Los autores desean agradecer ADIR (Aide à domicile aux Insuffisants respiratoires) y Fondation de l&#39;Avenir, por su apoyo financiero y el Dr. Fanie Barnabé-Heider para la edición del manuscrito.

1. Los cultivos primarios de la mucosa olfativa y olfativa Bulbos <ol><li> Antes de la disección <ol><li> Hacer medio, para 50 ml, mediante la adición de 44 ml de libre de calcio de Eagle modificado por Dulbecco / medio de Ham F12 (DMEM/F12), suplementado con 5 ml de suero fetal bovino (FBS) y 1 ml de penicilina / estreptomicina. </li><li> Escudo 75 cm 2 frascos con poli-L-lisina (50 g / ml, 1,5 mg / cm 2), 1 hora a temperatura ambiente. </li><li> Enjuague frascos con PBS 1x. </li><li> Guarde los frascos revestidos en el refrigerador hasta por 1 semana. </li></ol></li><li> Disección <ol><li> Cualquier método de eutanasia debe ser aprobado previamente por el cuidado de los animales y el uso comité de la institución y llevado a cabo por personal cualificado. </li><li> Elija puras ratas como ratas Fischer. </li><li> Después de la rata se ha confirmado que han entrado en anestesia profunda con pentobarbital de sodio o de otras formas inyectables de anestesia, tales como ketamina / xilazina, él y R decapitarquítelo de la piel. </li><li> Abra el cráneo desde la parte anterior a la parte posterior. </li><li> Retire la toma OB cuidado para evitar las meninges. </li><li> En la misma rata, abra la sagittaly cavidad nasal. </li><li> Eliminar la OM teniendo cuidado de evitar la mucosa respiratoria. Tenga en cuenta que el epitelio OM se puede identificar fácilmente por su color amarillento. </li><li> Protocolos más detallados sobre la disección de OM se pueden encontrar en una anterior <a href="https://www.jove.com/video/2762/isolating-nasal-olfactory-stem-cells-from-rodents-or-humans">J. Vis. Exp</a> . publicación 13. </li></ol></li><li> Cultura <ol><li> Coloque OB en solución de Hank tamponada de sal (HBSS) que contiene 0,1% de tripsina durante 45 min a 37 ° C. </li><li> Coloque OM en HBSS que contiene 0,05% de colagenasa A durante 45 min a 37 ° C. </li><li> Detener la digestión enzimática mediante la adición de 2 ml de medio caliente. </li><li> Lavar las células con medio y centrifúguelas a 300 xg durante 3 min. </li><li> Se tritura muestras de 2ml de medio con una pipeta P1000 hasta que se obtuvo una suspensión celular homogénea. </li><li> Placa de las células en los frascos previamente recubiertos (5-10 x 10 6 células / frasco) con 25 ml de medio caliente. </li><li> Incubar y cultivar las células a 37 ° C con 5% de CO 2. </li><li> Cambiar la mitad del medio cada 2 días. </li><li> Después de 6-8 días in vitro, comprobar la proporción de células p75 positivas en muestras de células pequeñas, se supone que es la OECO en roedores, por citometría de flujo o por inmunocitoquímica. Para estos análisis, otros marcadores se pueden estudiar tales como GFAP y S100β. </li></ol></li><li> El análisis de citometría de flujo <ol><li> Recoger las células como se describe en &quot;El trasplante celular&quot; (sección 2.2). </li><li> Incubar con p75 anticuerpo primario (1:100) durante 15 min a 4 ° C. </li><li> Lavar las células con 2 ml de PBS-EDTA y centrifúguelas a 300 xg durante 3 min. </li><li> Se incuban las células con PE anti-ratón anticuerpo secundario conjugado durante 15min a 4 ° C en la oscuridad (1:200). </li><li> Lavar las células con 2 ml de PBS-EDTA y centrifúguelas a 300 xg durante 3 min. </li><li> Resuspender las células en 500 l de PBS-EDTA. </li><li> Analizar 10-30 x 10 3 células con citómetro de flujo. </li></ol></li><li> Análisis de inmunocitoquímica <ol><li> Placa de las células en placas de 6 pocillos recubiertos previamente durante 48 horas como se describe en la &quot;cultura&quot; (apartado 1.1.2). </li><li> Lavar las células con PBS. </li><li> Fijar las células con PFA al 4% durante 15 min a TA. </li><li> Lavar las células con PBS. </li><li> Se incuban las células con PBS / Triton X100 (0.1%) durante 15 min a TA. </li><li> Lavar las células con PBS. </li><li> Se incuban las células con anticuerpos primarios (1:200): p75, S100β y GFAP durante la noche a 4 ° C. </li><li> Lavar las células con PBS. </li><li> Se incuban las células con los anticuerpos secundarios (1:500) durante 1 hora a temperatura ambiente en la oscuridad. </li><li> Lavar las células con PBS. </li><li> Se incuban las células con Hoechst 10 min a RT en la oscuridad. </li><li> Lavar las células con PBS. </li><li> Analizar las células usando un microscopio de fluorescencia. </li></ol></li><li> Células de etiquetado GFP <ol><li> Cinco días antes del trasplante, infectar cultivos de obstetricia y OM durante la noche con vector lentiviral albergar GFP mejorado (multiplicidad de infección: 20). </li><li> Ante la comprobación del trasplante en muestras pequeñas, la tasa de células GFP positivas por citometría de flujo como se describe anteriormente en la &quot;cultura&quot; (sección 1.1). </li></ol></li></ol> 2. Cirugía y Trasplante <ol><li> Anastomosis del nervio recurrente <ol><li> Todos los experimentos con animales deben ser aprobados previamente por el cuidado de los animales y el uso comité de la institución y llevados a cabo por personal cualificado. </li><li> Antes de la cirugía autoclave todos los instrumentos y mantener la esterilidad durante los procedimientos quirúrgicos. </li><li> Anestesie rata mediante inyección intraperitoneal de clorhidrato de ketamina (12,5 mg / kg) y clorhidrato de clorpromazina (0,625 mg / kg). Evaluar la adecuación de la anestesia por el pellizco del dedo del pie antes de la cirugía. </li><li> Coloque la rata en decúbito dorsal. </li><li> Realizar una incisión media vertical de 2 cm de cuello uterino cutánea con un escalpelo. </li><li> Realice una incisión vertical de los músculos infrahioideos siguiendo la línea blanca medial. </li><li> La exposicion laringe utilizando retractor autoestática entre los músculos infrahioideos. </li><li> Exponer la NLR. </li><li> Bajo control microscópico, cortar el nervio plenamente con micro tijeras a nivel del séptimo anillo traqueal. </li><li> Realice anastomosis utilizando un punto de sutura 11.0 bajo control microscópico. Esta cirugía produce una denervación motora específica de la laringe. </li></ol></li><li> Trasplante celular <ol><li> Justo antes del trasplante, eliminar las células de los platos usando 0,05% de EDTA tripsina durante 