メラノサイトを生成するための直接リプログラミングが報告されている。しかし、さまざまな転写因子がさまざまな研究で使用されています。このプロトコルでは、より高いリプログラミング効率で転写因子数を検証し、さらに減少させました。
我々は、Mitf、Sox10、PAX3の3つの転写因子のみを用いてメラノサイトを生成するための直接リプログラミングシステムを確立し、培養系をより安定で堅牢なものに修正した。機能性メラノサイトを再生する方法は、白斑のような色素脱失疾患の治療限界に対処するのに役立つ重要な問題である。適切なリプログラミングは、将来の提供 私たちの技術は、利便性、強力な操作性、安定性という特徴を持ち、促進と繰り返しが容易です。
濃縮レンチウイルスの産生を開始するには、6個のHEK-293T細胞を60ミリメートルディッシュに10回1.5回プレートし、5%二酸化炭素の加湿インキュベーター内で摂氏37度の通常培地で細胞を培養した。インキュベーションの24時間後、HEK-293T細胞が80〜90%コンフルエントに達したら、培地を3.5mLのDMEMと交換し、次いで5%二酸化炭素を含む加湿インキュベーター内で37°Cで細胞を2時間インキュベートする。インキュベーターから細胞を取り出した後、培地を2%FBSを含むDMEMと交換し、新しく調製したトランスフェクション複合体混合物を滴下して細胞に加える。
混合液を優しく混合する。8時間終了後、細胞培地を3.5 mLの正常培地と交換する。24時間および48時間でウイルス上清を回収する。
次に、2つの異なる時点で収集されたウイルス上清を混合し、混合物を200 xgで摂氏4度で5分間遠心分離する。次いで、収集した上清を0.45ミクロンのフィルターに通し、ろ液を50mL滅菌円錐管に集めた。濾過したウイルス上清を摂氏4度で6,000 xgで一晩遠心分離して濃縮する。
完了したら、ウイルスペレットが円錐形のチューブの底に見えるようにします。上澄み液をゆっくりと注ぎます。ウイルスペレットを通常の培地に溶解させ、ウイルス上清の100分の1*容量で溶解させる。
P1000マイクロピペットを使用して、均質な100倍濃縮ウイルス混合物が得られるまで、静かにピペットを上下にピペットします。濃縮したウイルスを微量遠心チューブに分割し、摂氏80度で保存します。5番目のHEK-293T細胞を1ウェルの6ウェルプレートに1回10回プレートする。
これらの細胞を、5%二酸化炭素の加湿インキュベーター内で摂氏37度の通常の培地で培養する。24時間後、0.1〜0.2マイクロリットルの100倍の蛍光濃縮ウイルスを各ウェルに加える。続いて、カチオン性ポリマートランスフェクション試薬のマイクロリットル当たり4ナノグラムを各ウェルに添加した。
ウイルス感染から約8〜12時間後、培地を通常の培地と交換する。感染後48時間で、1mLの滅菌PBSで皿を洗浄し、死細胞を除去した。次いで、室温で6ウェルプレートのウェル当たり250マイクロリットルの0.05%トリプシン-EDTA溶液を用いて細胞をトリプシン処理する。
プレートを200 xgで摂氏4度で5分間遠心分離します。上清を除去した後、細胞ペレットを1mLのPBSに再懸濁し、細胞懸濁液を5mLポリスチレン丸底チューブに加える。次に、チューブをフローサイトメーターに入れ、サンプルを分析します。
線維芽細胞の直接リプログラミングのために、6ウェル細胞培養プレートの1ウェルを室温で1mLの0.1%ゼラチン溶液でコーティングする。15〜30分後、ウェルがゼラチンで完全に覆われたら、0.1%ゼラチン溶液を吸引する。次に、4番目のマウス胚性線維芽細胞(MEFs)を、0.1%ゼラチンでコーティングした6ウェルプレートの1ウェルに10回プレートし、5%二酸化炭素で加湿した培養器内で摂氏37度で細胞を一晩培養した。
24時間後、MEFが40〜50%のコンフルエントに達したら、培地を通常の培地と交換する。次に、凍結した濃縮ウイルスを氷上で溶かします。式を使用して添加するウイルスの体積を計算し、計算された体積に従って、6つの転写因子の濃縮ウイルスを各ウェルに添加します。
カチオン性ポリマートランスフェクション剤の1mLあたり4マイクログラムをウェルに加える。レンチウイルス感染のゼロ日目と考えてください。初日に、感染の8〜12時間後、ウイルスを含む培地を新鮮な正常培地と交換し、ピューロマイシンを1mLあたり0.5マイクログラム添加して、安定した感染細胞株をスクリーニングする。
感染後48時間後の2日目に、上清培地を徐々に初期化培地に交換する。3マイクロモルのCHIR99021を添加する前に、培地全体の体積の4分の1を変化させる。3日目から7日目までは、細胞の状態に応じて、徐々に割合の高いリプログラミング培地に交換して培地を交換し、5日以内に完全なリプログラミング培地に切り替える。
次に、500マイクロリットルの0.05%トリプシン-EDTA消化酵素で室温で3分間細胞を剥離する。細胞の約60%が浮遊したら、消化酵素の2倍の容量である通常の培地を加えて消化を止めます。細胞懸濁液を15mL滅菌円錐管に集め、摂氏4度で200 xgで5分間遠心分離する。
細胞ペレットを初期化培地で再懸濁する前に上清を除去する。完了したら、再懸濁した細胞を60ミリメートルの滅菌皿にプレートします。加湿された5%二酸化炭素インキュベーター内で摂氏37度で細胞を培養する。
HEK-293T細胞におけるレンチウイルス感染の48時間後、濃縮レンチウイルス産生の成功を、GFPの蛍光強度を観察するか、またはフローサイトメトリーによって評価した。濃縮されたウイルスの力価は、10〜8番目のTU / mLで高いことが見出された。線維芽細胞の直接リプログラミングの間、細胞形態は徐々に細長い細胞シナプスおよび拡大した細胞核に変化した。
しかし、細胞は20日目以降に徐々に老化した。転写因子Mitf、Pax3またはSox10の除去は、メラニン球遺伝子Tyr、Tyrp1、およびMlanaの発現のサイレンシングをもたらし、メラノサイトへの線維芽細胞変換に最も大きな影響を及ぼすことを示している。したがって、3つの転写因子による直接プログラミングによって誘導されたメラニン球遺伝子の発現は、6つの転写因子と比較して高かった。
MEF誘導メラノサイト、またはiMelsを同定するために、メラニン球マーカーの発現を、TYRP1およびDCTを免疫蛍光染色を用いて検出した。さらに、DOPA染色やマッソンフォンタナ染色などのメラニン特異的染色法では、肯定的な結果を示した。293Tセルは均等に分布している必要があります。
また、細胞へのトランスフェクション混合物の添加は、細胞が浮遊するのを防ぐために穏やかに行う必要があります。このプロトコルは安定しており実用的であり、他のタイプのセルを再プログラムするために使用できます。将来の医学におけるメラノサイト再生におけるin vivo直接リプログラミングのための参照および戦略を提供することを期待している。
