我々は、細胞培養上清中のMMPの濃度を増加させるタンパク質集線装置の使用を示唆するため博士S.レスラーを（分子細胞生物学教室、ベイラー医科大学）に感謝いたします。 このプロジェクトは、（AR059838）ミセスクリフォードエルダーホワイトグラハム寄附研究基金とNIH / NIAMSからCBへの補助金によって支えられている。内容はもっぱら著者の責任であり、必ずしもNIHの公式見解を表すものではありません。

1。ジェルのロードと実行<ol><li>すべてのサンプルは、酵素の機能を維持するために十分に準備され、コレクションの直後に使用されるか、または-80℃で凍結保存する必要があります。℃にサンプルは、還元剤を含んではならない（例えば、β-メルカプトエタノール）またはゲルローディング前に一度沸騰させ。 </li><li>カセット内部にゲルを含んでいるポーチを開くと、脱イオン水でカセットをすすいでください。 <ul><li>カセットとゲルの上から櫛の底から保護テープを取り外します。 </li><li>ランニングバッファー（脱イオン水で1Xに希釈）でウェル三回すすいでください。 </li><li>ミニ細胞、カセットの小さい側が内側を向くようにすることにゲルを置きます。ゲルテンションウェッジを所定の位置にロックします。ミニセルは並列に1つまたは2つのゲルを実行することができます。 </li><li>井戸のレベル以上の1X泳動バッファーと上部（内側）室を埋めるため、任意の漏れをチェックします。漏れの場合には、バッファを削除し、ゲルを再配置する。 </li><li> 1X泳動バッファーと下室を埋める。 </li></ul></li><li>よく一つにタンパク質分子マーカーの10μLをロードする。 <ul><li>ゲルローディングチップを（各サンプルの間で変更）を用いてゲルのウェルにゲルローディング緩衝液の試料と負荷を均等に混ぜる。これらの井戸は20μL、合計​​すると、最大ロードすることができます。 </li></ul></li><li>ミニセルにふたをし、電源に電極コードを接続します。の電源を切り替え、90分間一定の125 Vで実行するように設定します。現在の発行部数を示し、下室のワイヤーに小さな気泡の形成を確認してください。 </li><li>最初のゲルを実行する際に、指標としてのローディングバッファーに含まれるブロモフェノールブルーを使用して、マイグレーション15分ごとの進行状況を監視。インジケータの色素がゲルの底に達するまでゲルの実行をしましょう​​。 </li></ol> 2。ジェルをRenaturingと開発<ol><li>それぞれのゲルの場合は、脱イオン水で両方、1X renaturingバッファとバッファを変性200mLを100mLのを準備。 </li><li>ブロモフェノールブルートラッキング色素がゲルの底部に達すると、電源を切るミニセルを開いて、ゲルを取り外します。ゲルのナイフ（または計量へら）を使用してカセットの両面を区切ります。ゲルの方向を示すためにコーナーをカット。 </li><li>慎重に100mLのrenaturingバッファを使用してコンテナにカセットと場所からゲルを取り除く。穏やかに撹拌しながら室温で30分間インキュベートする。 </li><li> renaturingバッファを削除し、ゲルにバッファーを開発して100 mLを加え。穏やかに撹拌しながら室温で30分間インキュベートする。 </li><li>開発バッファを削除し、ゲルに開発バッファー100mLの詳細を追加。 37℃（16〜18時間）一晩インキュベート℃に</li><li>開発バッファを削除し、室温で穏やかに撹拌下に脱イオン水で3回（5分ごとに）すすいでください。 </li><li>彼らはゲルの染色後に小さいか、または表示されていないとなると蛋白質の標準的なバンドの正確な位置を保存するためにゲルをスキャンします。 </li><li>ゲルにSimplyBlue Safestain 20mLを追加することでゲルを染色する。穏やかに撹拌しながら室温で1時間インキュベートする。 </li><li> SimplyBlue SafeStainと穏やかに撹拌下、室温で1時間を100mL以上の脱イオン水で脱染色ゲルを取り外します。 </li><li>より良い結果を得るために、穏やかに撹拌下、室温で別の時間以上に新鮮な脱イオン水とインキュベートして交換してください。 </li></ol> 3。データ解析<ol><li>慎重にプラスチックシートプロテクターの水と場所からゲルを取り除く。 </li><li> 300dpi以上の解像度でゲルをスキャンします。 TIFF形式（図1A）で画像を保存します。 </li><li> ImageJの（または別の同様のソフトウェア）とのバンド強度を測定します。 <ul><li> ImageJは（図1A）でTIFFファイルを開きます。 </li><li> （図1B）&quot;画像&gt;タイプ&gt; 8ビット&quot;を選択することにより、黒と白で視覚化する。 </li><li>少なくとも二回以上、それは（これはソフトウェアの要件です）横幅よりも長方形を描く、最初のバンドの輪郭を長方形選択ツールを使用してください。 </li><li> &quot;1&quot;を押すか、&quot;解析&gt;ジェル&gt;を選択最初のレーン&quot;とバンドが概説されます]を選択します。 </li><li>新しい長方形が表示されるので、次のバンドに移動し、&quot;&gt;ジェル&gt;を選択、次の車線を分析する&quot;が選択されます。すべてのバンドが選択されるまで繰り返します（図1B）。 </li><li> &quot;3&quot;を押すか、各バンド（図1C）のプロファイルプロットを生成するために&quot;解析&gt;ジェル&gt;プロットレーン&quot;を選択します。 </li><li>興味のピークが完全に密閉された場所であることができるように、基本線を描画する直線の選択を（既に自動的に選択する必要があります）を使用してください。 </li><li>杖ツールを選択して、それを選択するために、各ピークの内側をクリックします。 </li><li>選択した各ピークの面積を持つテーブルを取得するために&quot;解析&gt;ジェル&gt;ラベルのピーク&quot;を選択してください。これらのデータは、（Fとしてプロットすることができますigureの1D）または、選択されたバンドの値に正規化することができます。結果の統計的有意性を決定するためにいくつかの複製ゲルから値をプールする場合は、この正規化は特に重要です。 </li></ul></li></ol> 4。代表的な結果我々は、MMP - 2（図1A）の異なる量を含むさまざまな細胞培養上清を搭載した11ウェルのゲルを示す。このゲルの直接観察は、井戸のいくつかの間にMMP - 2濃度の明らかな違いを示しています。例えば、それは井戸＃4と5ははるかにMMP - 2も＃11またはさえも＃10よりが含まれていることは明らかである。バンドの客観的な定量化のために我々は、MMP - 2も＃11と井戸の間の量＃4と5との約2倍の差が約4倍の差を確認し、ImageJのソフトウェア（図1B - D）でデンシトメトリーを使用しているよく＃10と井戸＃4と5の間にMMP - 2の量。 <img src="/files/ftp_upload/2445/2445fig1.jpg" alt="図1" /> 図1ゼラチンザイモグラフィーによるMMP - 2の検出。ゼラチンゲルの、スキャン画像。よく数字は、ゲルの上部に示されています。 B、​​デンシトメトリー用の黒と白に示すのと同じゲル。各バンドは、ImageJの中の矩形で選択されまし​​た。 C、およびB（バンド＃4、＃11）に示すようにゲルのデンシトメトリーのプロファイルの二つの例。直線は、閉じた領域を作成するために、各ピークの基部に描かれました。 D、バンド＃1の密度にAとBの前（左）と後（右）正規に示すようにゲルのピーク面積のプロット。 <img src="/files/ftp_upload/2445/2445fig2.jpg" alt="図2" /> 図2この図は、ザイモグラフィーの半定量的なテクニックとして使用することができる方法を示しています。我々は7回連続のウェルに希釈系列を（1:1希釈の手順）にロードされ、プロMMP - 2およびMMP - 2の両方のバンドの密度を測定した。

