著者は、技術支援のためマリンダ元気に感謝したいと思います。我々はまた、現在および過去の資金源を認める：国立がん研究所（R01 CA131075、R01 CA131075-02S1）、ウェンディウィルケース癌研究基金、マーキーがん基金、チルドレンズミラクルネットワークとジェニファーとデヴィッド·ディケンズメラノーマ研究財団。

1。 プレクトランサスbarbatus（Cohleusフォルス）植物の粗根エキスから局所投与のためのフォルスコリンの調製<ol><li>ネズミの実験のためのプロトコルは、動物の管理と使用における倫理的な行動のためのガイドラインに従い、ケンタッキー大学の施設内動物管理使用委員会（プロトコール＃00768M2004）によって承認された。根抽出物は、70％エタノール、30％プロピレングリコールを標準皮膚科学的塩基中の40％重量/容量で構成されている。 </li><li>原油フォルス根エキスの200グラムを計量してビーカーに移す。 40％（w / v）の溶液500mlを作るために、車両のボリュームのすべて（70％エタノール、30％プロピレングリコール）との溶液をもたらすことはないがほとんどを添加することにより、粗フォルス根抽出物200gを再懸濁およそ450ミリリットル。 </li><li>室温で1時間撹拌した。解決策は、やや粘性になり、前に溶液中に「リフト」抽出物に、手動の攪拌が必要な場合があります撹拌棒を引き継ぐことができます。 </li><li> 1時間撹拌した後、メスシリンダーに混合物を注ぎ、（ビーカーからフォルスコリンの回収を最大にする）のスラリーを攪拌するために使用したビーカーを「すすぐ」するために使用されている車両を用いて500mlに体積を。 </li><li> 50ミリリットルのポリプロピレン遠心管にスラリーを転送します。卓上遠心分離機を用いて遠心分離（1500×gで、室温、15分）。この時点で、不溶物を上清が容易に注ぐことができるように、かなり圧縮されたであろう。 </li><li>抽出物から残留不溶性物質を除去するために0.22μmの酢酸セルロース膜を通して溶液を濾過する。私たちは、根抽出物の不溶性成分からの膜の早期目詰まりを防ぐために、ユニットに付属しているプレフィルタの使用に伴い、細胞培養用に設計されたボトルトップ·システムを使用しています。抽出物を大量に製造する場合には、一度におよそ100mlとフィルタリングし、プレフィルタベットを変更する追加された各ボリュームをWEEN。 </li><li>室温で保存した場合、抽出液には、最大1年間の生物学的活動を維持しています。 </li></ol> 2。局所治療のためのC57BL / 6 K14-SCFマウスの作製<ol><li>電気剪断によって動物から背側の毛皮を削除します。簡単に言うと0.25ミリメートルの手術の準備ヘッド（フィッシャー·サイエンティフィック）を装備した電気ばさみで背の毛皮のせん断を容易にするために、吸入イソフルランで動物を麻酔。好ましくはただの麻酔過剰摂取の危険性を最小限に抑えるために麻酔の1種類（ 例えば 、ケタミン/キシラジン）を使用します。飽和吸入チャンバーは、ヒュームフード以外に使用される職業上の危険を運び、動物に麻酔薬の未知の量を提供します。理想的には精密気化器を使用する必要があります。 </li><li>残留毛刈り株を削除するには、化学的な脱毛で動物を扱う。ケタミン40 mg / kgのキシラジンおよび4 mg / kgを腹腔内注射して動物に麻酔を投与し</li&gt; <li> （つま先のピンチによって判断されるように）動物を適切に麻酔をかけた後、手袋をはめた指を使用して剪断背部皮膚に脱毛クリームの指先サイズの額を適用します。 30〜60秒またはそれが周りに移動されているように、毛髪は、明らかにクリーム中に見ることができるまで、皮膚内にクリームをこする。長時間の暴露が、表皮の完全性の損失から皮膚の化学的燃焼、表皮破壊や死に至るように毛の除去に必要な最小限の時間だけでクリームを残す。 </li><li>すべてのクリームが除去されるまで、繰り返し水に浸したガーゼパッドで背部皮膚を拭きます。乾いた柔らかい紙タオルを使用して動物、およびそれらを暖かい静かな場所（温暖化パッド上に置い例えばクリーンケージ）で回復することができます。 1つずつの動物を脱毛し、プロシージャ全体で密接に監視します。 </li></ol> 3。フォルスコリンまたは車両制御の局所投与<ol><li>動物は、一度に1を処理する必要があります。簡単に言えば吸入で麻酔下のフォームフィットナイロン通気性フィルターの上にマウスを置くことによってDイソフルランは、ヒュームフード内イソフルラン飽和蓋付き透明なガラスジャーにイソフルラン飽和のペーパータオルを置いてきた。自主的な筋肉の動きを抑制するしか自発呼吸（通常は10から20秒）保存するように十分な時間、イソフルランにマウスを公開します。長すぎるイソフルランで動物を残すことは、呼吸抑制や死をもたらすでしょう。それは、 &quot;光を行く」と薬物やリスク死に動物をさらすオーバーよりイソフルランではなく、を簡単にマウスを再公開することのに越した方が良い。 </li><li>イソフルランチャンバーから動物を削除し、クリーンな吸収性ベンチパッドの上に置きます。 </li><li>使い捨てのポリプロピレン先端装備千μlのマイクロピペット、40％の粗フォルス抽出物400μLを策定の使用（車両制御動物は、70％エタノール、単独の30％プロピレングリコールを受信します）。 </li><li>上にエキスを転送すべての肌がカバーされるまで、バック動物の皮膚の上に滴下することにより、その後は、ピペットチップの側面を使用して、背側皮膚上エキスを汚す。塗布後の肌にブロットする必要はない。 </li><li>そのケージにマウスを返し、それが麻酔から回復するまで、慎重に観察します。 </li><li>非顔料cAMPの効果は、UV感度実験を混乱べきではないことには、UV露光（顔料効果が最後の局所治療を超えて、数日間持続する）と2日前までに、すべての局所治療を中止してください。 </li></ol> 4。反射型比色法の色の測定スキン<ol><li>簡単に言うと（上記参照）吸入イソフルランでマウスを麻酔。 </li><li>比色計を備えた標準化された白い表面にポータブルヘッドを配置することによって、ミノルタ比色計を校正します。 </li><li>確実に動物の背部皮膚を比色計フラッシュのポータブル測定ヘッドを配置することを1cm 2のラウンドapertureは完全に皮膚に押し付けられる。背部皮膚の異なる領域に、少なくとも3つの別々の測定を行う。 </li><li>動物あたりと治療群ごとの平均値±SDのL *スコアを計算する。反射測色は、実験の任意の時点で行うことができる。 </li></ol> 5。 「最小紅斑線量」（MED）を計算することにより、UV感度の定量<ol><li>上述したように、車両又はフォルスコリンのいずれかで前処理された動物を使用する。ケタミンおよびキシラジン（上記参照）の標準混合物の腹腔内注射で動物を麻酔。 </li><li> MEDテストのためのUV閉塞テープ片を準備します。テープの穴を生成するには、1cm 2の円形の切り欠き部（ 図2AおよびB）との大型穴パンチを使用しています。テープで定義されたサイズおよび配置の対称孔を有する照射後の皮膚変化の認識を容易にする。テープ内の各穴の上、小さいながらも簡単に取り外し可能な部分を適用<html>異なるUV線量の投与を可能にするためにUV露光中に定義された時点で除去することができるテープ。 </li><li>動物を適切に鎮静されると、背面にテープを配置。目の潤滑剤は常に麻酔下で利用されるべきである。 </li><li> 2ウェスティングハウスF15T8UV-Bの313ナノメートルのピーク出力を有するランプと280から370ナノメートルの範囲からなるUV源をオンにします。 （一般的にはウォームアップランプの数分かかります）、UVBセンサー付のUV光度計によって測定されたランプが一定のUV出力に平衡することができます。 </li><li> UV光度計によって測定されたUV透過率に基づいて、各々所望の用量のためのUV照射時間を算出する。例えば、私たちのランプのUVB出力措置2.4 MW / cm 2である 。したがって、5 kJの/ m 2で投与する、皮膚は、以下のように計算された、UVB放射線の（3分28秒）で208秒に露出される必要があるであろう。 upload/50670/50670eq1.jpg &quot;/&gt; </li><li>腹さえ紫外線曝露を確実にするために面を下鎮静動物（閉塞性テープでそれぞれの場所で）を配置します。紫外線放射の選択された用量を投与するために、順次、放射線の正しい投与量に対する皮膚の1cm 2の領域を露出するための穴をカバーする小型の閉塞性のテープを取り外します。 40 KJ / m 2を、実験で最大用量であるしたがって、上記の例を使用して、その後、動物は無いだろう40 KJ / m 2に状態の27分47秒の合計および皮膚のランプの下になりますテープの全体の時間の上にある。露光中に残っている208秒があった場合しかし、5 kJの/ m 2の条件を覆うテープが除去される。各条件が同時に終了するようにテープ除去のタイミングは行われるべきである。 </li><li> UV露光した後、突然、または過度に力強い動きで皮膚をリッピングしないように注意しながら、慎重に背部皮膚からテープをはがし。できるように、暖かい静かな場所に動物を配置麻酔からの回復。 </li><li> UV照射の具体的な用量にさらさ解剖学的部位に対応した（腫脹）紅斑（赤み）や浮腫の目立たない領域を探すために24〜48時間のためにマウスを監視します。写真的に皮膚所見を文書化します。 </li><li> MED値は、紅斑および/または皮膚の全露出円の浮腫によって定義されるような炎症を引き起こすUV線量の最小値に相当する。皮膚の色素沈着は、MEDの決定に挑戦することもできますが、紅斑および浮腫は、まだ一般的には正確には、部分的にはUV露光中にテープの開口の規定された形状のおかげで評価することができる。 </li></ol> 6。統計分析ボンフェローニポストテスト（グラフパッドPRISM）を一元配置分散分析によりマウスのコホート間でデータを分析します。p値 &lt;0.05を統計的に有意であると考えている。

著者は、彼らが競合する経済的利益を持っていないことを宣言します。

色白の人間の動物モデルを用いて、フォルスコリンが豊富な原油根抽出物の局所適用は堅牢に皮膚にメラニン産生を刺激することにより、表皮を暗くことがわかります。人間の皮膚ではなく、遺伝的に変更されていないマウスの皮膚で​​起こるような表皮メラニンは、基底表皮幹細胞因子の発現に依存している。遺伝的に変更されていないマウスの背部の皮膚は、皮膚に色素を付与するた?...

