我々は、抗PD-L1ブロッキング抗体を提供するためのゴードン·フリーマンに感謝します。私たちは、マサチューセッツ総合病院と、このプロジェクトでの重要な役割のためのすべての研究参加者で、臨床および実験室のスタッフに感謝します。 、国立心臓肺および国立衛生研究所の血液研究所（RO1 HL-092565; DEK）、この研究は、国立アレルギー研究所と国立衛生研究所の感染症（DEK PO1 AI-080192）によってサポートされていました。 DEKは、ケベック州保健研究基金研究員のキャリア賞（FRQS）でサポートされています。 FPが研究ハーバード大学グローバルヘルス研究所（HGHI）にマサチューセッツ総合病院経営委員会のフェローシップの助成金によってサポートされています。

1。フィコール分離により枯渇し、PBMCの分離<ol><li>全血50μL/ mlでヒトCD8 +枯渇カクテルを追加することにより、CD8 + T細胞を枯渇。 </li><li>よく混合し、室温（18〜25℃）で20分間インキュベートする。 </li><li>インキュベーション後、HBSS（Ca 2 +またはMg 2 +なしのハンクス液）で全血を混ぜてヒストを上の層。 30分（ブレーキなし、緩加速）のための340 RCFでスピン。 </li><li> PBMCをを収集し、新たな50ミリリットルコニカルに移す。 340 rcfで10分間スピンし、50 IUペニシリン、50μg/ mlのストレプトマイシン、2mMのL-グルタミン、及び1％HEPESを補充した45ミリリットルのRPMI 1640で2回洗浄。 </li></ol> 2。抗体遮断および細胞の抗原特異的刺激<ol><li> 50 IUペニシリン、50μg/ mlのストレプトマイシン、2mMのL-グルタミン、及び1％HEPESを補充した10％ヒト血清を含有するRPMI 1640中で条件あたり2×10 6で細胞を再懸濁し、条件あたり500μLを占めている。 </li><li> FACSチューブあたりの細胞懸濁液の一部を500μl。 </li><li>調べ経路に応じて、PD-L1、10μg/ mlの抗体でおよび/ ​​またはアイソタイプコントロールを遮断するIL-10Rαを添加し、37℃、5％CO 2で15分間インキュベートする。 </li><li> 1μg/ mlの/ペプチド最終濃度でのHIV-1のGagペプチドプールで細胞を刺激する。また、各ブロックする条件について「刺激なし」コントロールが含まれています。 37°C、48時間、5％CO 2でインキュベートする。 </li></ol> 3。上清の収集と分析<ol><li> 48時間後、340 RCFで7分間FACSチューブをスピンダウン。 </li><li>慎重にペレットを乱すことなく、ルミネックスビーズアレイ用のエッペンドルフチュー​​ブ内の2×225μlの上清を回収。 </li><li> 0.05％PBS-Tweenでの最終濃度を与えるために25μlの0.5％PBS-Tweenで回収した上清中のウイルスを不活性化する。 </li><li> IMMEDでない店回収した上清iately -80℃の冷凍庫で使用。 </li><li>製造業者のプロトコルに従ってミリポアルミネックス·キットを用いて所望のサイトカイン濃度を測定する。 </li></ol> 4。フローサイトメトリーを経由して収集し、細胞の表現型解析<ol><li>上清を収集した後、3ミリリットルのPBSで細胞を洗浄。 340 RCFで7分間細胞をスピンし、過剰な洗浄をデカントします。 </li><li>製造業者のプロトコールに従って生/死修正可能なの死細胞染色キットを用いて、生存に染色。 </li><li> 340 RCFで、4℃で7分間、PBSで細胞を洗浄100μlのPBS、1％FBS中に再懸濁。 </li><li>のFcRは、試薬と混合する渦をブロックする1.4μLを添加することにより、単球、または他の抗原提示細胞は、ブロックのFc受容体を染色した場合。 </li><li> 4℃で10分間インキュベート</li><li> 、表面抗体を追加し、ボルテックスし、暗所で4℃で20分間インキュベートする。 </li><li> PBS、1％のFBSで細胞を洗浄、過剰な洗浄をデカントし、200μlの4％パラホルムアルデヒドを追加します。インキュベート暗所で20分間室温で加えた。 </li><li> 250μLのPBS、1％FBS中で、PBS、1％のFBS、再懸濁して細胞を洗浄し、フローサイトメーターマルチレーザに取得（ 例えば 、BD LSRIIまたはFortessa）。 </li></ol> 5。定量RT-PCRによる細胞の分析<ol><li>細胞のためのフローサイトメトリーを介して分析していない：上清回収後、1％β-メルカプトエタノールを含む300μlのキアゲンバッファーRLT中の細胞を溶解。プロトコールを継続しない場合は、細胞は、この時点の後、-80℃で凍結することができる。 </li><li>製造業者のプロトコルに従ってRNA単離キットを用いてRNAを単離する。 </li><li>製造業者のプロトコルに従ってcDNA合成キットを用いてRNAからcDNAを合成する。 </li><li>サイバーグリーン技術を用いた定量的PCRを行う。 </li><li>各プライマーのためのプライマーミックスを作成する10の最終濃度を与えるようにヌクレアーゼフリー水にプライマーを添加することにより、ハウスキーピング遺伝子（ 例えば、IL-13、IL-10、IFN-γ、GAPDH）を含んで使用程度である。氷の上においてください。 </li><li>うまく10.5μLのヌクレアーゼフリー水、12.5μlのSYBRグリーン、およびプレートあたり1μlのプライマーミックスを追加することによって、各プライマーのためのマスターミックスを作成します。氷の上においてください。 </li><li>使用されるプレートの各ウェルにピペット24μlのマスターミックス。 </li><li>テンプレートに従って各ウェルに1μlのcDNAを追加します。 </li><li> 800 RCFで3分間キャップ井戸と遠心プレート。 </li><li>定量RT-PCR装置、 例えばストラタMX3005P機器でプレートを実行します。 </li></ol> 6。 48時間で細胞内サイトカイン染色のための適応ブレフェルジンとモネンシン前細胞内サイトカイン染色に6時間を追加します。モネンシンは、メーカーの説明書に従って添加しながらブレフェルジンを10μg/ mlの濃度で添加される。便宜上、ブレフェルジンは5μg/ mlの濃度で染色する前の12時間後に添加することができる。 <ol><li>表面染色した後、中のため、PBS、1％FBSおよび染色で細胞を洗浄固定/透過処理ソリューションキットおよびプロトコルを使用して、例えば、IL-12、IFN-γおよびTNF-αなどのサイトカインtracellular。 </li><li>洗浄細胞、250μlのPBS、1％のFBSに再懸濁し、マルチレーザフローサイトメーター（ 例えば 、BD LSR IIまたはFortessa）上で実行されます。 </li></ol> 7。セルを並べ替えるための適応<ol><li>製造業者のプロトコールに従って生/死修正可能なの死細胞染色キットを用いて、生存に刺激、染色後の16時間。全体の手順の間、氷上で細胞を維持する。 </li><li> 340 RCFで、4℃で7分間、PBSで細胞を洗浄100μlのPBS、1％FBS中に再懸濁。 </li><li> 、表面抗体を追加混合するボルテックスし、20分間、暗所で氷上で細胞をインキュベートする。 </li><li> 340 rcfで4℃でPBS、1％FBSで細胞を洗浄し、500μlの中で再懸濁し、10％ウシ胎児血清を含有する冷RPMI 1640 50 IUペニシリン、50μg/ mlのストレプトマイシン、2mMのL-グルタミン、および1％を補充したHEPES。 </li><li> 5ミリリットルポリスチレンテープを使用したフィルタセルセルストレーナーキャップ付きルネ丸底チューブ。 </li><li>ウシ胎児血清を各チューブに50 IUペニシリン、50μg/ mlのストレプトマイシン、2mMのL-グルタミン、及び1％HEPESを補充した10％を含有する200μlのRPMI 1640を添加することによってソートコレクションチューブを準備する。並べ替え中に氷の上で全てのチューブを保管してください。 </li><li>ライブバイオハザード材料のために装備施設に位置して、機器（ 例えば 、BD FACSアリアII）の利息の細胞サブセットを並べ替える。 </li><li>細胞がソートされた後、戻って所望の時間のためのインキュベーター内で、上澄み収集/ルミネックス解析、細胞ペレット収集/ PCR解析をたどる場所細胞。 </li></ol>

