この作品は、NIH NIDCD Y1-DC-8002から01によってサポートされていました。この作業は、契約DE-AC52-07NA27344下ローレンス·リバモア国立研究所で、米国エネルギー省の後援の下で行った。

1。補強材へのプローブの組立プロトコルのこのセクションでは、補強材、シリコン補強材の製造、および薄膜ポリマープローブの組み立てを説明しています。 図1に提案された補強材と一緒に、典型的なポリマー神経プローブを示している。補強材の設計の詳細は、図2に示されている。この設計の新規な特徴は、組み立て中に液状接着剤を分配するために使用され、その長さに沿って浅い「ウィッキング」チャネルである。補強材の広い部分は、アセンブリおよび外科的挿入の際に処理するためのタブです。タブのリザーバは、チャネルに接続します。成分は、標準的な微細加工プロセスを用いてシリコンから製造される。 <ol><li>ウィッキングチャネルを有するシリコン補強材は、補強材の所望の厚さに等しいデバイス層の厚さ（シリコン·オン·インシュレータ（SOI）ウェハから作製した<stronG&gt;図3A）。補強材の厚さの合理的な範囲は20〜100μmである。これは、補強材の幅はプローブの上面に接合界面から接着剤のオーバーフローを防ぐことができますプローブ幅より20〜30μmで小さくなることをお勧めします。最初のウィッキングチャンネルをドライエッチング標準ボッシュ法（ 図3B）を使用しています。次に、補強材の形状は、埋め込 ​​み酸化物層（ 図3C）で停止長いエッチングによって規定される。最後に、補剛材49％フッ化水素酸（ 図3D）中の埋め込 ​​み酸化物層を湿式エッチングすることによって解放される。補剛材を徹底的にすすいだ後、15分間それらを脱イオン水に浸す。 </li><li>貯水池への分子量10,000 g /モル（ 図4）のポリエチレングリコール（PEG）のペレットを配置します。 PEGが溶融し、毛管作用によってチャネルに発散するように65℃に補強材を加熱する。そして、固化し、室温まで冷却。 </lI&gt; <li> 図5に、セットアップフリップチップボンダーの概略図を示す。ツールヘッドに補強材をピックアップして、フリップチップボンダーのベースステージに逆さまに補強材を配置します。ベースステージに逆さまにプローブを配置します。フリップチップボンダーを用いて、補強材とプローブを合わせた後、補強材を下げ、プローブの上に置きます。 </li><li>フリップチップボンダーのステージは、ベース基板を加熱するための加熱素子を有するべきである。補強材を配置した後、65℃に再び集合体を加熱しPEGの1分が再溶融して、プローブと補強材との間のインタフェースを埋めるために始めることができます。固化させる冷却する。 </li><li>以上のアセンブリを回して、上から検査します。 PEGが完全にプローブと補強材との間のインターフェースを充填することを可能にするために、必要に応じて再加熱する。プローブは透明であるので、これは視覚的に評価することができる。アセンブリは、トップ（プローブ）アップサイドヒーターの上に座っているように、手動で1-3 Eを配置タブの上に固体PEGのエクストラペレット彼らはこの地域で、追加の補強（ 図6）を提供する、プローブの上に溶融するように。最後に、アセンブリはPEGが凝固するように冷却する。この時点で、アセンブリは、外科的挿入の準備ができている。 </li></ol> 2。挿抜<ol><li>タブ領域でのマイクロマニピュレータアームに補強材の背面を接着することにより、図7（a）に示すように、マイクロマニピュレータ、プローブ·補強材アセンブリを取り付けます。これは、両面テープや接着剤で行われますが、接着剤でプローブを連絡しないように注意してくださいすることができる。一時的に低い力で容易に除去できるような接着剤、パテの小片にマイクロマニピュレータへのプローブのコネクタ端部を固定する。 </li><li>ターゲット上にプローブアセンブリを配置し、所望の挿入速度でプローブを挿入します。このプロトコルを開発する際に0.13〜0.5ミリメートル/秒の挿入速度は、使用された。