著者は、技術的なサポートのためにニコールHasenkampfとアマンダタルドのに感謝したいと思います。我々はまた、博士に感謝します。キャピラリー供給方法の指示のためのリンデン胡とアドリアーナマルケスLeFlapの封じ込め装置の推薦のために、博士リセGern。この作品は、NIH / NCRRグラント8 P20 GM103458-09（MEE）によりおよび研究資源のための国民の中心および付与P51OD011104/P51RR000164を通じて国立衛生研究所の研究基盤プログラムの事務所（のoriP）によってサポートされていました。

ライム病の研究のための動物の際ダニ接種および給餌の実験的な概要を図1に示されている。 1。 Bと接種幼虫マダニティックキャピラリーチューブの供給を使用して、 ドルフェリ ダニとの操作を行う際には、弾性スリーブ、手袋、使い捨てフワフワキャップ白い白衣を着用されています。 <ol><li>我々の技術は、ブロードウォーターらによって報告されているものの修正版である。49。ピペットプラーを使用して薄さを破るにパスツールピペットを加熱し、引いて毛細管を準備します。鉗子を使用してスコープを解剖して、最適な直径（約0.2mm）にヒントを破る。ダニの口器サイズに標準化管をサイジングガイドとして使用される。ピペットを準備する際にフェイスシールドを着用してください。 </li><li> B.を育てるBSK-H培地中で10×2-8間7 / mlの（位相を中間対数）（シグマ）CONにドルフェリ6％ウサギ血清をtaining。 </li><li> 4-6週間後、幼虫の脱皮のために23℃で保存されてきた幼虫ティックを使用してください。場所は、皿の外底面に両面テープで小さな60×15ミリメートルペトリ皿の上に刻みます。腹側を上に向けティックを配置します。 </li><li> B.内に毛細管先端を浸し混合後のライム病培養管。解剖スコープを使用したダニの口の部分の口円錐の上に毛細管を配置します。 図2Aに示すように、適所に管を固定する成形粘土を使用する。 </li><li>封じ込めの追加のレベルの大規模な透明なプラスチック製の浴槽内に貼付ティックでペトリ皿を置きます。湿った紙タオルに水分を提供するために添加される。排便が明白になるまで、30分〜2時間37℃の熱インキュベーター内でダニを置きます。これはスピロヘータを含むメディアはダニを通過したことを示しています。 </li><li>授乳する前に、ダニの環境への適応を可能にするために23℃で2〜4週間ティックを休ま動物にそれら。 </li></ol> 2。 B.をマウスに感染させるダニによるドルフェリ <ol><li>滅菌水にケタミン株式1:10に希釈する。ツベルクリン注射器で腹腔内注射によるケタミン100 mg / kgの各マウスを麻酔</li><li>マウスが完全に麻酔されると、バック（レミントンがスムーズ＆シルキー）電気トリマー罰金を使用して中央に耳からマウスを剃る。 </li><li>他のオブジェクトとの白パンに近く、マウスの毛のない部分に湿らせた絵筆で若ダニ（その港のB.ブルグドル ） を移す。または、感染していないダニは疑わしい感染によるマウスの外因診断法のためにマウスで配置することができます。ダニの配置のためのきれいな、白い表面の使用は、任意の未結合のダニが容易に理解されることを保証するのに役立ちます。 </li><li>専門的な監禁（アレン監禁、ペンシルバニア州アレンタウン）でマウスを置きます。監禁、ケージの底から上昇したステンレス鋼製のグリルで構成されています。 T彼はケージ上部が下にマウスの自由な動きを可能にするのに十分水のボトルホルダーを上昇させるために社内の機械工場によって変更された。パンは、トラップへの水の約2インチのマウス（ 図3A）から落下任意マダニが充填されている。マウスは、麻酔から完全に目覚めるまで低体温症の危険性を最小限に抑えるために、再利用可能なマイクロ波照射加熱パッドは、使用前に、ケージの下に配置されている。彼らは麻酔および食料や水トレー擦れから回復などの動物は、多くの場合、運動失調であるので、これらを削除する必要があります。水位が水没から​​のマウスの肢を防ぐのに十分に低い。 </li><li>節足動物の取り込みを確実にするために昆布トラップペースト（Contech、ビクトリア、BC州、カナダ）とテープが並んでてきたトレイの中にケージを置きます。マウスを単独でケージに入れ、麻酔の期間中に連続的に観察される。 </li><li>マウスは麻酔から完全に目を覚ましている時に2時間以内に、食品トレーや水のボトルケージに置き換えられます。 2の後に4時間後、プラスチック製の小屋とnylaboneからなる筐体濃縮は置き換えられます。 </li><li> 3、4、および5日後に、供給されたダニのためのマウス、ケージとケージの水を確認してください。ケージ水はホワイトメタルパン（ すなわち、「金のためにパンを」）を介してふるいにかけている。 FRBはきれいな水ですすいでダニやプラスチックの瓶（ 図3B）で保管してください。 3日目および4に、きれいな水でケージ内の水を交換してください。 