黒色腫の発生率は、皮膚癌の最も致命的な形は、特に色白の人々の間で、米国では過去数十年の間に劇的に増加している。強い分子および疫学的証拠が主要な原因環境要因2-5として紫外線を関与。太陽への露出や日焼けベッドの使用の形で増加UV露光は、メラノーマの発生率6-7の増加の大部分の原因であると思われる。メラノーマのリスクは、特に日焼け8、生活9月10日の早い特にとリンクしそうです。日焼けのリスクは投与量とUV曝露の強度だけでなく、UV放射への皮膚の応答に影響を与える要因によって継承するだけでなく、連結されている。皮膚の色素沈着は、紫外線感受性の最も重要な決定要因の1、日焼けや癌のリスクのリスクである。メラノーマは、浅黒い肌individuaに比べて色白の人ではおよそ20倍も頻繁に発生しますLS 11月13日 。 メラニン、表皮内のメラニン細胞によって製造される顔料は、肌の血色の主な決定要因である。 （1）ユーメラニン、紫外線のエネルギーを吸収するのに効果的で濃い褐色/黒色顔料、および（2）フェオメラニン、皮膚に紫外線光子の浸透を防止するのに効果が低い赤みがかっ/ブロンド顔料：メラニンは、2つの主要な種類が付属しています。皮膚の色、UV感度および黒色腫のリスクは、主に表皮メラニン含有量14〜15によって決定される。表皮内のより多くのユーメラニンは、少ないUV光子は、皮膚に浸透することができます。なぜならユーメラニンの低生来のレベルで、色白の人々は、はるかに受けやすい紫外線照射16〜18の急性および慢性の影響にある。 皮膚の色素沈着、メラノーマリスクとは&quot;日焼け&quot; UV露光した後、すべてのメラノコルチン1受容体（MC1R）のシグナル伝達能力と相関、G s共役7膜貫通能力メラノサイト19〜22にurface受容体。 MC1Rがその同族高親和性リガンド、α-メラノサイト刺激ホルモン（α-MSH）を結合すると、二次メッセンジャーcAMPの23のアデニル酸シクラーゼと生産の活性化があります。紫外線照射後の皮膚の正常な生理学的応答はケラチノサイト24〜29によるα-MSHの表皮の生産が含まれています。我等は、ケラチノサイト由来のα-MSHはアデニル酸シクラーゼ30の活性化を介したcAMPセカンドメッセンジャーの下流の生産を開始し、表皮のメラニン細胞にMC1Rと結合すると仮定した。 cAMPレベルは、生存経路、DNA修復および顔料合成を含むメラニン細胞分化の多くの局面を制御する。 MC1RおよびcAMPシグナルは、明らかに顔料酵素レベルおよびユーメラニン産生を誘導する。 MC1Rシグナリングが損なわれていないとメラニン細胞cAMPレベルが強固である場合には、ユーメラニンが生成され、肌が暗くされる。しかしながら、MC1Rシグナル伝達に欠陥がある場合と細胞質内cAMPレベルが低いままで、フェオメラニンの代わりに1が生成される。ユーメラニン合成は、cAMPレベルを上昇させる1,14,31-35薬剤によって薬理学的に刺激することができる。 MC1Rタンパク質がヒト36〜46内の黒色腫のリスクの主要な調節因子であることから、我々はMC1RがUV誘導発癌に対するメラノサイトを保護するメカニズムに興味を持っています。我々の研究の基盤として、我々は純粋なC57BL / 6の遺伝的背景1にジェニックMC1R変異マウスモデルを生成した。このモデルでは、幹細胞因子（SCF）は、構成的に基底表皮で発現され、表皮メラニン細胞濾胞は毛包真皮内に局在メラノサイトする非トランスジェニックマウスとは対照的に、生命47を通じて皮膚に保持される。 K14-SCF導入遺伝子が組み込まれて、表皮は顔料の特徴的な特定のメラニン色素で着色になる動物1の株は野生型MC1Rシグナル伝達を有するC57BL / 6の遺伝的背景にK14-SCFマウスは漆黒の肌はメラニン色素の非常に高いレベルを特徴としている。当然のことながら、これらの動物は非常に紫外線抵抗力がある。これとは対照的に、変異型非アクティブMC1Rを抱い遺伝的に一致したK14-SCF C57BL / 6の動物は、表皮にはほとんどユーメラニンがありません。その代わりに、これらの「 拡張子 」動物（MC1RのE / E）はフェオメラニン色素（ 図1A）の析出による美肌顔色を持っており、多くの紫外線感受性48-49です。 皮膚への浸透を可能にする化学的性質を有する薬理学的化合物は、強力に直接皮膚に表皮メラノサイトにおいてcAMPレベルを操作することにより伸長（MC1R E / E）K14-SCFの動物モデルにおいてユーメラニンを誘導することが示されている。このモデルのメラニンアップレギュレーションはRでしたアデニル酸シクラーゼの活性化1だけでなく、ホスホジエステラーゼ4阻害35でeported。この記事では、 拡張子（MC1RのE / E）、K14-SCF動物モデル色白の紫外線感受性ヒトにおける準備とフォルスの局所適用を実証する。我々は、薬物の一日二回アプリケーションは、加速されたメラニン化を促進すること、皮膚の黒ずみはメラニン色素の表皮堆積によるもので、その誘導された表皮のメラニンが「最小紅斑線量」（MED）48を測定することにより紫外線による日焼けから保護することを示している。

