。 </li><li>ブロックを密封し、10分間6000×gでの遠心分離によって細胞を回収。 </li><li>ブロックを反転し、メディアをデカント。残りのメディアを排出するためにペーパータオルの上に静かにブロックをタップします。 </li><li> 20分の最低-80℃でプレートや店舗を密封。必要に応じて、この時点での実験で便利な処理されたブロックを残す。 </li><li>室温で20分間ペレット化し、デフロスト。 </li><li>溶解緩衝液（50mMのNaH 2 PO 4、300mMのNaCl、10mMのイミダゾール、1％vの200μlの完全に細胞を再懸濁し、4℃で、マルチチャンネルピ ​​ペットまたはオービタルシェーカー（10分間、1000rpmで）のいずれかを使用/ vのトゥイーン20、NaOHを用いてpHを8.0に調整する）。 </li><li> DLPI溶液20μl（20μlのDNアーゼI（4000単位/ ml）、20mgのリゾチーム、および水2mlの最終容量20μlのプロテ​​アーゼ阻害剤カクテル）を加える。 4℃で（〜1000回転）しながら10分間インキュベートする。 </li><li&gt; 25の10％ずつのn -ドデシルβ-D-マルトシド（DDM）を追加します。 </li><li> 4℃で（〜1000回転）しながら60分間インキュベートする。 </li><li>遠心機で4℃で30分間6000×gでディープウェルブロック。 </li><li>マイクロタイタープレートへの転送をクリア溶解液を10μlおよびSDS PAGEゲルローディングバッファー（100 mMトリス、pH6.8の10μlの、W / SDS V 4％、0.2％W / Vブロモフェノールブルー、10パーセント（v / v）のβを追加メルカプトエタノール、および20％（v / v）のグリセロール）。 注意！ SAMPLEを沸騰しないでください 。 </li><li>負荷ステップ5.11からサンプルを10μl/ウェルのSDS PAGEゲル（S）上に、色素フロントが下（2〜2.5時間）に達するまで寒い部屋の中で100〜120 V（定電圧）で動作します。 </li><li> （GFP融合タンパク質を検出するために、青色フィルタを例 ）イメージャ上にゲルを配置する。露光時間は、明るいバンドが飽和されないように選択される。 </li></ol>細胞培養の6スケールアップ<ol><li>有能なのアリコートを変換する<em&gt; E。セクション2に記載された大腸菌のように。 </li><li> （セクション3で説明したように補足した）電力ブロスの10ミリリットルにコロニーを採取し、37℃で一晩成長する。 </li><li> 500ミリリットルパワーブロス中に一晩培養の5ミリリットルを希釈する。 </li><li> 595nmのODが〜0.5になるまで37℃で、250rpmで振とうしながら成長する。 </li><li> 1.0 mMの最終濃度までIPTGを添加することにより発現を誘導する。 </li><li> 20℃で、250rpmで振とうしながら一晩増殖。 </li><li> 15分間5000×gでの遠心分離により細胞を回収。 </li><li>上清を捨てる。細胞ペレットを-80℃で保存することができる。 </li></ol>膜の7。準備<ol><li>細胞ペレットのグラム当たり5ミリリットルの容量で1×PBS pH7.5中、室温で解凍し、再懸濁細胞（必要な場合）。粘度が鼻水一貫性に減少するまで、必要に応じて音量を上げます。 10μg/ mlの一つの最終濃度が1 mMの、DNアーゼIの最終濃度までのMgCl 2を追加細胞ペレットを20g当たりプロテアーゼ阻害剤錠剤をあらかじめパッケージ。 30 KPSIの圧力で冷やした細胞破壊を使用して開いた細胞を破壊。 </li><li> 4℃で15分間、30,000 gで破壊されていない細胞と破片をペレット化。超遠心チューブに上清を移し。 </li><li> 4℃で1時間20万×gで超遠心上清をスピンダウンすることにより、総膜画分を収集する。 </li><li>上清を捨てる。 </li><li>細胞ホモジナイザーを用いて氷冷した10mlのPBS pH7.5中膜ペレットを再懸濁する。 1mlの再懸濁させた膜を、各洗浄剤のために必要とされる。必要に応じて、この段階では、フラッシュは-80℃で液体窒素とストア内の膜懸濁液を凍結する。 </li></ol>膜画分の8溶化および分析<ol><li>解凍膜画分（必要な場合）、各洗浄剤のための可溶化のために使用される、1.5ミリリットル中に膜懸濁液のアリコートを、900μlのポリアロマーマイクロcentrifuGEチューブ。 </li><li>指定された1.5ミリリットルチューブに1％の最終濃度にそれぞれ新たに調製された洗剤を100μl（10重量％/ DDM、DMのVソリューション、Cymal-6およびLDAO）を追加します。真核生物の膜タンパク質のコレステロールヘミスクシネート（0.2％最終濃度）の可溶化のための界面活性剤に添加することができる。 </li><li>穏やかに撹拌しながら1時間4℃での混合物をインキュベートする。 </li><li> 45分間、4℃で15万グラムで、確実にチューブが少なくとも半分フルである、ベンチトップの超遠心機と洗剤不溶性画分をペレットおよび上清を保持します。 注：界面活性剤可溶化の効果は、同じ容量のPBS中に再懸濁させ、界面活性剤不溶性画分と可溶化した膜のGFP蛍光を測定することにより、蛍光プレートリーダーを用いて推定することができる。 </li><li>蛍光検出サイズ排除クロマトグラフィーを用いて膜タンパク質複合体（FSEC）：異なる界面活性剤の単分散性を分析する。 </li><li> FSEC分析のために、広い画範囲を有するサイズ排除カラムを平衡化し、分子量5,000,000 例えば 5000、0.3ml /分の流速で緩衝液（20mMトリスpH7.5で、150mMのNaCl、0.03％DDM）を実行すると。それは試験した各洗剤のために変更されない。すなわち、すべてのサンプルについてこのバッファを使用します。 </li><li> /分0.3ミリリットルの流量でカラムに可溶化された膜を100μl注入する。蛍光光学系（488 nmでの励起および発光512 nmで）を使用した溶出プロファイルを監視します。インライン蛍光モニターを使用できない場合は、画分を回収し、プレートリーダーで蛍光を読み取る。 </li><li>グラフィック表示のための表計算プログラムにインポート溶出量と蛍光強度データ。 </li><li>項5に記載のようにゲル内蛍光によって残りの可溶化された膜材料を分析する。 </li></ol>