5日目に、ケージが、ダニのために徹底的にマウスだけで確認してください。通常、この時点で、すべてのダニが送られてきたマウスは、通常の監禁に戻すことができます。 </li><li>オートクレーブ滅菌および処分のためのバイオハザード容器に、液体を含む、マウスのケージからすべての廃棄物を配置します。マウス、常に回復したものに配置されたティック数のログを保管してください。 </li></ol> 3。 Bと感染のヒト以外の霊長類でダニを供給ドルフェリまたは外因診断法<ol><li>ダニ封じ込め装置を準備します。3インチXの1.75インチ径の円をカット清潔なメスで、測定ガイドを使用して3インチのLeFlap（フラップ）。 BiataneフォームとDuodermに同じ大きさの円をカットするためのテンプレートとして、カットアウトを使用してください。発泡体は、皮膚の表面上にフラップを高め、ダニの可能な破砕を防止するために使用される。 Duodermはクッション性の別の層を追加し、ダニのエスケープから追加されたセキュリティのための封じ込め装置のエッジをオーバーレイします。収容装 ​​置の図を図4に示されている。 </li><li>獣医スタッフは筋肉内注射により5-8 mg / kgのテラゾールで動物を麻酔します。 </li><li>サイズ40のブレードを搭載した電気トリマー（オスター）を使用して、動物の毛クリップ。ジャケットでカ​​バーされるすべての領域が切り取られています。バック、フロント、二の腕を。シェービングクリームとデュアルブレードの使い捨てカミソリを使用して、密接×20センチ、横、縦約25cmの面積を剃る。湿ったペーパータオルで拭いてください、皮膚を乾燥させるために弱火で乾燥吹く。 </li><li> Tにフラップを配置彼は動物の背部、ちょうど肩甲骨下の背骨の両側に。その場所に円をトレースするためのマーカーを使用しています。 SkinPrepでよく拭き取って円周上の皮膚の領域を準備します。これは、接着剤と封じ込め機器の付着に影響を与える可能性があり、皮膚に油を除去します。円の周りの空間の1cmの周囲に残して〜4cmの幅で皮膚接着剤（SkinBond）の層を適用します。 </li><li> Biataneフォームから接着剤バッキングを取り外し、適切なスポットで皮膚に貼り付けます。動物は再び5 mg / kgのテラゾールで獣医スタッフによって麻酔する。皮膚接着剤とHypafixテープで端をシールします。フラップから接着剤バッキングを取り外し、Biataneの上に貼り付けます。 LeFlapのエッジの周りHypafixテープを置き、フラップのメッシュフラップを下にテープで固定し、動物にジャケットを置く。テープと昆布トラップペーストが追加されたセキュリティのための非ヒト霊長類監禁を取り巻く周囲の床に適用されます。 </li><li> chemicの影響を最小限に収容装置が適所にある後ダニ摂食ステップ3.4において使用するalsは、目盛は24時間後に添加される。この時点で、デバイスのセキュリティも検査し、必要に応じて補強されている。通常は、20非給餌幼虫（4〜8週間後の幼虫脱皮）​​がペイントブラシを使用してデバイス内の皮膚に追加されます。 </li><li>フラップのメッシュから接着剤バッキングを取り外し、所定の位置に密封する。最後に、接着剤を露出させDuodermバッキングを削除し、封じ込め装置の上に置きます。オープンメッシュサークル全体でHypafixテープの一部を追加し、ジャケットを交換してください。完成した収容装 ​​置は、 図5Aに示されている。 </li><li>ジャケットが除去されている上記のように、5日後、動物を麻酔。メッシュ（ 図5B）を介して供給するダニを検査する最初のテープを取り外します。慎重にフラップからDuodermの皮をむく。 </li><li>ダニへのアクセスを提供するためにエッジにメッシュ部分を引き戻す。 FRBのダニは頻繁に近くや下にあります泡のサークル（ 図5C）とは、ペイントブラシで除去し、きれいな水に配置されます。 （ 図5D）を1回表示されているすべてのFRBのダニが収集されたデバイスを削除します。 </li></ol>注：多くの場合、収容装置は、単に皮膚から剥離することができる。密着性が強く、潜在的に、皮膚に損傷を与えることができれば、Unisolve溶媒を穏やかな除去のための領域に適用される。肌をイソプロパノールで拭くとダニは23℃で保存する感染のために使用する場合、ダニはBを含まれている番号を確認するために粉砕することができますドルフェリ外因診断法のために使用した場合。、ダニ前腸内容物の分析に1-3週間保持されます。

著者は、彼らが競合する経済的利益を持っていないことを宣言します。

その港Bのティック得るために、下流の研究のためのライム病 、ダニ、（1）幼虫期に感染したマウスに与え、（2）Bに浸漬し幼虫や幼虫の段階48のいずれかでのライム病の文化、（3）Bに顕微注入47 ドルフェリ 、または（4）毛細管葉B.ブルグドル49。これらの方法の各々は、ダニの大部分が感染ハーバーB.に使用さ?...