<table border="1">
		<tbody>
		 <tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Reagents</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Coleus Forskoli extract 20%</td>
			<td>Buckton Scott USA Inc. </td>
			<td>n/a</td>
			<td>Princeton, NJ</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Isothesia, Isoflurane , USP</td>
			<td>Butler Schein</td>
			<td>NCD 11695-6776-1</td>
			<td>Dublin, OH, USA</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Xylazine</td>
			<td>Anased Injection</td>
			<td>LA04612</td>
			<td>Shenandoah, Iowa, USA</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Ketamine HCl, USP</td>
			<td>Putney</td>
			<td>NDC 26637-411-01</td>
			<td>St. Joseph, MO, USA</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Decon Labs.</td>
			<td>2705</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Propylene glycol</td>
			<td>Adesco</td>
			<td>05751L</td>
			<td>Solon, OH, USA</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Depilatory cream, Nair</td>
			<td>Church &amp; Dwight</td>
			<td>JF-11 4381322</td>
			<td>Priceton, NJ</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>EQUIPMENT</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Germicidal Hg Lamp UV-B</td>
			<td>Westinghouse</td>
			<td>F15T8UV-B</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Radiometer photometer</td>
			<td>International light</td>
			<td>1LT400A</td>
			<td>Peabody, MA,USA</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Chromameter</td>
			<td>Konica Minolta</td>
			<td>CR-400</td>
			<td>Ramsey, NJ, USA</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Data Processor for 	Chromameter CR-400</td>
			<td>Konica Monilta</td>
			<td>DR-400</td>
			<td>Ramsey, NJ, USA</td>
		 </tr>
		</tbody>
 </table>

pharmacologic induction of epidermal melanin and protection against sunburn in a humanized mouse model

皮膚、紫外線感度と皮膚がんリスクの公平性のすべてがメラノコルチン1受容体の生理的機能、メラニン細胞の表面に見られるG s共役シグナル伝達タンパク質と相関する。 MC1Rは、順番に、皮膚のメラノサイトにおけるメラニン産生をアップレギュレートする、アデニリルシクラーゼおよびcAMP産生を刺激する。 MC1RシグナリングはUV損傷から皮膚を保護するメカニズムを研究するために、この研究は、幹細胞因子（SCF）の表皮の発現に基づいて「ヒト皮膚」のマウスモデルに依存している。K14-SCFトランスジェニックマウスにおけるメラノサイトを保持する表皮したがって、表皮メラニンを堆積させる能力を有する。この動物モデルにおいては、黒色メラニン顔料とUV-保護された表現型の強固な堆積野生型MC1R状態をもたらす。これとは対照的に、欠陥のMC1Rのシグナリング能力の展示ブロンド/赤色素沈着、皮膚にはほとんどユーメラニンとしたK14-SCF動物紫外線感受性表現。ユーメラニン沈着がMC1Rシグナリングを模倣する局所薬によって強化されるかもしれない推論は、MC1R良品色白のマウスの皮膚へのフォルス抽出物の直接的なアプリケーションが堅牢なユーメラニン誘導およびUVプロテクト1をもたらしたことがわかった。ここでは、K14-SCF色白のマウスにフォルスコリン含有天然根抽出物を調製し、適用するための方法を記載し、最小紅斑量（MED）を決定することによりUV感受性を測定する方法を報告している。この動物モデルを使用して、皮膚の表皮cAMP誘導及びメラニンは、UV照射への生理学的応答にどのように影響するかを研究することが可能である。

C57BL / 6マウスを、記載（ 図1A）のようなK14-SCF導入遺伝子を組み込んだ、eumelanotic pheomelanotic又はメラニン欠乏背景上に生成した。色白の延長（MC1R E / E、Tyrの+ / +）マウスのコホート車両（70％エタノール、30％プロピレングリコール）または40％の粗コリウスフォルス根エキスのどちらか1日2回投与で局所的に処理した（801μmあたり5日間（ <stron...

