1. 準備手順
<ol><li>蒸留水1Lに25gのMHスープを加えて混ぜ合わせて、ミュラー・ヒントンスープ(MHB)を準備します。121°Cで2.5時間オートクレーブ。次に、オートクレーブされた培地を室温または冷蔵庫に保管します。</li>
	<li>4象限ストリーキング法を用いて寒天培地上で問題の細菌(大腸菌 ESBL)をサブ培養し、37°Cで一晩インキュベートする。<ol>
<li>滅菌ループを使用して、1コロニーを取り、近い平行筋を行うことによって、マッコンキー寒天プレートの前半にそれを広げます。</li>
		<li>ループを使用して、第1象限からバクテリアをストリークして第2象限に広げる。</li>
		<li>2 番目の象限から、3 番目の象限のストリークを平行な近い縞を使用して延長します。</li>
		<li>第4象限の中央に細菌を広げ、第3象限からストリークする。</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. パネルの準備
<ol><li>4つの96ウェルプレートを隣り合わせて正方形にします。テープを使用して、底をテープでつなぎます。</li>
	<li>この手順を繰り返して、4 枚のプレートを含む 4 つのパネルを取得し、A1、A2、A3、および A4 という名前を付けます。</li>
	<li>4つのパネルの16個の96ウェルプレートの列2と列11の間の井戸にMHスープの50 μLを加えます。</li>
	<li>4つのパネルの16 96ウェルプレートで負のコントロールとして役立つウェルH12にMHスープの200 μLを加えます。</li>
	<li>4つのパネルの16 96ウェルプレートで正の制御井戸として機能する井戸A1とH1にMHスープの150 μLを追加します。</li>
</ol>3. 薬物1、セフォタキシム、連続希釈
<ol><li>円錐形の管に、生殖不能dH2Oの15 mLを加える。<ol>
<li>式C1 V1=C2V2に続く薬剤のストック溶液から除去する体積を計算する。したがって、V1=(C2 x 15 mL)/C1. 注:当社の場合、セフォタキシムストックソリューションは105 μg/mL、C2 は256 μg/mLです。したがって、V1 = 38.4 μL。</li>
	</ol>
</li>
	<li>15 mLの無菌dH2Oから計算された容積を取り除き、薬剤を加える。</li>
	<li>調製した薬物溶液のピペット50μLは、H12を除くカラム11およびカラム12の各ウェルに入る。</li>
	<li>列 11 から 50 μL を取り出して列 10 の対応するウェルに入れてシリアル希釈を開始し、10 から 2 列目から取り出した 50 μL が廃棄される列 2 まで続きます。</li>
	<li>4 つのパネルのすべての 16 96 ウェル プレートについて、手順 3.4 と 3.5 を繰り返します。</li>
</ol>4. 薬物2、アムカシン、連続希釈
<ol><li>円錐形の管に、生殖不能dH2Oの10 mLを加える。</li>
	<li>式C1 V1=C2V2に続く薬剤のストック溶液から除去する体積を計算する。したがって、V1=(C2 x 10 mL)/C1. 注:当社の場合、アミカシンストックソリューションは103 μg/mL、C2 は64 μg/mLです。したがって、V1 = 64 μL。</li>
	<li>10 mLの無菌dH2Oから計算された容積を取り除き、薬剤を加える。</li>
	<li>8つの別々の96ウェルプレートを取ります。</li>
	<li>各プレートに、行 G と B の間のウェルに MHB の 100 μL を追加します。</li>
	<li>前に調製した薬物2溶液の100μLを行Gのウェルに加える。</li>
	<li>各ウェルから100 μLを取って行Gから行Bに連続して希釈し、最後に行Bのウェルから100 μLを捨てます。</li>
	<li>8枚のプレートを準備するために、ステップ4.5、4.6、および4.7を繰り返します。</li>
</ol>5. 4つのパネルへの薬物2の移入
<ol><li>ピペット50μLの薬物2は、行GとBの間のウェルから、4枚のパネルの各プレートの対応するウェルに入る。1つの準備された96ウェルプレートには、1つのパネル内の2つのプレートに十分な100 μLの薬物2が含まれています。</li>
</ol>6. 薬物3、レボフロキサシン、追加
<ol><li>4つの異なる円錐形の管に、生殖不能dH2Oの14 mLを加える。</li>
	<li>式C1 V1=C2V2に続く薬剤のストック溶液から除去する体積を計算する。したがって、V1=(C2 x 14 mL)/C1. 注:当社の場合、レボフロキサシンは5 x 103 μg/mLのストック溶液から4つの異なる濃度で調製されます。 C1 = 2 μg/mL、V1 = 5.6 μL C2 = 4 μg/mL、V1 = 11.2 μL C3 = 8 μg/mL、 V1 = 22.4 μL C4 = 16 μg/mL、 V1 = 44.8 μL</li>
	<li>各チューブから14mLの無菌dH2Oから計算された体積を取り除き、薬剤を加えます。</li>
	<li>3番目の薬剤の必要な濃度を準備した後、50 μLを取り、C1が4つのパネルの4つのP1プレートに対応する各パネルの対応するプレートのBとGと列2と列12の間の対応する井戸に追加し、C2は4つのパネルの4つのP2プレートに対応します、C3は4つのパネルの4つのP3版に対応し、C4は4つのパネルの4つのP4版に対応する。</li>
</ol>7. ドラッグ4、トリメトプリム-スルファムトキサゾール、追加
<ol><li>円錐形の管に、生殖不能dH2Oの14 mLを加える。</li>
	<li>式C1 V1=C2V2に続く薬剤のストック溶液から除去する体積を計算する。したがって、V1=(C2 x 14 mL)/C1. 注:当社の場合、トリメトプリム-スルファメトキサゾールは、48 x 103 μg/mLのストック溶液から4つの異なる濃度で調製されます。 C1 = 512 μg/mL、V1 = 149.33 μL C2 = 1024 μg/mL、 V1 = 298.66 μL C3 = 2048 μg/mL, V1 = 597.33 μL C4 = 4096 μg/mL, V1 = 1 194.66 μL</li>
	<li>各チューブの14mLの無菌dH2Oから計算された体積を取り除き、薬剤を加えます。</li>
	<li>第4の薬剤の必要な濃度を調製した後、50μLを取り、C1がパネル1に対応し、C2がパネル2に対応し、C2がパネル3に対応し、C4がパネル4に対応する対応する4つのプレートの4つのプレートのBとGと列の間の対応する井戸に加える。</li>
</ol>8. 細菌性菌の調製と添加
