Gli autori vorrebbero riconoscere ADIR (Aide à Domicile aux Insuffisants Respiratoires) e Fondation de l&#39;Avenir per il loro sostegno finanziario e al dottor Fanie Barnabé-Heider per la modifica del manoscritto.

1. Colture primarie di mucosa olfattiva e olfattiva Bulbi <ol><li> Prima di dissezione <ol><li> Fai medio, per 50 ml, con l&#39;aggiunta di 44 ml di calcio senza di Dulbecco Modified Eagle / medio di Ham F12 (DMEM/F12), supplementato con 5 ml di siero fetale bovino (FBS) e 1 ml di penicillina / streptomicina. </li><li> Coat 75 centimetri 2 palloni con poli-L-lisina (50 mcg / ml, 1,5 mg / cm 2), 1 ora a temperatura ambiente. </li><li> Risciacquare boccette con PBS 1x. </li><li> Conservare i flaconi rivestiti in frigo per un massimo di 1 settimana. </li></ol></li><li> Dissezione <ol><li> Qualsiasi metodo di eutanasia deve essere preventivamente approvato dal cura degli animali e l&#39;uso comitato dell&#39;istituto e realizzato da personale qualificato. </li><li> Scegli ratti inbred come ratti Fischer. </li><li> Dopo il ratto è stato confermato essere entrato anestesia profonda con sodio pentobarbital o altre forme iniettabili di anestesia come la chetamina / xilazina, lui e r decapitareTogliete la pelle. </li><li> Aprire il cranio dalla anteriore alla parte posteriore. </li><li> Rimuovere la presa in carico OB per evitare le meningi. </li><li> Nella stessa ratto, aprire la cavità nasale sagittale. </li><li> Rimuovere l&#39;OM avendo cura di evitare la mucosa respiratoria. Si noti che l&#39;epitelio OM può essere facilmente identificato dal suo colore giallastro. </li><li> Protocolli ulteriormente dettagliate sulla dissezione di OM si possono trovare in una precedente <a href="https://www.jove.com/video/2762/isolating-nasal-olfactory-stem-cells-from-rodents-or-humans">J. Vis. Esp</a> . pubblicazione 13. </li></ol></li><li> Cultura <ol><li> Posizionare OB in soluzione tamponata di Hank sale (HBSS) contenente 0,1% di tripsina per 45 min a 37 ° C. </li><li> Posizionare OM in HBSS contenente 0,05% di collagenasi A per 45 min a 37 ° C. </li><li> Smettere di digestione enzimatica con l&#39;aggiunta di 2 ml di terreno caldo. </li><li> Lavare le cellule con mezzo e centrifugare a 300 xg per 3 min. </li><li> Campioni triturare di 2ml di terreno usando una pipetta P1000 fino ad ottenere una sospensione cellulare omogenea. </li><li> Piastra le cellule in fiasche pretrattate (5-10 x 10 6 cellule / fiasco) con 25 ml di terreno caldo. </li><li> Incubare e coltura le cellule a 37 ° C con 5% di CO 2. </li><li> Cambiare la metà del mezzo ogni 2 giorni. </li><li> Dopo 6-8 giorni in vitro, controllare la percentuale di p75 cellule positive su campioni di piccole cellule, presume essere OECs nei roditori, mediante citometria di flusso o immunocitochimica. Per queste analisi, altri marcatori possono essere studiati come GFAP e S100β. </li></ol></li><li> Citometria a flusso <ol><li> Raccogliere le celle come descritto in (sezione 2.2) &quot;trapianto cellulare&quot;. </li><li> Incubare con p75 anticorpo primario (1:100) durante 15 min a 4 ° C. </li><li> Lavare le cellule con 2 ml di PBS-EDTA e centrifugare a 300 xg per 3 min. </li><li> Incubare le cellule con PE anticorpo secondario anti-topo coniugato in 15min a 4 ° C al buio (1:200). </li><li> Lavare le cellule con 2 ml di PBS-EDTA e centrifugare a 300 xg per 3 min. </li><li> Risospendere le cellule in 500 microlitri di PBS-EDTA. </li><li> Analizzare 10-30 x 10 3 celle con flusso citometro. </li></ol></li><li> Analisi immunocitochimica <ol><li> Piastra le cellule in piastre da 6 pozzetti prerivestite per 48 ore come descritto in &quot;cultura&quot; (sezione 1.1.2 di seguito). </li><li> Lavare le cellule con PBS. </li><li> Fissare le cellule con PFA 4% per 15 min a RT. </li><li> Lavare le cellule con PBS. </li><li> Incubare le cellule con PBS / Triton X100 (0,1%) per 15 minuti a RT. </li><li> Lavare le cellule con PBS. </li><li> Incubare le cellule con anticorpi primari (1:200): p75, S100β e GFAP notte a 4 ° C. </li><li> Lavare le cellule con PBS. </li><li> Incubare le cellule con gli anticorpi secondari (1:500) per 1 ora a temperatura ambiente al buio. </li><li> Lavare le cellule con PBS. </li><li> Incubare le cellule con Hoechst 10 min a RT nel buio. </li><li> Lavare le cellule con PBS. </li><li> Analizzare le cellule utilizzando un microscopio a fluorescenza. </li></ol></li><li> Cellule GFP etichettatura <ol><li> Cinque giorni prima del trapianto, infettare culture OB e OM notte con vettore lentivirale ospitare rafforzata GFP (molteplicità di infezione: 20). </li><li> Prima del check trapianto su piccoli campioni il tasso di cellule GFP positive per citometria a flusso come descritto in precedenza in &quot;cultura&quot; (sezione 1.1). </li></ol></li></ol> 2. Chirurgia e Trapianti <ol><li> Ricorrente anastomosi nervo <ol><li> Tutti gli esperimenti con gli animali devono essere approvati preventivamente dalla cura degli animali e l&#39;uso comitato dell&#39;istituzione ed eseguite da personale qualificato. </li><li> Prima dell&#39;intervento autoclave tutti gli strumenti e mantenere la sterilità durante gli interventi chirurgici. </li><li> Anestetizzare ratto mediante iniezione intraperitoneale di ketamina cloridrato (12,5 mg / kg) e clorpromazina cloridrato (0,625 mg / kg). Valutare l&#39;adeguatezza di anestesia pizzico punta prima dell&#39;intervento. </li><li> Posizionare il ratto in decubito dorsale. </li><li> Eseguire una verticale di medie incisione cutanea cervicale due centimetri con un bisturi. </li><li> Eseguire un&#39;incisione verticale dei muscoli sottoioidei seguendo la linea bianca mediale. </li><li> Esporre laringe utilizzando divaricatore autostatico tra i muscoli sottoioidei. </li><li> Esporre il RLN. </li><li> Sotto il controllo microscopico, tagliare il nervo pienamente con microscissors a livello dell&#39;anello tracheale settima. </li><li> Eseguire anastomosi utilizzando un punto di 11,0 sutura sotto controllo microscopico. Questo intervento comporta una specifica denervazione motore della laringe. </li></ol></li><li> Il trapianto cellulare <ol><li> Appena prima del trapianto, rimuovere le cellule dalle stoviglie utilizzando 0,05% tripsina EDTA per 5 min a 37 ° C. </li><li> Smettere di digestione enzimatica con