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Pharmacologic Induction of Epidermal Melanin and Protection Against Sunburn in a Humanized Mouse Model

表皮のメラニンは、色白の紫外線感受性人間のマウスモデルにおいてフォルスコリンの局所適用によって誘導される。最小紅斑量（MED）アッセイによって測定されるように強く、UV媒介炎症（日焼け）から保護暗く、皮膚および表皮におけるcAMPレベルの薬理学的操作。

ヒト化マウスモデルにおける表皮のメラニンと保護に対する日焼け薬理学的誘導

Fairness of skin, UV sensitivity and skin cancer  risk all correlate with the physiologic function of the melanocortin 1  receptor, a Gs-coupled signaling ...

pharmacologic-induction-epidermal-melanin-protection-against-sunburn

Research

JoVE Journal

Medicine

18.0K ビュー.  University of Kentucky College of Medicine. 表皮のメラニンは、色白の紫外線感受性人間のマウスモデルにおいてフォルスコリンの局所適用によって誘導される。最小紅斑量（MED）アッセイによって測定されるように強く、UV媒介炎症（日焼け）から保護暗く、皮膚および表皮におけるcAMPレベルの薬理学的操作。 

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A Mouse Model of in Utero Transplantation

The transplantation of stem cells and viruses in utero has tremendous potential for treating congenital disorders in the human fetus. For example, in utero transplantation (IUT) of hematopoietic stem cells has been used to successfully treat patients with severe combined immunodeficiency.1,2 In several other conditions, however, IUT has been attempted without success.3 Given these mixed results, the availability of an efficient non-human model to study the biological sequelae of stem cell transplantation and gene therapy is critical to advance this field. We and others have used the mouse model of IUT to study factors affecting successful engraftment of in utero transplanted hematopoietic stem cells in both wild-type mice4-7 and those with genetic diseases.8,9 The fetal environment also offers considerable advantages for the success of in utero gene therapy. For example, the delivery of adenoviral10, adeno-associated viral10, retroviral11, and lentiviral vectors12,13 into the fetus has resulted in the transduction of multiple organs distant from the site of injection with long-term gene expression. in utero gene therapy may therefore be considered as a possible treatment strategy for single gene disorders such as muscular dystrophy or cystic fibrosis. Another potential advantage of IUT is the ability to induce immune tolerance to a specific antigen. As seen in mice with hemophilia, the introduction of Factor IX early in development results in tolerance to this protein.14 
In addition to its use in investigating potential human therapies, the mouse model of IUT can be a powerful tool to study basic questions in developmental and stem cell biology. For example, one can deliver various small molecules to induce or inhibit specific gene expression at defined gestational stages and manipulate developmental pathways. The impact of these alterations can be assessed at various timepoints after the initial transplantation. Furthermore, one can transplant pluripotent or lineage specific progenitor cells into the fetal environment to study stem cell differentiation in a non-irradiated and unperturbed host environment.
The mouse model of IUT has already provided numerous insights within the fields of immunology, and developmental and stem cell biology. In this video-based protocol, we describe a step-by-step approach to performing IUT in mouse fetuses and outline the critical steps and potential pitfalls of this technique.

A Mouse Model of in Utero Transplantation

The mouse model of in utero transplantation is a versatile tool that can be used to study the potential clinical applications of stem cell transplantation and gene therapy in the fetus. In this protocol, we present a general approach to performing this technique

のマウスモデル子宮内で移植

The transplantation of stem cells and viruses in utero has tremendous potential for treating congenital disorders in the human fetus.  For example, in ...

医学

Multi-photon Imaging of Tumor Cell Invasion in an Orthotopic Mouse Model of Oral Squamous Cell Carcinoma

Loco-regional invasion of head and neck cancer is linked to metastatic risk and presents a difficult challenge in designing and implementing patient management strategies. Orthotopic mouse models of oral cancer have been developed to facilitate the study of factors that impact invasion and serve as model system for evaluating anti-tumor therapeutics. In these systems, visualization of disseminated tumor cells within oral cavity tissues has typically been conducted by either conventional histology or with in vivo bioluminescent methods. A primary drawback of these techniques is the inherent inability to accurately visualize and quantify early tumor cell invasion arising from the primary site in three dimensions. Here we describe a protocol that combines an established model for squamous cell carcinoma of the tongue (SCOT) with two-photon imaging to allow multi-vectorial visualization of lingual tumor spread. The OSC-19 head and neck tumor cell line was stably engineered to express the F-actin binding peptide LifeAct fused to the mCherry fluorescent protein (LifeAct-mCherry). Fox1nu/nu mice injected with these cells reliably form tumors that allow the tongue to be visualized by ex-vivo application of two-photon microscopy. This technique allows for the orthotopic visualization of the tumor mass and locally invading cells in excised tongues without disruption of the regional tumor microenvironment. In addition, this system allows for the quantification of tumor cell invasion by calculating distances that invaded cells move from the primary tumor site. Overall this procedure provides an enhanced model system for analyzing factors that contribute to SCOT invasion and therapeutic treatments tailored to prevent local invasion and distant metastatic spread. This method also has the potential to be ultimately combined with other imaging modalities in an in vivo setting.