<ol><li>滅菌ループを使用して、以前にプレート上で培養した細菌分離物 大腸菌 ESBLの1コロニーを滅菌MHBおよび渦の2mLに移す。</li>
	<li>密度計を使用して0.5マクファーランドでなければならない濁度を確認してください。</li>
	<li>滅菌尿カップに80 mLの無菌MHスープを加えます。</li>
	<li>0.5マクファーランド内液から尿カップに細菌接種を加え、C 1 V1= C2V2に続く尿カップに V1 = (106 x 80 mL) / 10 8 =800 μL.</li>
	<li>管内管内溶液106CFU/mLのピペット50μLは、H12を除く各ウェルに、これは滅菌制御が良好である。</li>
	<li>パネルを一晩で37°Cでインキュベートします。</li>
	<li>インキュベーション後、50 μLのヨウドテトラゾリウムを加えて、ウェルの成長を記録します。</li>
</ol>9. FIC テンプレートのプロトコル (補足ファイル)
<ol><li>パネルAの黄色い細胞に薬物1(セフォタキシム)の最高濃度を書く。</li>
	<li>パネルBの黄色の細胞に薬物2(アミカシン)の最高濃度を書く。</li>
	<li>パネルCの黄色の細胞に薬物3(レボフロキサシン)の最高濃度を書く。</li>
	<li>パネルDに薬物4(トリメトプリム-スルファメトキサゾール)の最高濃度を書く。</li>
	<li>赤で成長している井戸を強調することによって、レッドライン(成長/成長なしインターフェイス)をトレースします。</li>
	<li>薬物1(ATB1)の表に薬物1のMICを書く。</li>
	<li>薬物2(ATB2)の表に薬物2のMICを書く。</li>
	<li>薬物3の表に薬物3のMICを書く(ATB3)。</li>
	<li>薬物4(ATB4)の表に薬物4のMICを書く。</li>
	<li>ATB1 の FIC を計算するには<ol>
<li>成長/成長なしインターフェイスのウェルを決定します。</li>
		<li>表 ATB1 で FIC1 の横のセルをダブルクリックし、パネル A の左側にある黄色のセルを最初に選択したウェルにドラッグします。</li>
		<li>井戸 1 が FIC1 に対応し、ウェル 2 が FIC2 に対応する、など、選択したすべてのウェルに対して、ステップ 9.10.2 を繰り返します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>ATB2 の FIC を計算するには<ol>
<li>表 ATB2 で FIC1 の横のセルをダブルクリックし、パネル B の左側にある黄色のセルを、最初に選択したウェルにドラッグします。</li>
		<li>事前に選択したすべてのウェルについて、ステップ 9.11.1 を繰り返します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>ATB3 の FIC を計算するには<ol>
<li>表 ATB3 で FIC1 の横のセルをダブルクリックし、パネル C の左側にある黄色のセルを、最初に選択したウェルにドラッグします。</li>
		<li>事前に選択したすべてのウェルに対して、ステップ 9.12.1 を繰り返します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>ATB4 の FIC を計算するには<ol>
<li>表 ATB4 で FIC1 の横のセルをダブルクリックし、パネル D の左側にある黄色のセルを、最初に選択したウェルにドラッグします。</li>
		<li>事前に選択したすべてのウェルに対して、ステップ 9.13.1 を繰り返します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>ATB1+2+3+4 というラベルのテーブルで、各 ATB の FIC1 を自動的に合計します。他の FICs(FIC2、FIC3 など)でも同じことが起こります。<ol>
<li>FIC を含み、黄色で強調表示されているセルで、それをダブルクリックし、テーブル ATB1+2+3+4 から合計された ΣFICs を選択します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>9 枚のプレートを表す 9 枚のシートのそれぞれに対して、これらの手順を繰り返します。 注: シート FIC all では、テーブルは得られた値の解釈と最終的な合計 FIC を示します。</li>
</ol>10. 4つの薬物のマイクロ希釈アッセイを用いたMICの決定
<ol><li>各試験薬の略称で4つの異なる行にラベルを付けます。例えば、セフォタキシム用CTX、アミカシンのAMK、レボフロキサシンのLEVO、トリメトプリムスルファメトキサゾールのSXTが挙げられない。</li>
	<li>ピペット200 μLの無菌ミュラーヒントンスープは、使用された各行でウェル番号1とウェル番号12にスープします。まあナンバー12はネガティブコントロールとしてうまく機能します。</li>
	<li>ピペット100μLの無菌ミュラーヒントンは、各使用列のウェル2〜11にスープを入れる。</li>
	<li>C1V1=C2V2を用いて添加する各薬剤の体積を計算する。したがって、V1=(C 2 x 4 x V2)/C1.V2はウェルの最終容積で、C1はストック溶液の濃度、C2は最初の井戸に必要な初期濃度です。 注: ここでは、次の項目を使用します。 セフォタキシム:C1 = 105 μg/mL、そこで104 μg/mL、C2 = 256 μg/mLに希釈します。したがって、V1 = 20.48 μL アミカシン: C1 = 103 μg/mL, C2 = 64 μg/mL;したがって、V1 = 51.2 μL レボフロキサシン:C1 = 5 x 103 μg/mL、そこで5 x 102 μg/mL、C2 = 16 μg/mLに希釈します。したがって、V1 = 25.6 μL トリメトプリム-スルファムトキサゾール:C1 = 48 x 103 μg/mL、C2 = 4096 μg/mL;したがって、V1 = 68.26 μL</li>
	<li>ピペットは、200 μLのスープから同じ体積を除去した後、対応する行の第1ウェルの各薬物に必要な体積を、薬剤の添加後に200μLの総体積を得た。</li>
	<li>ウェル1からウェル2に100 μLを取り除いて連続希釈し、ウェル10から取り出した100μLが廃棄されるウェル10に達するまで。井戸11は正のコントロールとしてうまく機能していることに注意してください。</li>
	<li>ピペット100 μLの106 は、ネガティブコントロールとして役立つ十分な番号12を除き、使用される各行の各ウェルに細菌接種を調製した。</li>
	<li>一晩で37°Cでインキュベートする。</li>
</ol>