l&#39;aggiunta di 2 ml di terreno caldo. </li><li> Centrifugare a 300 xg per 3 min. </li><li&gt; Al microscopio contare le cellule utilizzando un emocitometro e regolare la concentrazione cellulare secondo protocollo specifico. In questo modello, concentrazioni desiderate erano tra 1,2-6 x 10 6 cellule in 30 ml di DMEM/F12. </li><li> Fare la preparazione cellulare con 1:02 mix (30 e 60 microlitri in questo esperimento) di DMEM/F12-Matrige l in provetta da 1,5 ml prima di innesto e posizionarlo sul ghiaccio. Per evitare effetti non specifici, utilizzare il fattore di crescita ridotta Matrigel. </li><li> Appena prima del trapianto tenere il tubo in mano per pochi secondi a scaldare la Matrigel-medio impasto. </li><li> Deporre il mix sul sito anastomosi con una pipetta e attendere finché il composto auto-assembla sul nervo feriti. </li><li> Chiudere i muscoli e la pelle con una sutura 4.0. </li><li> Casa ratti individualmente e tenere sotto una lampada riscaldante per 24 ore. </li></ol></li></ol> 3. Valutazione <ol><li> Laringoscopia <ol><li> Anestetizzare ratti intraperitOneal iniezione di ketamina cloridrato (12,5 mg / kg) e clorpromazina cloridrato (0,625 mg / kg). Conferma ratti vengono anestetizzati con un pizzico punta prima di procedere con il protocollo. </li><li> Posizionare il ratto in decubito dorsale. </li><li> Inserire un 30 ° videolaryngoscope adeguati per fornire la migliore visione della laringe. Determinare punti di riferimento anatomici di riprodurre la stessa vista per ogni registrazione. </li><li> Registrare i movimenti delle corde vocali utilizzando il videolaryngoscope (5-10 sequenze / animale). Per ciascun animale selezionare tre sequenze successive di adduzione e abduzione massima massima. </li><li> Analizzare la funzione laringea utilizzando il software di analisi delle immagini. Determinare il movimento angolare assoluta misurando la differenza tra movimento di abduzione massima e adduzione massima delle corde vocali. Determinare punteggio dinamico misurando l&#39;ampiezza del movimento. Determinare il punteggio funzionale, misurando la synkinesis e movimenti paradossali. </li></ol></li><li> Elettromiografia (EMG) <ol><li&gt; Posizionare un elettrodo sui muscoli posteriori della coscia del ratto per l&#39;isolamento elettrico. </li><li> Esporre laringe e della trachea con l&#39;apertura della pelle e dei muscoli, come descritto in precedenza nella (sezione 2.1) &quot;anastomosi nervo ricorrente&quot;. </li><li> Esporre la cartilagine crico-tiroidea. </li><li> Aprire la cartilagine cricotiroidea per esporre il cricoarytenoid posteriore (PCA) del muscolo utilizzando microscissors. </li><li> Introdurre un elettrodo ad ago monopolare (38 x 0,45 millimetri) nel muscolo PCA. </li><li> Registrare l&#39;attività muscolare elettrica del muscolo PCA utilizzando un sistema di acquisizione durante la ventilazione spontanea. </li><li> Analizzare l&#39;attività muscolare in termini di ricchezza e la sincronizzazione con il respiro. Per analizzare EMG, assegnare un punteggio qualitativo 0-3 usando la seguente scala: 0: tracciato senza rima, senza aumento durante l&#39;inspirazione, 1: rima tracciando con inspiratori in aumento, ma povero tracing (Neurogen), 2: rima tracciando con l&#39;attività più ricchi, 3: rima rintracciamento, molto ricco, che costituisce un iReticolo nterferenze, simile ad una massima attività intenzionale. </li><li> Esporre il nervo vago per misurare la durata latenza e potenzialità. Il nervo vago è scelta come sede della stimolazione perché RLN può essere danneggiato durante la stimolazione grazie alle sue piccole dimensioni. </li><li> Stimolare il nervo vago con un elettrodo. </li><li> Registrare i segnali elettrici nel muscolo PCA. Misurare la latenza e la durata del potenziale. Se possibile utilizzare un modulo di acquisizione per registrare l&#39;attività muscolare, la latenza e la durata potenziale come il sistema Powerlab. </li></ol></li><li> Istologia <ol><li> Euthanize l&#39;animale con overdose di pentobarbital. </li><li> Rimuovere il moncone distale del RLN sotto controllo microscopico. La parte distale del RLN è definita come la parte tra anastomosi e della laringe. Si noti che è possibile trovare il sito di anastomosi diverse settimane dopo l&#39;intervento chirurgico perché il 11.0 sutura è una sutura non assorbibile. </li><li> Posizionare la porzione distale del RLN in 2% glutaraldeide 0,1 M fosfato(PH = 7,3) per 2 ore a 4 ° C. </li><li> Orientare con attenzione i campioni per realizzare sezioni coronali. </li><li> Lavare campioni in tampone fosfato. </li><li> Tagliare in segmenti più piccoli (3-4 mm di lunghezza) e postfix per 60 minuti a temperatura ambiente in 1% cacodilato tamponata OsO 4 e disidratate con etanolo. </li><li> Campioni orientare in stampi in silicone e incorporato in resine consistenti in POLYBED 812, DDSA e MNA, a cui è stato aggiunto il 2% di acceleratore BDMA. </li><li> Fai sezioni trasversali semi-sottile (1μm di spessore) con un ultramicrotomia sistema Pyramitome. </li><li> Colorazione con blu di toluidina 0,1% in 1% tetraborato di sodio per 75 sec a 70 ° C. </li><li> Analizzare campioni RLN con un sistema di analisi di conteggio. Contare il numero di fibre e misurare profili di fibre nervose mielinizzate determinando il contorno esterno e interno della guaina mielinica. </li></ol></li><li> Trapianto <ol><li> Preparazione delle cellule per il trapianto e trapianto di cellule come precedentemente descrittoin &quot;Il trapianto cellulare&quot; (paragrafo 2.2). </li><li> Analisi </li><li> Euthanize l&#39;animale con overdose di pentobarbital. Si noti che la fissazione degli animali può essere eseguita utilizzando iniezione intracardiaca di PFA 4%. </li><li> Rimuovere circa 2 cm di RLN. Utilizzare prossimale e parti distali del RLN. </li><li> Fissare campione RLN in azoto liquido. </li><li> Conservare i campioni a -80 ° C. </li><li> I campioni tagliati longitudinalmente con criostato (spessore 10-20 micron). </li><li> Analizzare i campioni al microscopio a fluorescenza per rilevare le cellule GFP positive. Si noti che l&#39;anticorpo anti-GFP può essere usato per aumentare emissione di fluorescenza ed effettuare costainings. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Barraud, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+crest+origin+of+olfactory+ensheathing+glia.">Neural crest origin of olfactory ensheathing glia.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 21040-21045 (2010).</li><li>Guerout, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+gene+expression+profiling+of+olfactory+ensheathing+cells+from+olfactory+bulb+and+olfactory+mucosa.">Comparative gene expression profiling of olfactory ensheathing cells from olfactory bulb and olfactory mucosa.</a> Glia. 58, 1570-1580 (1002).</li><li>Honore, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation,+characterization,+and+genetic+profiling+of+subpopulations+of+olfactory+ensheathing+cells+from+the+olfactory+bulb.">Isolation, characterization, and genetic profiling of subpopulations of olfactory ensheathing cells from the olfactory bulb.</a> Glia. 60, 404-413 (2012).</li><li>Franssen, E. H., de Bree, F. M., Verhaagen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Olfactory+ensheathing+glia:+their+contribution+to+primary+olfactory+nervous+system+regeneration+and+their+regenerative+potential+following+transplantation+into+the+injured+spinal+cord.">Olfactory ensheathing glia: their contribution to primary olfactory nervous system regeneration and their regenerative potential following transplantation into the injured spinal cord.</a> Brain Res. Rev. 56, 236-258 (2007).</li><li>Lakatos, A., Franklin, R. J., Barnett, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Olfactory+ensheathing+cells+and+Schwann+cells+differ+in+their+in+vitro+interactions+with+astrocytes.">Olfactory ensheathing cells and Schwann cells differ in their in vitro interactions with astrocytes.</a> Glia. 32, 214-225 (2000).</li><li>Woodhall, E., West, A. K., Chuah, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cultured+olfactory+ensheathing+cells+express+nerve+growth+factor,+brain-derived+neurotrophic+factor,+glia+cell+line-derived+neurotrophic+factor+and+their+receptors.">Cultured olfactory ensheathing cells express nerve growth factor, brain-derived neurotrophic factor, glia cell line-derived neurotrophic factor and their receptors.</a> Brain Res. Mol. Brain Res. 88, 203-213 (2001).</li><li>Dombrowski, M. A., Sasaki, M., Lankford, K. L., Kocsis, J. D., Radtke, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myelination+and+nodal+formation+of+regenerated+peripheral+nerve+fibers+following+transplantation+of+acutely+prepared+olfactory+ensheathing+cells.">Myelination and nodal formation of regenerated peripheral nerve fibers following transplantation of acutely prepared olfactory ensheathing cells.</a> Brain Res. 1125, 1-8 (2006).</li><li>Guerout, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transplantation+of+olfactory+ensheathing+cells+promotes+axonal+regeneration+and+functional+recovery+of+peripheral+nerve+lesion+in+rats.">Transplantation of olfactory ensheathing cells promotes axonal regeneration and functional recovery of peripheral nerve lesion in rats.</a> Muscle Nerve. 43, 543-551 (2011).</li><li>Guntinas-Lichius, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transplantation+of+olfactory+ensheathing+cells+stimulates+the+collateral+sprouting+from+axotomized+adult+rat+facial+motoneurons.">Transplantation of olfactory ensheathing cells stimulates the collateral sprouting from axotomized adult rat facial motoneurons.</a> Exp. Neurol. 172, 70-80 (2001).</li><li>Makoukji, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lithium+enhances+remyelination+of+peripheral+nerves.">Lithium enhances remyelination of peripheral nerves.</a> Proc. Natl. Acad. Sci U.S.A. 109, 3973-3978 (2012).</li><li>Guerout, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Co-transplantation+of+olfactory+ensheathing+cells+from+mucosa+and+bulb+origin+enhances+functional+recovery+after+peripheral+nerve+lesion.">Co-transplantation of olfactory ensheathing cells from mucosa and bulb origin enhances functional recovery after peripheral nerve lesion.</a> PloS one. 6, 22816 (2011).</li><li>Paviot, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficiency+of+laryngeal+motor+nerve+repair+is+greater+with+bulbar+than+with+mucosal+olfactory+ensheathing+cells.">Efficiency of laryngeal motor nerve repair is greater with bulbar than with mucosal olfactory ensheathing cells.</a> Neurobiol. Dis. 41, 688-694 (2011).</li><li>Girard, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolating+nasal+olfactory+stem+cells+from+rodents+or+humans.">Isolating nasal olfactory stem cells from rodents or humans.</a> J. Vis. Exp. , (2011).</li><li>Nash, H. H., Borke, R. C., Anders, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+method+of+purification+for+establishing+primary+cultures+of+ensheathing+cells+from+the+adult+olfactory+bulb.">New method of purification for establishing primary cultures of ensheathing cells from the adult olfactory bulb.</a> Glia. 34, 81-87 (2001).</li><li>Bianco, J. I., Perry, C., Harkin, D. G., Mackay-Sim, A., Feron, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurotrophin+3+promotes+purification+and+proliferation+of+olfactory+ensheathing+cells+from+human+nose.">Neurotrophin 3 promotes purification and proliferation of olfactory ensheathing cells from human nose.</a> Glia. 45, 111-123 (2004).</li><li>Paviot, A., Bon-Mardion, N., Duclos, C., Marie, J. P., Guerout, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Although+olfactory+ensheathing+cells+have+remarkable+potential+to+sustain+nerve+regeneration,+they+cannot+be+applied+to+a+severe+vagus+nerve+section/resection+model.">Although olfactory ensheathing cells have remarkable potential to sustain nerve regeneration, they cannot be applied to a severe vagus nerve section/resection model.</a> Muscle Nerve. 43, 919-920 (2011).</li></ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Le tecniche qui presentate fanno OECs un modello utile per studiare trapianti cellulari in modelli di lesione dei nervi periferici. Il protocollo di coltura cellulare è relativamente semplice e può essere facilmente effettuata. D&#39;altro canto, le procedure chirurgiche, in particolare la sezione / anastomosi del RLN, richiedono esperienza e devono essere eseguite da personale qualificato. Le procedure descritte in questo protocollo evidenziano fattori importanti per concentrarsi su al fi...