&lt;/李&gt; <li>すぐに静かにマイクロマニピュレータからのプローブのコネクタの端を削除して、このような第二マニピュレータアーム（ 図7B）として、近くの台の上に置きます。 PEGは、プローブを移動さ避けるために溶解し始める前に、これが行われなければならない。 </li><li> PEGは溶解するための時間を確保します。この時間量は、PEGの分子量とプローブと補強材との接触面積に依存するであろう。例えば、10,000 g /モル、微小電極プローブを約6mmと306μm幅であるマッチング補強材のPEG分子量が、15分で十分な時間であることが見出されている。プロトコルの第3節では、必要な溶解時間をテストするための方法を提示します。この時間の間に、ターゲット（ 図7C）の上にある任意のPEGを溶解するためにタブを挿入点の周りスポイトを用いてリン酸緩衝生理食塩水（PBS）を適用する。 </li><li>電動マイクロポジショナーを用いて、変位を適用することにより、補強材の抽出を開始する5ミリメートル/秒の速度で100μmである。この最初の速い動きは、どの静止摩擦を克服し、プローブ変位を最小限に抑えることができます。その後、約0.1ミリメートル/秒（ 図7D）の低速で補強材の抽出を完了します。 </li><li>実際の手術例では、21で示すように、プローブを固定し、保護するために、挿入部位でゲル、シリコーンおよび/ ​​または歯科アクリルを適用し、通常の手順に進みます。 </li></ol> 3。アガロースゲルテストプロトコルのこのセクションでは、バルクの機械的性質、pH、および脳組織17,22の塩分濃度を近似する0.6％アガロースゲル中の補強材の抽出を検討するセットアップと手順について説明します。ゲルは、短い距離を介して、ほぼ透明であるため、補強材分離およびプローブ変位を観察することができる。 <ol><li>リン酸緩衝生理食塩水（PBS）中の0.6％アガロース溶液を調製する。エレメントで混合完全アガロース粉末を溶解するための温度vated。浅いアクリルボックスに溶液を注ぐ。ゲルが深い中3/4- 1でなければなりません。時間室温で設定されたゲルを可能にする。 </li><li>それが乾燥しないように硬化ゲルをPBSで飽和していることを確認し、37℃にゲルを加熱し</li><li> 図8に示すように、マイクロマニピュレータ、アガロースゲルの箱、および顕微鏡カメラシステムをセットアップする。 </li><li>ゲルと箱の側面（ 図8）の間にスライドさせ、ゲルの箱にガラスの参照基準を挿入します。デジタル顕微鏡の視野に、参照基準上の特徴を二乗する歯科ピックを使用してください。 </li><li>ステップ2.1で説明したように、マイクロマニピュレータにプローブアセンブリを取り付けます。 </li><li>約1ミリメートルの参照基準の背後にあるシリカゲルのプローブアセンブリを配置します。 </li><li>視野内の所望の深さにそれを導くためにカメラを使用して、ゲル中にプローブを挿入する。&lt;/李&gt; <li>すぐに近くの表面に載るようにプローブのコネクタの端を移動します。 </li><li>プローブ（参照基準の特徴は、わずかに焦点が合っていてもよい）に集中するカメラ画像に対して必要な調整を行います。プローブ位置のスナップショットを作成します。 </li><li> PEGは（今回は変更になる場合があり、実際にテストされるべきパラメータであってもよい）を溶解することができます。ゲルの上にある、PEGを溶解するために、タブの近くに、PBSを適用します。 </li><li>必要に応じて、ビデオキャプチャを開始し、ステップ2.5で説明したように補強材の抽出を開始します。抽出が完了すると、プローブ位置の最終的なスナップショットを作成します。 </li><li>補強材の抽出前後の画像を比較する画像処理ツールを使用してください。 （位置合わせ）画像を登録する視野に表示され、参照基準上の機能を使用してください。プローブ上の既知のフィーチャのサイズに基づいて画像の縮尺を校正。プローブ変位の距離を測定します。 </li></ol>