<ol>
	<li>Luo, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+matrix+metalloproteinases+in+the+morphogenesis+of+the+cerebellar+cortex.">The role of matrix metalloproteinases in the morphogenesis of the cerebellar cortex.</a> Cerebellum. 4, 239-245 (2005).</li><li>Pasternak, B., Aspenberg, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metalloproteinases+and+their+inhibitors+-+diagnostic+and+therapeutic+opportunities+in+orthopedics.">Metalloproteinases and their inhibitors - diagnostic and therapeutic opportunities in orthopedics.</a> Acta Orthop. 80, 693-703 (2009).</li><li>Kessenbrock, K., Plaks, V., Werb, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrix+metalloproteinases:+regulators+of+the+tumor+microenvironment.">Matrix metalloproteinases: regulators of the tumor microenvironment.</a> Cell. 141, 52-67 (2010).</li><li>Lagente, V., Boichot, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+matrix+metallopreoteinases+in+the+inflammatory+process+of+respiratory+diseases.">Role of matrix metallopreoteinases in the inflammatory process of respiratory diseases.</a> J. Mol. Cell. Cardiol. 48, 440-444 (2010).</li><li>Rodr&#237;guez, D., Morrison, C. J., Overall, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrix+metallopreoteinases:+what+do+they+not+do?+New+substrates+and+biological+roles+identified+by+murine+models+and+proteomics.">Matrix metallopreoteinases: what do they not do? New substrates and biological roles identified by murine models and proteomics.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1803, 39-54 (2010).</li><li>Bourboulia, D., Stetler-Stevenson, W. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrix+metalloproteinases+(MMPs)+and+tissue+inhibitors+of+metalloproteinases+(TIMPs):+positive+and+negative+regulators+in+tumor+cell+adhesion.">Matrix metalloproteinases (MMPs) and tissue inhibitors of metalloproteinases (TIMPs): positive and negative regulators in tumor cell adhesion.</a> Semin. Cancer Biol. , (2010).</li><li>Heussen, C., Dowdle, E. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrophoretic+analysis+of+plasminogen+activators+in+polyacrylamide+gels+containing+sodium+dodecyl+sulfate+and+copolymerized+substrates.">Electrophoretic analysis of plasminogen activators in polyacrylamide gels containing sodium dodecyl sulfate and copolymerized substrates.</a> Analytical Biochem. , 102-196 (1980).</li><li>Lombard, C., Saulnier, J., Wallach, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assays+of+matrix+metalloproteinases+(MMPs)+activities:+a+review.">Assays of matrix metalloproteinases (MMPs) activities: a review.</a> Biochimie. 87, 265-272 (2005).</li><li>Snoek-van Beurden, P. A., Von den Hoff, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zymographic+techniques+for+the+analysis+of+matrix+metalloproteinases+and+their+inhibitors.">Zymographic techniques for the analysis of matrix metalloproteinases and their inhibitors.</a> Biotechniques. 38, 73-83 (2005).</li><li>Kupai, K., Szucs, G., Cseh, S., Hajdu, I., Csonka, C., Csont, T., Ferdinandy, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrix+metalloproteinase+activity+assays:+importance+of+zymography.">Matrix metalloproteinase activity assays: importance of zymography.</a> J. Pharmacol. Toxicol. Methods. 61, 205-209 (2010).</li><li>Kleiner, D. E., Stetler-Stevenson, W. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+zymography:+detection+of+pictogram+quantities+of+gelatinases.">Quantitative zymography: detection of pictogram quantities of gelatinases.</a> Anal. Biochem. 218, 325-329 (1994).</li><li>Yu, W. H., Woessner, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heparin-enhanced+zymographic+detection+of+matrilysin+and+collagenases.">Heparin-enhanced zymographic detection of matrilysin and collagenases.</a> Anal. Biochem. 293, 38-42 (2001).</li></ol>