5 min a 37 ° C. </li><li> Detener la digestión enzimática mediante la adición de 2 ml de medio caliente. </li><li> Centrifugar a 300 xg durante 3 min. </li><li&gt; Bajo un microscopio contar las células usando un hemocitómetro y ajustar la concentración celular de acuerdo a protocolo específico. En este modelo, las concentraciones deseadas fueron entre 1,2 a 6 x 10 6 células en 30 l de DMEM/F12. </li><li> Haga de la preparación celular con 1:02 de mezcla (30 y 60 l en este experimento) de DMEM/F12-Matrige l en un tubo de 1,5 ml antes del injerto y colóquelo sobre hielo. Para evitar los efectos no específicos, utilice el factor de crecimiento reducido Matrigel. </li><li> Justo antes del trasplante mantener el tubo en la mano durante unos segundos para calentar la mezcla de Matrigel mediano. </li><li> Deponer a la mezcla en el lugar de la anastomosis con una pipeta y espere hasta que la mezcla se auto-ensambla en el nervio lesionado. </li><li> Cierre los músculos y la piel con una sutura 4.0. </li><li> Casa de las ratas individualmente y mantener bajo una lámpara de calor durante 24 horas. </li></ol></li></ol> 3. Evaluación <ol><li> La laringoscopia <ol><li> Anestesie ratas por intraperitinyección oneal de clorhidrato de ketamina (12,5 mg / kg) y clorhidrato de clorpromazina (0,625 mg / kg). Confirmar ratas se anestesian con una pizca dedo del pie antes de proceder con el protocolo. </li><li> Coloque la rata en decúbito dorsal. </li><li> Inserte un 30 ° videolaryngoscope ajustadas para proporcionar la mejor vista de la laringe. Determinar puntos de referencia anatómicos para reproducir el mismo punto de vista para cada grabación. </li><li> Registre los movimientos de las cuerdas vocales con el videolaryngoscope (5-10 secuencias / animal). Para cada animal seleccionar tres secuencias sucesivas de aducción y abducción máxima máxima. </li><li> Analizar la función laríngea el uso de software de análisis de imágenes. Determinar movimiento angular absoluta mediante la medición de la diferencia entre el movimiento de abducción y aducción máxima máxima de las cuerdas vocales. Determine la puntuación dinámico midiendo la amplitud de movimiento. Determine la puntuación funcional midiendo la synkinesis y movimientos paradójicos. </li></ol></li><li> La electromiografía (EMG) <ol><li&gt; Coloque un electrodo en los músculos isquiotibiales de la rata para el aislamiento eléctrico. </li><li> La exposicion laringe y tráquea mediante la apertura de la piel y los músculos, como se describe anteriormente en &quot;anastomosis del nervio recurrente&quot; (sección 2.1). </li><li> Exponer el cartílago cricotiroidea. </li><li> Abra el cartílago cricotiroidea para exponer la cricoaritenoide posterior (ACP) músculo con micro tijeras. </li><li> Introducir un electrodo de aguja monopolar (38 x 0,45 mm) en el músculo PCA. </li><li> Registrar la actividad eléctrica muscular del músculo PCA utilizando un sistema de adquisición durante la ventilación espontánea. </li><li> Analizar la actividad muscular en términos de riqueza y la sincronización con la respiración. Analizar EMG, asignar una puntuación cualitativa 0-3 utilizando la siguiente escala: 0: el rastreo sin rima, sin aumento durante la inspiración, 1: rimada trazando con inspiración en aumento, pero pobre rastreo (Neurogen), 2: rimada trazando con la actividad más rico, 3: rimada localización, muy rica, lo que constituye un ipatrón nterferenc, similar a una actividad intencional máxima. </li><li> Exponer el nervio vago para medir la duración de latencia y potencial. El nervio vago es elegido como el sitio de estimulación del NLR porque puede dañarse durante la estimulación debido a su pequeño tamaño. </li><li> Estimular el nervio vago con un electrodo. </li><li> Registre las señales eléctricas en el músculo PCA. Medir la latencia y la duración del potencial. Si es posible utilizar un módulo de adquisición para registrar la actividad muscular, la latencia y la duración del potencial como sistema Powerlab. </li></ol></li><li> Histología <ol><li> La eutanasia a los animales usando sobredosis de pentobarbital. </li><li> Retire el muñón distal del NLR bajo control microscópico. La parte distal del NLR se define como la parte entre la anastomosis y la laringe. Tenga en cuenta que es posible encontrar el sitio de la anastomosis varias semanas después de la cirugía debido a que el 11,0 sutura es una sutura absorbible. </li><li> Coloque la porción distal del NLR en 2% de glutaraldehído con 0,1 M de fosfato(PH = 7,3) durante 2 horas a 4 ° C. </li><li> Orientar cuidadosamente las muestras para realizar cortes coronales. </li><li> Lavar las muestras en tampón de fosfato. </li><li> Cortar en segmentos más pequeños (3-4 mm de longitud) y posfijo durante 60 min a temperatura ambiente en 1% de cacodilato tamponadas OsO4 y deshidratados con etanol. </li><li> Muestras Orient en moldes de silicona y embebido en resinas que consisten en Polybed 812, DDSA y MNA, al que se añadió 2% de acelerador de la BDMA. </li><li> Hacer cortes transversales semi-delgadas (-1μm de espesor) utilizando un Sistema Ultramicrotomía Pyramitome. </li><li> Teñir con 0,1% de azul de toluidina en tetraborato de sodio al 1% durante 75 segundos a 70 ° C. </li><li> Analizar las muestras del NLR con un sistema de análisis de conteo. Contar el número de fibras y medir perfiles de fibras nerviosas mielinizadas mediante la determinación del límite exterior e interior de la vaina de mielina. </li></ol></li><li> Trasplante <ol><li> Preparar las células para el trasplante y trasplantar las células descritas anteriormenteen &quot;el trasplante celular&quot; (sección 2.2). </li><li> Análisis </li><li> La eutanasia a los animales usando sobredosis de pentobarbital. Tenga en cuenta que la fijación de los animales se puede realizar utilizando la inyección intracardíaca de PFA 4%. </li><li> Retire alrededor de 2 cm de NLR. Utilice partes proximales y distales del NLR. </li><li> Fijar la muestra del NLR en nitrógeno líquido. </li><li> Almacene las muestras a -80 ° C. </li><li> Las muestras cortadas longitudinalmente mediante criostato (10-20 m de espesor). </li><li> Analizar las muestras bajo el microscopio fluorescente para detectar células GFP positivas. Tenga en cuenta que el anticuerpo anti-GFP se puede utilizar para aumentar la emisión de fluorescencia y para llevar a cabo costainings. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Barraud, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+crest+origin+of+olfactory+ensheathing+glia.">Neural crest origin of olfactory ensheathing glia.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 21040-21045 (2010).</li><li>Guerout, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+gene+expression+profiling+of+olfactory+ensheathing+cells+from+olfactory+bulb+and+olfactory+mucosa.">Comparative gene expression profiling of olfactory ensheathing cells from olfactory bulb and olfactory mucosa.</a> Glia. 58, 1570-1580 (1002).</li><li>Honore, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation,+characterization,+and+genetic+profiling+of+subpopulations+of+olfactory+ensheathing+cells+from+the+olfactory+bulb.">Isolation, characterization, and genetic profiling of subpopulations of olfactory ensheathing cells from the olfactory bulb.</a> Glia. 60, 404-413 (2012).</li><li>Franssen, E. H., de Bree, F. M., Verhaagen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Olfactory+ensheathing+glia:+their+contribution+to+primary+olfactory+nervous+system+regeneration+and+their+regenerative+potential+following+transplantation+into+the+injured+spinal+cord.">Olfactory ensheathing glia: their contribution to primary olfactory nervous system regeneration and their regenerative potential following transplantation into the injured spinal cord.</a> Brain Res. Rev. 56, 236-258 (2007).</li><li>Lakatos, A., Franklin, R. J., Barnett, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Olfactory+ensheathing+cells+and+Schwann+cells+differ+in+their+in+vitro+interactions+with+astrocytes.">Olfactory ensheathing cells and Schwann cells differ in their in vitro interactions with astrocytes.</a> Glia. 32, 214-225 (2000).</li><li>Woodhall, E., West, A. K., Chuah, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cultured+olfactory+ensheathing+cells+express+nerve+growth+factor,+brain-derived+neurotrophic+factor,+glia+cell+line-derived+neurotrophic+factor+and+their+receptors.">Cultured olfactory ensheathing cells express nerve growth factor, brain-derived neurotrophic factor, glia cell line-derived neurotrophic factor and their receptors.</a> Brain Res. Mol. Brain Res. 88, 203-213 (2001).</li><li>Dombrowski, M. A., Sasaki, M., Lankford, K. L., Kocsis, J. D., Radtke, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myelination+and+nodal+formation+of+regenerated+peripheral+nerve+fibers+following+transplantation+of+acutely+prepared+olfactory+ensheathing+cells.">Myelination and nodal formation of regenerated peripheral nerve fibers following transplantation of acutely prepared olfactory ensheathing cells.</a> Brain Res. 1125, 1-8 (2006).</li><li>Guerout, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transplantation+of+olfactory+ensheathing+cells+promotes+axonal+regeneration+and+functional+recovery+of+peripheral+nerve+lesion+in+rats.">Transplantation of olfactory ensheathing cells promotes axonal regeneration and functional recovery of peripheral nerve lesion in rats.</a> Muscle Nerve. 43, 543-551 (2011).</li><li>Guntinas-Lichius, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transplantation+of+olfactory+ensheathing+cells+stimulates+the+collateral+sprouting+from+axotomized+adult+rat+facial+motoneurons.">Transplantation of olfactory ensheathing cells stimulates the collateral sprouting from axotomized adult rat facial motoneurons.</a> Exp. Neurol. 172, 70-80 (2001).</li><li>Makoukji, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lithium+enhances+remyelination+of+peripheral+nerves.">Lithium enhances remyelination of peripheral nerves.</a> Proc. Natl. Acad. Sci U.S.A. 109, 3973-3978 (2012).</li><li>Guerout, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Co-transplantation+of+olfactory+ensheathing+cells+from+mucosa+and+bulb+origin+enhances+functional+recovery+after+peripheral+nerve+lesion.">Co-transplantation of olfactory ensheathing cells from mucosa and bulb origin enhances functional recovery after peripheral nerve lesion.</a> PloS one. 6, 22816 (2011).</li><li>Paviot, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficiency+of+laryngeal+motor+nerve+repair+is+greater+with+bulbar+than+with+mucosal+olfactory+ensheathing+cells.">Efficiency of laryngeal motor nerve repair is greater with bulbar than with mucosal olfactory ensheathing cells.</a> Neurobiol. Dis. 41, 688-694 (2011).</li><li>Girard, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolating+nasal+olfactory+stem+cells+from+rodents+or+humans.">Isolating nasal olfactory stem cells from rodents or humans.</a> J. Vis. Exp. , (2011).</li><li>Nash, H. H., Borke, R. C., Anders, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+method+of+purification+for+establishing+primary+cultures+of+ensheathing+cells+from+the+adult+olfactory+bulb.">New method of purification for establishing primary cultures of ensheathing cells from the adult olfactory bulb.</a> Glia. 34, 81-87 (2001).</li><li>Bianco, J. I., Perry, C., Harkin, D. G., Mackay-Sim, A., Feron, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurotrophin+3+promotes+purification+and+proliferation+of+olfactory+ensheathing+cells+from+human+nose.">Neurotrophin 3 promotes purification and proliferation of olfactory ensheathing cells from human nose.</a> Glia. 45, 111-123 (2004).</li><li>Paviot, A., Bon-Mardion, N., Duclos, C., Marie, J. P., Guerout, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Although+olfactory+ensheathing+cells+have+remarkable+potential+to+sustain+nerve+regeneration,+they+cannot+be+applied+to+a+severe+vagus+nerve+section/resection+model.">Although olfactory ensheathing cells have remarkable potential to sustain nerve regeneration, they cannot be applied to a severe vagus nerve section/resection model.</a> Muscle Nerve. 43, 919-920 (2011).</li></ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Las técnicas presentadas aquí hacen OECs un modelo útil para estudiar los trasplantes celulares en modelos de lesión del nervio periférico. El protocolo de cultivo de células es relativamente sencillo y se puede llevar a cabo fácilmente. Por otro lado, los procedimientos quirúrgicos, en particular la sección / anastomosis del NLR, requieren experiencia y deben ser realizadas por personal cualificado. Los procedimientos descritos en este protocolo destacan factores importantes para c...