<ol>
	<li>Ibezim, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbial+resistance+to+antibiotics.">Microbial resistance to antibiotics.</a> African Journal of Biotechnology. 4, 1606-1611 (2006).</li><li>Ventola, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+antibiotic+resistance+crisis:+part+1:+causes+and+threats.">The antibiotic resistance crisis: part 1: causes and threats.</a> P &amp; T: A Peer-Reviewed Journal for Formulary Management. 40 (4), 277-283 (2015).</li><li>Alanis, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resistance+to+antibiotics:+Are+we+in+the+post-antibiotic+era.">Resistance to antibiotics: Are we in the post-antibiotic era.</a> Archives of Medical Research. 36 (6), 697-705 (2005).</li><li>Nathan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibiotics+at+the+crossroads.">Antibiotics at the crossroads.</a> Nature. 431 (7011), 899-902 (2004).</li><li>Bollenbach, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antimicrobial+interactions:+mechanisms+and+implications+for+drug+discovery+and+resistance+evolution.">Antimicrobial interactions: mechanisms and implications for drug discovery and resistance evolution.</a> Current Opinion in Microbiology. 27, 1-9 (2015).</li><li>Mehta, K. 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A review of antimicrobial synergy testing.</a> Journal of Clinical Microbiology. 52 (12), 4124-4128 (2014).</li><li>Stein, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three+dimensional+checkerboard+synergy+analysis+of+colistin,+meropenem,+tigecycline+against+multidrug-resistant+clinical+klebsiella+pneumonia+isolates.">Three dimensional checkerboard synergy analysis of colistin, meropenem, tigecycline against multidrug-resistant clinical klebsiella pneumonia isolates.</a> PloS One. 10 (6), 0126479 (2015).</li><li>Langeveld, W. T., Veldhuizen, E. J. A., Burt, S. 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C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synergy,+antagonism,+and+what+the+chequerboard+puts+between+them.">Synergy, antagonism, and what the chequerboard puts between them.</a> The Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 52 (1), 1 (2003).</li></ol>