2011年には、ライム病は、北米（第6回最も一般的な全国届出疾患だっ<a href="http://www.cdc.gov/lyme/stats/index.html" target="_blank">http://www.cdc.gov/lyme/stats/index.html</a> ）。B.ライム病は、両方の遺伝的および抗原的に（1に概説されている）、汎用性の高い微生物である。その遺伝子構成は、大規模な（&gt; 900 KB）染色体の分離株の間で様々なプラスミド含有量の21プラスミド（12線形、9円形）、までが含まれています。多くは、プラスミドのオープンリーディングフレームの90％がいずれかの既知の細菌配列2,3とは無関係であるように、このスピロヘータについて学んだことです。B.ライム病は、宿主免疫の潜在的な標的として多種多様な抗原を提示する。しかし、未処理の感染がしばしば持続する。ダニの環境と脊椎動物宿主環境とスピロヘータの相互作用は、Bでの適応が必要となる感染過程を通してブルグドル 。いくつかのプラスミドにコードさ遺伝子が示差的温度、pH、細胞密度およびダニのライフサイクル4-8の偶数段の変化に応答して発現することが知られている。 Bの研究自然経路による感染後のライム病の風土病サイクル全体での適応、および宿主応答は、適切な動物モデルでダニを養うための能力に依存しています。このような研究は、Bを抱くティックを生成する技術的な課題に満たされているライム病 、および効率的な伝送および/ ​​またはモデル·ホスト上のダニの供給を確実にする。また、感染したダニの封じ込めや回収が不可欠である。使用されるモデルの中ではライム病研究の貴重なツールとなって、それぞれがマウスとヒト以外の霊長類であり、。 Bの自然保有宿主である白い足マウスと同様に、 ライム病は 、実験用マウスは、Bで持続感染をサポートし、高度に感受性宿主であるブルグドル 9。 FOLこのようなC3H株として疾患感受性マウスの感染をlowing、スピロヘータは、皮膚、膀胱、筋肉、関節や心臓を含む複数の組織に広める。感染に対する炎症反応は、病気にかかった心臓や関節組織につながる。スピロヘータは、このホストに固執し、感染まま、炎症性病変ではなく、ヒトでのプロセスとは異なり、断続的になることがあります。マウスモデルは、このようB.上の多くの情報を提供している関節炎や心炎を含むライム病誘発性の病理学、および免疫応答を10月12日を開催。ダニベクトル13-21からの送信のためのいくつかは、必要に応じて持っている病原体の観点からは、差動で、哺乳動物の感染時に発現特定の遺伝子は、特徴付けられている。 いくつかの動物種は22ライム病を研究するために使用されてきたが、アカゲザルに最も近いヒト疾患23の多臓器文字を模倣する。他とは異なり、動物モデルは、例えば、遊走性紅斑、心炎、関節炎、および末梢および中枢神経系の神経障害などの疾患症状の幅は、マカクで観察される。 B.用マウスにおいて、リザーバホスト初期および後期-広め症状が9珍しくありながらライム病、疾患は、マウス系統、年齢24によって異なります。また、他のげっ歯類、ウサギ、イヌとは、全てのB.神経疾患を示すことができないドルフェリ感染症25。重要なのは、マカクはライムボレリア、すなわち、早期ローカライズされ、早期普及、および後期ライム病26〜28 3段階に特徴的な兆候を示す。遊走性紅斑（EM）は、ヒトの場合29の70〜80％に起こると考えられており、また、アカゲザル28,30に見られる。感染後、スピロヘータは、複数の臓器に接種部位から発信。スピロヘータDNAは、骨格ムーで検出されているscles、心臓、膀胱、末梢神経や神経叢のほか、中枢神経系（大脳、脳幹や小脳、脊髄および硬膜）31。 マウスを食べダニ貯水能力で32〜36を研究し 、Bの研究で、ダニのコロニーの増殖のために、私たちや他の研究チームによって利用されていますドルフェリ病因37〜40。この技術は、マウス41-44に外因診断法およびワクチンの有効性を試験するために使用されている。我々は、供給されたマダニはモデル開発28、ワクチンの有効性45の研究のため、および永続性抗生物質投与後の処置46の評価において外因診断法のためにヒト以外の霊長類にダニがある。その港B.ティックライム病はスピロヘータがライフステージを介して送信されるように、感染したマウスに幼虫を供給し、研究のためのニンフを使って、自然の地方病のサイクルを維持することができる。本報告書で、我々は、野生型または変異型Bで感染ダニを生成する方法について指示するライム病 、毛細管送りを用いて、これはまた、マイクロインジェクション47によって、浸漬48によって達成することができる。 Bの人工導入の目的マダニにブルグドルフェリは 、その透過率は不明である変異株を研究するために、高い感染率とのダニ群を生成するために、すっきりとし、そうでなければ、非感染ダニのコロニーを維持することにより、エラーの可能性を低減することができる。封じ込め及び充満マダニの回収を確実にするように加えて、我々は、マウスおよびヒト以外の霊長類を餌ティ​​ックを示す。ダニ供給の使用は、Bに対する免疫応答の将来の研究のために不可欠であるライム病感染、潜在的なライムワクチンの有効性、およびオカルト感染の検出のための外因診断法。