El sistema olfativo principal se compone de dos partes distintas; la mucosa olfativa (OM) en el sistema nervioso periférico y el bulbo olfatorio (OB) en el sistema nervioso central. El sistema olfativo principal se caracteriza por la capacidad de las neuronas olfativas primarios (PON) de auto-renovación durante toda la vida en las especies de mamíferos. Esta capacidad se hace posible debido a la presencia de células madre neurales en la OM. PON crecimiento y la regeneración de la OM de OB se ve facilitada por las células gliales especializadas llamadas células olfativas ensheathing (OECO). OECs son las células de la cresta neural, que crean un microambiente favorable para la neurogénesis del PON de OM a OB 1. De este modo, OECs se puede encontrar en OM y en el OB constituyendo diferentes subpoblaciones de células 2,3. Las diferentes propiedades de la OECO han principales científicos de utilizarlos para trasplantes celulares en varios paradigmas de lesiones del sistema nervioso 4. De hecho, los factores de crecimiento de productos OECs, reducen la cicatrización glial, prregeneración axonal Omote, y puede mezclarse libremente con astrocitos 5,6. Sin embargo, la gran mayoría de estos estudios se basan en la lesión de la médula espinal (SCI); pocos de ellos han utilizado OECs después de la lesión del nervio periférico (PNI) 7,8. Aunque el sistema nervioso periférico tiene una gran capacidad de regenerarse después de una lesión nerviosa, secciones completas inducir la regeneración axonal aberrante. De hecho, después de transección completa de la cara o de los nervios laríngeos recurrentes (NLR) de los axones mal enrutadas causan cocontractions musculares llamados synkinesis. Por lo tanto, es de importancia primaria a proponer un modelo de PNI no sólo para cuantificar la regeneración axonal, pero también para evaluar la eficacia de las contracciones musculares. En la literatura el modelo más común descrito se basa en 9,10 lesión del nervio facial. En este modelo, las evaluaciones funcionales se basan en la recuperación de los movimientos de la barba 10. Sin embargo, es complicado de demostrar la eficiencia de la movmentos y discriminar los cocontractions fenómenos musculares. Proponemos aquí un modelo basado en una lesión del NLR. Este modelo permite la evaluación no sólo de regeneración axonal y los movimientos de las cuerdas vocales, sino también la eficiencia y la funcionalidad de estos movimientos después de los trasplantes celulares 11,12. Este protocolo proporciona un procedimiento paso a paso a la cultura y el trasplante OECs de OM y OB en un modelo de la sección del NLR / anastomosis y evaluar los animales después de la cirugía.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="591">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:240px;">DMEM/F12</td>
			<td style="width:155px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:197px;">E3521T</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FBS</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>E3387M</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Penicilin/streptomycin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>1152-8876</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HBSS</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>M3467Y</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Trypsin-EDTA</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>M3513P</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cacodylate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.03256.0100</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DDSA</td>
			<td>BIOVALLEY</td>
			<td>00563-450</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MNA</td>
			<td>BIOVALLEY</td>
			<td>00886-450</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BDMA</td>
			<td>BIOVALLEY</td>
			<td>00141-100</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">POLYBED 812</td>
			<td>BIOVALLEY</td>
			<td>08791-500</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PE anti-mouse&#160;</td>
			<td>BD Bioscience&#160;</td>
			<td>550589</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Matrigel GFR</td>
			<td>BD Bioscience&#160;</td>
			<td>356231</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Collagenase A</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10103586001</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mouse anti P75</td>
			<td>Chemicon</td>
			<td>MAB 365</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">11.0 Wire</td>
			<td>Ethicon&#160;</td>
			<td>FG 2881</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Toluidine Blue&#160;</td>
			<td>RAL DIAGNOSTICS</td>
			<td>361590-0025</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Centrifuge</td>
			<td>Sigma&#160;</td>
			<td>Sigma 2-16PK</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Incubator&#160;</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Laminar flow hood</td>
			<td>Faster</td>
			<td style="width:197px;">BH-EN 2003 S</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Flow cytometer</td>
			<td>BD Bioscience&#160;</td>
			<td>FACSCalibur</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Videolaryngoscope</td>
			<td>Karl Storz Endoskope</td>
			<td>Telecam SL NLSC 20212120</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Acquisition system</td>
			<td>ADInstruments</td>
			<td>Powerlab system</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Pyramitome Ultramicrotomy System&#160;</td>
			<td style="width:155px;">Leica</td>
			<td>Ultracut S</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Image analysis system</td>
			<td>Explora Nova</td>
			<td>Mercator</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