利害の衝突は宣言されません。

我々は、細胞培養上清中のMMP - 2のzymographic分析を実行する方法を示している。 ゲルにロードするサンプル量は、経験的に関心の起源とMMPに応じて決定する必要があります。プロテアーゼは、バンドの領域に消化できるだけなので非常に基板があるので、あまりにも多くのロード中に少し検出を防ぐことがあまりにもロードすると、飽和状態につながる可能性があります。必要に応じて、サンプルをローディングバッファーや開発に時間と混合する前に脱イオン水で希釈することができますデは4時間に一晩に短縮できます。それは、コンセントレータ（例えばミリポアカタログ＃UFC803024）を用いて溶液中のタンパク質を濃縮することも可能です。バンドがほとんど見えない状態のままなら、それも、最大48時間まで、時間の長い期間のためのゲルを開発する必要があるかもしれません。組織培養上清からサンプルを調製する際に、それはウシ胎児血清（および他の血清が）結果に影響を与える可能性のMMPを含んでいることに留意すべきである。このような理由から、我々は、無血清培地での培養後に上清のすべてを収集する。 プロトコルのパラグラフ2.9および2.10で説明されている洗浄は消化バンドの染色バックグラウンドを除去する必要があります。長い洗浄時間は、ゲル全体に基板の染色をより多くの背景を削除しますが、また暗くなる。長い洗浄時間が必要な場合、我々は最高のコントラストを使用してスキャンを選択するためにゲルを数時間おきにスキャンすることをお勧めします。 この手法は、他のMMPを検出するために使用することができます。ゼラチンが好ましい基質ではないとして、例えば、MMP - 9はゼラチンゲル上で、そしてまた、より低い程度MMP - 1、MMP - 8、およびMMP - 13に検出することができます。 MMP - 1およびカゼインはMMP - 12、およびMMP - 13、MMP - 7、MMP - 3、MMP - 11のための好ましい基質であるともMMP - 1の検出を可能にする間、MMP - 13は最高のコラーゲンのザイモグラフィーで検出されています9。 MMP - 7（マトリリシン）およびコラゲナーゼ（MMP - 1およびMMP - 13）時カゼインまたはゼラチンゲル中での低レベルで存在を検出することは困難です。ゲルローディング時の試料へのヘパリンの添加はMMP - 7の検出限界を大幅に向上させます。 MMP - 1およびMMP - 13の場合は、ヘパリンは、電気泳動の実行は片道12で既に後にゲルに追加する必要があります。 ザイモグラフィーは、酵素の変性と再生の後に酵素活性を測定するので、試料中に存在するすべてのMMPの活性を測定します。これは、酵素、プロ酵素、及び内因性阻害剤（例えば、TIMP - 2）に結合した酵素が含まれています。それはわずかに高い分子量を持つ活性酵素のとプロ酵素のそのバンドの密度を、比較することにより、サンプル中のMMP活性のレベルを決定することは可能です。 ザイモグラフィーは頻繁にMMPを識別するのに十分ではありません。既知の分子量を基準とMMPの移行レベルの比較では、識別に役立つありませんが、これらの規格の一部が還元剤を含んでおり、その非還元条件下で使用したときには9種類の分子量を示すかもしれないことに注意すべきである。オプションは、テストサンプルと同じゲル上可溶性組換えMMPをロードすることです。 MMPは、しかし、見かけの分子量の変化を誘導し、他のタンパク質に関連付けられる場合があります。選択的MMP阻害剤はinterest.A第二の技術（ウェスタンブロット、免疫細胞化学、またはELISA）のMMPをすることをお勧めしますアイデンティティへの薬理学的ツールとして開発し、バッファ内のインキュベーションの間にゲル（または半分にゲルカットの部分）を追加することができます興味のMMPの同定に役立つ。これはウェスタンブロット法の検出限界は、このテクニックを使用するときに潜在的に偽陰性の結果につながる、しばしばzymographicゲルのものよりもはるかに低いことに留意すべきである。