4倍のチェッカーボード法は、そのプロトコルのチェッカーボードと3次元チェッカーボードに似ています。ただし、実験中のエラーを避けるために、特定の重要な手順を考慮する必要があります。
試験された分離株に対して各薬物のMICをテストし、プレートで連続希釈する必要がある薬物1および薬物2の希釈を開始するために必要な濃度を知るためにプロトコルを開始し?...

抗生物質1,2の過剰使用や誤用による耐性の増加に伴い、細菌感染を治療するための新薬や薬剤の開発が非常に重要になっています。新薬開発などの新しいアプローチは、抵抗危機を克服するために非常に重要です。しかし、製薬業界は新しい抗菌剤の開発には関心がありません。さらに、新薬が開発されれば、細菌はこれらの新薬3,4に対する耐性を進化し、開発し続けるだろう。したがって、抵抗の問題は解決されず、細菌耐性を克服するために考慮され、研究されるべき別のアプローチの必要性を作る。
薬物の組み合わせは、主に多剤耐性病原体5、6によって引き起こされる細菌感染症を治療するための非常に重要な概念である。それは治療の経過を減少させる、与えられた用量を減少させる;したがって、与えられた薬物の毒性を減少させ、抵抗性の発生率を低下させるのに役立ち、そしてある意味では、担保感受性5、7、8、9の概念に記載されているように、与えられた薬剤に細菌を感作する。
1つの薬剤に対する耐性の開発は、単一の突然変異を必要とします;しかし、複数の経路を標的とする薬物の組み合わせに対する耐性の開発には、この組み合わせによって減速されるいくつかの独立した突然変異が必要である。併用療法を使用する間の抵抗の低下の一例は、結核菌10におけるリバンフィンに対する抵抗率の低下である。別の例は、ピペラシリンを単独で服用している患者において抵抗性株の出現率がカルボキシペニシリンとアミノグリコシド10との組み合わせを服用したものよりも高いことを示したGribbleららの研究である。研究は、進化する細菌におけるアミノグリコシドへの耐性の発達がこれらの株を様々な他の薬物に敏感にしたことを示している5。β-ラクタム級薬物アモキシシリンとラクタマーゼ阻害剤のクラクタマーゼ阻害剤との組合せは、耐性菌株8の治療に成功を示した。
治療時間を短縮することは、薬物の組み合わせから生じる良い利点です。例えば、2週間のジェンタマイシンとペニシリンまたはセフトリアキシンを併用する療法は、ペニシリンまたはセフトリアキシン単独で与えられる同じ効力を与える。併用薬は、サブICのような単独で与えられた場合に有効ではない薬物の低用量の使用を可能にする。スルホンアミドの例は、トリプルスルホンアミドの使用が最小限に抑えられるところに、より低い用量で、全用量で不溶性スルホンアミドを使用する場合に結晶形成または結晶化物である毒性を与えることができる。
したがって、与えられた投与量と治療時間を減らすことは、最終的に体内の薬物の毒性を減少させる。併用薬物間の相互作用を評価する方法を開発するという考え方は非常に重要です。ある研究では、併用療法がアシネトバクターおよびP.緑素吸砂の耐性種の治療に対してより効果的であることを示した。
併用して薬を与える チェッカーボード法、タイムキル曲線法、Eテスト法13など、薬物の組み合わせを調べることができる方法は様々です。チェッカーボード法は、1つの実験自体で問題の2つの薬物の間のすべての可能な組み合わせを研究することができます。また、3つの薬剤14の組み合わせを研究するために開発された。現在、これを拡張して、主に多剤耐性病原体の治療のための4つの薬剤の組み合わせを研究しています。
タイムキル曲線アッセイは、通常、ある薬剤の殺菌効果を試験するために行われる。また、いくつかの薬物が特定の濃度で組み合わされる薬物の組み合わせの効果をテストするために使用されました。このプロトコルは、各カップに我々は、スープ、薬物の組み合わせ、および必要な細菌株を追加するいくつかの無菌チューブまたはカップの調製を必要とする。いくつかの時点で光学密度のインキュベーションと記録後、その結果を、使用された菌株の正常な成長率と比較して、増殖速度が増加したか、減少したか、または13を変化させなかったかを調べる。
E-test法は、通常、対象の薬物の勾配濃度を含むストリップが接種されたプレート上に置かれている最小の阻害濃度(MIC)を試験するために行われる。また、2つのストリップが彼らのMCS13で交差する垂直な方法でプレートに追加される2つの薬物の組み合わせをテストするために使用されました。
文献によれば、相乗効果を定義し、研究するためのゴールドスタンダードはありません。したがって、組み合わせを研究するために使用される方法のどれがより良く、どれがより良く、より信頼性の高い結果を主に13を生成するかを評価することは困難です。しかし、時間殺しの検定は、労働集約的で時間がかかり、高価な15,16であり、Eテスト法は2つの薬物の組み合わせを研究するために開発される。チェッカーボードは、テストされた2つの薬物間のすべての可能な組み合わせを研究することができ、これがこの技術が開発するために選択された理由です。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1000 &#181;L tips</td>
			<td>Citotest</td>
			<td>4330000402</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 &#181;L tips</td>
			<td>Citotest</td>
			<td>4330-0013-17</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL centrifuge tube</td>
			<td>corning</td>
			<td>430828</td>
			<td>For drug 3 and 4 preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL polysterene round-bottom Tube</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352058</td>
			<td>For 0.5 MacFarland bacterial inoculum preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>90mm petri dishes</td>
			<td>JRZ Plastilab</td>
			<td></td>
			<td>As bed for the solutions to be added using the multichannel pipette</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plates</td>
			<td>corning</td>
			<td>3596</td>
			<td>For serial diltuion and combining drugs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bactrim 200, 40 mg (Trimethoprim-sulamethoxazole</td>
			<td>By CRNEXI SAS Fontenay-sous-Bois, France</td>
			<td>10177403</td>
			<td>Drug 4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ceforane, 1 g (Cefotaxime)</td>
			<td>PHARCO Pharmaceuticals</td>
			<td>24750/2006</td>
			<td>Drug 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Densitometer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E. Coli ESBL strain</td>
			<td>Retreived as a medical strain from the Saint-George Hospital Lebanon</td>
			<td></td>
			<td>Bacterial strain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mac Conkey + crystal violet agar</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>64169508</td>
			<td>For making agar plates used for subculturing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Miacin 500 mg/2 mL (Amikacin)</td>
			<td>HIKMA Pharmaceuticals</td>
			<td>2BXMIA56N-AEF</td>
			<td>Drug 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Muller-Hinton Broth</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>69444</td>
			<td>For making bacterial media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multichannel Pipette</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>GJ54761</td>
			<td>For serial dilution and addition of media, bacteria and drugs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paper Tape</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single Channel pipettes</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>OH19855 HH40868</td>
			<td>For the addition of media, bacteria and drugs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tavanic, 500 mg (Levofloxacin)</td>
			<td>sanofi aventis</td>
			<td>221937/2009</td>
			<td>Drug 3</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quadruple-checkerboard: a modification of the three-dimensional checkerboard for studying drug combinations