<ol>
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T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+realistic+brain+tissue+phantom+for+intraparenchymal+infusion+studies.">A realistic brain tissue phantom for intraparenchymal infusion studies.</a> Journal of Neurosurgery. 101 (2), 314-322 (2004).</li><li>Felix, S., Shah, K. G., George, D., Tolosa, V., Tooker, A., Sheth, H., Delima, T., Pannu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Removable+silicon+insertion+stiffeners+for+neural+probes+using+polyethylene+glycol+as+a+biodissolvable+adhesive.">Removable silicon insertion stiffeners for neural probes using polyethylene glycol as a biodissolvable adhesive.</a> , 871-874 (2012).</li></ol>

著者らは、競合する金融利害関係はありません。

ここで説明する方法は、生体溶解性接着剤を用いて別々の補強材に薄膜ポリマープローブを取り付けるための十分に制御された方法を提供する。また、これらの取り外し可能な補強材と所定のプローブ·補強材構成に対して、in vitroでの手順を検証する技術を実現するための推奨の外科的処置がある発表した。補強材を任意に硬質にすることができるので、方法は、比較的長いプローブ...

微小電極アレイは、神経科学の不可欠なツールだけでなく、このような人工装具などの新興臨床応用である。特に、貫通微小電極プローブは、脳、脊髄、および末梢神経細胞との密接な接触を介して神経活動の刺激と記録を可能にする。移植された神経プローブの主要な課題は、刺激および記録機能の安定性と寿命です。微小電極プローブや神経組織の間の相互作用のモデル化と実験的研究では、分解のための1メカニズムは、プローブと組織1-3の間のわずかな相対運動に起因する神経組織の微小断裂であることを示唆している。一つの解決策は、相対的な微動を最小化するために、より密接に神経組織の嵩剛性特性に一致する柔軟なプローブを製造することである。このように、ポリイミドやパリレン等の生体適合性の薄膜ポリマーは、マイクロエレクト​​ロニクスのための良好な基質として採用されているtrodeプローブ4-8。 フレキシブルプローブのトレードオフは、それらが神経組織に挿入することが困難であることである。研究者は、望ましい機械的特性を維持しながら、柔軟なプローブの挿入を​​容易にするために様々なアプローチをとっている。デザインの一つのクラスは他の部分のコンプライアンスを維持しつつ、特定のセクション又は軸の剛性を高めるために、ポリマープローブの幾何学的形状を変更する。これは、リブまたは他の材料の層9,10を組み込むことによって達成された。別のアプローチは、生分解性材料11が充填されたポリマープローブの設計に3-Dチャネルを統合する。このプローブは、一時的に剛化、チャネル溶解し、ドレインアウト挿入後の材料することができる。ただし、恒久的に最終的な埋め込まれた装置のジオメトリを変更するこのような方法は、柔軟なプローブの望ましい機能の一部が損なわれることがあります。 Nを行う一つの方法最終的なプローブ形状を変えるotのは、一時的にデバイス12から14を補強するために、生分解性材料とポリマーデバイスをカプセル化することです。しかしながら、典型的な生分解性材料は、シリコンよりも小さい大きさのヤング率次数を有し、その結果、同一の剛性を達成するために、より大きな厚さ​​を必要とするであろう。適切にプローブを塗布して、挿入をより困難に、より丸みを帯び、または丸い先端になることがあります。溶解可能なコーティングが露出しているため、また、それらを組織に接触、あるいは近接するとすぐに溶解するおそれがある。 方法の別のクラスは、組織内に移植された後、剛性が低減する新規プローブ基板材料を使用する。このような材料は、形状記憶ポリマー15と機械的に適応ナノ複合材料16を含む。これらの材料は、挿入後の弾性率が著しく低下することができ、より密接にMATCプローブをもたらすことができる時間神経組織の機械的特性。しかしながら、剛性の達成可能な範囲は依然として限られているので、シリコン又はタングステンワイヤに非常に高い剛性と等価を提供することができない可能性がある。極めて低い剛性を有する非常に長い（ 例えば、&gt; 3 mm）であるか、または可撓性のプローブの場合には、一時的に、より剛性の補強材を取り付ける方法が依然として必要とされ得る。 報告されたまた別の有望な方法は、コーティングするために、シャトルと柔軟なプローブ17との間の表面の相互作用をカスタマイズするための恒久的な自己組織化単分子膜（SAM）で補強シャトルです。乾燥時には、プローブは静電塗装、シャトルに準拠しています。挿入後、水をシャトルが抽出できるように、シャトルからプローブを分離する、親水性表面上に移行する。減少プローブ変位とのシャトル抽出（85μm）を実証した。ただし、静電相互作用がTにプローブを保持した彼シャトルは、挿入前との間にシャトルに比べてプローブの滑りのいくつかのリスクがあります。 我々は、可撓性プローブ​​がしっかりと挿入中にプローブを保持するテンポラリ生体溶解性接着材料を有する補強材に付着させる方法を開発した。使用したプローブは2-4 GPaの程度の弾性率を有するポリイミドで作られていた。補強材を約200 GPaの弾性率と、シリコンから製造した。取り付けられたとき、シリコンの剛性は、挿入を容易にする、支配する。一度組織に挿入、接着材料は溶解し、補強材は、その初期の柔軟性にプローブを復元するために抽出される。我々は、生体溶解性接着材料として、ポリエチレングリコール（PEG）を選択した。 PEGは、例えば、神経プローブ、組織工学、薬物送達11,18,19等の移植された用途で使用されている。いくつかの証拠は、PEGは、脳内の神経炎症応答を弱める可能性が示唆されました組織18,20。スクロース、ポリ乳酸 - コ - グリコール酸（PLGA）、およびポリビニルアルコール（PVA）を含む他の可能な材料に比べ、PEGの順に（多くのインプラント手術のために適切なスケールである生物学的液体中の溶解時間を有する分子量に応じて数十分）。また、50〜65℃の範囲の温度、室温と液体で固体このプロパティは、我々の精密組立プロセスのために特に適している。また、SAMと同様の17に記載され、溶解したPEGは、補強材の抽出を容易にする、親水性である。この有利なアプローチは、均一な接着剤の適用範囲および正確で再現性のある位置合わせを確実に新たな補強材の設計および系統的な組立工程で有効になっています。組立工程に加えて、我々は、手術中に取り外し可能な補強材を実現する方法、ならびにSTIの抽出を評価するためのインビトロ手順を示しffener。 ここに提示されたプロトコルは、ユーザーが柔軟なポリマー微小電極プローブを有していることを前提としています。補強材は、このプローブの補強材とアセンブリの製造を関連プロトコルの一部は、微細加工施設で見られる一般的なツールへのアクセスを前提としています。挿抜に関するプロトコルは、おそらく神経科学指向の実験室で行われることになる。