<ol>
	<li>Zajac, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viral+immune+evasion+due+to+persistence+of+activated+T+cells+without+effector+function.">Viral immune evasion due to persistence of activated T cells without effector function.</a> J. Exp. Med. 188, 2205-2213 (1998).</li><li>Wherry, E. J., Blattman, J. N., Murali-Krishna, K., vander Most, R., Ahmed, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viral+persistence+alters+CD8+T-cell+immunodominance+and+tissue+distribution+and+results+in+distinct+stages+of+functional+impairment.">Viral persistence alters CD8 T-cell immunodominance and tissue distribution and results in distinct stages of functional impairment.</a> J. Virol. 77, 4911-4927 (2003).</li><li>Kwon, D. S., Kaufmann, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protective+and+detrimental+roles+of+IL-10+in+HIV+pathogenesis.">Protective and detrimental roles of IL-10 in HIV pathogenesis.</a> Eur. Cytokine Netw. 21, 208-214 (2010).</li><li>Porichis, F., Kaufmann, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+PD-1+in+HIV+pathogenesis+and+as+target+for+therapy.">Role of PD-1 in HIV pathogenesis and as target for therapy.</a> Curr. HIV/AIDS Rep. 9, 81-90 (2012).</li><li>Wherry, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+cell+exhaustion.">T cell exhaustion.</a> Nat. 12, 492-499 (2011).</li><li>Trautmann, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Upregulation+of+PD-1+expression+on+HIV-specific+CD8++T+cells+leads+to+reversible+immune+dysfunction.">Upregulation of PD-1 expression on HIV-specific CD8+ T cells leads to reversible immune dysfunction.</a> Nat. Med. 12, 1198-1202 (2006).</li><li>Day, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PD-1+expression+on+HIV-specific+T+cells+is+associated+with+T-cell+exhaustion+and+disease+progression.">PD-1 expression on HIV-specific T cells is associated with T-cell exhaustion and disease progression.</a> Nature. 443, 350-354 (2006).</li><li>Brockman, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IL-10+is+up-regulated+in+multiple+cell+types+during+viremic+HIV+infection+and+reversibly+inhibits+virus-specific+T+cells.">IL-10 is up-regulated in multiple cell types during viremic HIV infection and reversibly inhibits virus-specific T cells.</a> Blood. 114, 346-356 (2009).</li><li>Barber, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Restoring+function+in+exhausted+CD8+T+cells+during+chronic+viral+infection.">Restoring function in exhausted CD8 T cells during chronic viral infection.</a> Nature. 439, 682-687 (2006).</li><li>Zhang, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PD-1+up-regulation+is+correlated+with+HIV-specific+memory+CD8++T-cell+exhaustion+in+typical+progressors+but+not+in+long-term+nonprogressors.">PD-1 up-regulation is correlated with HIV-specific memory CD8+ T-cell exhaustion in typical progressors but not in long-term nonprogressors.</a> Blood. 109, 4671-4678 (2007).</li><li>Ndhlovu, Z. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-dimensional+immunomonitoring+models+of+HIV-1-specific+CD8+T-cell+responses+accurately+identify+subjects+achieving+spontaneous+viral+control.">High-dimensional immunomonitoring models of HIV-1-specific CD8 T-cell responses accurately identify subjects achieving spontaneous viral control.</a> Blood. 121, 801-811 (2013).</li><li>Porichis, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Responsiveness+of+HIV-specific+CD4+T+cells+to+PD-1+blockade.">Responsiveness of HIV-specific CD4 T cells to PD-1 blockade.</a> Blood. 118, 965-974 (2011).</li><li>Kwon, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD4++CD25++regulatory+T+cells+impair+HIV-1-specific+CD4+T+cell+responses+by+upregulating+interleukin-10+production+in+monocytes.">CD4+ CD25+ regulatory T cells impair HIV-1-specific CD4 T cell responses by upregulating interleukin-10 production in monocytes.</a> 86, 6586-6594 (2012).</li></ol>