薬物併用療法の概念は、主に薬剤に対する耐性の急激な増加に伴って非常に重要になってきています。Qチェッカーボードとも呼ばれる4倍のチェッカーボードは、他のプロトコルと同じ結果を達成するために必要な時間と作業を最小限に抑えるために、1つの実験で4つの薬物の間で得ることができる可能な組み合わせの数を最大化することを目的としています。このプロトコルは、薬物を希釈し、いくつかの96ウェルプレートで一緒に組み合わせる単純なマイクロ希釈技術に基づいています。
96ウェルプレートの最初のセットでは、ミュラー・ヒントンスープが追加され、その後に最初に必要な薬物(例えば、Cefotaximeはここで)を連続的に希釈する。最初のステップが完了した後、別の96ウェルプレートのセットが第2の薬物(例えば、アミカチ)を希釈するために使用され、これは特定の量の薬物2を除去することによって移され、薬物1を含む96ウェルプレートの最初のセットの対応する井戸に入れられます。第3のステップは、第3の薬物(例えば、レボフロキサシン)の必要な濃度を、薬物1および2の組み合わせを含む初期セットの適切なプレートに添加することによって行われる。第4のステップは、第1セットの適切なプレートに第4の薬物(例えば、トリメトプリム-スルファメトキサゾール)の必要な濃度を加えることによって行われる。次に、 大腸菌 ESBL細菌接種を調製し、添加する。
この方法は、すべての可能な組み合わせを評価するために重要であり、さらに in vivo テストのためにテストされる可能性の広い範囲を有する。多くの焦点を必要とする疲れた技術であるにもかかわらず、結果は顕著であり、多くの組み合わせを単一の実験でテストできる時間を節約します。

図2A は、セフォタキシムとアミカシンをレボフロキサシンおよびトリメトプリム-スルファメトキサゾールの特異的濃度と組み合わせた結果を表す。図の左側には、図の右側に薬物の濃度を模式的に提示した4つのプレートが見られます。矢印は、成長/成長なしインターフェイスのウェルを表します。色付きの井戸は成長を含む井戸です。第4版は組合せを含む象限の成長...

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Quadruple-Checkerboard: A Modification of the Three-Dimensional Checkerboard for Studying Drug Combinations

このプロトコルは、1回の実験で4つの薬剤の間で得ることができるすべての可能な組み合わせを研究する方法を説明します。この方法は、標準の96ウェルプレートマイクロ希釈アッセイと、結果を評価するための分数抑制濃度(FICs)の計算に基づいています。

4倍のチェッカーボード:薬物の組み合わせを研究するための三次元チェッカーボードの変形

The concept of drug-combination therapy is becoming very important mainly with the drastic increase in resistance to drugs. The ...

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4.3K ビュー.  University of Balamand. このプロトコルは、1回の実験で4つの薬剤の間で得ることができるすべての可能な組み合わせを研究する方法を説明します。この方法は、標準の96ウェルプレートマイクロ希釈アッセイと、結果を評価するための分数抑制濃度(FICs)の計算に基づいています。

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Chip-based Three-dimensional Cell Culture in Perfused Micro-bioreactors

We have developed a chip-based cell culture system for the three-dimensional cultivation of cells. The chip is typically manufactured from non-biodegradable polymers, e.g., polycarbonate or polymethyl methacrylate by micro injection molding, micro hot embossing or micro thermoforming. But, it can also be manufactured from bio-degradable polymers. Its overall dimensions are 0.7 1 x 20 x 20 x 0.7 1 mm (h x w x l). The main features of the chips used are either a grid of up to 1156 cubic micro-containers (cf-chip) each the size of 120-300 x 300 x 300 &mu; (h x w x l) or round recesses with diameters of 300 &mu; and a depth of 300 &mu; (r-chip). The scaffold can house 10 Mio. cells in a three-dimensional configuration. For an optimal nutrient and gas supply, the chip is inserted in a bioreactor housing. The bioreactor is part of a closed steril circulation loop that, in the simplest configuration, is additionaly comprised of a roller pump and a medium reservoir with a gas supply. The bioreactor can be run in perfusion, superfusion, or even a mixed operation mode. We have successfully cultivated cell lines as well as primary cells over periods of several weeks. For rat primary liver cells we could show a preservation of organotypic functions for more than 2 weeks. For hepatocellular carcinoma cell lines we could show the induction of liver specific genes not or only slightly expressed in standard monolayer culture. The system might also be useful as a stem cell cultivation system since first differentiation experiments with stem cell lines were promising.

We describe a chip-based platform for the three-dimensional cultivation of cells in micro-bioreactors. One chip can house up to 10 Mio. cells that can be cultivated under precisely defined conditions with regard to fluid flow, oxygen tension etc. in a sterile, closed circulation loop.

灌流マイクロバイオリアクターのチップベースの三次元細胞培養

We have developed a chip-based cell culture system for the three-dimensional cultivation of cells. The chip is typically manufactured from ...

生物学

Microfabrication of Chip-sized Scaffolds for Three-dimensional Cell cultivation

Using microfabrication technologies is a prerequisite to create scaffolds of reproducible geometry and constant quality for three-dimensional cell cultivation. These technologies offer a wide spectrum of advantages not only for manufacturing but also for different applications. The size and shape of formed cell clusters can be influenced by the exact and reproducible architecture of the microfabricated scaffold and, therefore, the diffusion path length of nutrients and gases can be controlled.1 This is unquestionably a useful tool to prevent apoptosis and necrosis of cells due to an insufficient nutrient and gas supply or removal of cellular metabolites.
Our polymer chip, called CellChip, has the outer dimensions of 2 x 2 cm with a central microstructured area. This area is subdivided into an array of up to 1156 microcontainers with a typical dimension of 300 m edge length for the cubic design (cp- or cf-chip) or of 300 m diameter and depth for the round design (r-chip).2
So far, hot embossing or micro injection moulding (in combination with subsequent laborious machining of the parts) was used for the fabrication of the microstructured chips. Basically, micro injection moulding is one of the only polymer based replication techniques that, up to now, is capable for mass production of polymer microstructures.3 However, both techniques have certain unwanted limitations due to the processing of a viscous polymer melt with the generation of very thin walls or integrated through holes. In case of the CellChip, thin bottom layers are necessary to perforate the polymer and provide small pores of defined size to supply cells with culture medium e.g. by microfluidic perfusion of the containers.
In order to overcome these limitations and to reduce the manufacturing costs we have developed a new microtechnical approach on the basis of a down-scaled thermoforming process. For the manufacturing of highly porous and thin walled polymer chips, we use a combination of heavy ion irradiation, microthermoforming and track etching. In this so called "SMART" process (Substrate Modification And Replication by Thermoforming) thin polymer films are irradiated with energetic heavy projectiles of several hundred MeV introducing so-called "latent tracks" Subsequently, the film in a rubber elastic state is formed into three dimensional parts without modifying or annealing the tracks. After the forming process, selective chemical etching finally converts the tracks into cylindrical pores of adjustable diameter.