transplantation of olfactory ensheathing cells to evaluate functional recovery after peripheral nerve injury

<html> Células olfativas ensheathing (OECO) son las células de la cresta neural, que permiten el crecimiento y la regeneración de las neuronas olfatorias primarias. De hecho, el sistema olfativo principal se caracteriza por su capacidad para dar lugar a nuevas neuronas, incluso en los animales adultos. Esta habilidad particular, se debe en parte a la presencia de la OECO que crean un microambiente favorable para la neurogénesis. Esta propiedad de OECs se ha utilizado para el trasplante celular, tales como en modelos de lesión de la médula espinal. Aunque el sistema nervioso periférico tiene una mayor capacidad de regenerarse después de una lesión del nervio que el sistema nervioso central, secciones completas inducir encaminamiento erróneo durante el rebrote axonal en particular, después de la cara de la transección del nervio laríngeo. Específicamente, llena la sección del nervio laríngeo recurrente (NLR) induce el rebrote axonal aberrante que resulta en synkinesis de las cuerdas vocales. En este modelo específico, se demostró que el trasplante OECs aumenta eficazmente el recrecimiento axonal. ve_content &quot;&gt; OECs están constituidos de varias subpoblaciones presentes tanto en la mucosa olfativa (OM-OECO) y los bulbos olfativos (Ob-OECO). Presentamos aquí un modelo de trasplante celular basado en el uso de estas diferentes subpoblaciones de OECs en un modelo de lesión del NLR. Utilizando este paradigma, los cultivos primarios de OB-OECs y OM-OECs se trasplantaron en matrigel después de la sección y anastomosis del NLR. Dos meses después de la cirugía, se evaluaron animales trasplantados por análisis complementarios sobre la base de videolarin-goscopia, la electromiografía (EMG) , y los estudios histológicos. Primero, videolarin-goscopia nos permitió evaluar las funciones de la laringe, en particular cocontractions musculares fenómenos. Entonces, EMG analiza riqueza demostrada y sincronización de las actividades musculares. Finalmente, los estudios histológicos basado en azul de toluidina tinción permite la cuantificación del número y perfil de fibras mielinizadas. Todos juntos, como se describe aquí cómo aislar, cultura, identify y trasplante OECs de OM y OB después NLR sección anastomosis y la forma de evaluar y analizar la eficacia de estas células trasplantadas en las funciones de rebrote y laríngeos axonal.

Ilustraciones con el control y la reinervado (sección / anastomosados) los animales han sido elegidos como los resultados pueden variar dependiendo de los trasplantes celulares realizados (OM, OB o OM + OB). Cultivo celular Las células se adhieren rápidamente a la superficie de plástico y se convirtieron en segregado en franjas paralelas de células que son o que se estrecha alargada, triangular, multipolar, o en forma de huso (Figuras 1A y 1B).</st...

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Transplantation of Olfactory Ensheathing Cells to Evaluate Functional Recovery after Peripheral Nerve Injury

Células olfativas ensheathing (OECO) son las células de la cresta neural, que permiten el crecimiento de las neuronas olfatorias primarias. Esta propiedad específica se puede utilizar para el trasplante celular. Se presenta aquí un modelo de trasplante celular basado en el uso de OECs en un modelo de lesión del nervio laríngeo.

El trasplante de células ensheathing olfativo para evaluar la recuperación funcional después de la lesión del nervio periférico

Olfactory ensheathing cells (OECs) are neural crest cells which allow growth and regrowth of the primary olfactory neurons. Indeed, the primary olfactory ...

transplantation-olfactory-ensheathing-cells-to-evaluate-functional

Research

JoVE Journal

Neuroscience

11.7K vistas.  University of Rouen.  Células olfativas ensheathing (OECO) son las células de la cresta neural, que permiten el crecimiento de las neuronas olfatorias primarias. Esta propiedad específica se puede utilizar para el trasplante celular. Se presenta aquí un modelo de trasplante celular basado en el uso de OECs en un modelo de lesión del nervio laríngeo. 