<ol>
	<li>Wallin, E., von Heijne, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+analysis+of+integral+membrane+proteins+from+eubacterial,+archaean,+and+eukaryotic+organisms.">Genome-wide analysis of integral membrane proteins from eubacterial, archaean, and eukaryotic organisms.</a> Protein Sci. 7 (4), 1029-1038 (1998).</li><li>Fagerberg, L., Jonasson, K., von Heijne, G., Uhlen, M., Berglund, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prediction+of+the+human+membrane+proteome.">Prediction of the human membrane proteome.</a> Proteomics. 10 (6), 1141-1149 (2010).</li><li>Okada, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=X-Ray+diffraction+analysis+of+three-dimensional+crystals+of+bovine+rhodopsin+obtained+from+mixed+micelles.">X-Ray diffraction analysis of three-dimensional crystals of bovine rhodopsin obtained from mixed micelles.</a> J Struct Biol. 130 (1), 73-80 (2000).</li><li>Palczewski, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structure+of+rhodopsin:+A+G+protein-coupled+receptor.">Crystal structure of rhodopsin: A G protein-coupled receptor.</a> Science. 289 (5480), 739-745 (2000).</li><li>Miroux, B., Walker, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Over-production+of+proteins+in+Escherichia+coli:+mutant+hosts+that+allow+synthesis+of+some+membrane+proteins+and+globular+proteins+at+high+levels.">Over-production of proteins in Escherichia coli: mutant hosts that allow synthesis of some membrane proteins and globular proteins at high levels.</a> J Mol Biol. 260 (3), 289-298 (1996).</li><li>Wagner, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tuning+Escherichia+coli+for+membrane+protein+overexpression.">Tuning Escherichia coli for membrane protein overexpression.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (38), 14371-14376 (2008).</li><li>Schlegel, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimizing+membrane+protein+overexpression+in+the+Escherichia+coli+strain+Lemo21(DE3).">Optimizing membrane protein overexpression in the Escherichia coli strain Lemo21(DE3).</a> J Mol Biol. 423 (4), 648-659 (2012).</li><li>Chun, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fusion+partner+toolchest+for+the+stabilization+and+crystallization+of+G+protein-coupled+receptors.">Fusion partner toolchest for the stabilization and crystallization of G protein-coupled receptors.</a> Structure. 20 (6), 967-976 (2012).</li><li>Drew, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GFP-based+optimization+scheme+for+the+overexpression+and+purification+of+eukaryotic+membrane+proteins+in+Saccharomyces+cerevisiae.">GFP-based optimization scheme for the overexpression and purification of eukaryotic membrane proteins in Saccharomyces cerevisiae.</a> Nat Protoc. 3 (5), 784-798 (2008).</li><li>Drew, D. E., von Heijne, G., Nordlund, P., de Gier, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Green+fluorescent+protein+as+an+indicator+to+monitor+membrane+protein+overexpression+in+Escherichia+coli.">Green fluorescent protein as an indicator to monitor membrane protein overexpression in Escherichia coli.</a> FEBS Lett. 507 (2), 220-224 (2001).</li><li>Kawate, T., Gouaux, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence-detection+size-exclusion+chromatography+for+precrystallization+screening+of+integral+membrane+proteins.">Fluorescence-detection size-exclusion chromatography for precrystallization screening of integral membrane proteins.</a> Structure. 14 (4), 673-681 (2006).</li><li>Newstead, S., Kim, H., von Heijne, G., Iwata, S., Drew, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+fluorescent-based+optimization+of+eukaryotic+membrane+protein+overexpression+and+purification+in+Saccharomyces+cerevisiae.">High-throughput fluorescent-based optimization of eukaryotic membrane protein overexpression and purification in Saccharomyces cerevisiae.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (35), 13936-13941 (2007).</li><li>Busso, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+protein+complexes+using+multiple+Escherichia+coli+protein+co-expression+systems:+a+benchmarking+study.">Expression of protein complexes using multiple Escherichia coli protein co-expression systems: a benchmarking study.</a> J Struct Biol. 175 (2), 159-170 (2011).</li><li>Sonoda, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Benchmarking+membrane+protein+detergent+stability+for+improving+throughput+of+high-resolution+X-ray+structures.">Benchmarking membrane protein detergent stability for improving throughput of high-resolution X-ray structures.</a> Structure. 19 (1), 17-25 (2011).</li><li>Low, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+analytical+gel+filtration+screening+of+integral+membrane+proteins+for+structural+studies.">High-throughput analytical gel filtration screening of integral membrane proteins for structural studies.</a> Biochim Biophys Acta. 1830 (6), 3497-3508 (2013).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