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		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Xcell SureLock Mini-Cell CE mark electrophoresis apparatus</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>EI0001</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Power supply (model 302)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>VWR</td>
<td>93000-744</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Novex 10% gelatin zymogram gels, 1.0 mm, 12 wells</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>EC61752BOX</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Blue Juice gel loading buffer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>10816015</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Gel loading tips</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>VWR</td>
<td>53509-015</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Protein molecular weight standard</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>LC5800</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Novex Tris-Glycine-SDS running buffer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>LC2675</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Novex zymogram renaturing buffer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>LC2670</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Novex zymogram developing buffer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>LC2671</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>SimplyBlue SafeStain</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>LC6060</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Epson Perfection 4490 Photo Scanner</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Amazon</td>
<td>n/a</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>ImageJ software</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>http://rsbweb.nih.gov/ij/ </td>
<td>n/a</td>
<td>Authored by W. Rasband, NIH/NIMH</td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>

detection of functional matrix metalloproteinases by zymography

マトリックスメタロプロテアーゼ（MMP）は亜鉛含有エンドペプチダーゼです。彼らは、ペプチド結合の切断によってタンパク質を分解。 20以上のMMPは同定されており、その構造と基質特異性（コラゲナーゼ、ゼラチナーゼ、膜の種類[MT - MMP]、ストロメリシン、matrilysins、など）に基づいて6つのグループに分けられます。 MMPは、細胞浸潤、軟骨の劣化、組織の再構築、創傷治癒、および胚形成において重要な役割を果たす。したがって、それらは両方とも通常のプロセスで、そのような関節リウマチ、がん、または慢性閉塞性肺疾患1から6のような多くの疾患の病因に関与。ここで、我々は、MMP - 2（ゼラチナーゼA、IV型コラゲナーゼ）、広く発現MMPに焦点を当てます。私たちは、ザイモグラフィーは、まずC. HeussenとEBドゥードル70から10が1980年に記載されて一般的に使用される、シンプルな、そして非常に敏感な技術によって、細胞の培養上清中のMMP - 2を検出する方法を説明します。この技術は半定量的である組換えMMPの既知の濃度は同じゲル11の上にロードされるとき、それは、したがって、試験サンプル中のMMPレベルを決定するために使用することができます。 とゼラチン（MMP - 2の基質）、MMPを（例えば細胞培養上清、尿、または血清）を含むソリューションは、ドデシル硫酸ナトリウム（タンパク質を線形化するためにSDS）を含むポリアクリルアミドゲル上にロードされています。サンプルのバッファは（ゲルローディングを容易にする）サンプルの粘度を高めるために設計されて、追跡用色素（ブロモフェノールブルー、サンプルの移行を監視する）を提供する、変性分子（タンパク質を線形化するために）提供し、サンプルのpHを制御する。タンパク質は、その後、一定の移行率を提供するように設計された実行中のバッファで電流下での移行が許可されています。移行の距離は反比例タンパク質の分子量（小さなタンパク質は大きなタンパク質に比べゲルを介して高速に移動するため、ゲルの下方に移行）と相関している。移行後は、ゲルは、タンパク質が酵素活性に必要なそれらの三次構造を、回復できるようにrenaturingバッファに置かれます。次いでゲルをプロテアーゼはその基質を消化できるように設計開発をバッファに置かれます。発展途上バッファはまた、アクティブなMMPをに非タンパク質分解プロMMPを活性化するためのp - aminophenylmercuric酢酸（APMA）が含まれています。次のステップは、基板を（この例ではゼラチン）染色で構成されています。ゲルから余分な色素を洗浄した後、プロテアーゼ消化の領域は明確なバンドとして表示されます。明確なバンドは、より濃縮されたプロテアーゼは、それが含まれています。バンドの染色強度は、サンプルの比較を可能にする、などのImageJなどのソフトウェアを使用して、デンシトメトリーによって測定することができる。