Il sistema olfattivo primario è composto di due parti distinte: la mucosa olfattiva (OM) nel sistema nervoso periferico e il bulbo olfattivo (OB) nel sistema nervoso centrale. Il sistema olfattivo primario è caratterizzato dalla capacità dei neuroni olfattivi primari (PON) auto-di rinnovare tutta la vita in specie di mammiferi. Questa capacità è reso possibile grazie alla presenza di cellule staminali neurali nel OM. La crescita PON e la ricrescita da OM a OB è facilitata dalle cellule gliali specializzate chiamate cellule ensheathing olfattive (OECs). OECs sono cellule della cresta neurale che creano un microambiente favorevole per la neurogenesi del PON da OM a OB 1. In tal modo, OECs può essere trovato in OM e in OB costituendo diverse sottopopolazioni di cellule 2,3. Le diverse proprietà di OECs gli scienziati hanno di piombo per usarli per trapianti cellulari in diversi paradigmi sistema nervoso lesione 4. Infatti, OECs fattori di crescita prodotti, ridurre spaventare gliali, prOmote ricrescita assonale, e può mescolarsi liberamente con astrociti 5,6. Tuttavia, la stragrande maggioranza di questi studi si basano su lesioni del midollo spinale (SCI), pochi di loro hanno usato OECs dopo la lesione del nervo periferico (PNI) 7,8. Sebbene il sistema nervoso periferico ha una grande capacità di rigenerarsi dopo una lesione del nervo, sezioni complete indurre aberrante assonale ricrescita. Infatti, dopo transections complete del viso o dei nervi laringei ricorrenti (RLN) assoni pervenute all&#39;indirizzo sbagliato causano cocontractions muscolari chiamati synkinesis. Pertanto è di primaria importanza per proporre un modello di PNI quantificare non solo ricrescita assonale ma anche per valutare l&#39;efficienza delle contrazioni muscolari. Nella letteratura il modello più comune descritto è basato sulla lesione del nervo facciale 9,10. In questo modello, valutazioni funzionali sono basati sul recupero dei movimenti whisker 10. Tuttavia è complicato per dimostrare l&#39;efficacia del movENTI e discriminare i fenomeni cocontractions muscolari. Proponiamo qui un modello basato su una lesione RLN. Questo modello permette di valutare non solo la ricrescita degli assoni e dei movimenti delle corde vocali, ma anche l&#39;efficienza e la funzionalità di questi movimenti dopo trapianti cellulari 11,12. Questo protocollo fornisce una procedura passo passo alla cultura e trapianto OECs da OM e OB in un modello sezione RLN / anastomosi e di valutare animali dopo l&#39;intervento chirurgico.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="591">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:240px;">DMEM/F12</td>
			<td style="width:155px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:197px;">E3521T</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FBS</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>E3387M</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Penicilin/streptomycin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>1152-8876</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HBSS</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>M3467Y</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Trypsin-EDTA</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>M3513P</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cacodylate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.03256.0100</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DDSA</td>
			<td>BIOVALLEY</td>
			<td>00563-450</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MNA</td>
			<td>BIOVALLEY</td>
			<td>00886-450</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BDMA</td>
			<td>BIOVALLEY</td>
			<td>00141-100</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">POLYBED 812</td>
			<td>BIOVALLEY</td>
			<td>08791-500</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PE anti-mouse&#160;</td>
			<td>BD Bioscience&#160;</td>
			<td>550589</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Matrigel GFR</td>
			<td>BD Bioscience&#160;</td>
			<td>356231</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Collagenase A</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10103586001</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mouse anti P75</td>
			<td>Chemicon</td>
			<td>MAB 365</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">11.0 Wire</td>
			<td>Ethicon&#160;</td>
			<td>FG 2881</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Toluidine Blue&#160;</td>
			<td>RAL DIAGNOSTICS</td>
			<td>361590-0025</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Centrifuge</td>
			<td>Sigma&#160;</td>
			<td>Sigma 2-16PK</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Incubator&#160;</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Laminar flow hood</td>
			<td>Faster</td>
			<td style="width:197px;">BH-EN 2003 S</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Flow cytometer</td>
			<td>BD Bioscience&#160;</td>
			<td>FACSCalibur</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Videolaryngoscope</td>
			<td>Karl Storz Endoskope</td>
			<td>Telecam SL NLSC 20212120</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Acquisition system</td>
			<td>ADInstruments</td>
			<td>Powerlab system</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Pyramitome Ultramicrotomy System&#160;</td>
			<td style="width:155px;">Leica</td>
			<td>Ultracut S</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Image analysis system</td>
			<td>Explora Nova</td>
			<td>Mercator</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