この資料に記載されたプロトコルでは、GFPレポーターベクターにライゲーション非依存性クローニングが急速E.で複数の膜タンパク質の相対発現をスクリーニングする蛍光検出と組み合わされ大腸菌 。ベクターは、第一の発現スクリーニングは、さらに週取ると4営業日で行うことができます。全細胞の洗浄剤溶解物のゲル内蛍光は、二次スクリーニングにおいて、さらなる分析のための発現ヒットをランク付けするために使用される。提示される一次式スクリーンが離れてディープウェルブロックで細胞を成長させるのに適しシェーカーインキュベーターからの専門家装置を必要としない。 96ウェルSBSプレートを含む他の全ての液体の取り扱いは、マルチチャンネルピペットを用いて行うことができる。プロトコルは容易に異なる発現条件（ 例えばより低い温度）の下で成長させ、他の大腸菌株を含むように修飾することができる。ラムノースのレベルを滴定LEMO21（DE3）の場合には（0から2.0 mMまで）いくつかの膜タンパク質7の発現レベルを増加させることができる転写速度を調節するために添加した。過酷な洗剤は、封入体からタンパク質を可溶化し、従って偽陽性を与えるかもしれないがDDM以外の界面活性剤は、一次スクリーニングで抽出のために使用することができる。明らかに、より多くの初期画面になる手の込んだ、より多くの時間のかかる実験を。 二次スクリーニングは、一次スクリーニングで同定された表現のヒットから全膜画分を調製することを含む。これは、Eの膜への融合タンパク質の局在を確認するように重要なステップであるcoli細胞 。異なる洗剤中のGFP融合タンパク質のその後の抽出は、界面活性剤 - タンパク質複合体の単分散性を評価するために、可溶化物質の蛍光検出サイズ排除クロマトグラフィーによって監視される。それが最も適切な洗剤を識別するので、これはもう一つの重要なステップである後続の下流の処理のための膜タンパク質の可溶化。しかしながら、経験は、界面活性剤（単数または複数）の選択のさらなる最適化がまだ精製および結晶化の間に必要とされ得ることを示している。比較的小さなミセルのサイズ（ 例えば LDAO）を持つものを含む、様々な界面活性剤が均一動作の証拠は、原核生物の膜タンパク質14、少なくともよく回折する結晶を形成する傾向の良好な指標であると思われる。この点において、 図2Bの膜タンパク質について示されたプロファイルは非常に良好な表示。 GFPレポーターを使用することの主な利点は、未精製の試料における発現の迅速な読み出しを与えることである。欠点は、GFP融合タンパク質は、結晶化のためのタンパク質の精製中に除去しなければならないことである。ここで使用されるベクターの場合には、ライノウイルス3Cプロテアーゼ部位はGFPの切断を可能にする。あるいは、それは簡単である唯一のその後の精製のためにポリヒスチジンまたは他の親和性タグを追加するベクターへのスクリーニングで同定された再クローン候補タンパク質は、である。これは、GFPの融合が発現に必要ではないことを前提としています。膜タンパク質の発現および可溶化を検出するためのGFPへの融合を使用する主な代替案は、ヒスチジンタグを付加することである。しかし、このアプローチは、典型的には、多くの変形を評価するために非常に時間がかかるとなる膜画分15で始まる必要とする。 要約すると、この資料に記載されたプロトコルの主な目的は、膜タンパク質配列の多数の急速な発現および界面活性剤可溶化の点で評価され、より深い分析のために優先される変異を可能にすることである。

これは、膜タンパク質は、ヒトゲノム2を含むすべての配列決定されたゲノム1で符号化された遺伝子の約20~30％を占めると推定されている。多くの生物学的プロセスにおけるその重要な役割を考慮すると、代謝産物、エネルギー生成および薬物標的としての、例えば輸送のために、それらの三次元構造の決定に強い関心がある。しかし、可溶性タンパク質と比較して、膜タンパク質は、タンパク質データバンクで表さアンダー高度である。実際には、PDB（で99624リリース構造から<a href="http://www.rcsb.org/pdb/">http://www.rcsb.org/pdb/</a> ）のみ471（ <a href="http://blanco.biomol.uci.edu/mpstruc/">http://blanco.biomol.uci.edu/mpstruc/</a> ）膜タンパク質に分類される。これは、自然に、比較的低レベルで発現される膜タンパク質での作業の技術的な問題を反映しロドプシンは、いくつかの例外を除き3,4の一つです。組換えバージョンの過剰発現異種細胞中のSは、多くの場合、生産の全体的なレベルを制限し、膜にミスフォールディングと貧しいターゲティングになる。一旦発現膜タンパク質の抽出および可溶化のための最高の洗剤を選択すると、その後の精製が困難になると慎重な最適化を必要とする。 大腸菌は、72％（占め膜タンパク質のための最も一般的に使用される発現宿主まま<a href="http://blanco.biomol.uci.edu/mpstruc/">http://blanco.biomol.uci.edu/mpstruc/</a>細菌源からほぼ排他的であり、今日まで解 ​​析された構造の）。具体的なE.大腸菌株C41（DE3）およびC43（DE3）は、膜タンパク質の過剰発現をもたらし、したがって、他のBL21のために観察された毒性は5,6株の影響を回避しない単離されている。組換え膜タンパク質の発現のレベルを調整すると、生産6,7のレベルを最適化するために重要であると思われる。 6-8を利用するためにアミノ末端およびカルボキシ末端欠失、複数のオーソログを含む、複数のバージョンの評価を必要としてきた。したがって、並列に複数の膜タンパク質の発現をスクリーニングするための方法が不可欠である。 1つの一般的に使用されるアプローチは、タンパク質を精製することなく、追跡される緑色蛍光タンパク質（GFP）の発現を可能にするタンパク質を融合することである。このように、異なる洗剤中の発現レベル、安定性、および動作に関する情報は、未精製物質9-12少量で評価することができる。 この記事では、Eにおける膜タンパク質のクローニングおよび発現スクリーニングのための合理化されたプロトコルを記述洗剤の生産とその後の特性化のレポーターとしてGFPとの融合を使用して大腸菌 ：タンパク質COMPlexes（ 図1）。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of Material</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pOPIN-N-GFP</td>
			<td>addgene (www.addgene.org)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pOPINE-3C-GFP</td>
			<td>addgene (www.addgene.org)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C41(DE3)pLysS</td>
			<td>Lucigen (http://lucigen.com/</td>
			<td>60444-1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LEMO21(DE3)</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>C2528H</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>In-Fusion HD EcoDry Cloning System, 96 Rxns</td>
			<td>Clontech/Takara</td>
			<td>639688</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Power broth</td>
			<td>Molecular Dimensions (http://www.moleculardimensions.com/)</td>
			<td>MD12-106-1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease Inhibitor tablets</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11697498001</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cOmplete, Mini, EDTA-Free; Protease Inhibitor Cocktail&#160;</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11836170001</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Rhamnose monohydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>83650</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease Inhibitor Cocktail&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8849</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNAse 1</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>DN25</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysozyme</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L7651</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholesterol hemisuccinate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C6512</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CYMAL-6 ( 6-Cyclohexyl-1-Hexyl-&#946;-D-Maltoside)</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>C326</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DDM ( n-Dodecyl &#223;-maltoside )</td>
			<td>Generon</td>
			<td>D97002</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DM (n-Decyl &#223;-maltoside)</td>
			<td>Generon</td>
			<td>D99003</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LDAO ( N,N-Dimethyl-n-dodecylamine N-oxide)</td>
			<td>Generon</td>
			<td>D71111</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E1 ClipTip Eq384 8 channel 1-30 ul&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific&#160;</td>
			<td>4672030</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rainin Pipette Pipet-Lite XLS 6ch 100-1200&#181;L LTS Spacer</td>
			<td>Anachem</td>
			<td>LA6-300XLS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rainin Pipette Light XLS+ 8ch 2-20&#181;L LTS</td>
			<td>Anachem</td>
			<td>L8-20XLSPLUS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette Pipet-Lite XLS 8ch 100-1200&#181;L LTS Tip</td>
			<td>Anachem</td>
			<td>L8-1200XLS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 well V bottom deep well blocks</td>
			<td>Porvair sciences</td>
			<td>360115</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BenchMark Fluorescent Protein Standard</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>LC5928</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE Novex 10% Bis-Tris Midi Protein Gels, 26 well</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>WG1203BOX</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XCell4 SureLock Midi-Cell</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>WR0100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibramax 100</td>
			<td>Heidolph</td>
			<td>544-21200-00</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tension rollers attachment</td>
			<td>Heidolph</td>
			<td>549-81000-00</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ptima L-100 Ultracentrifuge running 45-Ti rotor</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>393253</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optima Max-XP ultracentrifuge running TLA-55 rotor</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>393315</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Floor standing centrifuge, Avanti J-26S XPI running JA-17 and JS-5.3 rotors&#160;</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>B14535</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prominence UFLC with RF-20A Fluorescence detector</td>
			<td>Shimadzu</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sepharose 6 10/300 GL size exclusion column</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-5172-01&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SSI5R-HS SHEL LAB Floor Model Shaking Incubator, 5 Cu.Ft. (144 L), 30-850 RPMs</td>
			<td>Shel Lab&#160;</td>
			<td>SSI5R-HS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Innova44R incubator</td>
			<td>New Brunswick /Eppendorf</td>
			<td>Innova44R</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TS SERIES 0.75KW DISRUPTER 230V 50HZ 1PH (40KPSI)</td>
			<td>Constant systems</td>
			<td>PL083016</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Rhamnose monohydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>83650</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