<table border="1">
		<tbody>
		 <tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Reagent</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>BSK-H</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B-8291</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Ketamine HCl</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Tangle Trap coating Paste</td>
			<td>Ladd research</td>
			<td>T-131</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>SkinPrep</td>
			<td>Allegro Medical Supplies</td>
			<td>177364</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>LeFlap, 3" x 3"</td>
			<td>Monarch Labs</td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Hypafix tape</td>
			<td>Allegro Medical Supplies</td>
			<td>191523</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>SkinBond</td>
			<td>Allegro Medical Supplies</td>
			<td>554536</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>UniSolve</td>
			<td>Allegro Medical Supplies</td>
			<td>176640</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Biatane Foam, adhesive 4"x4"</td>
			<td>Coloplast</td>
			<td>3420</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>DuoDerm CGF Dressing - 4" x 4", (3/4)" adhesive border </td>
			<td>Convatec</td>
			<td>187971 </td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Nonhuman primate jackets with flexible 2" back panels; add drawstrings at top and bottom</td>
			<td>Lomir Biomedical Inc.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>EQUIPMENT </td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Pipet puller</td>
			<td>David Kopf Instruments</td>
			<td>Model 700C</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Dark field microscope</td>
			<td>Leitz Wetzlar</td>
			<td>Dialux</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Dissecting microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>Zoom 2000</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Mouse caging</td>
			<td>Allentown caging</td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		</tbody>
 </table>

feeding of ticks on animals for transmission and xenodiagnosis in lyme disease research

ライム病、 ボレリア·ブルグドルフェリの病原体の伝達は、哺乳動物宿主に目盛りマダニ種の付着および吸血によって起こる。自然界では、この人獣共通細菌性病原体は、リザーバ様々な宿主を使用することができますが、白い足マウス（ シロアシマウス ） は 、北米で幼虫と幼虫ダニの主要な貯水池である。人間は最も頻繁にBに感染した付随的な宿主である幼虫の段階でダニに咬まによるドルフェリ。B.ライム病は風土病サイクルを通じて、そのホストに適応するため、これらのスピロヘータの機能や哺乳類宿主への影響を調査する機能は、ダニの摂食を使用する必要があります。また、（検出および感染性物質の回収のための自然なベクターを用いて）外因診断法の技術が不可解な感染症の研究に有用であった。得るために、幼虫は、その港B.ダニライム病 、ダニは、キャピラリーチューブを通して文化の中で生きスピロヘータを与えている。 2つの動物モデルは、マウスおよびヒト以外の霊長類は、最も一般的にはダニ摂食を伴うライム病の研究のために使用される。我々は、これらのダニが上に供給され、感染または外因診断法のいずれかのために動物から回収することができる方法を実証する。

これらは、送信のために動物に供給される前に、毛管供給終了後、ダニは通常、2〜3週間、23℃で休息している。毛管給技術を用いて、我々は摂食の90％が港B.ダニことを見出したブルグドル。正ダニの割合は、洗浄することにより決定され、その後マイクロチューブ形乳棒で滅菌PBSでそれらを破砕、過酸化物及びエタノールに刻みます。スライド上に固定し、FITCコンジュゲート?...

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Feeding of Ticks on Animals for Transmission and Xenodiagnosis in Lyme Disease Research

ライム病は、北米で最も一般的に報告された媒介疾患である。原因物質、 ボレリア·ブルグドルフェリティックマダニによって送信されたスピロヘータ細菌である。動物モデルでの感染の伝播および検出は、我々はここで説明するダニ送り、使用することによって最適化されています。

ライム病研究における送信および外因診断法のために動物にダニの摂食

Transmission of the etiologic agent of Lyme disease, Borrelia burgdorferi, occurs by the  attachment and blood feeding of Ixodes species ticks on ...

feeding-ticks-on-animals-for-transmission-xenodiagnosis-lyme-disease

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

13.1K ビュー.  Tulane University Health Sciences Center. ライム病は、北米で最も一般的に報告された媒介疾患である。原因物質、 ボレリア·ブルグドルフェリティックマダニによって送信されたスピロヘータ細菌である。動物モデルでの感染の伝播および検出は、我々はここで説明するダニ送り、使用することによって最適化されています。 