transplantation of olfactory ensheathing cells to evaluate functional recovery after peripheral nerve injury

<html> Cellule ensheathing olfattive (OECs) sono cellule della cresta neurale che permettono la crescita e ricrescita dei neuroni olfattivi primari. Infatti, il sistema olfattivo primario è caratterizzato dalla sua capacità di dare origine a nuovi neuroni anche in animali adulti. Questa particolare abilità è in parte dovuta alla presenza di OECs che creano un microambiente favorevole per neurogenesi. Questa struttura di OECs è stato usato per il trapianto cellulare come nei modelli di lesione del midollo spinale. Sebbene il sistema nervoso periferico ha una maggiore capacità di rigenerare dopo lesione del nervo rispetto al sistema nervoso centrale, sezioni complete indurre misrouting durante ricrescita assonale in particolare dopo facciale di transezione del nervo laringeo. In particolare, pieno sezionamento del nervo laringeo ricorrente (RLN) induce aberrante ricrescita assonale conseguente synkinesis delle corde vocali. In questo modello specifico, abbiamo dimostrato che OECs trapianto aumenta efficacemente la ricrescita assonale. ve_content &quot;&gt; OECs sono costituiti da diverse sottopopolazioni presenti sia nella mucosa olfattiva (OM-OECs) e bulbo olfattivo (OB-OECs). Presentiamo qui un modello di trapianto cellulare basata sull&#39;uso di questi differenti sottopopolazioni di OECs in un modello di lesione RLN. Utilizzando questo paradigma, colture primarie di OB-OECs e OM-OECs sono stati trapiantati in Matrigel dopo la sezione e anastomosi del RLN. due mesi dopo l&#39;intervento, abbiamo valutato animali trapiantati da analisi complementari sulla base di videolaryngoscopy, elettromiografia (EMG) , e studi istologici. Innanzitutto, videolaryngoscopy permesso di valutare le funzioni della laringe, in particolare cocontractions muscolari fenomeni. Poi, EMG analizza dimostrato ricchezza e la sincronizzazione delle attività muscolari. Infine, studi istologici basato su colorazione blu di toluidina permesso la quantificazione del numero e profilo di fibre mieliniche. Tutti insieme, si descrive qui come isolare, cultura, identify e trapianto OECs da OM e OB dopo RLN sezione-anastomosi e come valutare e analizzare l&#39;efficienza di queste cellule trapiantate sulle funzioni ricrescita e laringei assonale.

Illustrazioni di controllo e reinnervated (sezione / anastomizzata) gli animali sono stati scelti come i risultati possono variare a seconda delle trapianti cellulari effettuati (OM, OB o OM + OB). Coltura cellulare Le cellule aderiscono rapidamente alla superficie plastica e divenne segregata in andane parallele di cellule che sono allungate o rastremata, triangolare, multipolare, o forma-mandrino (Figure 1A e 1B). Dopo 8 giorni in vitro</...

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Transplantation of Olfactory Ensheathing Cells to Evaluate Functional Recovery after Peripheral Nerve Injury

Cellule ensheathing olfattive (OECs) sono cellule della cresta neurale che permettono la crescita dei neuroni olfattivi primari. Questa proprietà specifica può essere utilizzato per il trapianto cellulare. Presentiamo qui un modello di trapianto cellulare basata sull&#39;uso di OECs in un modello di lesione del nervo laringeo.