We present two processes for the microfabrication of porous polymer chips for three-dimensional cell cultivation. The first one is hot embossing combined with a solvent vapour welding process. The second one uses a recently developed microthermoforming process combined with ion track technology leading to a significant simplification of manufacture.

三次元細胞培養用チップサイズの足場の微細加工

Using microfabrication technologies is a prerequisite to create scaffolds of reproducible geometry and constant quality for three-dimensional cell ...

Hi-C: A Method to Study the Three-dimensional Architecture of Genomes.

The three-dimensional folding of chromosomes compartmentalizes the genome and and can bring distant functional elements, such as promoters and enhancers, into close spatial proximity 2-6. Deciphering the relationship between chromosome organization and genome activity will aid in understanding genomic processes, like transcription and replication. However, little is known about how chromosomes fold. Microscopy is unable to distinguish large numbers of loci simultaneously or at high resolution. To date, the detection of chromosomal interactions using chromosome conformation capture (3C) and its subsequent adaptations required the choice of a set of target loci, making genome-wide studies impossible 7-10.
We developed Hi-C, an extension of 3C that is capable of identifying long range interactions in an unbiased, genome-wide fashion. In Hi-C, cells are fixed with formaldehyde, causing interacting loci to be bound to one another by means of covalent DNA-protein cross-links. When the DNA is subsequently fragmented with a restriction enzyme, these loci remain linked. A biotinylated residue is incorporated as the 5' overhangs are filled in. Next, blunt-end ligation is performed under dilute conditions that favor ligation events between cross-linked DNA fragments. This results in a genome-wide library of ligation products, corresponding to pairs of fragments that were originally in close proximity to each other in the nucleus. Each ligation product is marked with biotin at the site of the junction. The library is sheared, and the junctions are pulled-down with streptavidin beads. The purified junctions can subsequently be analyzed using a high-throughput sequencer, resulting in a catalog of interacting fragments.
Direct analysis of the resulting contact matrix reveals numerous features of genomic organization, such as the presence of chromosome territories and the preferential association of small gene-rich chromosomes. Correlation analysis can be applied to the contact matrix, demonstrating that the human genome is segregated into two compartments: a less densely packed compartment containing open, accessible, and active chromatin and a more dense compartment containing closed, inaccessible, and inactive chromatin regions. Finally, ensemble analysis of the contact matrix, coupled with theoretical derivations and computational simulations, revealed that at the megabase scale Hi-C reveals features consistent with a fractal globule conformation.

The Hi-C method allows unbiased, genome-wide identification of chromatin interactions (1). Hi-C couples proximity ligation and massively parallel sequencing. The resulting data can be used to study genomic architecture at multiple scales: initial results identified features such as chromosome territories, segregation of open and closed chromatin, and chromatin structure at the megabase scale.

ハイC：ゲノムの三次元構造を研究する方法。

The three-dimensional folding of chromosomes compartmentalizes the genome and and can bring distant functional elements, such as promoters and enhancers, ...

An Analytical Tool that Quantifies Cellular Morphology Changes from Three-dimensional Fluorescence Images

The most common software analysis tools available for measuring fluorescence images are for two-dimensional (2D) data that rely on manual settings for inclusion and exclusion of data points, and computer-aided pattern recognition to support the interpretation and findings of the analysis. It has become increasingly important to be able to measure fluorescence images constructed from three-dimensional (3D) datasets in order to be able to capture the complexity of cellular dynamics and understand the basis of cellular plasticity within biological systems. Sophisticated microscopy instruments have permitted the visualization of 3D fluorescence images through the acquisition of multispectral fluorescence images and powerful analytical software that reconstructs the images from confocal stacks that then provide a 3D representation of the collected 2D images. Advanced design-based stereology methods have progressed from the approximation and assumptions of the original model-based stereology1 even in complex tissue sections2. Despite these scientific advances in microscopy, a need remains for an automated analytic method that fully exploits the intrinsic 3D data to allow for the analysis and quantification of the complex changes in cell morphology, protein localization and receptor trafficking. 
Current techniques available to quantify fluorescence images include Meta-Morph (Molecular Devices, Sunnyvale, CA) and Image J (NIH) which provide manual analysis. Imaris (Andor Technology, Belfast, Northern Ireland) software provides the feature MeasurementPro, which allows the manual creation of measurement points that can be placed in a volume image or drawn on a series of 2D slices to create a 3D object. This method is useful for single-click point measurements to measure a line distance between two objects or to create a polygon that encloses a region of interest, but it is difficult to apply to complex cellular network structures. Filament Tracer (Andor) allows automatic detection of the 3D neuronal filament-like however, this module has been developed to measure defined structures such as neurons, which are comprised of dendrites, axons and spines (tree-like structure). This module has been ingeniously utilized to make morphological measurements to non-neuronal cells3, however, the output data provide information of an extended cellular network by using a software that depends on a defined cell shape rather than being an amorphous-shaped cellular model. To overcome the issue of analyzing amorphous-shaped cells and making the software more suitable to a biological application, Imaris developed Imaris Cell. This was a scientific project with the Eidgen&ouml;ssische Technische Hochschule, which has been developed to calculate the relationship between cells and organelles. While the software enables the detection of biological constraints, by forcing one nucleus per cell and using cell membranes to segment cells, it cannot be utilized to analyze fluorescence data that are not continuous because ideally it builds cell surface without void spaces. To our knowledge, at present no user-modifiable automated approach that provides morphometric information from 3D fluorescence images has been developed that achieves cellular spatial information of an undefined shape (Figure 1). 
We have developed an analytical platform using the Imaris core software module and Imaris XT interfaced to MATLAB (Mat Works, Inc.). These tools allow the 3D measurement of cells without a pre-defined shape and with inconsistent fluorescence network components. Furthermore, this method will allow researchers who have extended expertise in biological systems, but not familiarity to computer applications, to perform quantification of morphological changes in cell dynamics.