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RNA Interference in Ticks

Ticks are obligate hematophagous ectoparasites of wild and domestic animals and humans, and are considered to be second worldwide to mosquitoes as vectors of human diseases1 and the most important vectors affecting cattle industry worldwide2. Ticks are classified in the subclass Acari, order Parasitiformes, suborder Ixodida and are distributed worldwide from Arctic to tropical regions3. Despite efforts to control tick infestations, these ectoparasites remain a serious problem for human and animal health4,5.
RNA interference (RNAi)6 is a nucleic acid-based reverse genetic approach that involves disruption of gene expression in order to determine gene function or its effect on a metabolic pathway. Small interfering RNAs (siRNAs) are the effector molecules of the RNAi pathway that is initiated by double-stranded RNA (dsRNA) and results in a potent sequence-specific degradation of cytoplasmic mRNAs containing the same sequence as the dsRNA trigger7-9. Post-transcriptional gene silencing mechanisms initiated by dsRNA have been discovered in all eukaryotes studied thus far, and RNAi has been rapidly developed in a variety of organisms as a tool for functional genomics studies and other applications10.
RNAi has become the most widely used gene-silencing technique in ticks and other organisms where alternative approaches for genetic manipulation are not available or are unreliable5,11. The genetic characterization of ticks has been limited until the recent application of RNAi12,13. In the short time that RNAi has been available, it has proved to be a valuable tool for studying tick gene function, the characterization of the tick-pathogen interface and the screening and characterization of tick protective antigens14. Herein, a method for RNAi through injection of dsRNA into unfed ticks is described. It is likely that the knowledge gained from this experimental approach will contribute markedly to the understanding of basic biological systems and the development of vaccines to control tick infestations and prevent transmission of tick-borne pathogens15-19.

A method for RNA interference (RNAi) by injection of dsRNA into unfed ticks is described. RNAi is the most widely used gene-silencing technique in ticks where the use of other methods of genetic manipulation has been limited.

ダニのRNA干渉

Ticks are obligate hematophagous ectoparasites of wild and domestic animals and humans, and are considered to be second worldwide to mosquitoes as vectors ...

免疫・感染学

Methods for Rapid Transfer and Localization of Lyme Disease Pathogens Within the Tick Gut

Lyme disease is caused by infection with the spirochete pathogen Borrelia burgdorferi, which is maintained in nature by a tick-rodent infection cycle 1. A tick-borne murine model 2 has been developed to study Lyme disease in the laboratory. While na&iacute;ve ticks can be infected with B. burgdorferi by feeding them on infected mice, the molting process takes several weeks to months to complete. Therefore, development of more rapid and efficient tick infection techniques, such as a microinjection-based procedure, is an important tool for the study of Lyme disease 3,4. The procedure requires only hours to generate infected ticks and allows control over the delivery of equal quantities of spirochetes in a cohort of ticks. This is particularly important as the generation of B. burgdorferi infected ticks by the natural feeding process using mice fails to ensure 100% infection rate and potentially results in variation of pathogen burden amongst fed ticks. Furthermore, microinjection can be used to infect ticks with B. burgdorferi isolates in cases where an attenuated strain is unable to establish infection in mice and thus can not be naturally acquired by ticks 5. This technique can also be used to deliver a variety of other biological materials into ticks, for example, specific antibodies or double stranded RNA 6. In this article, we will demonstrate the microinjection of nymphal ticks with in vitro-grown B. burgdorferi. We will also describe a method for localization of Lyme disease pathogens in the tick gut using confocal immunofluorescence microscopy.

Lyme disease research studies often require generation of ticks infected with the pathogen Borrelia burgdorferi, a process that typically takes several weeks. Here we demonstrate a microinjection-based tick infection procedure that can be accomplished within hours. We also demonstrate an immunofluorescence method for in situ localization of B. burgdorferi within ticks.

ティック腸内ライム病の病原体の迅速な伝達とローカリゼーションのための方法

Lyme disease is caused by infection with the spirochete pathogen Borrelia burgdorferi, which is maintained in nature by a tick-rodent infection cycle 1.  ...