<table border="1">
		<tbody>
		 <tr>
			<td>Name of Reagent/Material</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Polyethylene glycol, 10,000 g/mol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>309028</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A9539</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Flexible Sub-micron Die Bonder</td>
			<td>Finetech</td>
			<td>Fineplacer lambda</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Micromanipulator</td>
			<td>KOPF</td>
			<td>1760-61</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Digital Microscope</td>
			<td>Hirox</td>
			<td>KH-7700</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Dual Illumination Revolver Zoom Lens</td>
			<td>Hirox</td>
			<td>MXG-2500REZ</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Precision Motorized Actuator</td>
			<td>Newport</td>
			<td>LTA-HS</td>
			<td>w/ CONEX-CC controller</td>
		 </tr>
		</tbody>
 </table>

insertion of flexible neural probes using rigid stiffeners attached with biodissolvable adhesive

生体適合性の薄膜ポリマーから作られる神経インタフェースデバイス用の微小電極アレイは、可撓性材料は、微動により引き起こされる有害な組織反応を最小限に抑えることができるので、機能的な寿命を延長していることが期待される。しかしながら、それらの柔軟性は、正確に神経組織内に挿入されるのを防止する。この記事では、一時的にプローブを正確に、外科的挿入を容易にするために、生体溶解性ポリエチレングリコール（PEG）を使用し、剛性補強材に柔軟な微小電極プローブを接続する方法を示しています。ユニークな補強材の設計は、プローブの長さに沿ったPEG接着剤の均一な分布を可能にする。フリップチップ、マイクロエレクト​​ロニクスのパッケージで使用される一般的なツールは、補強材への正確で再現性の高いアライメントとプローブの取り付けを可能にします。プローブおよび補強材を外科その後PEGは補強材がプローブを出る抽出できるように溶解させ、一緒に移植される所定の位置に。最後に、 インビトロ試験法は、脳組織のアガロースゲルモデルにおける補強材抽出を評価するために使用される。移植のこのアプローチは、長い柔軟なプローブ（&gt; 3ミリメートル）のために特に有利であることが判明している。また、両面フレキシブルなプローブを注入する実現可能な方法を提供する。今日まで、この技術は、ラット皮質からの種々 の生体内の記録データを取得するために使用されている。

この挿入技術は、ISO 10993生体適合性基準に合格しており、慢性の移植のために意図されているLLNL薄膜ポリイミドプローブと組み合わせて使用​​した。典型的な薄膜ポリイミドプローブは、狭い領域での長約10mmであるシリコン補強材と共に図1に示されている。 図2に示すように、この補強材は、その長さに沿って実行される1つウィッキングチャネルを?...

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Insertion of Flexible Neural Probes Using Rigid Stiffeners Attached with Biodissolvable Adhesive

柔軟な神経微小電極プローブの挿入は、ポリエチレングリコール（PEG）を有する剛性補剛材にプローブを取り付けることによって有効になっている。独自の組立工程は、均一で再現性のある添付ファイルを確実にします。組織内に挿入した後、PEGを溶解し、補強材を抽出する。 インビトロ試験法は、アガロースゲル中の技術を評価する。

生体溶解性接着剤で取り付けられている硬質補強材を用いた柔軟神経プローブの挿入

Microelectrode  arrays for neural interface devices that are made of biocompatible thin-film  polymer are expected to have extended functional lifetime ...

insertion-flexible-neural-probes-using-rigid-stiffeners-attached-with

Research

JoVE Journal

Bioengineering

14.6K ビュー.  Lawrence Livermore National Laboratory. 柔軟な神経微小電極プローブの挿入は、ポリエチレングリコール（PEG）を有する剛性補剛材にプローブを取り付けることによって有効になっている。独自の組立工程は、均一で再現性のある添付ファイルを確実にします。組織内に挿入した後、PEGを溶解し、補強材を抽出する。 インビトロ試験法は、アガロースゲル中の技術を評価する。 

ビデオ: Insertion of Flexible Neural Probes Using Rigid Stiffeners Attached with Biodissolvable Adhesive

Attaching Biological Probes to Silica Optical Biosensors Using Silane Coupling Agents