著者は、彼らが競合する経済的利益を持っていないことを宣言します。

上澄みCollectionこの実験計画の不可欠な部分です。ルミネックスアッセイのための上清を採取する際に、アリコートを作製し、サイクルの凍結融解に起因するタンパク質の分解を防止するために-80°Cで保存した。凍結融解のタンパク質について、凍結解凍を最小化することによって、過酷なプロセスであることができ、信号は、アッセイにおいて最大となる。したがって、同じ回数の凍結融解...

持続性ウイルス感染の間に、ウイルス特異的T細胞は、T細胞の枯渇として知られるプロセスにおいて機能的欠陥を獲得する。初期の慢性ウイルス感染症のマウスLCMVモデルにおけるインビボ研究消耗ウイルス特異的T細胞は、ウイルス感染細胞に対する細胞溶解機能が低下して増殖する能力を失い、例えばIL-2、TNF-などのサイトカインを産生する能力が低下してきたことを示したαおよびIFN-γ1,2。例えば、PD-1およびIL-10などの免疫調節経路の複雑なネットワークは、慢性感染の間にアップレギュレートし、（3,4に総説）T細胞の機能不全に寄与する。 インビボ LCMVマウスにおいてこれらの経路の阻害に対する阻止抗体の投与モデルは、T細胞の枯渇が（5日）、部分的に可逆的な現象であることを示す、消耗したウイルス特異的T細胞の機能および拡張ウイルスクリアランスを回復した。 目の上の調査結果EのLCMVモデルは迅速なHBV、HCVおよびHIVの5のようなヒトの慢性ウイルス感染症にも拡張されました。慢性HIV-1感染では、PD-1およびIL-10経路は、感染患者でアップレギュレートされ、疾患進行のパラメータと相関、直接ウイルス量と反比例CD4と6-8を数える。 LCMVマウスモデルに類似していることを示してPD-1またはHIV-特異的CD4およびCD8 T細胞のインビトロ復元増殖における IL-10経路の抗体遮断は、ヒトにおけるT細胞の枯渇は、部分的に可逆的な現象である。しかし、ヒトのサンプルだけでなく、in vitroアッセイの感度の限界の実験の繊細な性質のために、これらの介入によって達成機能回復プロファイルの徹底的な調査が著しく欠けている。増殖アッセイは、これまでのところ、ほとんどの研究でテスト唯一の信頼できるin vitroアッセイされているが、まだこれらの相互の影響に関する証拠の著しい欠如している上ventions：細胞傷害性T細胞の1）殺傷能力、2）ウイルス複製に対するT細胞の抗ウイルス効果、3）サイトカイン分泌プロファイル、および他の細胞サブセット上のCD4 T細胞ヘルプに4）の効果。 細胞内サイトカイン染色（ICS）は、マウスおよびヒトの両方における種々の細胞型においてサイトカインの産生を検出するために使用されるベースの非常に有用かつ広く使用されているフローサイトメトリーアッセイである。また、阻害性経路の遮断抗体の効果を調べるために使用されている。 ICSアッセイにおいて、サイトカイン分泌を、ブレフェルジンおよび/またはモネンシンを添加することによって遮断される。細胞内に捕捉されたサイトカインは、次いで、多色フローサイトメトリーを用いた蛍光抗体を用いて検出される。通常は、抗原添加の2時間以内に追加されブレフェルジンとモネンシン、どちらも細胞に対して毒性であるため、アッセイの期間は通常、抗原刺激後6か12時間に制限されています。 ICSアッセイは、便利なIされている強力な手法であるnは、細胞を抗体曝露後9時間の一定期間後に抽出されたマウスにおける抗体の介入を阻止するのインビボ投与の効果の調査。しかし、ヒト試料中の阻害性受容体の遮断の影響を評価するために、この実験的なアプローチを適用するためのいくつかの制限がある。 インビトロで 6または12時間刺激（ヒト試料と、典型的な場合）における阻害経路の抗体介入を行う場合は、標準的なICSアッセイにより測定されるように、ほとんどの場合、阻害性受容体の遮断が、抗原特異的T細胞応答の頻度を変化させない6,7。平均値または中央値蛍光強度によって測定されるセル当たりのサイトカイン産生の測定値は矛盾した結果が図6、図7、図10を与えている。一方、ICSは後後期の時点で実行されるときに、刺激（ すなわち、六日）、サイトカイン分泌数cの変化のエルを観察することができる。相違点は、変化した増殖、生存、および6時間の特定の期間にわたって蓄積するエフェクター機能の変化の複合効果である。部分的にこれらの制限を克服する1つの方法は、増殖が起こるのを待つことなく、サイトカイン分泌ブロッカーの添加前に抗原と、より長い期間（ 例えば 36時間、60時間など ）インキュベートすることである。我々は、正常にHIV特異的CD4およびCD8 T細胞11,12によるサイトカイン分泌の動態を決定するために、このメソッドを使用しているが、このアプローチは、小さな応答を検出することができず、発生した総サイトカイン分泌の統合された結果を得られる刺激以来。したがって、ICSはsupernatanにおけるサイトカインmRNA定量またはサイトカイン分泌の測定値と比較して、活性化T細胞によって産生されるサイトカインの量に対する阻害経路の遮断の影響を検出するための敏感な十分な方法ではない同じ時点でT。さらに、活性化T細胞によって産生されるサイトカインのほとんどが正または負のフィードバックに貢献する自己分泌様式で作用し、抗原提示細胞との相互作用を介してループする。したがって、ICSアッセイの間またはモネンシン、ブレフェルジンの添加は、サイトカイン分泌を防止し、従って、T細胞の刺激が最適ではない。最後に、ICと複数のサイトカインの検出は、フローサイトメトリーと同様に、任意のパネルで同時に使用することができる蛍光色素の数の制約によって可用性とサイトカインの検出のための抗体の感度によって制限されます。 我々は、細胞（APC）及びナチュラルキラー細胞（NK細胞）が抗原提示するHIV特異的CD4 T細胞によるサイトカイン分泌を調節し、続いてCD4ヘルプの免疫調節経路の影響を評価するための高感度インビトロ実験的なアプローチを開発した。この方法はまた、IMPAを評価するために使用することができるPBMCからCD4 T細胞を枯渇させることによってのみ、CD8 T細胞によって認識され、最適なペプチドを用いて刺激することにより、CD8T細胞機能に対する阻害分子の遮断のCT。細胞内サイトカイン染色アッセイとは対照的に、我々のことができるようにするために、HIV-特異的CD4 T細胞によるサイトカイン分泌を妨害しないことを決定した：1）産生されるサイトカインレベルのより正確な定量化を行うこと、2）広範なパネルを調べるサイトカインまたはエフェクター分子の、3）他の細胞サブセット上のHIV-特異的CD4 T細胞によって産生されるサイトカインの影響を評価する。私たちは、関心のある免疫調節経路のための抗体をブロックの存在下でのHIV-1のGagペプチドプールで、CD8枯渇したPBMCを刺激する。インキュベーションの所望の時間の後、通常48時間後、我々は、ビーズアレイを有するサイトカイン分泌を測定し、異なる細胞サブセットの表現型分析または転写解析のためにいずれかの細胞ペレットを収集するために、上清を集める。注目すべきは、tにおけるその48時間の時点で、我々は、T細胞の増殖し12の有意な集団を検出しない。これは、柔軟なアプローチであり、この設計のいくつかの適応は、異なる仮説に取り組むために適用することができる。 36時間さらにインキュベーションが上清および細胞ペレットの回収が続く前に、例えば、（例えば、HIV-特異的CD4 T細胞またはPD-1の高いCD4 T細胞などのような）個々の細胞サブセットを、インキュベーションの12時間後にソートすることができより具体的に定義されたPBMCのサブ集団によるサイトカイン分泌に対する遮断介入の影響を調査する。