Saliva, Salivary Gland, and Hemolymph Collection from Ixodes scapularis Ticks

Ticks are found worldwide and afflict humans with many tick-borne illnesses. Ticks are vectors for pathogens that cause Lyme disease and tick-borne relapsing fever (Borrelia spp.), Rocky Mountain Spotted fever (Rickettsia rickettsii), ehrlichiosis (Ehrlichia chaffeensis and E. equi), anaplasmosis (Anaplasma phagocytophilum), encephalitis (tick-borne encephalitis virus), babesiosis (Babesia spp.), Colorado tick fever (Coltivirus), and tularemia (Francisella tularensis) 1-8. To be properly transmitted into the host these infectious agents differentially regulate gene expression, interact with tick proteins, and migrate through the tick 3,9-13. For example, the Lyme disease agent, Borrelia burgdorferi, adapts through differential gene expression to the feast and famine stages of the tick's enzootic cycle 14,15. Furthermore, as an Ixodes tick consumes a bloodmeal Borrelia replicate and migrate from the midgut into the hemocoel, where they travel to the salivary glands and are transmitted into the host with the expelled saliva 9,16-19.
As a tick feeds the host typically responds with a strong hemostatic and innate immune response 11,13,20-22. Despite these host responses, I. scapularis can feed for several days because tick saliva contains proteins that are immunomodulatory, lytic agents, anticoagulants, and fibrinolysins to aid the tick feeding 3,11,20,21,23. The immunomodulatory activities possessed by tick saliva or salivary gland extract (SGE) facilitate transmission, proliferation, and dissemination of numerous tick-borne pathogens 3,20,24-27. To further understand how tick-borne infectious agents cause disease it is essential to dissect actively feeding ticks and collect tick saliva. This video protocol demonstrates dissection techniques for the collection of hemolymph and the removal of salivary glands from actively feeding I. scapularis nymphs after 48 and 72 hours post mouse placement. We also demonstrate saliva collection from an adult female I. scapularis tick.

Saliva, Salivary Gland, and Hemolymph Collection from Ixodes scapularis Ticks

The collection of infected tick hemolymph, salivary glands, and saliva is important to study how tick-borne pathogens cause disease. In this protocol we demonstrate how to collect hemolymph and salivary glands from feeding Ixodes scapularis nymphs. We also demonstrate saliva collection from female I. scapularis adults.

マダニScapularisダニの唾液、唾液腺、および体液コレクション

Ticks are found worldwide and afflict humans with many tick-borne illnesses. Ticks are vectors for pathogens that cause Lyme disease and tick-borne ...

Swab Sampling Method for the Detection of Human Norovirus on Surfaces

Human noroviruses are a leading cause of epidemic and sporadic gastroenteritis worldwide. Because most infections are either spread directly via the person-to-person route or indirectly through environmental surfaces or food, contaminated fomites and inanimate surfaces are important vehicles for the spread of the virus during norovirus outbreaks.
We developed and evaluated a protocol using macrofoam swabs for the detection and typing of human noroviruses from hard surfaces. Compared with fiber-tipped swabs or antistatic wipes, macrofoam swabs allow virus recovery (range 1.2-33.6%) from toilet seat surfaces of up to 700 cm2. The protocol includes steps for the extraction of the virus from the swabs and further concentration of the viral RNA using spin columns. In total, 127 (58.5%) of 217 swab samples that had been collected from surfaces in cruise ships and long-term care facilities where norovirus gastroenteritis had been reported tested positive for GII norovirus by RT-qPCR. Of these 29 (22.8%) could be successfully genotyped. In conclusion, detection of norovirus on environmental surfaces using the protocol we developed may assist in determining the level of environmental contamination during outbreaks as well as detection of virus when clinical samples are not available; it may also facilitate monitoring of effectiveness of remediation strategies.

A macrofoam based sampling methodology was developed and evaluated for the detection and quantification of norovirus on environmental hard surfaces.

表面上のヒトノロウイルスの検出のためのスワブサンプリング方法

Human noroviruses are a leading cause of epidemic and sporadic gastroenteritis worldwide. Because most infections are either spread directly via the ...

Protocols for Investigating the Host-tissue Distribution, Transmission-mode, and Effect on the Host Fitness of a Densovirus in the Cotton Bollworm

Many novel viruses have been discovered in animal hosts using next-generation sequencing technologies. Previously, we reported a mutualistic virus, Helicoverpa armigera densovirus (HaDV2), in a lepidopteran species, the cotton bollworm, Helicoverpa armigera (Hubner). Here, we describe the protocols that are currently used to study the effect of HaDV2 on its host. First, we establish a HaDV2-free cotton bollworm colony from a single breeding pair. Then, we orally inoculate some neonate larval offspring with HaDV2-containing filtered liquid to produce two colonies with the same genetic background: one HaDV2-infected, the other uninfected. A protocol to compare life table parameters (e.g., larval, pupal, and adult periods and fecundity) between the HaDV2-infected and -uninfected individuals is also presented, as are the protocols for determining the host-tissue distribution and transmission efficiency of HaDV2. These protocols would also be suitable for investigating the effects of other orally transmitted viruses on their insect hosts, lepidopteran hosts in particular.

Here, we present a protocol to investigate the host-tissue distribution, transmission mode, and effect on the host fitness of a densovirus within a lepidopteran species, the cotton bollworm. This protocol can also be used for studying the interaction between other orally-transmitted viruses and their insect hosts.