In order to interface with biological environments, biosensor platforms, such as the popular Biacore system (based on the Surface Plasmon Resonance (SPR) technique), make use of various surface modification techniques, that can, for example, prevent surface fouling, tune the hydrophobicity / hydrophilicity of the surface, adapt to a variety of electronic environments, and most frequently, induce specificity towards a target of interest.1-5 These techniques extend the functionality of otherwise highly sensitive biosensors to real-world applications in complex environments, such as blood, urine, and wastewater analysis.2,6-7 While commercial biosensing platforms, such as Biacore, have well-understood, standard techniques for performing such surface modifications, these techniques have not been translated in a standardized fashion to other label-free biosensing platforms, such as Whispering Gallery Mode (WGM) optical resonators.8-9
WGM optical resonators represent a promising technology for performing label-free detection of a wide variety of species at ultra-low concentrations.6,10-12 The high sensitivity of these platforms is a result of their unique geometric optics: WGM optical resonators confine circulating light at specific, integral resonance frequencies.13 Like the SPR platforms, the optical field is not totally confined to the sensor device, but evanesces; this "evanescent tail" can then interact with species in the surrounding environment. This interaction causes the effective refractive index of the optical field to change, resulting in a slight, but detectable, shift in the resonance frequency of the device. Because the optical field circulates, it can interact many times with the environment, resulting in an inherent amplification of the signal, and very high sensitivities to minor changes in the environment.2,14-15
To perform targeted detection in complex environments, these platforms must be paired with a probe molecule (usually one half of a binding pair, e.g. antibodies / antigens) through surface modification.2 Although WGM optical resonators can be fabricated in several geometries from a variety of material systems, the silica microsphere is the most common. These microspheres are generally fabricated on the end of an optical fiber, which provides a "stem" by which the microspheres can be handled during functionalization and detection experiments. Silica surface chemistries may be applied to attach probe molecules to their surfaces; however, traditional techniques generated for planar substrates are often not adequate for these three-dimensional structures, as any changes to the surface of the microspheres (dust, contamination, surface defects, and uneven coatings) can have severe, negative consequences on their detection capabilities. Here, we demonstrate a facile approach for the surface functionalization of silica microsphere WGM optical resonators using silane coupling agents to bridge the inorganic surface and the biological environment, by attaching biotin to the silica surface.8,16 Although we use silica microsphere WGM resonators as the sensor system in this report, the protocols are general and can be used to functionalize the surface of any silica device with biotin.

Biosensors interface with complex, biological environments and perform targeted detection by combining highly sensitive sensors with highly specific probes attached to the sensor via surface modification. Here, we demonstrate the surface functionalization of silica optical sensors with biotin using silane coupling agents to bridge the sensor and the biological environment.

シランカップリング剤を用いた石英系光バイオセンサーへの生物学的プローブの取り付け

In order to interface with biological environments, biosensor platforms, such as the popular Biacore system (based on the Surface Plasmon Resonance (SPR) ...

生物工学

Micropipette Aspiration of Substrate-attached Cells to Estimate Cell Stiffness

Growing number of studies show that biomechanical properties of individual cells play major roles in multiple cellular functions, including cell proliferation, differentiation, migration and cell-cell interactions. The two key parameters of cellular biomechanics are cellular deformability or stiffness and the ability of the cells to contract and generate force. Here we describe a quick and simple method to estimate cell stiffness by measuring the degree of membrane deformation in response to negative pressure applied by a glass micropipette to the cell surface, a technique that is called Micropipette Aspiration or Microaspiration.
Microaspiration is performed by pulling a glass capillary to create a micropipette with a very small tip (2-50 &mu;m diameter depending on the size of a cell or a tissue sample), which is then connected to a pneumatic pressure transducer and brought to a close vicinity of a cell under a microscope. When the tip of the pipette touches a cell, a step of negative pressure is applied to the pipette by the pneumatic pressure transducer generating well-defined pressure on the cell membrane. In response to pressure, the membrane is aspirated into the pipette and progressive membrane deformation or "membrane projection" into the pipette is measured as a function of time. The basic principle of this experimental approach is that the degree of membrane deformation in response to a defined mechanical force is a function of membrane stiffness. The stiffer the membrane is, the slower the rate of membrane deformation and the shorter the steady-state aspiration length.The technique can be performed on isolated cells, both in suspension and substrate-attached, large organelles, and liposomes.
Analysis is performed by comparing maximal membrane deformations achieved under a given pressure for different cell populations or experimental conditions. A "stiffness coefficient" is estimated by plotting the aspirated length of membrane deformation as a function of the applied pressure. Furthermore, the data can be further analyzed to estimate the Young's modulus of the cells (E), the most common parameter to characterize stiffness of materials. It is important to note that plasma membranes of eukaryotic cells can be viewed as a bi-component system where membrane lipid bilayer is underlied by the sub-membrane cytoskeleton and that it is the cytoskeleton that constitutes the mechanical scaffold of the membrane and dominates the deformability of the cellular envelope. This approach, therefore, allows probing the biomechanical properties of the sub-membrane cytoskeleton.

Here we describe a quick and simple method to measure cell stiffness. The general principle of this approach is to measure membrane deformation in response to well-defined negative pressure applied through a micropipette to the cell surface. This method provides a powerful tool to study biomechanical properties of substrate-attached cells.