<table border="1">
		<tbody>
		 <tr>
			<td>Name of Reagent/Material</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Hanks Balanced Salt Solution without Ca2+ or Mg2+</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H9394</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>RPMI 1640</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R0883</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Histopaque-1077</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>10771</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Human Serum AB</td>
			<td>Gemini BioProducts</td>
			<td>100-512</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Mediatech</td>
			<td>30 001 CI</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>Mediatech</td>
			<td>25 005 CI</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>HEPES buffer</td>
			<td>Mediatech</td>
			<td>25060CI</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>FcR blocking reagent, human</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-059-901</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>RosetteSep Human CD8+ Depletion Cocktail </td>
			<td>Stem Cell </td>
			<td>15663</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>LIVE/DEAD Fixable Dead Cell Stain Kit, for UV excitation</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>L23105</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Rneasy Mini Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74104</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Improm-II Reverse Transcription System</td>
			<td>Promega</td>
			<td>A3800</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Brilliant II SYBR qPCR Low Rox Master Mix</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>600830</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>BD Cytofix/Cytoperm Fixation/Permeabilization Solution Kit</td>
			<td>BD</td>
			<td>554714</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP337100</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>IFN-&gamma; primer</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td></td>
			<td>FOR: CGAGATGACTTCGAAAAGCTGA REV: TCTTCGACCTCGAAACAGCA</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>GAPDH primer</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td></td>
			<td>FOR: TCATCATCTCTGCCCCCTCT REV: AGTGATGGCATGGACTGTGG</td>
		 </tr>
		</tbody>
 </table>

in vitro assay to evaluate the impact of immunoregulatory pathways on hiv-specific cd4 t cell effector function