green fluorescent protein-based expression screening of membrane proteins in escherichia coli

構造的および機能的研究のための組換え膜タンパク質の生産が低レベルの発現一度洗浄剤中で可溶化し、多くの膜タンパク質の固有の不安定性のために技術的に困難なままである。プロトコルは、GFP蛍光によって検出された大腸菌で発現GFP融合体などの膜タンパク質のライゲーション非依存性クローニングを組み合わせることが記載されている。これは、時間と労力のさらなる投資に適した候補を同定するために、複数の膜タンパク質/バリアントの構築および発現のスクリーニングを可能にする。 GFPレポーターは、SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS-PAGE）は、次のGFP蛍光を可視化することにより式の一次スクリーニングに使用される。自由GFPの不在によって示されるように、最小の劣化で高い発現レベルの両方を示す膜タンパク質は、二次スクリーニングのために選択される。これらの構築物は、スケーリングされ、総膜画分を調製し、可溶化されている4異なる界面活性剤の研究開発。界面活性剤不溶性の物質を除去するために超遠心分離に続いて、溶解物を、蛍光検出サイズ排除クロマトグラフィー（FSEC）によって分析される。 GFP蛍光によってサイズ排除プロフィールを監視することは別の洗剤中の膜タンパク質の単分散性と完全性についての情報を提供します。タンパク質：ほとんど、あるいはまったく自由GFPと最小集約対称のピークで溶出洗剤の組み合わせは、その後の精製のための候補である。上記の方法論を用いて、E。で異種発現SED（形状、伸長、除算、および胞子）菌の47の異なる種からのタンパク質の大腸菌を分析した。これらのタンパク質は、典型的には10の膜貫通ドメインを有し、細胞分裂に必須である。結果は、EにSEDのオルソログの生産大腸菌は、発現レベルおよびGFP融合タンパク質の完全性に関して非常に可変であった。実験Iさらなる調査のためのサブセットをdentified。