セルの剛性を推定するために基板に接続された細胞のマイクロピペット吸引

Growing number of studies show that biomechanical properties of individual cells play major roles in multiple cellular functions, including cell ...

Creating Adhesive and Soluble Gradients for Imaging Cell Migration with Fluorescence Microscopy

Cells can sense and migrate towards higher concentrations of adhesive cues such as the glycoproteins of the extracellular matrix and soluble cues such as growth factors. Here, we outline a method to create opposing gradients of adhesive and soluble cues in a microfluidic chamber, which is compatible with live cell imaging. A copolymer of poly-L-lysine and polyethylene glycol (PLL-PEG) is employed to passivate glass coverslips and prevent non-specific adsorption of biomolecules and cells. Next, microcontact printing or dip pen lithography are used to create tracks of streptavidin on the passivated surfaces to serve as anchoring points for the biotinylated peptide arginine-glycine-aspartic acid (RGD) as the adhesive cue. A microfluidic device is placed onto the modified surface and used to create the gradient of adhesive cues (100% RGD to 0% RGD) on the streptavidin tracks. Finally, the same microfluidic device is used to create a gradient of a chemoattractant such as fetal bovine serum (FBS), as the soluble cue in the opposite direction of the gradient of adhesive cues.

A method for the assembly of adhesive and soluble gradients in a microscopy chamber for live cell migration studies is described. The engineered environment combines antifouling surfaces and adhesive tracks with solution gradients and therefore allows one to determine the relative importance of guidance cues.

蛍光顕微鏡を用いたイメージング細胞遊走用接着剤及び可溶性グラデーションを作成する

Cells can sense and migrate towards higher concentrations of adhesive cues such as the glycoproteins of the extracellular matrix and soluble cues such as ...

Fabrication and Implantation of Miniature Dual-element Strain Gages for Measuring In Vivo Gastrointestinal Contractions in Rodents.

Gastrointestinal dysfunction remains a major cause of morbidity and mortality. Indeed, gastrointestinal (GI) motility in health and disease remains an area of productive research with over 1,400 published animal studies in just the last 5 years. Numerous techniques have been developed for quantifying smooth muscle activity of the stomach, small intestine, and colon. In vitro and ex vivo techniques offer powerful tools for mechanistic studies of GI function, but outside the context of the integrated systems inherent to an intact organism. Typically, measuring in vivo smooth muscle contractions of the stomach has involved an anesthetized preparation coupled with the introduction of a surgically placed pressure sensor, a static pressure load such as a mildly inflated balloon or by distending the stomach with fluid under barostatically-controlled feedback. Yet many of these approaches present unique disadvantages regarding both the interpretation of results as well as applicability for in vivo use in conscious experimental animal models. The use of dual element strain gages that have been affixed to the serosal surface of the GI tract has offered numerous experimental advantages, which may continue to outweigh the disadvantages. Since these gages are not commercially available, this video presentation provides a detailed, step-by-step guide to the fabrication of the current design of these gages. The strain gage described in this protocol is a design for recording gastric motility in rats. This design has been modified for recording smooth muscle activity along the entire GI tract and requires only subtle variation in the overall fabrication. Representative data from the entire GI tract are included as well as discussion of analysis methods, data interpretation and presentation.

Fabrication and Implantation of Miniature Dual-element Strain Gages for Measuring In Vivo Gastrointestinal Contractions in Rodents.

The in vivo measurement of smooth muscle contractions along the gastrointestinal tract of laboratory animals remains a powerful, though underutilized, technique. Flexible, dual element strain gages are not commercially available and require fabrication. This protocol describes the construction of reliable, inexpensive strain gages for acute or chronic implantation in rodents.

測定するための小型のデュアルエレメントひずみゲージの作製と移植<em&gt;インビボ</em&gt;げっ歯類における消化管収縮。

Gastrointestinal dysfunction remains a major cause of morbidity and mortality. Indeed, gastrointestinal (GI) motility in health and disease remains an ...

Using Adhesive Patterning to Construct 3D Paper Microfluidic Devices

We demonstrate the use of patterned aerosol adhesives to construct both planar and nonplanar 3D paper microfluidic devices. By spraying an aerosol adhesive through a metal stencil, the overall amount of adhesive used in assembling paper microfluidic devices can be significantly reduced. We show on a simple 4-layer planar paper microfluidic device that the optimal adhesive application technique and device construction style depends heavily on desired performance characteristics. By moderately increasing the overall area of a device, it is possible to dramatically decrease the wicking time and increase device success rates while also reducing the amount of adhesive required to keep the device together. Such adhesive application also causes the adhesive to form semi-permanent bonds instead of permanent bonds between paper layers, enabling single-use devices to be non-destructively disassembled after use. Nonplanar 3D origami devices also benefit from the semi-permanent bonds during folding, as it reduces the likelihood that unrelated faces may accidently stick together. Like planar devices, nonplanar structures see reduced wicking times with patterned adhesive application vs uniformly applied adhesive.