A comprehensive overview of the techniques involved in generating a mouse model of oral cancer and quantitative monitoring of tumor invasion within the tongue through multi-photon microscopy of labeled cells is presented. This system can serve as a useful platform for the molecular assessment and drug efficacy of anti-invasive compounds.

口腔扁平上皮癌の同所性マウスモデルにおける腫瘍細胞の浸潤の多光子イメージング

Loco-regional invasion of head and neck cancer is linked to metastatic risk and presents a difficult challenge in designing and implementing patient ...

Sublingual Immunotherapy as an Alternative to Induce Protection Against Acute Respiratory Infections

Sublingual route has been widely used to deliver small molecules into the bloodstream and to modulate the immune response at different sites. It has been shown to effectively induce humoral and cellular responses at systemic and mucosal sites, namely the lungs and urogenital tract. Sublingual vaccination can promote protection against infections at the lower and upper respiratory tract; it can also promote tolerance to allergens and ameliorate asthma symptoms. Modulation of lung&#8217;s immune response by sublingual immunotherapy (SLIT) is safer than direct administration of formulations by intranasal route because it does not require delivery of potentially harmful molecules directly into the airways. In contrast to intranasal delivery, side effects involving brain toxicity or facial paralysis are not promoted by SLIT. The immune mechanisms underlying SLIT remain elusive and its use for the treatment of acute lung infections has not yet been explored. Thus, development of appropriate animal models of SLIT is needed to further explore its potential advantages. 
This work shows how to perform sublingual administration of therapeutic agents in mice to evaluate their ability to protect against acute pneumococcal pneumonia. Technical aspects of mouse handling during sublingual inoculation, precise identification of sublingual mucosa, draining lymph nodes and isolation of tissues, bronchoalveolar lavage and lungs are illustrated. Protocols for single cell suspension preparation for FACS analysis are described in detail. Other downstream applications for the analysis of the immune response are discussed. Technical aspects of the preparation of Streptococcus pneumoniae inoculum and intranasal challenge of mice are also explained.
SLIT is a simple technique that allows screening of candidate molecules to modulate lungs&#8217; immune response. Parameters affecting the success of SLIT are related to molecular size, susceptibility to degradation and stability of highly concentrated formulations.

The present work illustrates the convenience of using sublingual immunotherapy to boost the innate immune response in the lungs and confer protection against acute pneumococcal pneumonia in mouse.

代替として舌下免疫療法は、急性呼吸器感染症に対する保護を誘導するために

Sublingual route has been widely used to deliver small molecules into the bloodstream and to modulate the immune response at different sites. It has been ...

Establishment and Characterization of UTI and CAUTI in a Mouse Model

Urinary tract infections (UTI) are highly prevalent, a significant cause of morbidity and are increasingly resistant to treatment with antibiotics. Females are disproportionately afflicted by UTI: 50% of all women will have a UTI in their lifetime. Additionally, 20-40% of these women who have an initial UTI will suffer a recurrence with some suffering frequent recurrences with serious deterioration in the quality of life, pain and discomfort, disruption of daily activities, increased healthcare costs, and few treatment options other than long-term antibiotic prophylaxis. Uropathogenic Escherichia coli (UPEC) is the primary causative agent of community acquired UTI. Catheter-associated UTI (CAUTI) is the most common hospital acquired infection accounting for a million occurrences in the US annually and dramatic healthcare costs. While UPEC is also the primary cause of CAUTI, other causative agents are of increased significance including Enterococcus faecalis. Here we utilize two well-established mouse models that recapitulate many of the clinical characteristics of these human diseases. For UTI, a C3H/HeN model recapitulates many of the features of UPEC virulence observed in humans including host responses, IBC formation and filamentation. For CAUTI, a model using C57BL/6 mice, which retain catheter bladder implants, has been shown to be susceptible to E. faecalis bladder infection. These representative models are being used to gain striking new insights into the pathogenesis of UTI disease, which is leading to the development of novel therapeutics and management or prevention strategies.

The ability to model urinary tract infections (UTI) is crucial in order to be able to understand bacterial pathogenesis and spawn the development of novel therapeutics. This work&#8217;s goal is to demonstrate mouse models of experimental UTI and catheter associated UTI that recapitulate and predict findings seen in humans.

マウスモデルにおけるUTIとCAUTIの樹立とその性状

Urinary tract infections (UTI) are highly prevalent, a significant cause of morbidity and are increasingly resistant to treatment with antibiotics. ...