タンパク質のSEDSファミリー（形状、伸び、部門、および胞子形成）は、細菌の細胞分裂に不可欠である。これらの一体型のタンパク質は通常、細胞内のアミノ末端およびカルボキシ末端の両方を持つ10の膜貫通領域を持っている。上述のプロトコールを例示するために、47 SEDのオルソログは、ベクターpOPINE-3C-eGFPの中にクローニングした。構築物の小規模発現画面は2つのE .coli株で実施した、0.25ミリモルの存在下で増殖させLemo21（DE3）は、日常的に、膜の発現のために使用されるリーキーな発現およびC41（DE3）pLysS株を、ブロックするラムノースタンパク質5-8。 誘導培養の洗剤可溶化した溶解物をSDSポリアクリルアミド電気泳動により分析した。ゲル内蛍光を使用することで発現GFP融合タンパク質は、47 SEDの構築物のうちの2株の間38が生成されることが示された可視化する。興味深いことに2発現株との間に差はなかった。 38構築物を発現し、わずか18は14だけLemo21（DE3）および6のみC41で（DE3）pLysS中で発現し、両系統を作製した。の全体的に、C41（DE3）pLysS株（24対38）に比べLemo21（DE3）のためのより高い成功率があった。しかし、いくつかのタンパク質は、株特異的であるように思われた観察は、両方のスクリーニングで有用であることを意味する。 47のSEDの24のための代表的なデータは、構築物は、図1に示されている。バンドの強度は、しかし、両方の株でよく、追加の表現、例えば 、図1A及び図1BのウェルC4における融合タンパク質の発現のレベルの指標を与える低分子量のバンドは、タンパク質が部分的に分解されることを示唆している。多くのレーンにGFP単独のサイズに対応するバンドが存在する。タンパク質の完全性の定性的評価は、自由GFPの融合タンパク質の相対的強度を調べることによって行うことができる。Lemo21（DE3）にいくつかの完全なタンパク質（ 図1A）があるのに対し、 例えば G4およびH4は完全にC41でのフリーGFP（DE3）pLysSを（ 図1B）に分解される。 38発現されたタンパク質のうち14の空きGFPバンドの強度は、（遊離GFPバンドの強度は、融合タンパク質および融合タンパク質の少数のそれよりも大きい21のために、3融合タンパク質と同様である/ 38は、 図1Aに） 例えば F6及びG6を発現した融合タンパク質と比較して比較的少ない自由GFPを有する。 一次スクリーニングのB5（遊離GFP融合タンパク質のための高強度バンド）及びG6（少し自由GFP）で十分に発現構築物のうちの2つが発現し、総膜画分を500mlの細胞培養物から調製した。再懸濁した膜は、アリコートに分割し、蛍光検出サイズ排除クロマトグラフィー（FSEC）により分析した。 FSECプロファイルはFIGURに提示されているE 2Aおよび2Bそれぞれと2 SEDのタンパク質が試験した4つの洗剤に異なる挙動を示すことを示している。 1ケース（ 図2A：サンプルB5）において、タンパク質は、したがって、その後の精製の ​​ための選択の洗剤だろうDDMに少し凝集対称ピークを与えた。対照的に、他の融合タンパク質（ 図2B：サンプルG6）は、試験した全ての界面活性剤で同様のプロフィールを示した。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/52357/52357fig1highres.jpg" width="700px" /> 図1：E.、膜タンパク質の発現をスクリーニングするためのワークフローの図GFPレポーターを使用して大腸菌 。 <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/52357/52357fig2highres.jpg" /> 図2：ゲル内蛍光を用いた膜タンパク質の発現の主画面。 </strongEの&gt;洗剤溶解物大腸菌細胞はブルー落射照明と28分の530フィルターを使用して画像化SDS-PAGEおよびゲルで分析した。結果は、（96ウェルプレート内の位置に基づいて、A4-H6ラベル）24の構築物について示されている。自由GFPおよびGFP融合タンパク質のためのバンドの位置が示されている。Lemo21（DE3）（B）C41（DE3）pLysS中で発現されたタンパク質で発現（A）タンパク質である。 <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/52357/52357fig3highres.jpg" /> 図3：膜タンパク質の発現の二次スクリーン蛍光検出サイズ排除クロマトグラフィー（FSEC）を使用して、合計の膜画分は、4つの異なる界面活性剤で抽出し、可溶化した膜タンパク質は、蛍光検出器に結合されたFPLCシステムを用いたサイズ排除クロマトグラフィーにより分析した。 （A）膜タンパク質B5および（B）はFSECプロファイル</s·チョン&gt;膜タンパク質G6。凝集したタンパク質、可溶化されたGFP融合タンパク質および遊離GFPに対応するピークの位置が示されている。テスト洗剤は、プロファイルの下に示されている。

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Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

緑色蛍光タンパク質の融合に基づく大腸菌における組換え膜タンパク質の発現についてスクリーニングする効率的なアプローチが提示される。

膜タンパク質の緑色蛍光タンパク質ベースの発現スクリーニングで<em&gt;エシェリヒア·コリ</em

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and ...

green-fluorescent-protein-based-expression-screening-membrane

Research

JoVE Journal

Biology

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

32.4K ビュー.  Research Complex at Harwell. 緑色蛍光タンパク質の融合に基づく大腸菌における組換え膜タンパク質の発現についてスクリーニングする効率的なアプローチが提示される。 

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Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents (Methanol, Ethanol or 2-Propanol) and acetic acid are used for fixation, staining and destaining of proteins in a gel after SDS-PAGE. To speed up the procedure, heating the staining solution in the microwave oven for a short time is frequently used. This usually results in evaporation of toxic or hazardous Methanol, Ethanol or 2-Propanol and a strong smell of acetic acid in the lab which should be avoided due to safety considerations. In a protocol originally published in two patent applications by E.M. Wondrak (US2001046709 (A1), US6319720 (B1)), an alternative composition of the staining solution is described in which no organic solvent or acid is used. The CBB is dissolved in bidistilled water (60-80mg of CBB G-250 per liter) and 35 mM HCl is added as the only other compound in the staining solution. The CBB staning of the gel is done after SDS-PAGE and thorough washing of the gel in bidistilled water. By heating the gel during the washing and staining steps, the process can be finished faster and no toxic or hazardous compunds are evaporating. The staining of proteins occurs already within 1 minute after heating the gel in staining solution and is fully developed after 15-30 min with a slightly blue background that is destained completely by prolonged washing of the stained gel in bidistilled water, without affecting the stained protein bands.

A short protocol for protein staining with Coomassie Brilliant Blue (CBB) G-250 in polyacrylamide gels is described without using organic solvents or acetic acid as in the classical staining procedures with CBB.

クーマシー有機溶媒および酢酸のないG - 250でゲル中のタンパク質の染色

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

生物学

An Assay for Measuring the Activity of Escherichia coli Inducible Lysine Decarboxyase

Escherichia coli is an enteric bacterium that is capable of growing over a wide range of pH values (pH 5 - 9)1 and, incredibly, is able to survive extreme acid stresses including passage through the mammalian stomach where the pH can fall to as low as pH 1 - 22. To enable such a broad range of acidic pH survival, E. coli possesses four different inducible amino acid decarboxylases that decarboxylate their substrate amino acids in a proton-dependent manner thus raising the internal pH. The decarboxylases include the glutamic acid decarboxylases GadA and GadB3, the arginine decarboxylase AdiA4, the lysine decarboxylase LdcI5, 6 and the ornithine decarboxylase SpeF7. All of these enzymes utilize pyridoxal-5'-phospate as a co-factor8 and function together with inner-membrane substrate-product antiporters that remove decarboxylation products to the external medium in exchange for fresh substrate2. In the case of LdcI, the lysine-cadaverine antiporter is called CadB. Recently, we determined the X-ray crystal structure of LdcI to 2.0 &#197;, and we discovered a novel small-molecule bound to LdcI the stringent response regulator guanosine 5'-diphosphate,3'-diphosphate (ppGpp) 14. The stringent response occurs when exponentially growing cells experience nutrient deprivation or one of a number of other stresses9. As a result, cells produce ppGpp which leads to a signaling cascade culminating in the shift from exponential growth to stationary phase growth10. We have demonstrated that ppGpp is a specific inhibitor of LdcI 14. Here we describe the lysine decarboxylase assay, modified from the assay developed by Phan et al.11, that we have used to determine the activity of LdcI and the effect of pppGpp/ppGpp on that activity. The LdcI decarboxylation reaction removes the &alpha;-carboxy group of L-lysine and produces carbon dioxide and the polyamine cadaverine (1,5-diaminopentane)5. L-lysine and cadaverine can be reacted with 2,4,6-trinitrobenzensulfonic acid (TNBS) at high pH to generate N,N'-bistrinitrophenylcadaverine (TNP-cadaverine) and N,N&#8242;-bistrinitrophenyllysine (TNP-lysine), respectively11. The TNP-cadaverine can be separated from the TNP-lysine as the former is soluble in organic solvents such as toluene while the latter is not (See Figure 1). The linear range of the assay was determined empirically using purified cadaverine.