T細胞の枯渇は、慢性ウイルス感染時に障害が発生した病原体のクリアランスの主要な要因である。例えば、PD-1およびIL-10などの免疫調節経路は、この進行中の抗原の曝露の際にアップレギュレートおよび増殖の喪失、減少した細胞溶解機能に寄与し、CD4およびCD8 T細胞によるサイトカイン産生が損なわれている。 LCMV感染のマウスモデルにおいて、これらの二つの経路に対する遮断抗体の投与は、T細胞応答を増強した。しかし、ヒト試料からの細胞でのサイトカイン分泌に対するそのような遮断の影響を測定するために何in vitroアッセイは現在ありません。我々のプロトコルおよび実験的アプローチは、正確かつ効率的にHIV感染被験者からのHIV-特異的CD4 T細胞によるサイトカイン産生の回復を定量化するために、私たちを可能にする。 ここでは、HIV-特異的CD4 T細胞および他のセルへの影響によるサイトカイン分泌の測定を可能にインビトロ実験デザインを示すLサブセット。 CD8 T細胞は、全血から枯渇し、残りのPBMCをフィコール分離法により単離した。 CD8枯渇PBMCをその後、HIV-1のGagペプチドプールで刺激した後、細胞を37℃、5％CO 2でインキュベートし、PD-L1および/ ​​またはIL-10Rαに対する遮断抗体とインキュベートした。 48時間後、上清をビーズアレイによるサイトカイン分析のために収集し、細胞ペレットを、定量RT-PCRを用いてフローサイトメトリーまたは転写解析を使用して流れる表現型分析のいずれかのために収集した。より詳細な分析のために、異なる細胞集団を、PBMCからの選択サブセットの枯渇によって、または同一のアッセイで評価される前に、フローサイトメトリーを用いて選別することによって得た。これらの方法は、抗原特異的Tヘルパー細胞によるサイトカイン産生の調節を決定し、免疫細胞の異なる集団の間の機能的相互作用を決定するために、高感度かつ特異的なアプローチを提供する。

このin vitro系を用いてサイトカインの測定を行う場合には、刺激なしコントロールに比較して抗原特異的応答を区別することができることが不可欠である。一般的に、我々は、アッセイの直線範囲内であった、少なくとも三倍の無刺激対照と比較してサイトカインレベルの増加および抗原刺激を与える任意の値として正の応答を検討した。我々は、弱い抗原特異的CD4 T細胞応答を観察?...

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In Vitro Assay to Evaluate the Impact of Immunoregulatory Pathways on HIV-specific CD4 T Cell Effector Function

我々は、HIV-特異的CD4 T細胞によるサイトカイン分泌の調節における免疫調節経路の役割を調査するためのインビトロアッセイを開発した。

インビトロアッセイで HIV特異的CD4 T細胞エフェクター機能に対する免疫調節経路の影響を評価する

T cell exhaustion is a major factor in failed pathogen clearance during chronic viral infections. Immunoregulatory pathways, such as PD-1 and IL-10, are ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

In Vitro Assay to Evaluate the Impact of Immunoregulatory Pathways on HIV-specific CD4 T Cell Effector Function

14.0K ビュー.  The Ragon Institute of MGH, MIT and Harvard. 我々は、HIV-特異的CD4 T細胞によるサイトカイン分泌の調節における免疫調節経路の役割を調査するためのインビトロアッセイを開発した。 

ビデオ: In Vitro Assay to Evaluate the Impact of Immunoregulatory Pathways on HIV-specific CD4 T Cell Effector Function

Isolation and Th17 Differentiation of Na&iuml;ve CD4 T Lymphocytes

Th17 cells are a distinct subset of T cells that have been found to produce interleukin 17 (IL-17), and differ in function from the other T cell subsets including Th1, Th2, and regulatory T cells. Th17 cells have emerged as a central culprit in overzealous inflammatory immune responses associated with many autoimmune disorders. In this method we purify T lymphocytes from the spleen and lymph nodes of C57BL/6 mice, and stimulate purified CD4+ T cells under control and Th17-inducing environments. The Th17-inducing environment includes stimulation in the presence of anti-CD3 and anti-CD28 antibodies, IL-6, and TGF-&#946;. After incubation for at least 72 hours and for up to five days at 37 &#176;C, cells are subsequently analyzed for the capability to produce IL-17 through flow cytometry, qPCR, and ELISAs. Th17 differentiated CD4+CD25- T cells can be utilized to further elucidate the role that Th17 cells play in the onset and progression of autoimmunity and host defense. Moreover, Th17 differentiation of CD4+CD25- lymphocytes from distinct murine knockout/disease models can contribute to our understanding of cell fate plasticity.

Isolation and Th17 Differentiation of Na&amp;#239;ve CD4 T Lymphocytes

With effector functions distinct from other T cell subsets, Th17 cells have been centrally implicated in inflammatory autoimmunity. This in vitro Th17 differentiation protocol provides a means to determine whether na&#239;ve CD4+ T lymphocytes can differentiate into Th17 cells, and to further examine their role in autoimmunity and host response.

離とナイーブCD4 Tリンパ球のTh17分化

Th17 cells are a distinct subset of T cells that have been found to produce interleukin 17 (IL-17), and differ in function from the other T cell subsets ...