Stem-cell Based Engineered Immunity Against HIV Infection in the Humanized Mouse Model

With the rapid development of stem cell-based gene therapies against HIV, there is pressing requirement for an animal model to study the hematopoietic differentiation and immune function of the genetically modified cells. The humanized Bone-marrow/Liver/Thymus (BLT) mouse model allows for full reconstitution of a human immune system in the periphery, which includes T cells, B cells, NK cells and monocytes. The human thymic implant also allows for thymic selection of T cells in autologous thymic tissue. In addition to the study of HIV infection, the model stands as a powerful tool to study differentiation, development and functionality of cells derived from hematopoietic stem cells (HSCs). Here we outline the construction of humanized non-obese diabetic (NOD)-severe combined immunodeficient (SCID)-common gamma chain knockout (c&#947;-/-)-Bone-marrow/Liver/Thymus (NSG-BLT) mice with HSCs transduced with CD4 chimeric antigen receptor (CD4CAR) lentivirus vector. We show that the CD4CAR HSCs can successfully differentiate into multiple lineages and have anti-HIV activity. The goal of the study is to demonstrate the use of NSG-BLT mouse model as an in vivo model for engineered immunity against HIV. It is worth noting that, because lentivirus and human tissue is used, experiments and surgeries should be performed in a Class II biosafety cabinet in a Biosafety Level 2 (BSL2) with special precautions (BSL2+) facility.

This protocol describes the methods in constructing a humanized bone-marrow/liver/thymus mouse model with stem cell-based engineered immunity against HIV infection.

ヒト化マウスモデルにおけるHIV感染に対する幹細胞ベースの設計さイミュニティ

With the rapid development of stem cell-based gene therapies against HIV, there is pressing requirement for an animal model to study the hematopoietic ...

Generation of a Humanized Mouse Liver Using Human Hepatic Stem Cells

A novel animal model involving chimeric mice with humanized livers established via human hepatocyte transplantation has been developed. These mice, in which the liver has been repopulated with functional human hepatocytes, could serve as a useful tool for investigating human hepatic cell biology, drug metabolism, and other preclinical applications. One of the key factors required for successful transplantation of human hepatocytes into mice is the elimination of the endogenous hepatocytes to prevent competition with the human cells and provide a suitable space and microenvironment for promoting human donor cell expansion and differentiation. To date, two major liver injury mouse models utilizing fumarylacetoacetate hydrolase (Fah) and uroplasminogen activator (uPA) mice have been established. However, Fah mice are used mainly with mature hepatocytes and the application of the uPA model is limited by decreased breeding. To overcome these limitations, Alb-toxin receptor mediated cell knockout (TRECK)/SCID mice were used for in vivo differentiation of immature human hepatocytes and humanized liver generation. Human hepatic stem cells (HpSCs) successfully repopulated the livers of Alb-TRECK/SCID mice that had developed lethal fulminant hepatic failure following diphtheria toxin (DT) treatment. This model of a humanized liver in Alb-TRECK/SCID mice will have functional applications in studies involving drug metabolism and drug-drug interactions and will promote other in vivo and in vitro studies.

Here, we present a novel humanized mouse liver model generated in Alb-toxin receptor mediated cell knockout (TRECK)/SCID mice following the transplantation of immature and expandable human hepatic stem cells.

ヒト肝幹細胞を用いたヒト化マウス肝臓の生成

A novel animal model involving chimeric mice with humanized livers established via human hepatocyte transplantation has been developed. These mice, in ...

Induction of Accelerated Atherosclerosis in Mice: The "Wire-Injury" Model

Atherosclerosis is a proliferative fibro-inflammatory disease developing in the arterial wall, inducing a deficient blood flow or a lack of blood flow. Moreover, by rupture of the defective vascular wall, atherosclerosis induces occlusive thrombus formation, which represents the main cause of myocardial infarction or stroke and the most frequent cause of death. Despite the advances in the cardiovascular field, many questions remain unanswered, and additional basic research is essential to improve our understanding of the molecular mechanisms during atherosclerosis and its effects. Due to limited clinical studies, there is a need for representative animal models recreating atherosclerotic conditions such as neointima formation after stent implantation, balloon angioplasty, or endarterectomy. Since the mouse presents many advantages and is the most frequently used model for studying molecular processes, the current study proposes an invasive procedure of endothelial denudation, also known as the wire-injury model, which is representative of the human condition of neointima formation in arteries after revascularization procedures.

Induction of Accelerated Atherosclerosis in Mice: The &quot;Wire-Injury&quot; Model

This study describes an invasive procedure for the induction of accelerated atherosclerosis in mice. In comparison to other methods using electric- or cryo-induced injury, mechanical-induced injury mimics the human condition of restenosis after revascularization therapies and is ideal for the study of the molecular mechanisms involved.

マウスにおける加速アテローム性動脈硬化症の誘導:ワイヤー傷害モデル

Atherosclerosis is a proliferative fibro-inflammatory disease developing in the arterial wall, inducing a deficient blood flow or a lack of blood flow. ...