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Detection of Functional Matrix Metalloproteinases by Zymography

このプロトコルは、アクティビティベースの培養上清や体液中マトリックスメタロプロテアーゼを検出するためのアッセイを説明します。

ザイモグラフィーによる機能マトリックスメタロプロテイナーゼの検出

Matrix metalloproteinases (MMPs) are zinc-containing endopeptidases. They degrade proteins by cleavage of peptide bonds. More than twenty MMPs have been ...

detection-of-functional-matrix-metalloproteinases-by-zymography

Research

JoVE Journal

Biology

83.5K ビュー.  Baylor College of Medicine. このプロトコルは、アクティビティベースの培養上清や体液中マトリックスメタロプロテアーゼを検出するためのアッセイを説明します。

ビデオ: Detection of Functional Matrix Metalloproteinases by Zymography

Labeling Stem Cells with Fluorescent Dyes for non-invasive Detection with Optical Imaging

Optical imaging (OI) is an easy, fast and inexpensive tool for in vivo monitoring of new stem cell based therapies. The technique is based on ex vivo labeling of stem cells with a fluorescent dye, subsequent intravenous injection of the labeled cells and visualization of their accumulation in specific target organs or pathologies. The presented technique demonstrates how we label human mesenchymal stem cells (hMSC) by simple incubation with the lipophilic fluorescent dye DiD (C67H103CIN2O3S) and how we label human embryonic stem cells (hESC) with the FDA approved fluorescent dye Indocyanine Green (ICG). The uptake mechanism is via adherence and diffusion of the lypophilic dye across the phospholipid cell membrane bilayer. The labeling efficiency is usually improved if the cells are incubated with the dye in serum-free media as opposed to incubation in serum-containing media. Furthermore, the addition of the transfection agent Protamine Sulfate significantly improves contrast agent uptake.

This video shows techniques for labeling of human embryonic stem cells and mesenchymal stem cells with fluorescent dyes. This technique can be used for an in vivo tracking of transplanted stem cells with optical imaging and for histopathological correlations with fluorescence microscopy.

光イメージングによる非侵襲的検出のための蛍光色素で標識幹細胞

Optical imaging (OI) is an easy, fast and inexpensive tool for in vivo monitoring of new stem cell based therapies. The technique is based on ex vivo ...

生物学

Detection of Post-translational Modifications on Native Intact Nucleosomes by ELISA

The genome of eukaryotes exists as chromatin which contains both DNA and proteins. The fundamental unit of chromatin is the nucleosome, which contains 146 base pairs of DNA associated with two each of histones H2A, H2B, H3, and H41. The N-terminal tails of histones are rich in lysine and arginine and are modified post-transcriptionally by acetylation, methylation, and other post-translational modifications (PTMs). The PTM configuration of nucleosomes can affect the transcriptional activity of associated DNA, thus providing a mode of gene regulation that is epigenetic in nature 2,3. We developed a method called nucleosome ELISA (NU-ELISA) to quantitatively determine global PTM signatures of nucleosomes extracted from cells. NU-ELISA is more sensitive and quantitative than western blotting, and is useful to interrogate the epiproteomic state of specific cell types. This video journal article shows detailed procedures to perform NU-ELISA analysis.

Nucleosome ELISA (NU-ELISA) is a sensitive and quantitative method to detect global patterns of post-translational modifications in preparations of native, intact nucleosomes. These modifications include methylations, acetylations, and phosphorylations at specific histone amino acid residues, and hence NU-ELISA provides a global proteomic assay of the overall chromatin modification states of specific cell types.

ELISAによるネイティブ無傷ヌクレオソーム上の翻訳後修飾の検出

The genome of eukaryotes exists as chromatin which contains both DNA and proteins. The fundamental unit of chromatin is the nucleosome, which contains 146 ...