Il trapianto di cellule olfattive ensheathing per valutare il recupero funzionale dopo Peripheral Nerve Injury

Olfactory ensheathing cells (OECs) are neural crest cells which allow growth and regrowth of the primary olfactory neurons. Indeed, the primary olfactory ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

11.7K Views.  University of Rouen.  Cellule ensheathing olfattive (OECs) sono cellule della cresta neurale che permettono la crescita dei neuroni olfattivi primari. Questa proprietà specifica può essere utilizzato per il trapianto cellulare. Presentiamo qui un modello di trapianto cellulare basata sull'uso di OECs in un modello di lesione del nervo laringeo. 

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An Optic Nerve Crush Injury Murine Model to Study Retinal Ganglion Cell Survival

Injury to the optic nerve can lead to axonal degeneration, followed by a gradual death of retinal ganglion cells (RGCs), which results in irreversible vision loss. Examples of such diseases in human include traumatic optic neuropathy and optic nerve degeneration in glaucoma. It is characterized by typical changes in the optic nerve head, progressive optic nerve degeneration, and loss of retinal ganglion cells, if uncontrolled, leading to vision loss and blindness.
The optic nerve crush (ONC) injury mouse model is an important experimental disease model for traumatic optic neuropathy, glaucoma, etc. In this model, the crush injury to the optic nerve leads to gradual retinal ganglion cells apoptosis. This disease model can be used to study the general processes and mechanisms of neuronal death and survival, which is essential for the development of therapeutic measures. In addition, pharmacological and molecular approaches can be used in this model to identify and test potential therapeutic reagents to treat different types of optic neuropathy.
Here, we provide a step by step demonstration of (I) Baseline retrograde labeling of retinal ganglion cells (RGCs) at day 1, (II) Optic nerve crush injury at day 4, (III) Harvest the retinae and analyze RGC survival at day 11, and (IV) Representative result.

This protocol shows how to retrogradely label retinal ganglion cells, and how to subsequently make an optic nerve crush injury in order to analyze retinal ganglion cell survival and apoptosis. It is an experimental disease model for different types of optic neuropathy, including glaucoma.

Una lesione del nervo ottico Modello Crush murini per studiare la sopravvivenza delle cellule gangliari della retina

Injury to the optic nerve can lead to axonal degeneration, followed by a gradual death of retinal ganglion cells (RGCs), which results in irreversible ...

Ricerca

Neuroscienze

Functional Evaluation of Olfactory Pathways in Living Xenopus Tadpoles

Xenopus tadpoles offer a unique platform to investigate the function of the nervous system. They provide multiple experimental advantages, such as accessibility to numerous imaging approaches, electrophysiological techniques and behavioral assays. The Xenopus tadpole olfactory system is particularly well suited to investigate the function of synapses established during normal development or reformed after injury. Here, we describe methodologies to evaluate the processing of olfactory information in living Xenopus larvae. We outline a combination of in vivo measurements of presynaptic calcium responses in glomeruli of the olfactory bulb with olfactory-guided behavior assays. Methods can be combined with the transection of olfactory nerves to study the rewiring of synaptic connectivity. Experiments are presented using both wild-type and genetically modified animals expressing GFP reporters in central nervous system cells. Application of the approaches described to genetically modified tadpoles can be useful for unraveling the molecular bases that define vertebrate behavior.

Functional Evaluation of Olfactory Pathways in Living Xenopus Tadpoles

Xenopus tadpoles offer a unique platform to investigate the function of the nervous system in vivo. We describe methodologies to evaluate the processing of olfactory information in living Xenopus larvae in normal rearing conditions or after injury.

Valutazione funzionale delle vie olfattive in girini di Xenopus vivente

Xenopus tadpoles offer a unique platform to investigate the function of the nervous system. They provide multiple experimental advantages, such as ...

A Preclinical Model to Assess Brain Recovery After Acute Stroke in Rats

The purpose of this study was to establish and validate an animal brain ischemia model in the recovery and sequela stages. A middle cerebral artery occlusion/reperfusion (MCAO/R) model in male Sprague-Dawley rats was chosen. By changing the rat&#39;s weight (260&#8722;330 g), the thread bolt type (2636/2838/3040/3043) and the brain infarct time (2-3 h), a higher Longa&#39;s score, a larger infarct volume and a greater model success ratio were screened using the Longa&#39;s score and TTC staining. The optimum model condition (300 g, 3040 thread bolt, 3 h brain infarct time) was acquired and used in a 1-90 day observation period after reperfusion via assessment of sensorimotor functions and infarct volume. At these conditions, the bilateral asymmetry test had a significant difference from 1 to 90 days, and the grid-walking test had a significant difference from 1 to 60 days; both differences could be a suitable sensorimotor functional test. Thus, the most appropriate condition of a novel rat model in the recovery and sequela stages of brain ischemia was found: 300 g rats that underwent MCAO with a 3040 thread bolt for a 3 h brain infarct and then reperfused. The appropriate sensorimotor functional tests were a bilateral asymmetry test and a grid-walking test.

The&#160;purpose of this study is to establish and validate an animal model for research in the recovery and sequela stages of brain ischemia by testing brain infarction and sensorimotor function after middle cerebral artery occlusion/reperfusion (MCAO/R) after 1-90 days in rats.

Un modello preclinico per valutare il recupero del cervello dopo l'ictus acuto nei ratti

The purpose of this study was to establish and validate an animal brain ischemia model in the recovery and sequela stages. A middle cerebral artery ...