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Dorsal Root Ganglia Neurons and Differentiated Adipose-derived Stem Cells: An In Vitro Co-culture Model to Study Peripheral Nerve Regeneration

Dorsal root ganglia (DRG) neurons, located in the intervertebral foramina of the spinal column, can be used to create an in vitro system facilitating the study of nerve regeneration and myelination. The glial cells of the peripheral nervous system, Schwann cells (SC), are key facilitators of these processes; it is therefore crucial that the interactions of these cellular components are studied together. Direct contact between DRG neurons and glial cells provides additional stimuli sensed by specific membrane receptors, further improving the neuronal response. SC release growth factors and proteins in the culture medium, which enhance neuron survival and stimulate neurite sprouting and extension. However, SC require long proliferation time to be used for tissue engineering applications and the sacrifice of an healthy nerve for their sourcing. Adipose-derived stem cells (ASC) differentiated into SC phenotype are a valid alternative to SC for the set-up of a co-culture model with DRG neurons to study nerve regeneration. The present work presents a detailed and reproducible step-by-step protocol to harvest both DRG neurons and ASC from adult rats; to differentiate ASC towards a SC phenotype; and combines the two cell types in a direct co-culture system to investigate the interplay between neurons and SC in the peripheral nervous system. This tool has great potential in the optimization of tissue-engineered constructs for peripheral nerve repair.

Dorsal Root Ganglia Neurons and Differentiated Adipose-derived Stem Cells: An In Vitro Co-culture Model to Study Peripheral Nerve Regeneration

Dorsal root ganglia (DRG) are structures containing the sensory neurons of the peripheral nervous system. When dissociated, they can be co-cultured with SC-like adipose-derived stem cells (ASC), providing a valuable model to study in vitro nerve regeneration and myelination, mimicking the in vivo environment at the injury site.

Ganglios de raíz dorsal neuronas y las células madre derivadas de la adiposa diferenciada: Un<em&gt; In Vitro</em&gt; Co-cultivo modelo para estudiar la regeneración de los nervios periféricos

Dorsal root ganglia (DRG) neurons, located in the intervertebral foramina of the spinal column, can be used to create an in vitro system facilitating the ...

Investigación

Neurociencias

Functional Evaluation of Olfactory Pathways in Living Xenopus Tadpoles

Xenopus tadpoles offer a unique platform to investigate the function of the nervous system. They provide multiple experimental advantages, such as accessibility to numerous imaging approaches, electrophysiological techniques and behavioral assays. The Xenopus tadpole olfactory system is particularly well suited to investigate the function of synapses established during normal development or reformed after injury. Here, we describe methodologies to evaluate the processing of olfactory information in living Xenopus larvae. We outline a combination of in vivo measurements of presynaptic calcium responses in glomeruli of the olfactory bulb with olfactory-guided behavior assays. Methods can be combined with the transection of olfactory nerves to study the rewiring of synaptic connectivity. Experiments are presented using both wild-type and genetically modified animals expressing GFP reporters in central nervous system cells. Application of the approaches described to genetically modified tadpoles can be useful for unraveling the molecular bases that define vertebrate behavior.

Functional Evaluation of Olfactory Pathways in Living Xenopus Tadpoles

Xenopus tadpoles offer a unique platform to investigate the function of the nervous system in vivo. We describe methodologies to evaluate the processing of olfactory information in living Xenopus larvae in normal rearing conditions or after injury.

Evaluación funcional de las vías olfatorias en los renacuajos de Xenopus de vida

Xenopus tadpoles offer a unique platform to investigate the function of the nervous system. They provide multiple experimental advantages, such as ...

A Preclinical Model to Assess Brain Recovery After Acute Stroke in Rats

The purpose of this study was to establish and validate an animal brain ischemia model in the recovery and sequela stages. A middle cerebral artery occlusion/reperfusion (MCAO/R) model in male Sprague-Dawley rats was chosen. By changing the rat&#39;s weight (260&#8722;330 g), the thread bolt type (2636/2838/3040/3043) and the brain infarct time (2-3 h), a higher Longa&#39;s score, a larger infarct volume and a greater model success ratio were screened using the Longa&#39;s score and TTC staining. The optimum model condition (300 g, 3040 thread bolt, 3 h brain infarct time) was acquired and used in a 1-90 day observation period after reperfusion via assessment of sensorimotor functions and infarct volume. At these conditions, the bilateral asymmetry test had a significant difference from 1 to 90 days, and the grid-walking test had a significant difference from 1 to 60 days; both differences could be a suitable sensorimotor functional test. Thus, the most appropriate condition of a novel rat model in the recovery and sequela stages of brain ischemia was found: 300 g rats that underwent MCAO with a 3040 thread bolt for a 3 h brain infarct and then reperfused. The appropriate sensorimotor functional tests were a bilateral asymmetry test and a grid-walking test.

The&#160;purpose of this study is to establish and validate an animal model for research in the recovery and sequela stages of brain ischemia by testing brain infarction and sensorimotor function after middle cerebral artery occlusion/reperfusion (MCAO/R) after 1-90 days in rats.

Un modelo preclínico para evaluar la recuperación cerebral después de un accidente cerebrovascular agudo en ratas

The purpose of this study was to establish and validate an animal brain ischemia model in the recovery and sequela stages. A middle cerebral artery ...