Harvesting and Cryo-cooling Crystals of Membrane Proteins Grown in Lipidic Mesophases for Structure Determination by Macromolecular Crystallography

An important route to understanding how proteins function at a mechanistic level is to have the structure of the target protein available, ideally at atomic resolution. Presently, there is only one way to capture such information as applied to integral membrane proteins (Figure 1), and the complexes they form, and that method is macromolecular X-ray crystallography (MX). To do MX diffraction quality crystals are needed which, in the case of membrane proteins, do not form readily. A method for crystallizing membrane proteins that involves the use of lipidic mesophases, specifically the cubic and sponge phases1-5, has gained considerable attention of late due to the successes it has had in the G protein-coupled receptor field6-21 (<a href="http://www.mpdb.tcd.ie" target="_blank">www.mpdb.tcd.ie</a>). However, the method, henceforth referred to as the in meso or lipidic cubic phase method, comes with its own technical challenges. These arise, in part, due to the generally viscous and sticky nature of the lipidic mesophase in which the crystals, which are often micro-crystals, grow. Manipulating crystals becomes difficult as a result and particularly so during harvesting22,23. Problems arise too at the step that precedes harvesting which requires that the glass sandwich plates in which the crystals grow (Figure 2)24,25 are opened to expose the mesophase bolus, and the crystals therein, for harvesting, cryo-cooling and eventual X-ray diffraction data collection.
The cubic and sponge mesophase variants (Figure 3) from which crystals must be harvested have profoundly different rheologies4,26. The cubic phase is viscous and sticky akin to a thick toothpaste. By contrast, the sponge phase is more fluid with a distinct tendency to flow. Accordingly, different approaches for opening crystallization wells containing crystals growing in the cubic and the sponge phase are called for as indeed different methods are required for harvesting crystals from the two mesophase types. Protocols for doing just that have been refined and implemented in the Membrane Structural and Functional Biology (MS&amp;FB) Group, and are described in detail in this JoVE article (Figure 4). Examples are given of situations where crystals are successfully harvested and cryo-cooled. We also provide examples of cases where problems arise that lead to the irretrievable loss of crystals and describe how these problems can be avoided. In this article the Viewer is provided with step-by-step instructions for opening glass sandwich crystallization wells, for harvesting and for cryo-cooling crystals of membrane proteins growing in cubic and in sponge phases.

Herein is described procedures implemented in the Caffrey Membrane Structural and Functional Biology Group to harvest and cryo-cool membrane protein crystals grown in lipidic cubic and sponge phases for use in structure determination using macromolecular X-ray crystallography.

高分子結晶学による構造決定のための脂質メソフェーズで栽培膜タンパク質の収穫とクライオ冷却結晶

An important route to understanding how proteins function at a mechanistic level is to have the structure of the target protein available, ideally at ...

Detection of Viral RNA by Fluorescence in situ Hybridization (FISH)

Viruses that infect cells elicit specific changes to normal cell functions which serve to divert energy and resources for viral replication. Many aspects of host cell function are commandeered by viruses, usually by the expression of viral gene products that recruit host cell proteins and machineries. Moreover, viruses engineer specific membrane organelles or tag on to mobile vesicles and motor proteins to target regions of the cell (during de novo infection, viruses co-opt molecular motor proteins to target the nucleus; later, during virus assembly, they will hijack cellular machineries that will help in the assembly of viruses). Less is understood on how viruses, in particular those with RNA genomes, coordinate the intracellular trafficking of both protein and RNA components and how they achieve assembly of infectious particles at specific loci in the cell. The study of RNA localization began in earlier work. Developing lower eukaryotic embryos and neuronal cells provided important biological information, and also underscored the importance of RNA localization in the programming of gene expression cascades. The study in other organisms and cell systems has yielded similar important information. Viruses are obligate parasites and must utilise their host cells to replicate. Thus, it is critical to understand how RNA viruses direct their RNA genomes from the nucleus, through the nuclear pore, through the cytoplasm and on to one of its final destinations, into progeny virus particles 1.
FISH serves as a useful tool to identify changes in steady-state localization of viral RNA. When combined with immunofluorescence (IF) analysis 22, FISH/IF co-analyses will provide information on the co-localization of proteins with the viral RNA3. This analysis therefore provides a good starting point to test for RNA-protein interactions by other biochemical or biophysical tests 4,5, since co-localization by itself is not enough evidence to be certain of an interaction. In studying viral RNA localization using a method like this, abundant information has been gained on both viral and cellular RNA trafficking events 6. For instance, HIV-1 produces RNA in the nucleus of infected cells but the RNA is only translated in the cytoplasm. When one key viral protein is missing (Rev) 7, FISH of the viral RNA has revealed that the block to viral replication is due to the retention of the HIV-1 genomic RNA in the nucleus 8. 
Here, we present the method for visual analysis of viral genomic RNA in situ. The method makes use of a labelled RNA probe. This probe is designed to be complementary to the viral genomic RNA. During the in vitro synthesis of the antisense RNA probe, the ribonucleotide that is modified with digoxigenin (DIG) is included in an in vitro transcription reaction. Once the probe has hybridized to the target mRNA in cells, subsequent antibody labelling steps (Figure 1) will reveal the localization of the mRNA as well as proteins of interest when performing FISH/IF.