免疫・感染学

Transplantation of Tail Skin to Study Allogeneic CD4 T Cell Responses in Mice

The study of T cell responses and their consequences during allo-antigen recognition requires a model that enables one to distinguish between donor and host T cells, to easily monitor the graft, and to adapt the system in order to answer different immunological questions. Medawar and colleagues established allogeneic tail-skin transplantation in mice in 1955. Since then, the skin transplantation model has been continuously modified and adapted to answer specific questions. The use of tail-skin renders this model easy to score for graft rejection, requires neither extensive preparation nor deep anesthesia, is applicable to animals of all genetic background, discourages ischemic necrosis, and permits chemical and biological intervention. 
In general, both CD4+ and CD8+ allogeneic T cells are responsible for the rejection of allografts since they recognize mismatched major histocompatibility antigens from different mouse strains. Several models have been described for activating allogeneic T cells in skin-transplanted mice. The identification of major histocompatibility complex (MHC) class I and II molecules in different mouse strains including C57BL/6 mice was an important step toward understanding and studying T cell-mediated alloresponses. In the tail-skin transplantation model described here, a three-point mutation (I-Abm12) in the antigen-presenting groove of the MHC-class II (I-Ab) molecule is sufficient to induce strong allogeneic CD4+ T cell activation in C57BL/6 mice. Skin grafts from I-Abm12 mice on C57BL/6 mice are rejected within 12-15 days, while syngeneic grafts are accepted for up to 100 days. The absence of T cells (CD3-/- and Rag2-/- mice) allows skin graft acceptance up to 100 days, which can be overcome by transferring 2 x 104 wild type or transgenic T cells. Adoptively transferred T cells proliferate and produce IFN-&#947; in I-Abm12-transplanted Rag2-/- mice.

Tail-skin transplantation is a powerful model for studying T cell-dependent rejection and tolerance induction during allogeneic immune responses in mice. The advantages of this protocol are minor invasive surgery, and ease of monitoring with no need to sacrifice the recipient mouse.

マウスにおける同種のCD4 T細胞応答を研究する尾皮膚の移植

The study of T cell responses and their consequences during allo-antigen recognition requires a model that enables one to distinguish between donor and ...

Image-based Flow Cytometry Technique to Evaluate Changes in Granulocyte Function In Vitro

Granulocytes play a key role in the body&#8217;s innate immune response to bacterial and viral infections. While methods exist to measure granulocyte function, in general these are limited in terms of the information they can provide. For example, most existing assays merely provide a percentage of how many granulocytes are activated following a single, fixed length incubation. Complicating matters, most assays focus on only one aspect of function due to limitations in detection technology. This report demonstrates a technique for simultaneous measurement of granulocyte phagocytosis of bacteria and oxidative burst. By measuring both of these functions at the same time, three unique phenotypes of activated granulocytes were identified: 1) Low Activation (minimal phagocytosis, no oxidative burst), 2) Moderate Activation (moderate phagocytosis, some oxidative burst, but no co-localization of the two functional events), and 3) High Activation (high phagocytosis, high oxidative burst, co-localization of phagocytosis and oxidative burst). A fourth population that consisted of inactivated granulocytes was also identified. Using assay incubations of 10, 20, and 40-min the effect of assay incubation duration on the redistribution of activated granulocyte phenotypes was assessed. A fourth incubation was completed on ice as a control. By using serial time incubations, the assay may be able to able to detect how a treatment spatially affects granulocyte function. All samples were measured using an image-based flow cytometer equipped with a quantitative imaging (QI) option, autosampler, and multiple lasers (488, 642, and 785 nm).

Image-based Flow Cytometry Technique to Evaluate Changes in Granulocyte Function In Vitro

This method demonstrates a technique for assessing granulocyte function by simultaneously measuring phagocytosis of bacteria and oxidative burst. Image-based flow cytometry allowed for the identification of three distinct subsets of activated granulocytes that all differed in their relative functional capacity.

顆粒球機能の変化を評価するために、イメージベースのフローサイトメトリー技術<em&gt;インビトロ</em

Granulocytes play a key role in the body&#8217;s innate immune response to bacterial and viral infections. While methods exist to measure granulocyte ...

Induction of Murine Intestinal Inflammation by Adoptive Transfer of Effector CD4+CD45RBhigh T Cells into Immunodeficient Mice

There are many different animal models available for studying the pathogenesis of human inflammatory bowel diseases (IBD), each with its own advantages and disadvantages. We describe here an experimental colitis model that is initiated by adoptive transfer of syngeneic splenic CD4+CD45RBhigh T cells into T and B cell deficient recipient mice. The CD4+CD45RBhigh T cell population that largely consists of na&#239;ve effector cells is capable of inducing chronic intestinal inflammation, closely resembling key aspects of human IBD. This method can be manipulated to study aspects of disease onset and progression. Additionally it can be used to study the function of innate, adaptive, and regulatory immune cell populations, and the role of environmental exposures, i.e., the microbiota, in intestinal inflammation. In this article we illustrate the methodology for inducing colitis with a step-by-step protocol. This includes a video demonstration of key technical aspects required to successfully develop this murine model of experimental colitis for research purposes.

Induction of Murine Intestinal Inflammation by Adoptive Transfer of Effector CD4+CD45RBhigh T Cells into Immunodeficient Mice

Here, we present a protocol to induce colonic inflammation in mice by adoptive transfer of syngeneic CD4+CD45RBhigh T cells into T and B cell deficient recipients. Clinical and histopathological features mimic human inflammatory bowel diseases. This method allows the study of the initiation of colonic inflammation and progression of disease.

エフェクターCD4の養子移入によるマウス腸の炎症の誘導<sup&gt; +</sup&gt; CD45RB<sup&gt;高い</sup&gt;免疫不全マウスへのT細胞

There are many different animal models available for studying the pathogenesis of human inflammatory bowel diseases (IBD), each with its own advantages ...