We demonstrate the use of patterned aerosol adhesives to construct 3D paper microfluidic devices. This method of adhesive application forms semi-permanent bonds between layers, enabling single-use devices to be non-destructively disassembled after use and to ease folding complex nonplanar structures.

3Dペーパーマイクロ流体デバイスを構築するために接着剤パターニングを使用して、

We demonstrate the use of patterned aerosol adhesives to construct both planar and nonplanar 3D paper microfluidic devices. By spraying an aerosol ...

Force System with Vertical V-Bends: A 3D In Vitro Assessment of Elastic and Rigid Rectangular Archwires

A proper understanding of the force system created by various orthodontic appliances can make treatment of patients efficient and predictable. Reducing the complicated multi-bracket appliances to a simple two-bracket system for the purpose of force system evaluation will be the first step in this direction. However, much of the orthodontic biomechanics in this regard is confined to 2D experimental studies, computer modeling/analysis or theoretical extrapolation of existing models. The objective of this protocol is to design, construct and validate an in vitro 3D model capable of measuring the forces and moments generated by an archwire with a V-bend placed between two brackets. Additional objectives are to compare the force system generated by different types of archwires among themselves and to previous models. For this purpose, a 2 x 4 appliance representing a molar and an incisor has been simulated. An orthodontic wire tester (OWT) is constructed consisting of two multi-axis force transducers or load cells (nanosensors) to which the orthodontic brackets are attached. The load cells are capable of measuring the force system in all the three planes of space. Two types of archwires, stainless-steel and beta-titanium of three different sizes (0.016 x 0.022 inch, 0.017 x 0.025 inch and 0.019 x 0.025 inch), are tested. Each wire receives a single vertical V-bend systematically placed at a specific position with a predefined angle. Similar V-bends are replicated on different archwires at 11 different locations between the molar and incisor attachments. This is the first time an attempt has been made in vitro to simulate an orthodontic appliance utilizing V-bends on different archwires.

Force System with Vertical V-Bends: A 3D In Vitro Assessment of Elastic and Rigid Rectangular Archwires

The method presented here is designed to construct and validate an in vitro 3D model capable of measuring the force system generated by different archwires with V-bends placed between two brackets. Additional objectives are to compare this force system with different types of archwires and to previous models.

強制的に垂直 V ベンドとシステム: 弾性体と剛体の長方形型の 3 Dの in Vitro評価

A proper understanding of the force system created by various orthodontic appliances can make treatment of patients efficient and predictable. Reducing ...

Rat Model of Adhesive Capsulitis of the Shoulder

This proposal aims to create an in vivo rat model of adhesive capsulitis for researching potential treatment options for this condition and other etiologies of comparable arthrofibrosis. The model includes extra-articular fixation of the shoulder in rats via scapular to humeral suturing, resulting in a secondary contracture without invading the intra-articular space and resulting in decreased rotational ROM and increased joint stiffness.
We used 10 Sprague-Dawley rats for the purpose of this study. Baseline ROM measurements were taken before glenohumeral immobilization. The rats were subjected to 8 weeks of immobilization before the fixation sutures were removed and changes in ROM and joint stiffness were evaluated. To evaluate whether immobilization resulted in a significant reduction in ROM, changes in kinematics were calculated. ROM was measured at each time point in the follow-up period and was compared to the baseline internal and external ROM measurements. In order to evaluate the stiffness, joint kinetics were calculated by determining the differences in torque (text and tint ) needed to reach the initial external rotation of 60&#176; and initial internal rotation of 80&#176;.
After the removal of the extra-articular suture fixation on follow-up day 0, we found a 63% decrease in total ROM compared to baseline. We observed continuous improvement until week 5 of follow-up, with the progress slowing down around a 19% restriction. On week 8 of follow-up, there was still an 18% restriction of ROM. Additionally, on follow-up day 0, we found the torque increased by 13.3 Nmm when compared to baseline. On week 8, the total torque was measured to be 1.4 &#177; 0.2 Nmm higher than initial measurements. This work introduces a rat model of shoulder adhesive capsulitis with lasting reduced ROM and increased stiffness.

This protocol presents an in vivo rat model of adhesive capsulitis. The model includes an internal fixation of the glenohumeral joint with extra-articular suture fixation for an extended time, resulting in a decreased rotational range of motion (ROM) and increased joint stiffness.

肩の接着剤の被膜のモデルラット

This proposal aims to create an in vivo rat model of adhesive capsulitis for researching potential treatment options for this condition and other ...