コットンボールワームでデンソウイルスのホストフィットネス上のホスト組織分布、伝送モード、および効果を調査するためのプロトコル

Many novel viruses have been discovered in animal hosts using next-generation sequencing technologies. Previously, we reported a mutualistic virus, ...

Assessment of the Cytotoxic and Immunomodulatory Effects of Substances in Human Precision-cut Lung Slices

Respiratory diseases in their broad diversity need appropriate model systems to understand the underlying mechanisms and enable development of new therapeutics. Additionally, registration of new substances requires appropriate risk assessment with adequate testing systems to avoid the risk of individuals being harmed, for example, in the working environment. Such risk assessments are usually conducted in animal studies. In view of the 3Rs principle and public skepticism against animal experiments, human alternative methods, such as precision-cut lung slices (PCLS), have been evolving. The present paper describes the ex vivo technique of human PCLS to study the immunomodulatory potential of low-molecular-weight substances, such as ammonium hexachloroplatinate (HClPt). Measured endpoints include viability and local respiratory inflammation, marked by altered secretion of cytokines and chemokines. Pro-inflammatory cytokines, tumor necrosis factor alpha (TNF-&#945;), and interleukin 1 alpha (IL-1&#945;) were significantly increased in human PCLS after exposure to a sub-toxic concentration of HClPt. Even though the technique of PCLS has been substantially optimized over the past decades, its applicability for the testing of immunomodulation is still in development. Therefore, the results presented here are preliminary, even though they show the potential of human PCLS as a valuable tool in respiratory research.

In view of the 3Rs principle, respiratory models as alternatives to animal studies are evolving. Especially for risk assessment of respiratory substances, there is a lack of appropriate assays. Here, we describe the use of human precision-cut lung slices for the assessment of airborne substances.

細胞毒性の評価と肺癌精密カット スライスで物質の免疫調節効果

Respiratory diseases in their broad diversity need appropriate model systems to understand the underlying mechanisms and enable development of new ...

Collection and Processing of Lymph Nodes from Large Animals for RNA Analysis: Preparing for Lymph Node Transcriptomic Studies of Large Animal Species

Large animals (both livestock and wildlife) serve as important reservoirs of zoonotic pathogens, including Brucella, Mycobacterium bovis, Salmonella, and E. coli, and are useful for the study of pathogenesis and/or spread of the bacteria in natural hosts. With the key function of lymph nodes in the host immune response, lymph node tissues serve as a potential source of RNA for downstream transcriptomic analyses, in order to assess the temporal changes in gene expression in cells over the course of an infection. This article presents an overview of the process of lymph node collection, tissue sampling, and downstream RNA processing in livestock, using cattle (Bos taurus) as a model, with additional examples provided from the American bison (Bison bison). The protocol includes information about the location, identification, and removal of lymph nodes from multiple key sites in the body. Additionally, a biopsy sampling methodology is presented that allows for a consistency of sampling across multiple animals. Several considerations for sample preservation are discussed, including the generation of RNA suitable for downstream methodologies like RNA-sequencing and RT-PCR. Due to the long delays inherent in large animal vs. mouse time course studies, representative results from bison and bovine lymph node tissues are presented to describe the time course of the degradation in this tissue type, in the context of a review of previous methodological work on RNA degradation in other tissues. Overall, this protocol will be useful to both veterinary researchers beginning transcriptome projects on large animal samples and to molecular biologists interested in learning techniques for in vivo tissue sampling and in vitro processing.

This protocol provides an overview of procedures for the isolation of RNA for the transcriptomic profiling of lymph node tissues from large animals, including steps in the identification and excision of lymph nodes from livestock and wildlife, sampling approaches to provide consistency across multiple animals, and considerations plus representative results for the post-collection preservation and processing for RNA analysis.

コレクションと RNA 解析のための大型動物からリンパ節の処理: リンパ節トランスクリプトーム研究大型動物種のための準備

Large animals (both livestock and wildlife) serve as important reservoirs of zoonotic pathogens, including Brucella, Mycobacterium bovis, Salmonella, and ...

Sexual Transmission of American Trypanosomes from Males and Females to Naive Mates

American trypanosomiasis is transmitted to humans by triatomine bugs through the ingestion of contaminated food, by blood transfusions or accidently in hospitals and research laboratories. In addition, the Trypanosoma cruzi infection is transmitted congenitally from a&#160;chagasic mother to her offspring, but the male partner&#39;s contribution to in utero contamination is unknown. The findings of nests and clumps of amastigotes and of trypomastigotes in the theca cells of the ovary, in the goniablasts and in the lumen of seminiferous tubules suggest that T. cruzi infections are sexually transmitted. The research protocol herein presents the results of a family study population showing parasite nuclear DNA in the diploid blood mononuclear cells and in the haploid gametes of human subjects. Thus, three independent biological samples collected one year apart confirmed that T. cruzi infections were sexually transmitted to progeny. Interestingly, the specific T. cruzi antibody was absent in the majority of family progeny that bore immune tolerance to the parasite antigen. Immune tolerance was demonstrated in chicken refractory to T. cruzi after the first week of embryonic growth, and chicks hatched from the flagellate-inoculated eggs were unable to produce the specific antibody.&#160;Moreover, the instillation of the human semen ejaculates intraperitoneally or into the vagina of naive mice yielded T. cruzi amastigotes in the epididymis, seminiferous tubule, vas deferens and uterine tube with an absence of inflammatory reactions in the immune privileged organs of reproduction. The breeding of T. cruzi-infected male and female mice with naive mates resulted in acquisition of the infections, which were later transmitted to the progeny. Therefore, a robust education, information and communication program that involves the population and social organizations is deemed necessary to prevent Chagas disease.