Mouse Na&#239;ve CD4+ T Cell Isolation and In vitro Differentiation into T Cell Subsets

Antigen inexperienced (na&#239;ve) CD4+ T cells undergo expansion and differentiation to effector subsets at the time of T cell receptor (TCR) recognition of cognate antigen presented on MHC class II. The cytokine signals present in the environment at the time of TCR activation are a major factor in determining the effector fate of a na&#239;ve CD4+ T cell. Although the cytokine environment during na&#239;ve T cell activation may be complex and involve both redundant and opposing signals in vivo, the addition of various cytokine combinations during naive CD4+ T cell activation in vitro can readily promote the establishment of effector T helper lineages with hallmark cytokine and transcription factor expression. Such differentiation experiments are commonly used as a first step for the evaluation of targets believed to promote or inhibit the development of certain CD4+ T helper subsets. The addition of mediators, such as signaling agonists, antagonists, or other cytokines, during the differentiation process can also be used to study the influence of a particular target on T cell differentiation. Here, we describe a basic protocol for the isolation of na&#239;ve T cells from mouse and the subsequent steps necessary for polarizing na&#239;ve cells to various T helper effector lineages in vitro.

Mouse Na&amp;#239;ve CD4+ T Cell Isolation and In vitro Differentiation into T Cell Subsets

Na&#239;ve CD4+ T cells polarize to various subsets depending on the environment at the time of activation. The differentiation of na&#239;ve CD4+ T cells to various effector subsets can be achieved in vitro through the addition of T cell receptor stimuli and specific cytokine signals.

マウスナイーブCD4<sup&gt; +</sup&gt; T細胞の単離と<em&gt;インビトロ</em&gt; T細胞サブセットへの分化

Antigen inexperienced (na&#239;ve) CD4+ T cells undergo expansion and differentiation to effector subsets at the time of T cell receptor (TCR) recognition ...

Application of Long-term cultured Interferon-&#947; Enzyme-linked Immunospot Assay for Assessing Effector and Memory T Cell Responses in Cattle

Effector and memory T cells are generated through developmental programing of na&#239;ve cells following antigen recognition. If the infection is controlled up to 95 % of the T cells generated during the expansion phase are eliminated (i.e., contraction phase) and memory T cells remain, sometimes for a lifetime. In humans, two functionally distinct subsets of memory T cells have been described based on the expression of lymph node homing receptors. Central memory T cells express C-C chemokine receptor 7 and CD45RO and are mainly located in T-cell areas of secondary lymphoid organs. Effector memory T cells express CD45RO, lack CCR7 and display receptors associated with lymphocyte homing to peripheral or inflamed tissues. Effector T cells do not express either CCR7 or CD45RO but upon encounter with antigen produce effector cytokines, such as interferon-&#947;. Interferon-&#947; release assays are used for the diagnosis of bovine and human tuberculosis and detect primarily effector and effector memory T cell responses. Central memory T cell responses by CD4+ T cells to vaccination, on the other hand, may be used to predict vaccine efficacy, as demonstrated with simian immunodeficiency virus infection of non-human primates, tuberculosis in mice, and malaria in humans. Several studies with mice and humans as well as unpublished data on cattle, have demonstrated that interferon-&#947; ELISPOT assays measure central memory T cell responses. With this assay, peripheral blood mononuclear cells are cultured in decreasing concentration of antigen for 10 to 14 days (long-term culture), allowing effector responses to peak and wane; facilitating central memory T cells to differentiate and expand within the culture.

Application of Long-term cultured Interferon-&amp;#947; Enzyme-linked Immunospot Assay for Assessing Effector and Memory T Cell Responses in Cattle

Long-term cultured interferon-&#947; enzyme-linked immunospot assay is used as a measure of central memory responses and correlates with protective anti-mycobacterial vaccine responses. With this assay, peripheral blood mononuclear cells are stimulated with mycobacterial antigens and interleukin-2 for 14 days, enabling differentiation and expansion of central memory T cells.

牛にエフェクターおよびメモリーT細胞応答を評価するための長期培養インターフェロンγ酵素結合免疫アッセイの応用

Effector and memory T cells are generated through developmental programing of na&#239;ve cells following antigen recognition. If the infection is ...

Imaging CD4 T Cell Interstitial Migration in the Inflamed Dermis

The ability of CD4 T cells to carry out effector functions is dependent upon the rapid and efficient migration of these cells in inflamed peripheral tissues through an as-yet undefined mechanism. The application of multiphoton microscopy to the study of the immune system provides a tool to measure the dynamics of immune responses within intact tissues. Here we present a protocol for non-invasive intravital multiphoton imaging of CD4 T cells in the inflamed mouse ear dermis. Use of a custom imaging platform and a venous catheter allows for the visualization of CD4 T cell dynamics in the dermal interstitium, with the ability to interrogate these cells in real-time via the addition of blocking antibodies to key molecular components involved in motility. This system provides advantages over both in vitro models and surgically invasive imaging procedures. Understanding the pathways used by CD4 T cells for motility may ultimately provide insight into the basic function of CD4 T cells as well as the pathogenesis of both autoimmune diseases and pathology from chronic infections.

The mechanisms that govern the interstitial motility of CD4 effector T cells at sites of inflammation are relatively unknown. We present a non-invasive approach to visualize and manipulate in vitro-primed CD4 T cells in the inflamed ear dermis, allowing for study of the dynamic behavior of these cells in situ.

炎症真皮における撮像CD4 T細胞間質への移行

The ability of CD4 T cells to carry out effector functions is dependent upon the rapid and efficient migration of these cells in inflamed peripheral ...