3D Kinematic Analysis for the Functional Evaluation in the Rat Model of Sciatic Nerve Crush Injury

Compared to the Sciatic Functional Index (SFI), kinematic analysis is a more reliable and sensitive method for performing functional evaluations of sciatic nerve injury rodent models. In this protocol, we describe a novel kinematic analysis method that uses a three-dimensional (3D) motion capture apparatus for functional evaluations using a rat sciatic nerve crush injury model. First, the rat is familiarized with treadmill walking. Markers are then attached to the designated bone landmarks and the rat is made to walk on the treadmill at the desired speed. Meanwhile, the posterior limb movements of the rat are recorded using four cameras. Depending on the software used, marker tracings are created using both automatic and manual modes and the desired data are produced after subtle adjustments. This method of kinematic analysis, which uses a 3D motion capture apparatus, offers numerous advantages, including superior precision and accuracy. Many more parameters can be investigated during the comprehensive functional evaluations. This method has several shortcomings that require consideration: The system is expensive, can be complicated to operate, and may produce data deviations due to skin shifting. Nevertheless, kinematic analysis using a 3D motion capture apparatus is useful for performing functional anterior and posterior limb evaluations. In the future, this method may become increasingly useful for generating accurate assessments of various traumas and diseases.

We introduce a kinematic analysis method that uses a three-dimensional motion capture apparatus containing four cameras and data processing software for performing functional evaluations during fundamental research involving rodent models.

Análisis cinemático 3D para la evaluación funcional en el modelo de rata de lesión de aplastamiento de nervios ciáticos

Compared to the Sciatic Functional Index (SFI), kinematic analysis is a more reliable and sensitive method for performing functional evaluations of ...

Purification of Fibroblasts and Schwann Cells from Sensory and Motor Nerves in Vitro

The principal cells in the peripheral nervous system are the Schwann cells (SCs) and the fibroblasts. Both these cells distinctly express the sensory and motor phenotypes involved in different patterns of neurotrophic factor gene expression and other biological processes, affecting nerve regeneration. The present study has established a protocol to obtain highly purified rat sensory and motor SCs and fibroblasts more rapidly. The ventral root (motor nerve) and the dorsal root (sensory nerve) of neonatal rats (7-days-old) were dissociated and the cells were cultured for 4-5 days, followed by isolation of sensory and motor fibroblasts and SCs by combining differential digestion and differential adherence methods sequentially. The results of immunocytochemistry and flow cytometry analyses showed that the purity of the sensory and motor SCs and fibroblasts were &#62;90%. This protocol can be used to obtain a large number of sensory and motor fibroblasts/SCs more rapidly, contributing to the exploration of sensory and motor nerve regeneration.

Here, we present a method to purify fibroblasts and Schwann cells from sensory and motor nerves in vitro.

Purificación de fibroblastos y células Schwann de los nervios sensoriales y motores en Vitro

The principal cells in the peripheral nervous system are the Schwann cells (SCs) and the fibroblasts. Both these cells distinctly express the sensory and ...

Intra-Arterial Delivery of Neural Stem Cells to the Rat and Mouse Brain: Application to Cerebral Ischemia

Neural stem cell (NSC) therapy is an emerging innovative treatment for stroke, traumatic brain injury and neurodegenerative disorders. As compared to intracranial delivery, intra-arterial administration of NSCs is less invasive and produces a more diffuse distribution of NSCs within the brain parenchyma. Further, intra-arterial delivery allows the first-pass effect in the brain circulation, lessening the potential for trapping of cells in peripheral organs, such as liver and spleen, a complication associated with peripheral injections. Here, we detail the methodology, in both mice and rats, for delivery of NSCs through the common carotid artery (mouse) or external carotid artery (rat) to the ipsilateral hemisphere after an ischemic stroke. Using GFP-labeled NSCs, we illustrate the widespread distribution achieved throughout the rodent ipsilateral hemisphere at 1 d, 1 week and 4 weeks after postischemic delivery, with a higher density in or near the ischemic injury site. In addition to long-term survival, we show evidence of differentiation of GFP-labeled cells at 4 weeks. The intra-arterial delivery approach described here for NSCs can also be used for administration of therapeutic compounds, and thus has broad applicability to varied CNS injury and disease models across multiple species.

A method for delivering neural stem cells, adaptable for injecting solutions or suspensions, through the common carotid artery (mouse) or external carotid artery (rat) after ischemic stroke is reported. Injected cells are distributed broadly throughout the brain parenchyma and can be detected up to 30 d after delivery.

Entrega intra-arterial de células madre neuronales a la rata y el cerebro del ratón: aplicación a la isquemia cerebral

Neural stem cell (NSC) therapy is an emerging innovative treatment for stroke, traumatic brain injury and neurodegenerative disorders. As compared to ...

Automated Gait Analysis to Assess Functional Recovery in Rodents with Peripheral Nerve or Spinal Cord Contusion Injury

Peripheral and central nerve injuries are mostly studied in rodents, especially rats, given the fact that these animal models are both cost-effective and a lot of comparative data has been published in the literature. This includes a multitude of assessment methods to study functional recovery following nerve injury and repair. Besides evaluation of nerve regeneration by means of histology, electrophysiology, and other in vivo and in vitro assessment techniques, functional recovery is the most important criterion to determine the degree of neural regeneration. Automated gait analysis allows recording of a vast quantity of gait-related parameters such as Paw Print Area and Paw Swing Speed as well as measures of inter-limb coordination. Additionally, the method provides digital data of the rats&#8217; paws after neuronal damage and during nerve regeneration, adding to our understanding of how peripheral and central nervous injuries affect their locomotor behavior. Besides the predominantly used sciatic nerve injury model, other models of peripheral nerve injury such as the femoral nerve can be studied by means of this method. In addition to injuries of the peripheral nervous systems, lesions of the central nervous system, e.g., spinal cord contusion can be evaluated. Valid and reproducible data assessment is strongly dependent on meticulous adjustment of the hard- and software settings prior to data acquisition. Additionally, proper training of the experimental animals is of crucial importance. This work aims to illustrate the use of computerized automated gait analysis to assess functional recovery in different animal models of peripheral nerve injury as well as spinal cord contusion injury. It also emphasizes the method&#8217;s limitations, e.g., evaluation of nerve regeneration in rats with sciatic nerve neurotmesis due to limited functional recovery. Therefore, this protocol is thought to help researchers interested in peripheral and central nervous injuries to assess functional recovery in rodent models.