An Assay for Measuring the Activity of Escherichia coli Inducible Lysine Decarboxyase

The activity of the inducible lysine decarboxylase is monitored by reacting the substrate L-lysine and the product cadaverine with 2,4,6-trinitrobenzensulfonic acid to form adducts that have differential solubility in toluene.

の活性を測定するアッセイ大腸菌誘導性リジンDecarboxyase

Escherichia coli is an enteric bacterium that is capable of growing over a wide range of pH values (pH 5 - 9)1 and, incredibly, is able to survive extreme ...

Crystallization of Membrane Proteins in Lipidic Mesophases

Membrane proteins perform critical functions in living cells related to signal transduction, transport and energy transformations, and, as such, are implicated in a multitude of malfunctions and diseases. However, a structural and functional understanding of membrane proteins is strongly lagging behind that of their soluble partners, mainly, due to difficulties associated with their solubilization and generation of diffraction quality crystals. Crystallization in lipidic mesophases (also known as in meso or LCP crystallization) is a promising technique which was successfully applied to obtain high resolution structures of microbial rhodopsins, photosynthetic proteins, outer membrane beta barrels and G protein-coupled receptors. In meso crystallization takes advantage of a native-like membrane environment and typically produces crystals with lower solvent content and better ordering as compared to traditional crystallization from detergent solutions. The method is not difficult, but requires an understanding of lipid phase behavior and practice in handling viscous mesophase materials. Here we demonstrate a simple and efficient way of making LCP and reconstituting a membrane protein in the lipid bilayer of LCP using a syringe mixer, followed by dispensing nanoliter portions of LCP into an assay or crystallization plate, conducting pre-crystallization assays and harvesting crystals from the LCP matrix. These protocols provide a basic guide for approaching in meso crystallization trials; however, as with any crystallization experiment, extensive screening and optimization are required, and a successful outcome is not necessarily guaranteed.

The protocols describe the essential steps for obtaining diffraction quality crystals of a membrane protein starting from reconstitution of the protein in a lipidic cubic phase (LCP), finding initial conditions with LCP-FRAP pre-crystallization assays, setting up LCP crystallization trials and harvesting crystals.

脂質中間相における膜タンパク質の結晶化

Membrane proteins perform critical functions in living cells related to signal transduction, transport and energy transformations, and, as such, are ...

High Throughput Screening of Fungal Endoglucanase Activity in Escherichia coli

Cellulase enzymes (endoglucanases, cellobiohydrolases, and &beta;-glucosidases) hydrolyze cellulose into component sugars, which in turn can be converted into fuel alcohols1. The potential for enzymatic hydrolysis of cellulosic biomass to provide renewable energy has intensified efforts to engineer cellulases for economical fuel production2. Of particular interest are fungal cellulases3-8, which are already being used industrially for foods and textiles processing.
Identifying active variants among a library of mutant cellulases is critical to the engineering process; active mutants can be further tested for improved properties and/or subjected to additional mutagenesis. Efficient engineering of fungal cellulases has been hampered by a lack of genetic tools for native organisms and by difficulties in expressing the enzymes in heterologous hosts. Recently, Morikawa and coworkers developed a method for expressing in E. coli the catalytic domains of endoglucanases from H. jecorina3,9, an important industrial fungus with the capacity to secrete cellulases in large quantities. Functional E. coli expression has also been reported for cellulases from other fungi, including Macrophomina phaseolina10 and Phanerochaete chrysosporium11-12. 
We present a method for high throughput screening of fungal endoglucanase activity in E. coli. (Fig 1) This method uses the common microbial dye Congo Red (CR) to visualize enzymatic degradation of carboxymethyl cellulose (CMC) by cells growing on solid medium. The activity assay requires inexpensive reagents, minimal manipulation, and gives unambiguous results as zones of degradation (&#x201C;halos&#x201D;) at the colony site. Although a quantitative measure of enzymatic activity cannot be determined by this method, we have found that halo size correlates with total enzymatic activity in the cell. Further characterization of individual positive clones will determine , relative protein fitness. 
Traditional bacterial whole cell CMC/CR activity assays13 involve pouring agar containing CMC onto colonies, which is subject to cross-contamination, or incubating cultures in CMC agar wells, which is less amenable to large-scale experimentation. Here we report an improved protocol that modifies existing wash methods14 for cellulase activity: cells grown on CMC agar plates are removed prior to CR staining. Our protocol significantly reduces cross-contamination and is highly scalable, allowing the rapid screening of thousands of clones. In addition to H. jecorina enzymes, we have expressed and screened endoglucanase variants from the Thermoascus aurantiacus and Penicillium decumbens (shown in Figure 2), suggesting that this protocol is applicable to enzymes from a range of organisms.

High Throughput Screening of Fungal Endoglucanase Activity in Escherichia coli

We describe a low cost, high throughput method to screen for fungal endoglucanase activity in E. coli. The method relies on a simple visual readout of substrate degradation, does not require enzyme purification, and is highly scalable. This allows for the rapid screening of large libraries of enzyme variants.

における真菌エンドグルカナーゼ活性のハイスループットスクリーニング大腸菌</em

Cellulase enzymes (endoglucanases, cellobiohydrolases, and &beta;-glucosidases) hydrolyze cellulose into component sugars, which in turn can be converted ...