The Trypanosoma cruzi agent of Chagas disease produces long-lasting asymptomatic infections that abruptly develop into clinically recognized pathology. The following research protocol describes a short-run family-based epidemiological study to unravel the T. cruzi infection transmitted sexually from parent to progeny.

男性と女性からのナイーブの仲間にアメリカトリパノソーマの性行

American trypanosomiasis is transmitted to humans by triatomine bugs through the ingestion of contaminated food, by blood transfusions or accidently in ...

Highly Efficient Transfection of Primary Macrophages with In Vitro Transcribed mRNA

Macrophages are phagocytic cells specialized in detecting molecules of non-self origin. To this end, they are equipped with a large array of pattern recognition receptors (PRRs). Unfortunately, this also makes macrophages particularly challenging to transfect as the transfection reagent and the transfected nucleic acids are often recognized by the PRRs as non-self. Therefore, transfection often results in macrophage activation and degradation of the transfected nucleic acids or even in suicide of the macrophages. Here, we describe a protocol that allows highly efficient transfection of murine primary macrophages such as peritoneal macrophages (PM) and bone marrow-derived macrophages (BMDM) with mRNA in vitro transcribed from DNA templates such as plasmids. With this simple protocol, transfection rates of about 50-65% for PM and about 85% for BMDM are achieved without cytotoxicity or immunogenicity observed. We describe in detail the generation of mRNA for transfection from DNA constructs such as plasmids and the transfection procedure.

Macrophages, especially primary macrophages, are challenging to transfect as they specialize in detecting molecules of non-self origin. We describe a protocol that allows highly efficient transfection of primary macrophages with mRNA generated from DNA templates such as plasmids.

インビトロ転写mRNAによる一次マクロファージの高効率トランスフェクション

Macrophages are phagocytic cells specialized in detecting molecules of non-self origin. To this end, they are equipped with a large array of pattern ...

Standard Membrane Feeding Assay for the Detection of Plasmodium falciparum Infection in Anopheles Mosquito Vectors

Malaria remains one of the most devastating diseases worldwide and, to date, the African region is still responsible for 94% of all cases worldwide. This parasitic disease requires a protozoan parasite, an Anopheles mosquito vector, and a vertebrate host. The Anopheles genus comprises more than 500 species, of which 60 are known as vectors of the parasite. The Plasmodium parasite genus consists of 250 species, and 48 of these are involved in disease transmission. Furthermore, the Plasmodium falciparum parasite has contributed toward an estimated 99.7% of malaria cases in sub-Saharan Africa in recent years. 
Gametocytes form part of the sexual stage of the parasite and are ingested by the female mosquito upon feeding on an infected human host. Further development of the parasite within the mosquito is enhanced by favorable environmental conditions in the midgut of the mosquito. Here, the fusion of the female and male gametes takes place, and the motile ookinetes originate. The ookinetes enter the midgut epithelium of the mosquito, and mature ookinetes form oocysts, which, in turn, produce motile sporozoites. These sporozoites migrate to the mosquito's salivary glands and are injected as a mosquito takes a blood meal. 
For drug discovery purposes, mosquitoes were artificially infected with gametocyte-infected blood in the standard membrane feeding assay (SMFA). To detect infection within the mosquito and/or to assess the efficacy of antimalarial compounds, the midguts of the female mosquitoes were removed post infection and were stained with mercurochrome. This method was used to enhance the visual detection of oocysts under the microscope for the accurate determination of oocyst prevalence and intensity.

Standard Membrane Feeding Assay for the Detection of Plasmodium falciparum Infection in Anopheles Mosquito Vectors

The standard membrane feeding assay (SMFA) is regarded as the gold standard for the assessment and identification of potential antimalarial compounds. This artificial feeding system is used to infect mosquitoes to further evaluate the effects of such compounds on the intensity and prevalence of the Plasmodium falciparum parasite.

ハマダラカ媒介動物における熱帯熱マラリア原虫感染の検出のための標準的な膜摂食アッセイ

Malaria remains one of the most devastating diseases worldwide and, to date, the African region is still responsible for 94% of all cases worldwide. This ...