Detection of Viral RNA by Fluorescence in situ Hybridization FISH

A fluorescence in situ hybridization (FISH) method was developed to visually detect viral genomic RNA using fluorescence microscopy. A probe is made with specificity to the viral RNA that can then be identified using a combination of hybridization and immunofluorescence techniques. This technique offers the advantage of identifying the localization of the viral RNA or DNA at steady-state, providing information on the control of intracellular virus trafficking events.

蛍光によるウイルスRNAの検出<em&gt;その場で</em&gt;ハイブリダイゼーション（FISH）

Viruses  that infect cells elicit specific changes to normal cell functions which serve  to divert energy and resources for viral replication. Many ...

Improving the Success Rate of Protein Crystallization by Random Microseed Matrix Screening

Random microseed matrix screening (rMMS) is a protein crystallization technique in which seed crystals are added to random screens. By increasing the likelihood that crystals will grow in the metastable zone of a protein's phase diagram, extra crystallization leads are often obtained, the quality of crystals produced may be increased, and a good supply of crystals for data collection and soaking experiments is provided. Here we describe a general method for rMMS that may be applied to either sitting drop or hanging drop vapor diffusion experiments, established either by hand or using liquid handling robotics, in 96-well or 24-well tray format.

Here we describe a general method for random microseed matrix screening. This technique is shown to significantly increase the success rate of protein crystallization screening experiments, reduce the need for optimization, and provide a reliable supply of crystals for data collection and ligand-soaking experiments.

ランダムMicroseedマトリックススクリーニングによってタンパク質結晶化の成功率を向上させる

Random microseed matrix screening  (rMMS) is a protein crystallization technique in which seed crystals are added  to random screens. By increasing the ...

Detection of Live Escherichia coli O157:H7 Cells by PMA-qPCR

A unique open reading frame (ORF) Z3276 was identified as a specific genetic marker for E. coli O157:H7. A qPCR assay was developed for detection of E. coli O157:H7 by targeting ORF Z3276. With this assay, we can detect as low as a few copies of the genome of DNA of E. coli O157:H7. The sensitivity and specificity of the assay were confirmed by intensive validation tests with a large number of E. coli O157:H7 strains (n = 369) and non-O157 strains (n = 112). Furthermore, we have combined propidium monoazide (PMA) procedure with the newly developed qPCR protocol for selective detection of live cells from dead cells. Amplification of DNA from PMA-treated dead cells was almost completely inhibited in contrast to virtually unaffected amplification of DNA from PMA-treated live cells. Additionally, the protocol has been modified and adapted to a 96-well plate format for an easy and consistent handling of a large number of samples. This method is expected to have an impact on accurate microbiological and epidemiological monitoring of food safety and environmental source.

Detection of Live Escherichia coli O157:H7 Cells by PMA-qPCR

A qPCR assay was developed for detection of Escherichia coli O157:H7 targeting a unique genetic marker, Z3276. The qPCR was combined with propidium monoazide (PMA) treatment for live cell detection. This protocol has been modified and adapted to a 96-well plate format for easy and consistent handling of numerous samples

ライブの検出<em&gt;エシェリヒア·コリ</em&gt; O157：PMA-qPCRによりH7細胞

A unique open reading frame (ORF) Z3276 was identified as a specific genetic marker for E. coli O157:H7. A qPCR assay was developed for detection of E. ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) maintain the turnover of all mature blood cell lineages. The coordination of the complex signals leading to specific HSC fates relies upon the interaction between HSCs and the intricate bone marrow microenvironment, which is still poorly understood[1-2].
We describe how by combining a newly developed specimen holder for stable animal positioning with multi-step confocal and two-photon in vivo imaging techniques, it is possible to obtain high-resolution 3D stacks containing HSPCs and their surrounding niches and to monitor them over time through multi-point time-lapse imaging. High definition imaging allows detecting ex vivo labeled hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) residing within the bone marrow. Moreover, multi-point time-lapse 3D imaging, obtained with faster acquisition settings, provides accurate information about HSPC movement and the reciprocal interactions between HSPCs and stroma cells.
Tracking of HSPCs in relation to GFP positive osteoblastic cells is shown as an exemplary application of this method. This technique can be utilized to track any appropriately labeled hematopoietic or stromal cell of interest within the mouse calvarium bone marrow space.

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

The nature of the interactions between hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) and bone marrow niches is poorly understood. Custom hardware modifications and a multi-step acquisition protocol allow the use of two-photon and confocal microscopy to image ex vivo labeled HSPCs homed within bone marrow areas, tracking interactions and movement.