We developed a software platform that utilizes Imaris Neuroscience, ImarisXT and MATLAB to measure the changes in morphology of an undefined shape taken from three-dimensional confocal fluorescence of single cells. This novel approach can be used to quantify changes in cell shape following receptor activation and therefore represents a possible additional tool for drug discovery.

三次元蛍光画像から細胞形態の変化を定量分析ツール

The most common software analysis tools available for measuring fluorescence images are for two-dimensional (2D) data that rely on manual settings for ...

Using High Resolution Computed Tomography to Visualize the Three Dimensional Structure and Function of Plant Vasculature

High resolution x-ray computed tomography (HRCT) is a non-destructive diagnostic imaging technique with sub-micron resolution capability that is now being used to evaluate the structure and function of plant xylem network in three dimensions (3D) (e.g. Brodersen et al. 2010; 2011; 2012a,b). HRCT imaging is based on the same principles as medical CT systems, but a high intensity synchrotron x-ray source results in higher spatial resolution and decreased image acquisition time. Here, we demonstrate in detail how synchrotron-based HRCT (performed at the Advanced Light Source-LBNL Berkeley, CA, USA) in combination with Avizo software (VSG Inc., Burlington, MA, USA) is being used to explore plant xylem in excised tissue and living plants. This new imaging tool allows users to move beyond traditional static, 2D light or electron micrographs and study samples using virtual serial sections in any plane. An infinite number of slices in any orientation can be made on the same sample, a feature that is physically impossible using traditional microscopy methods.
Results demonstrate that HRCT can be applied to both herbaceous and woody plant species, and a range of plant organs (i.e. leaves, petioles, stems, trunks, roots). Figures presented here help demonstrate both a range of representative plant vascular anatomy and the type of detail extracted from HRCT datasets, including scans for coast redwood (Sequoia sempervirens), walnut (Juglans spp.), oak (Quercus spp.), and maple (Acer spp.) tree saplings to sunflowers (Helianthus annuus), grapevines (Vitis spp.), and ferns (Pteridium aquilinum and Woodwardia fimbriata). Excised and dried samples from woody species are easiest to scan and typically yield the best images. However, recent improvements (i.e. more rapid scans and sample stabilization) have made it possible to use this visualization technique on green tissues (e.g. petioles) and in living plants. On occasion some shrinkage of hydrated green plant tissues will cause images to blur and methods to avoid these issues are described. These recent advances with HRCT provide promising new insights into plant vascular function.

High resolution x-ray computed tomography (HRCT) is a non-destructive diagnostic imaging technique that can be used to study the structure and function of plant vasculature in 3D. We demonstrate how HRCT facilitates exploration of xylem networks across a wide range of plant tissues and species.

プラントの脈管構造の三次元構造と機能を可視化するために、高分解能CTを用いた

High resolution x-ray computed tomography (HRCT) is a non-destructive diagnostic imaging technique with sub-micron resolution capability that is now being ...

FRET Imaging in Three-dimensional Hydrogels

Imaging of F&#246;rster resonance energy transfer (FRET)&#160;is a powerful tool for examining cell biology in real-time. Studies utilizing FRET commonly employ two-dimensional (2D) culture, which does not mimic the three-dimensional (3D) cellular microenvironment. A method to perform quenched emission FRET imaging using conventional widefield epifluorescence microscopy of cells within a 3D hydrogel environment is presented. Here an analysis method for ratiometric FRET probes that yields linear ratios over the probe activation range is described. Measurement of intracellular cyclic adenosine monophosphate (cAMP) levels is demonstrated in chondrocytes under forskolin stimulation using a probe for EPAC1 activation (ICUE1) and the ability to detect differences in cAMP signaling dependent on hydrogel material type, herein a photocrosslinking hydrogel (PC-gel, polyethylene glycol dimethacrylate) and a thermoresponsive hydrogel (TR-gel). Compared with 2D FRET methods, this method requires little additional work. Laboratories already utilizing FRET imaging in 2D can easily adopt this method to perform cellular studies in a 3D microenvironment. It can further be applied to high throughput drug screening in engineered 3D microtissues. Additionally, it is compatible with other forms of FRET imaging, such as anisotropy measurement and fluorescence lifetime imaging (FLIM), and with advanced microscopy platforms using confocal, pulsed, or modulated illumination.

F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) imaging is a powerful tool for real-time cell biology studies. Here a method for FRET imaging cells in physiologic three-dimensional (3D) hydrogel microenvironments using conventional epifluorescence microscopy is presented. An analysis for ratiometric FRET probes that yields linear ratios over the activation range is described.

三次元ハイドロゲルでイメージングをFRET

Imaging of F&#246;rster resonance energy transfer (FRET)&#160;is a powerful tool for examining cell biology in real-time. Studies utilizing FRET commonly ...