Increasing Durability of Dissociated Neural Cell Cultures Using Biologically Active Coralline Matrix

Cultures of dissociated hippocampal neuronal and glial cells are a valuable experimental model for studying neural growth and function by providing high cell isolation and a controlled environment. However, the survival of hippocampal cells in vitro is compromised: most cells die during the first week of culture. It is therefore of great importance to identify ways to increase the durability of neural cells in culture.
Calcium carbonate in the form of crystalline aragonite derived from the skeleton of corals can be used as a superior, active matrix for neural cultures. By nurturing, protecting, and activating glial cells, the coral skeleton enhances the survival and growth of these cells in vitro better than other matrices.
This protocol describes a method for cultivating hippocampal cells on a coralline matrix. This matrix is generated by attaching grains of coral skeletons to culture dishes, flasks, and glass coverslips. The grains assist in improving the environment of the cells by introducing them to a fine three-dimensional (3D) environment to grow on and to form tissue-like structures. The 3D environment introduced by the coral skeleton can be optimized for the cells by grinding, which enables control over the size and density of the grains (i.e., the matrix roughness), a property that has been found to influence glial cells activity. Moreover, the use of grains makes the observation and analysis of the cultures easier, especially when using light microscopy. Hence, the protocol includes procedures for generation and optimization of the coralline matrix as a tool to improve the maintenance and functionality of neural cells in vitro.

Dissociated hippocampal cell culture is a pivotal experimental tool in neuroscience. Neural cell survival and function in culture is enhanced when coralline skeletons are used as matrices, due to their neuroprotective and neuromodulative roles. Hence, neural cells grown on coralline matrix show higher durability, and thereby are more adequate for culturing.

生物学的に活性なサンゴリンマトリックスを用いた解離神経細胞培養の耐久性向上

Cultures of dissociated hippocampal neuronal and glial cells are a valuable experimental model for studying neural growth and function by providing high ...

Automated Two-dimensional Spatiotemporal Analysis of Mobile Single-molecule FRET Probes

Single-molecule F&#246;rster resonance energy transfer (smFRET) is a versatile technique reporting on distances in the sub-nanometer to nanometer range. It has been used in a wide range of biophysical and molecular biological experiments, including the measurement of molecular forces, characterization of conformational dynamics of biomolecules, observation of intracellular colocalization of proteins, and determination of receptor-ligand interaction times. In a widefield microscopy configuration, experiments are typically performed using surface-immobilized probes. Here, a method combining single-molecule tracking with alternating excitation (ALEX) smFRET experiments is presented, permitting the acquisition of smFRET time traces of surface-bound, yet mobile probes in plasma membranes or glass-supported lipid bilayers. For the analysis of recorded data, an automated, open-source software collection was developed supporting (i) the localization of fluorescent signals, (ii) single-particle tracking, (iii) determination of FRET-related quantities including correction factors, (iv) stringent verification of smFRET traces, and (v) intuitive presentation of the results. The generated data can conveniently be used as input for further exploration via specialized software, e.g., for the assessment of the diffusional behavior of probes or the investigation of FRET transitions.

This article presents a method for spatiotemporal analysis of mobile, single-molecule F&#246;rster resonance energy transfer (smFRET)-based probes using widefield fluorescence microscopy. The newly developed software toolkit allows the determination of smFRET time traces of moving probes, including the correct FRET efficiency and the molecular positions, as functions of time.

モバイル1分子フレットプローブの自動二次元時空間解析

Single-molecule F&#246;rster resonance energy transfer (smFRET) is a versatile technique reporting on distances in the sub-nanometer to nanometer range. ...

A Flexible Chamber for Time-Lapse Live-Cell Imaging with Stimulated Raman Scattering Microscopy

Stimulated Raman scattering (SRS) microscopy is a label-free chemical imaging technology. Live-cell imaging with SRS has been demonstrated for many biological and biomedical applications. However, long-term time-lapse SRS imaging of live cells has not been widely adopted. SRS microscopy often uses a high numerical aperture (NA) water-immersion objective and a high NA oil-immersion condenser to achieve high-resolution imaging. In this case, the gap between the objective and the condenser is only a few millimeters. Therefore, most commercial stage-top environmental chambers cannot be used for SRS imaging because of their large thickness with a rigid glass cover. This paper describes the design and fabrication of a flexible chamber that can be used for time-lapse live-cell imaging with transmitted SRS signal detection on an upright microscope frame. The flexibility of the chamber is achieved by using a soft material - a thin natural rubber film. The new enclosure and chamber design can be easily added to an existing SRS imaging setup. The testing and preliminary results demonstrate that the flexible chamber system enables stable, long-term, time-lapse SRS imaging of live cells, which can be used for various bioimaging applications in the future.

We report a stage-top, flexible environmental chamber for time-lapse imaging of live cells using upright stimulated Raman scattering microscopy with transmitted signal detection. Lipid droplets were imaged in SKOV3 cells treated with oleic acid for up to 24 h with a 3 min time interval.

刺激ラマン散乱顕微鏡によるタイムラプス生細胞イメージングのための柔軟なチャンバー

Stimulated Raman scattering (SRS) microscopy is a label-free chemical imaging technology. Live-cell imaging with SRS has been demonstrated for many ...