Use of a Robot for High-throughput Crystallization of Membrane Proteins in Lipidic Mesophases

Structure-function studies of membrane proteins greatly benefit from having available high-resolution 3-D structures of the type provided through macromolecular X-ray crystallography (MX). An essential ingredient of MX is a steady supply of ideally diffraction-quality crystals. The in meso or lipidic cubic phase (LCP) method for crystallizing membrane proteins is one of several methods available for crystallizing membrane proteins. It makes use of a bicontinuous mesophase in which to grow crystals. As a method, it has had some spectacular successes of late and has attracted much attention with many research groups now interested in using it. One of the challenges associated with the method is that the hosting mesophase is extremely viscous and sticky, reminiscent of a thick toothpaste. Thus, dispensing it manually in a reproducible manner in small volumes into crystallization wells requires skill, patience and a steady hand. A protocol for doing just that was developed in the Membrane Structural &amp; Functional Biology (MS&amp;FB) Group1-3. JoVE video articles describing the method are available1,4. 
The manual approach for setting up in meso trials has distinct advantages with specialty applications, such as crystal optimization and derivatization. It does however suffer from being a low throughput method. Here, we demonstrate a protocol for performing in meso crystallization trials robotically. A robot offers the advantages of speed, accuracy, precision, miniaturization and being able to work continuously for extended periods under what could be regarded as hostile conditions such as in the dark, in a reducing atmosphere or at low or high temperatures. An in meso robot, when used properly, can greatly improve the productivity of membrane protein structure and function research by facilitating crystallization which is one of the slow steps in the overall structure determination pipeline. 
In this video article, we demonstrate the use of three commercially available robots that can dispense the viscous and sticky mesophase integral to in meso crystallogenesis. The first robot was developed in the MS&amp;FB Group5,6. The other two have recently become available and are included here for completeness.	
An overview of the protocol covered in this article is presented in Figure 1. All manipulations were performed at room temperature (~20 &deg;C) under ambient conditions.

Herein is described a robotic approach to high-throughput crystallization of membrane proteins in lipidic mesophases for use in structure determination using macromolecular X-ray crystallography. Three robots capable of handling the viscous and sticky protein-laden mesophase integral to the method are introduced.

脂質中間相における膜タンパク質のハイスループット結晶化のためのロボットの使用

Structure-function studies of membrane proteins greatly benefit from having available high-resolution 3-D structures of the type provided through ...

Intravital Microscopy for Imaging Subcellular Structures in Live Mice Expressing Fluorescent Proteins

Here we describe a procedure to image subcellular structures in live rodents that is based on the use of confocal intravital microscopy. As a model organ, we use the salivary glands of live mice since they provide several advantages. First, they can be easily exposed to enable access to the optics, and stabilized to facilitate the reduction of the motion artifacts due to heartbeat and respiration. This significantly facilitates imaging and tracking small subcellular structures. Second, most of the cell populations of the salivary glands are accessible from the surface of the organ. This permits the use of confocal microscopy that has a higher spatial resolution than other techniques that have been used for in vivo imaging, such as two-photon microscopy. Finally, salivary glands can be easily manipulated pharmacologically and genetically, thus providing a robust system to investigate biological processes at a molecular level.
In this study we focus on a protocol designed to follow the kinetics of the exocytosis of secretory granules in acinar cells and the dynamics of the apical plasma membrane where the secretory granules fuse upon stimulation of the beta-adrenergic receptors. Specifically, we used a transgenic mouse that co-expresses cytosolic GFP and a membrane-targeted peptide fused with the fluorescent protein tandem-Tomato. However, the procedures that we used to stabilize and image the salivary glands can be extended to other mouse models and coupled to other approaches to label in vivo cellular components, enabling the visualization of various subcellular structures, such as endosomes, lysosomes, mitochondria, and the actin cytoskeleton.

Intravital microscopy is a powerful tool that enables imaging various biological processes in live animals. In this article, we present a detailed method for imaging the dynamics of subcellular structures, such as the secretory granules, in the salivary glands of live mice.

蛍光タンパク質を発現する生きたマウスでのイメージング細胞内の構造物の生体顕微鏡

Here we describe a procedure to image subcellular structures in live rodents that is based on the use of confocal intravital microscopy. As a model organ, ...

Protocols for Implementing an Escherichia coli Based TX-TL Cell-Free Expression System for Synthetic Biology

Ideal cell-free expression systems can theoretically emulate an in vivo cellular environment in a controlled in vitro platform.1 This is useful for expressing proteins and genetic circuits in a controlled manner as well as for providing a prototyping environment for synthetic biology.2,3 To achieve the latter goal, cell-free expression systems that preserve endogenous Escherichia coli transcription-translation mechanisms are able to more accurately reflect in vivo cellular dynamics than those based on T7 RNA polymerase transcription. We describe the preparation and execution of an efficient endogenous E. coli based transcription-translation (TX-TL) cell-free expression system that can produce equivalent amounts of protein as T7-based systems at a 98% cost reduction to similar commercial systems.4,5 The preparation of buffers and crude cell extract are described, as well as the execution of a three tube TX-TL reaction. The entire protocol takes five days to prepare and yields enough material for up to 3000 single reactions in one preparation. Once prepared, each reaction takes under 8 hr from setup to data collection and analysis. Mechanisms of regulation and transcription exogenous to E. coli, such as lac/tet repressors and T7 RNA polymerase, can be supplemented.6 Endogenous properties, such as mRNA and DNA degradation rates, can also be adjusted.7 The TX-TL cell-free expression system has been demonstrated for large-scale circuit assembly, exploring biological phenomena, and expression of proteins under both T7- and endogenous promoters.6,8 Accompanying mathematical models are available.9,10 The resulting system has unique applications in synthetic biology as a prototyping environment, or "TX-TL biomolecular breadboard."

Protocols for Implementing an Escherichia coli Based TX-TL Cell-Free Expression System for Synthetic Biology

This five-day protocol outlines all steps, equipment, and supplemental software necessary for creating and running an efficient endogenous Escherichia coli based TX-TL cell-free expression system from scratch. With reagents, the protocol takes 8 hours or less to setup a reaction, collect, and process data.

実装するためのプロトコル<em&gt;エシェリヒア·コリ</em合成生物学のための&gt;に基づくTX-TLの無細胞発現系

Ideal cell-free expression systems can theoretically emulate an in vivo cellular environment in a controlled in vitro platform.1 This is useful for ...