3D Kinematic Analysis for the Functional Evaluation in the Rat Model of Sciatic Nerve Crush Injury

Compared to the Sciatic Functional Index (SFI), kinematic analysis is a more reliable and sensitive method for performing functional evaluations of sciatic nerve injury rodent models. In this protocol, we describe a novel kinematic analysis method that uses a three-dimensional (3D) motion capture apparatus for functional evaluations using a rat sciatic nerve crush injury model. First, the rat is familiarized with treadmill walking. Markers are then attached to the designated bone landmarks and the rat is made to walk on the treadmill at the desired speed. Meanwhile, the posterior limb movements of the rat are recorded using four cameras. Depending on the software used, marker tracings are created using both automatic and manual modes and the desired data are produced after subtle adjustments. This method of kinematic analysis, which uses a 3D motion capture apparatus, offers numerous advantages, including superior precision and accuracy. Many more parameters can be investigated during the comprehensive functional evaluations. This method has several shortcomings that require consideration: The system is expensive, can be complicated to operate, and may produce data deviations due to skin shifting. Nevertheless, kinematic analysis using a 3D motion capture apparatus is useful for performing functional anterior and posterior limb evaluations. In the future, this method may become increasingly useful for generating accurate assessments of various traumas and diseases.

We introduce a kinematic analysis method that uses a three-dimensional motion capture apparatus containing four cameras and data processing software for performing functional evaluations during fundamental research involving rodent models.

Analisi kinematica 3D per la valutazione funzionale nel modello di ratto di lesioni da schiacciamento del nervo sciatico

Compared to the Sciatic Functional Index (SFI), kinematic analysis is a more reliable and sensitive method for performing functional evaluations of ...

Purification of Fibroblasts and Schwann Cells from Sensory and Motor Nerves in Vitro

The principal cells in the peripheral nervous system are the Schwann cells (SCs) and the fibroblasts. Both these cells distinctly express the sensory and motor phenotypes involved in different patterns of neurotrophic factor gene expression and other biological processes, affecting nerve regeneration. The present study has established a protocol to obtain highly purified rat sensory and motor SCs and fibroblasts more rapidly. The ventral root (motor nerve) and the dorsal root (sensory nerve) of neonatal rats (7-days-old) were dissociated and the cells were cultured for 4-5 days, followed by isolation of sensory and motor fibroblasts and SCs by combining differential digestion and differential adherence methods sequentially. The results of immunocytochemistry and flow cytometry analyses showed that the purity of the sensory and motor SCs and fibroblasts were &#62;90%. This protocol can be used to obtain a large number of sensory and motor fibroblasts/SCs more rapidly, contributing to the exploration of sensory and motor nerve regeneration.

Here, we present a method to purify fibroblasts and Schwann cells from sensory and motor nerves in vitro.

Purificazione dei fibroblasti e delle cellule di Schwann dai nervi sensoriali e motori in Vitro

The principal cells in the peripheral nervous system are the Schwann cells (SCs) and the fibroblasts. Both these cells distinctly express the sensory and ...

Automated Gait Analysis to Assess Functional Recovery in Rodents with Peripheral Nerve or Spinal Cord Contusion Injury

Peripheral and central nerve injuries are mostly studied in rodents, especially rats, given the fact that these animal models are both cost-effective and a lot of comparative data has been published in the literature. This includes a multitude of assessment methods to study functional recovery following nerve injury and repair. Besides evaluation of nerve regeneration by means of histology, electrophysiology, and other in vivo and in vitro assessment techniques, functional recovery is the most important criterion to determine the degree of neural regeneration. Automated gait analysis allows recording of a vast quantity of gait-related parameters such as Paw Print Area and Paw Swing Speed as well as measures of inter-limb coordination. Additionally, the method provides digital data of the rats&#8217; paws after neuronal damage and during nerve regeneration, adding to our understanding of how peripheral and central nervous injuries affect their locomotor behavior. Besides the predominantly used sciatic nerve injury model, other models of peripheral nerve injury such as the femoral nerve can be studied by means of this method. In addition to injuries of the peripheral nervous systems, lesions of the central nervous system, e.g., spinal cord contusion can be evaluated. Valid and reproducible data assessment is strongly dependent on meticulous adjustment of the hard- and software settings prior to data acquisition. Additionally, proper training of the experimental animals is of crucial importance. This work aims to illustrate the use of computerized automated gait analysis to assess functional recovery in different animal models of peripheral nerve injury as well as spinal cord contusion injury. It also emphasizes the method&#8217;s limitations, e.g., evaluation of nerve regeneration in rats with sciatic nerve neurotmesis due to limited functional recovery. Therefore, this protocol is thought to help researchers interested in peripheral and central nervous injuries to assess functional recovery in rodent models.

Automated gait analysis is a feasible tool to evaluate functional recovery in rodent models of peripheral nerve injury and spinal cord contusion injury. While it requires only one setup to assess locomotor function in various experimental models, meticulous hard- and soft-ware adjustment and training of the animals is highly important.

Analisi automatizzata dell'andatura per valutare il recupero funzionale nei roditori con lesione da contusione del nervo periferico o del midollo spinale

Peripheral and central nerve injuries are mostly studied in rodents, especially rats, given the fact that these animal models are both cost-effective and ...