Three-dimensional Reconstruction of the Vascular Architecture of the Passive CLARITY-cleared Mouse Ovary

The ovary is the main organ of the female reproductive system and is essential for the production of female gametes and for controlling the endocrine system, but the complex structural relationships and three-dimensional (3D) vasculature architectures of the ovary are not well described. In order to visualize the 3D connections and architecture of blood vessels in the intact ovary, the first important step is to make the ovary optically clear. In order to avoid tissue shrinkage, we used the hydrogel fixation-based passive CLARITY (Clear Lipid-exchanged Acrylamide-hybridized Rigid Imaging/ Immunostaining/In situ-hybridization-compatible Tissue Hydrogel) protocol method to clear an intact ovary. Immunostaining, advanced multiphoton confocal microscopy, and 3D image-reconstructions were then used for the visualization of ovarian vessels and follicular capillaries. Using this approach, we showed a significant positive correlation (P &#60;0.01) between the length of the follicular capillaries and volume of the follicular wall.

Here we present an adaptation of the passive CLARITY and 3D reconstruction method for visualization of the ovarian vasculature and follicular capillaries in intact mouse ovaries.

受動的な明快さクリア マウス卵巣の血管の 3次元再構築

The ovary is the main organ of the female reproductive system and is essential for the production of female gametes and for controlling the endocrine ...

Adipo-Clear: A Tissue Clearing Method for Three-Dimensional Imaging of Adipose Tissue

Adipose tissue plays a central role in energy homeostasis and thermoregulation. It is composed of different types of adipocytes, as well as adipocyte precursors, immune cells, fibroblasts, blood vessels, and nerve projections. Although the molecular control of cell type specification and how these cells interact have been increasingly delineated, a more comprehensive understanding of these adipose-resident cells can be achieved by visualizing their distribution and architecture throughout the whole tissue. Existing immunohistochemistry and immunofluorescence approaches to analyze adipose histology rely on thin paraffin-embedded sections. However, thin sections capture only a small portion of tissue; as a result, the conclusions can be biased by what portion of tissue is analyzed. We have therefore developed an adipose tissue clearing technique, Adipo-Clear, to permit comprehensive three-dimensional visualization of molecular and cellular patterns in whole adipose tissues. Adipo-Clear was adapted from iDISCO/iDISCO+, with specific modifications made to completely remove the lipid stored in the tissue while preserving native tissue morphology. In combination with light-sheet fluorescence microscopy, we demonstrate here the use of the Adipo-Clear method to obtain high-resolution volumetric images&#160;of an entire adipose tissue.

Due to the high lipid content, adipose tissue has been challenging to visualize using traditional histological methods. Adipo-Clear is a tissue clearing technique that allows robust labeling and high-resolution volumetric fluorescent imaging of adipose tissue. Here, we describe the methods for sample preparation, pretreatment, staining, clearing, and mounting for imaging.

裏打ちクリア: 組織の脂肪組織の三次元イメージング法をクリア

Adipose tissue plays a central role in energy homeostasis and thermoregulation. It is composed of different types of adipocytes, as well as adipocyte ...

Genetic Modification of Cyanobacteria by Conjugation Using the CyanoGate Modular Cloning Toolkit

Cyanobacteria are a diverse group of prokaryotic photosynthetic organisms that can be genetically modified for the renewable production of useful industrial commodities. Recent advances in synthetic biology have led to development of several cloning toolkits such as CyanoGate, a standardized modular cloning system for building plasmid vectors for subsequent transformation or conjugal transfer into cyanobacteria. Here we outline a detailed method for assembling a self-replicating vector (e.g., carrying a fluorescent marker expression cassette) and conjugal transfer of the vector into the cyanobacterial strains Synechocystis sp. PCC 6803 or Synechococcus elongatus UTEX 2973. In addition, we outline how to characterize the performance of a genetic part (e.g., a promoter) using a plate reader or flow cytometry.

Here, we present a protocol describing how to i) assemble a self-replicating vector using the CyanoGate modular cloning toolkit, ii) introduce the vector into a cyanobacterial host by conjugation, and iii) characterize transgenic cyanobacteria strains using a plate reader or flow cytometry.

シアノゲートモジュラークローニングツールキットを用いたコンジュゲーションによるシアノバクテリアの遺伝子改変

Cyanobacteria are a diverse group of prokaryotic photosynthetic organisms that can be genetically modified for the renewable production of useful ...

Single-Cell Resolution Three-Dimensional Imaging of Intact Organoids

Organoid technology, in vitro 3D culturing of miniature tissue, has opened a new experimental window for cellular processes that govern organ development and function as well as disease. Fluorescence microscopy has played a major role in characterizing their cellular composition in detail and demonstrating their similarity to the tissue they originate from. In this article, we present a comprehensive protocol for high-resolution 3D imaging of whole organoids upon immunofluorescent labeling. This method is widely applicable for imaging of organoids differing in origin, size and shape. Thus far we have applied the method to airway, colon, kidney, and liver organoids derived from healthy human tissue, as well as human breast tumor organoids and mouse mammary gland organoids. We use an optical clearing agent, FUnGI, which enables the acquisition of whole 3D organoids with the opportunity for single-cell quantification of markers. This three-day protocol from organoid harvesting to image analysis is optimized for 3D imaging using confocal microscopy.

The entire 3D structure and cellular content of organoids, as well as their phenotypic resemblance to the original tissue can be captured using the single-cell resolution 3D imaging protocol described here. This protocol can be applied to a wide range of organoids varying in origin, size and shape.

インタクトオルガノイドの単一細胞分解能3次元イメージング

Organoid technology, in vitro 3D culturing of miniature tissue, has opened a new experimental window for cellular processes that govern organ development ...