Intravital Microscopy and Thrombus Induction in the Earlobe of a Hairless Mouse

Thrombotic complications of vascular diseases are one leading cause of morbidity and mortality in industrial nations. Due to the complex interactions between cellular and non-cellular blood components during thrombus formation, reliable studies of the physiology and pathophysiology of thrombosis can only be performed in vivo. Therefore, this article presents an ear model in hairless mice and focuses on the in vivo analysis of microcirculation, thrombus formation, and thrombus evolution. By using intravital fluorescence microscopy and the intravenous (iv) application of the respective fluorescent dyes, a repetitive analysis of microcirculation in the auricle can easily be performed, without the need for surgical preparation. Furthermore, this model can be adapted for in vivo studies of different issues, including wound healing, reperfusion injury, or angiogenesis. In summary, the ear of hairless mice is an ideal model for the in vivo study of skin microcirculation in physiological or pathophysiological conditions and for the evaluation of its reaction to different systemic or topical treatments.

The ear model of the hairless SKH1-Hrhr mouse enables intravital fluorescence microscopy of microcirculation and phototoxic thrombus induction without prior surgical preparation in the examined microvascular bed. Therefore, the ear of the hairless mouse is an excellent in vivo model to study the complex interactions during microvascular thrombus formation, thrombus evolution, and thrombolysis.

ヘアレスマウスの耳たぶにおける生体顕微鏡および血栓誘導

Thrombotic complications of vascular diseases are one leading cause of morbidity and mortality in industrial nations. Due to the complex interactions ...

Induction and Micro-CT Imaging of Cerebral Cavernous Malformations in Mouse Model

Mutations in the CCM1 (aka KRIT1), CCM2, or CCM3 (aka PDCD10) gene cause cerebral cavernous malformation (CCM) in humans. Mouse models of CCM disease have been established by tamoxifen induced deletion of Ccm genes in postnatal animals. These mouse models provide invaluable tools to investigate molecular mechanism and therapeutic approaches for CCM disease. An accurate and quantitative method to assess lesion burden and progression is essential to harness the full value of these animal models. Here, we demonstrate the induction of CCM disease in a mouse model and the use of the contrast enhanced X-ray micro computed tomography (micro-CT) method to measure CCM lesion burden in mouse brains. At postnatal day 1 (P1), we used 4-hydroxytamoxifen (4HT) to activate Cre recombinase activity from the Cdh5-CreErt2 transgene to cleave the floxed allele of Ccm2. CCM lesions in mouse brains were analyzed at P8. For micro-CT, iodine based Lugol&#39;s solution was used to enhance contrast in brain tissue. We have optimized the scan parameters and utilized a voxel dimension of 9.5 &#181;m, which lead to a minimum feature size of approximately 25 &#181;m. This resolution is sufficient to measure CCM lesion volume and number globally and accurately, and provide high-quality 3-D mapping of CCM lesions in mouse brains. This method enhances the value of the established mouse models to study the molecular basis and potential therapies for CCM and other cerebrovascular diseases.

This protocol demonstrates the induction of cerebral cavernous malformation disease in a mouse model and uses contrast enhanced micro computed tomography to measure lesion burden. This method enhances the value of established mouse models to study the molecular basis and potential therapies for cerebral cavernous malformation and other cerebrovascular diseases.

誘導およびマウス モデルにおける脳海綿静脈奇形のマイクロ CT イメージング

Mutations in the CCM1 (aka KRIT1), CCM2, or CCM3 (aka PDCD10) gene cause cerebral cavernous malformation (CCM) in humans. Mouse models of CCM disease have ...

Isometric Contractility Measurement of the Mouse Mesenteric Artery Using Wire Myography

The wire myograph technique is used to assess the contractility of vascular smooth muscles in response to depolarization, GPCR agonists/inhibitors and drugs. It is widely used in many studies on the physiological functions of vascular smooth muscle, the pathogenesis of vascular diseases such as hypertension, and the development of smooth muscle relaxant drugs. The mouse is a widely used model animal with a large pool of disease models and genetically modified strains. We introduced this method to measure the isometric contraction of mouse mesenteric artery in detail. A 1.4-mm segment of mouse mesenteric resistance artery was isolated and mounted on a myograph chamber by passing two steel wires through its lumen. After equilibration and normalization steps, the vessel segment was potentiated by a high-K+ solution twice prior to the contraction assay. As an example of the application of this method in drug development, we measured the relaxant effect of a novel natural substance, neoliensinine, isolated from a Chinese herb, embryos of the lotus seed (Nelumbo nucifera Gaertn.) on mouse mesenteric arteries. The vessel segments mounted on the myograph chamber were stimulated with a high-K+ solution. When the force tension reached a stable sustained phase, cumulative doses of neoliensinine were added to the chamber. We found that neoliensinine had a dose-dependent relaxant effect on smooth muscle contraction, thus suggesting that it bears potential activity against hypertension. In addition, as the vessel segment can survive at least 4 hours after mounting and maintain contractility induced by the high-K+ solution for many times, we suggest that the wire myograph system may be used for the time-consuming process of drug screening.

The wire myograph technique is used to investigate vascular smooth muscle functions and screen new drugs. We report a detailed protocol for measuring the isometric contractility of the mouse mesenteric artery and for screening new relaxants of vascular smooth muscle.

ワイヤー図法を使用してマウスの腸間膜動脈の等尺性収縮力測定

The wire myograph technique is used to assess the contractility of vascular smooth muscles in response to depolarization, GPCR agonists/inhibitors and ...