High Throughput Quantitative Expression Screening and Purification Applied to Recombinant Disulfide-rich Venom Proteins Produced in E. coli

Escherichia coli (E. coli) is the most widely used expression system for the production of recombinant proteins for structural and functional studies. However, purifying proteins is sometimes challenging since many proteins are expressed in an insoluble form. When working with difficult or multiple targets it is therefore recommended to use high throughput (HTP) protein expression screening on a small scale (1-4&#160;ml cultures) to quickly identify conditions for soluble expression. To cope with the various structural genomics programs of the lab, a quantitative (within a range of 0.1-100 mg/L culture of recombinant protein) and HTP protein expression screening protocol was implemented and validated on thousands of proteins. The protocols were automated with the use of a liquid handling robot but can also be performed manually without specialized equipment.
Disulfide-rich venom proteins are gaining increasing recognition for their potential as therapeutic drug leads. They can be highly potent and selective, but their complex disulfide bond networks make them challenging to produce. As a member of the FP7 European Venomics project (<a href="http://www.venomics.eu">www.venomics.eu</a>), our challenge is to develop successful production strategies with the aim of producing thousands of novel venom proteins for functional characterization. Aided by the redox properties of disulfide bond isomerase DsbC, we adapted our HTP production pipeline for the expression of oxidized, functional venom peptides in the E. coli cytoplasm. The protocols are also applicable to the production of diverse disulfide-rich proteins. Here we demonstrate our pipeline applied to the production of animal venom proteins. With the protocols described herein it is likely that soluble disulfide-rich proteins will be obtained in as little as a week. Even from a small scale, there is the potential to use the purified proteins for validating the oxidation state by mass spectrometry, for characterization in pilot studies, or for sensitive micro-assays.

High Throughput Quantitative Expression Screening and Purification Applied to Recombinant Disulfide-rich Venom Proteins Produced in E. coli

A protocol for the quantitative, high throughput expression screening and analytical purification of fusion proteins from small-scale Escherichia coli cultures is described and applied to the expression of disulfide-rich animal venom protein targets.

で産生された組換えジスルフィド豊富な毒タンパク質に印加される高スループット定量的発現スクリーニングおよび精製<em&gt; E.大腸菌の</em

Escherichia coli (E. coli) is the most widely used expression system for the production of recombinant proteins for structural and functional studies. ...

Non-chromatographic Purification of Recombinant Elastin-like Polypeptides and their Fusions with Peptides and Proteins from Escherichia coli

Elastin-like polypeptides are repetitive biopolymers that exhibit a lower critical solution temperature phase transition behavior, existing as soluble unimers below a characteristic transition temperature and aggregating into micron-scale coacervates above their transition temperature. The design of elastin-like polypeptides at the genetic level permits precise control of their sequence and length, which dictates their thermal properties. Elastin-like polypeptides are used in a variety of applications including biosensing, tissue engineering, and drug delivery, where the transition temperature and biopolymer architecture of the ELP can be tuned for the specific application of interest. Furthermore, the lower critical solution temperature phase transition behavior of elastin-like polypeptides allows their purification by their thermal response, such that their selective coacervation and resolubilization allows the removal of both soluble and insoluble contaminants following expression in Escherichia coli. This approach can be used for the purification of elastin-like polypeptides alone or as a purification tool for peptide or protein fusions where recombinant peptides or proteins genetically appended to elastin-like polypeptide tags can be purified without chromatography. This protocol describes the purification of elastin-like polypeptides and their peptide or protein fusions and discusses basic characterization techniques to assess the thermal behavior of pure elastin-like polypeptide products.

Non-chromatographic Purification of Recombinant Elastin-like Polypeptides and their Fusions with Peptides and Proteins from Escherichia coli

Elastin-like polypeptides are stimulus-responsive biopolymers with applications ranging from recombinant protein purification to drug delivery. This protocol describes the purification and characterization of elastin-like polypeptides and their peptide or protein fusions from Escherichia coli using their lower critical solution temperature phase transition behavior as a simple alternative to chromatography.

からのペプチドおよびタンパク質との組換えエラスチン様ポリペプチドおよびその融合の非クロマトグラフィー精製<em&gt;エシェリヒア·コリ</em

Elastin-like polypeptides are repetitive biopolymers that exhibit a lower critical solution temperature phase transition behavior, existing as soluble ...

The Multifaceted Benefits of Protein Co-expression in Escherichia coli

We report here that the expression of protein complexes in vivo in Escherichia coli can be more convenient than traditional reconstitution experiments in vitro. In particular, we show that the poor solubility of Escherichia coli DNA polymerase III &#949; subunit (featuring 3&#8217;-5&#8217; exonuclease activity) is highly improved when the same protein is co-expressed with the &#945; and &#952; subunits (featuring DNA polymerase activity and stabilizing &#949;, respectively). We also show that protein co-expression in E. coli can be used to efficiently test the competence of subunits from different bacterial species to associate in a functional protein complex. We indeed show that the &#945; subunit of Deinococcus radiodurans DNA polymerase III can be co-expressed in vivo with the &#949; subunit of E. coli. In addition, we report on the use of protein co-expression to modulate mutation frequency in E. coli. By expressing the wild-type &#949; subunit under the control of the araBAD promoter (arabinose-inducible), and co-expressing the mutagenic D12A variant of the same protein, under the control of the lac promoter (inducible by isopropyl-thio-&#946;-D-galactopyranoside, IPTG), we were able to alter the E. coli mutation frequency using appropriate concentrations of the inducers arabinose and IPTG. Finally, we discuss recent advances and future challenges of protein co-expression in E. coli.

The Multifaceted Benefits of Protein Co-expression in Escherichia coli

Protein co-expression is a powerful alternative to the reconstitution in vitro of protein complexes, and is of help in performing biochemical and genetic tests in vivo. Here we report on the use of protein co-expression in Escherichia coli to obtain protein complexes, and to tune the mutation frequency of cells.

タンパク質の共発現の多面的メリットで<em&gt;エシェリヒア·コリ</em

We report here that the expression of protein complexes in vivo in Escherichia coli can be more convenient than traditional reconstitution experiments in ...