Coculture of Axotomized Rat Retinal Ganglion Neurons with Olfactory Ensheathing Glia, as an In Vitro Model of Adult Axonal Regeneration

Olfactory ensheathing glia (OEG) cells are localized all the way from the olfactory mucosa to and into the olfactory nerve layer (ONL) of the olfactory bulb. Throughout adult life, they are key for axonal growing of newly generated olfactory neurons, from the lamina propria to the ONL. Due to their pro-regenerative properties, these cells have been used to foster axonal regeneration in spinal cord or optic nerve injury models.
We present an in vitro model to assay and measure OEG neuroregenerative capacity after neural injury. In this model, reversibly immortalized human OEG (ihOEG) is cultured as a monolayer, retinas are extracted from adult rats and retinal ganglion neurons (RGN) are cocultured onto the OEG monolayer. After 96 h, axonal and somatodendritic markers in RGNs are analyzed by immunofluorescence and the number of RGNs with axon and the mean axonal length/neuron are quantified.
This protocol has the advantage over other in vitro assays that rely on embryonic or postnatal neurons, that it evaluates OEG neuroregenerative properties in adult tissue. Also, it is not only useful for assessing the neuroregenerative potential of ihOEG but can be extended to different sources of OEG or other glial cells.

We present an in vitro model to assess olfactory ensheathing glia (OEG) neuroregenerative capacity, after neural injury. It is based on a coculture of axotomized adult retinal ganglion neurons (RGN) on OEG monolayers and subsequent study of axonal regeneration, by analyzing RGN axonal and somatodendritic markers.

Cocultura di neuroni ganglionali retini di ratto axotomizzati con glia ensheathing olfattiva, come modello in vitro di rigenerazione assionale adulta

Olfactory ensheathing glia (OEG) cells are localized all the way from the olfactory mucosa to and into the olfactory nerve layer (ONL) of the olfactory ...

Motor Dual-Tasks for Gait Analysis and Evaluation in Post-Stroke Patients

Eighteen stroke patients were recruited for this study involving the evaluation of cognition and walking ability and multitask gait analysis. Multitask gait analysis consisted of a single walking task (Task 0), a simple motor dual-task (water-holding, Task 1), and a complex motor dual-task (crossing obstacles, Task 2). The task of crossing obstacles was considered to be equivalent to the combination of a simple walking task and a complex motor task as it involved more nervous system, skeletal movement, and cognitive resources. To eliminate heterogeneity in the results of the gait analysis of the stroke patients, the dual-task gait cost values were calculated for various kinematic parameters. The major differences were observed in the proximal joint angles, especially in the angles of the trunk, pelvis, and hip joints, which were significantly larger in the dual motor tasks than in the single walking task. This research protocol aims to provide a basis for the clinical diagnosis of gait function and an in-depth study of motor control in stroke patients with motor control deficits through the analyses of dual-motor walking tasks.

This paper presents a protocol specifically for dual motor task gait analysis in stroke patients with motor control deficits.

Doppio compito motorio per l'analisi e la valutazione dell'andatura nei pazienti post-ictus

Eighteen stroke patients were recruited for this study involving the evaluation of cognition and walking ability and multitask gait analysis. Multitask ...

Multifactorial Assessment of Motor Behavior in Rats after Unilateral Sciatic Nerve Crush Injury

The induction of a peripheral nerve injury is a widely used method in neuroscience for the assessment of repair and pain mechanisms among others. In addition, in the research field of movement disorders, sciatic crush injury has been employed to trigger a dystonia-like phenotype in genetically predisposed DYT-TOR1A rodent models of dystonia. To achieve consistent, reproducible and comparable results after a sciatic nerve crush injury, a standardized method for inducing the nerve crush is essential, in addition to a standardized phenotypical characterization. Attention must be paid not only to the specific assortment of behavioral tests, but also to the technical requirements, the correct execution and consecutive data analysis. This protocol describes in detail how to perform a sciatic nerve crush injury and provides a behavioral test battery for the assessment of motor deficits in rats that includes the open field test, the CatWalk XT gait analysis, the beam walking task, and the ladder rung walking task.

We provide a protocol for the assessment of motor behavior via a behavioral test battery in rats after sciatic nerve crush injury.

Valutazione multifattoriale del comportamento motorio nei ratti dopo la lesione unilaterale da schiacciamento del nervo sciatico

The induction of a peripheral nerve injury is a widely used method in neuroscience for the assessment of repair and pain mechanisms among others. In ...

A Scalable Model to Study the Effects of Blunt-Force Injury in Adult Zebrafish

Blunt-force traumatic brain injuries (TBI) are the most common form of head trauma, which spans a range of severities and results in complex and heterogenous secondary effects. While there is no mechanism to replace or regenerate the lost neurons following a TBI in humans, zebrafish possess the ability to regenerate neurons throughout their body, including the brain. To examine the breadth of pathologies exhibited in zebrafish following a blunt-force TBI and to study the mechanisms underlying the subsequent neuronal regenerative response, we modified the commonly used rodent Marmarou weight drop for the use in adult zebrafish. Our simple blunt-force TBI model is scalable, inducing a mild, moderate, or severe TBI, and recapitulates many of the phenotypes observed following human TBI, such as contact- and post-traumatic seizures, edema, subdural and intracerebral hematomas, and cognitive impairments, each displayed in an injury severity-dependent manner. TBI sequelae, which begin to appear within minutes of the injury, subside and return to near undamaged control levels within 7 days post-injury. The regenerative process begins as early as 48 hours post-injury (hpi), with the peak cell proliferation observed by 60 hpi. Thus, our zebrafish blunt-force TBI model produces characteristic primary and secondary injury TBI pathologies similar to human TBI, which allows for investigating disease onset and progression, along with the mechanisms of neuronal regeneration that is unique to zebrafish.

We modified the Marmarou weight drop model for adult zebrafish to examine a breadth of pathologies following blunt-force traumatic brain injury (TBI) and the mechanisms underlying subsequent neuronal regeneration. This blunt-force TBI model is scalable, induces a mild, moderate, or severe TBI, and recapitulates injury heterogeneity observed in human TBI.