成体マウス頭蓋冠骨髄中の造血幹細胞および前駆細胞のin vivo 4次元トラッキングで

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

Fecal Glucocorticoid Analysis: Non-invasive Adrenal Monitoring in Equids

Adrenal activity can be assessed in the equine species by analysis of feces for corticosterone metabolites. During a potentially aversive situation, corticotrophin releasing hormone (CRH) is released from the hypothalamus in the brain. This stimulates the release of adrenocorticotrophic hormone (ACTH) from the pituitary gland, which in turn stimulates release of glucocorticoids from the adrenal gland. In horses the glucocorticoid corticosterone is responsible for several adaptations needed to support equine flight behaviour and subsequent removal from the aversive situation. Corticosterone metabolites can be detected in the feces of horses and assessment offers a non-invasive option to evaluate long term patterns of adrenal activity. Fecal assessment offers advantages over other techniques that monitor adrenal activity including blood plasma and saliva analysis. The non-invasive nature of the method avoids sampling stress which can confound results. It also allows the opportunity for repeated sampling over time and is ideal for studies in free ranging horses. This protocol describes the enzyme linked immunoassay (EIA) used to assess feces for corticosterone, in addition to the associated biochemical validation.

Adrenal activity can be assessed in the equine species by analysis of feces for corticosterone metabolites. The method offers a non-invasive option to assess long term patterns in both domestic and free ranging horses. This protocol describes the enzyme linked immunoassay involved and the associated biochemical validation.

糞便グルココルチコイド分析：ウマにおける非侵襲性副腎モニタリング

Adrenal activity can be assessed in the equine species by analysis of feces for corticosterone metabolites. During a potentially aversive situation, ...

Detection of RNA-binding Proteins by In Vitro RNA Pull-down in Adipocyte Culture

RNA-binding proteins (RBPs) are emerging as a regulatory layer in the development and function of adipose. RBPs play a key role in the gene expression regulation at posttranscriptional levels by affecting the stability and translational efficiency of target mRNAs. RNA pull-down technique has been widely used to study RNA-protein interaction, which is necessary to elucidate the mechanism underlying RBPs&#39; as well as long non-coding RNAs&#39; (lncRNAs) function. However, the high lipid abundance in adipocytes poses a technical challenge in conducting this experiment. Here a detailed RNA pull-down protocol is optimized for primary adipocyte culture. An RNA fragment from androgen receptor&#39;s (AR) 3&#39; untranslated region (3&#39;UTR) containing an adenylate-uridylate-rich elementwas used as an example to demonstrate how to retrieve its RBP partner, HuR protein, from adipocyte lystate. The method described here can be applied to detect the interactions between RBPs and noncoding RNAs, as well as between RBPs and coding RNAs.

Detection of RNA-binding Proteins by In Vitro RNA Pull-down in Adipocyte Culture

An RNA pull-down protocol is optimized here for detection of interactions between RNA-binding proteins (RBPs) and noncoding as well as coding RNAs. An RNA fragment from androgen receptor (AR) was used as an example to demonstrate how to retrieve its RBP from lystate of primary brown adipocytes.

RNA結合タンパク質の検出によって、<em&gt;インビトロ</em脂肪細胞培養における&gt; RNAプルダウン

RNA-binding proteins (RBPs) are emerging as a regulatory layer in the development and function of adipose. RBPs play a key role in the gene expression ...

A Rapid, Scalable Method for the Isolation, Functional Study, and Analysis of Cell-derived Extracellular Matrix

The extracellular matrix (ECM) is recognized as a diverse, dynamic, and complex environment that is involved in multiple cell-physiological and pathological processes. However, the isolation of ECM, from tissues or cell culture, is complicated by the insoluble and cross-linked nature of the assembled ECM and by the potential contamination of ECM extracts with cell surface and intracellular proteins. Here, we describe a method for use with cultured cells that is rapid and reliably removes cells to isolate a cell-derived ECM for downstream experimentation.
Through use of this method, the isolated ECM and its components can be visualized by in situ immunofluorescence microscopy. The dynamics of specific ECM proteins can be tracked by tracing the deposition of a tagged protein using fluorescence microscopy, both before and after the removal of cells. Alternatively, the isolated ECM can be extracted for biochemical analysis, such as sodium dodecyl sulphate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) and immunoblotting. At larger scales, a full proteomics analysis of the isolated ECM by mass spectrometry can be conducted. By conducting ECM isolation under sterile conditions, sterile ECM layers can be obtained for functional or phenotypic studies with any cell of interest. The method can be applied to any adherent cell type, is relatively easy to perform, and can be linked to a wide repertoire of experimental designs.

The extracellular matrix plays a major role in defining the microenvironment of cells and in modulating cell behavior and phenotype. We describe a rapid method for the isolation of cell-derived extracellular matrix, which can be adapted to different scales for microscopic, biochemical, proteomic, or functional studies.

Methods Article

ザイモグラフィーによる機能マトリックスメタロプロテイナーゼの検出