Automated gait analysis is a feasible tool to evaluate functional recovery in rodent models of peripheral nerve injury and spinal cord contusion injury. While it requires only one setup to assess locomotor function in various experimental models, meticulous hard- and soft-ware adjustment and training of the animals is highly important.

Análisis automatizado de gaita para evaluar la recuperación funcional en roedores con daño de contusión de nervio periférico o médula espinal

Peripheral and central nerve injuries are mostly studied in rodents, especially rats, given the fact that these animal models are both cost-effective and ...

Coculture of Axotomized Rat Retinal Ganglion Neurons with Olfactory Ensheathing Glia, as an In Vitro Model of Adult Axonal Regeneration

Olfactory ensheathing glia (OEG) cells are localized all the way from the olfactory mucosa to and into the olfactory nerve layer (ONL) of the olfactory bulb. Throughout adult life, they are key for axonal growing of newly generated olfactory neurons, from the lamina propria to the ONL. Due to their pro-regenerative properties, these cells have been used to foster axonal regeneration in spinal cord or optic nerve injury models.
We present an in vitro model to assay and measure OEG neuroregenerative capacity after neural injury. In this model, reversibly immortalized human OEG (ihOEG) is cultured as a monolayer, retinas are extracted from adult rats and retinal ganglion neurons (RGN) are cocultured onto the OEG monolayer. After 96 h, axonal and somatodendritic markers in RGNs are analyzed by immunofluorescence and the number of RGNs with axon and the mean axonal length/neuron are quantified.
This protocol has the advantage over other in vitro assays that rely on embryonic or postnatal neurons, that it evaluates OEG neuroregenerative properties in adult tissue. Also, it is not only useful for assessing the neuroregenerative potential of ihOEG but can be extended to different sources of OEG or other glial cells.

We present an in vitro model to assess olfactory ensheathing glia (OEG) neuroregenerative capacity, after neural injury. It is based on a coculture of axotomized adult retinal ganglion neurons (RGN) on OEG monolayers and subsequent study of axonal regeneration, by analyzing RGN axonal and somatodendritic markers.

Cocultura de neuronas ganglionas retinal de rata axotomizada con glia olfativa, como modelo in vitro de regeneración axonal adulta

Olfactory ensheathing glia (OEG) cells are localized all the way from the olfactory mucosa to and into the olfactory nerve layer (ONL) of the olfactory ...

Motor Dual-Tasks for Gait Analysis and Evaluation in Post-Stroke Patients

Eighteen stroke patients were recruited for this study involving the evaluation of cognition and walking ability and multitask gait analysis. Multitask gait analysis consisted of a single walking task (Task 0), a simple motor dual-task (water-holding, Task 1), and a complex motor dual-task (crossing obstacles, Task 2). The task of crossing obstacles was considered to be equivalent to the combination of a simple walking task and a complex motor task as it involved more nervous system, skeletal movement, and cognitive resources. To eliminate heterogeneity in the results of the gait analysis of the stroke patients, the dual-task gait cost values were calculated for various kinematic parameters. The major differences were observed in the proximal joint angles, especially in the angles of the trunk, pelvis, and hip joints, which were significantly larger in the dual motor tasks than in the single walking task. This research protocol aims to provide a basis for the clinical diagnosis of gait function and an in-depth study of motor control in stroke patients with motor control deficits through the analyses of dual-motor walking tasks.

This paper presents a protocol specifically for dual motor task gait analysis in stroke patients with motor control deficits.

Tareas duales motoras para el análisis y la evaluación de la marcha en pacientes con accidente cerebrovascular

Eighteen stroke patients were recruited for this study involving the evaluation of cognition and walking ability and multitask gait analysis. Multitask ...

Multifactorial Assessment of Motor Behavior in Rats after Unilateral Sciatic Nerve Crush Injury

The induction of a peripheral nerve injury is a widely used method in neuroscience for the assessment of repair and pain mechanisms among others. In addition, in the research field of movement disorders, sciatic crush injury has been employed to trigger a dystonia-like phenotype in genetically predisposed DYT-TOR1A rodent models of dystonia. To achieve consistent, reproducible and comparable results after a sciatic nerve crush injury, a standardized method for inducing the nerve crush is essential, in addition to a standardized phenotypical characterization. Attention must be paid not only to the specific assortment of behavioral tests, but also to the technical requirements, the correct execution and consecutive data analysis. This protocol describes in detail how to perform a sciatic nerve crush injury and provides a behavioral test battery for the assessment of motor deficits in rats that includes the open field test, the CatWalk XT gait analysis, the beam walking task, and the ladder rung walking task.

We provide a protocol for the assessment of motor behavior via a behavioral test battery in rats after sciatic nerve crush injury.

Evaluación Multifactorial Del Comportamiento Motor En Ratas Después De La Lesión Unilateral Por Aplastamiento Del Nervio Ciático

The induction of a peripheral nerve injury is a widely used method in neuroscience for the assessment of repair and pain mechanisms among others. In ...