An In Vitro Model of the Blood-brain Barrier Using Impedance Spectroscopy: A Focus on T Cell-endothelial Cell Interaction

Breakdown of the blood-brain barrier (BBB) is a critical step in the development of autoimmune diseases such as multiple sclerosis (MS) and its animal model experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE). This process is characterized by the transmigration of activated T cells across brain endothelial cells (ECs), the main constituents of the BBB. However, the consequences on brain EC function upon interaction with such T cells are largely unknown. Here we describe an assay that allows for the evaluation of primary mouse brain microvascular EC (MBMEC) function and barrier integrity during the interaction with T cells over time. The assay makes use of impedance cell spectroscopy, a powerful tool for studying EC monolayer integrity and permeability, by measuring changes in transendothelial electrical resistance (TEER) and cell layer capacitance (Ccl). In direct contact with ECs, stimulated but not na&#239;ve T cells are capable of inducing EC monolayer dysfunction, as visualized by a decrease in TEER and an increase in Ccl. The assay records changes in EC monolayer integrity in a continuous and automated fashion. It is sensitive enough to distinguish between different strengths of stimuli and levels of T cell activation and it enables the investigation of the consequences of a targeted modulation of T cell-EC interaction using a wide range of substances such as antibodies, pharmacological reagents and cytokines. The technique can also be used as a quality control for EC integrity in in vitro T-cell transmigration assays. These applications make it a versatile tool for studying BBB properties under physiological and pathophysiological conditions.

An In Vitro Model of the Blood-brain Barrier Using Impedance Spectroscopy: A Focus on T Cell-endothelial Cell Interaction

Here, we describe an in vitro murine model of the blood-brain barrier that makes use of impedance cell spectroscopy, with a focus on the consequences on endothelial cell integrity and permeability upon interaction with activated T cells.

アン<em&gt;インビトロ</em&gt;インピーダンス分光法を用いた血液脳関門のモデル：T細胞 - 内皮細胞の相互作用に焦点を当て

Breakdown of the blood-brain barrier (BBB) is a critical step in the development of autoimmune diseases such as multiple sclerosis (MS) and its animal ...

Assessing Retinal Microglial Phagocytic Function In Vivo Using a Flow Cytometry-based Assay

Microglia are the tissue resident macrophages of the central nervous system (CNS) and they perform a variety of functions that support CNS homeostasis, including phagocytosis of damaged synapses or cells, debris, and/or invading pathogens. Impaired phagocytic function has been implicated in the pathogenesis of diseases such as Alzheimer's and age-related macular degeneration, where amyloid-&#946; plaque and drusen accumulate, respectively. Despite its importance, microglial phagocytosis has been challenging to assess in vivo. Here, we describe a simple, yet robust, technique for precisely monitoring and quantifying the in vivo phagocytic potential of retinal microglia. Previous methods have relied on immunohistochemical staining and imaging techniques. Our method uses flow cytometry to measure microglial uptake of fluorescently labeled particles after intravitreal delivery to the eye in live rodents. This method replaces conventional practices that involve laborious tissue sectioning, immunostaining, and imaging, allowing for more precise quantification of microglia phagocytic function in just under six hours. This procedure can also be adapted to test how various compounds alter microglial phagocytosis in physiological settings. While this technique was developed in the eye, its use is not limited to vision research.

Assessing Retinal Microglial Phagocytic Function In Vivo Using a Flow Cytometry-based Assay

Microglial phagocytosis is critical for the maintenance of tissue homeostasis and inadequate phagocytic function has been implicated in pathology. However, assessing microglia function in vivo is technically challenging. We have developed a simple but robust technique for precisely monitoring and quantifying the phagocytic potential of microglia in a physiological setting.

網膜ミクログリアの貪食機能を評価します<em&gt;インビボ</em&gt;フローサイトメトリーベースのアッセイを使用しました

Microglia are the tissue resident macrophages of the central nervous system (CNS) and they perform a variety of functions that support CNS homeostasis, ...

In Vitro Differentiation of Human CD4+FOXP3+ Induced Regulatory T Cells (iTregs) from Na&#239;ve CD4+ T Cells Using a TGF-&#946;-containing Protocol

Regulatory T cells (Tregs) are an integral part of peripheral tolerance, suppressing immune reactions against self-structures and thus preventing autoimmune diseases. Clinical approaches to adoptively transfer Tregs, or to deplete Tregs in cancer, are underway with promising first outcomes. 
Because the number of naturally occurring Tregs (nTregs) is very limited, studying certain Treg features using in vitro induced Tregs (iTregs) can be advantageous. To date, the best although not absolutely specific protein marker to delineate Tregs is the transcription factor FOXP3. Despite the importance of Tregs including non-redundant roles of peripherally induced Tregs, the protocols to generate iTregs are currently controversial, particularly for human cells. This protocol therefore describes the in vitro differentiation of human CD4+FOXP3+ iTregs from human na&#239;ve T cells using a range of Treg-inducing factors (TGF-&#946; plus IL-2 only, or their combination with retinoic acid, rapamycin or butyrate) in parallel. It also describes the phenotyping of these cells by flow cytometry and qRT-PCR. 
These protocols result in reproducible expression of FOXP3 and other Treg signature genes and enable the study of general FOXP3-regulatory mechanisms as well as protocol-specific effects to delineate the impact of certain factors. iTregs can be utilized to study various phenotypic aspects as well as molecular mechanisms of Treg induction. Detailed molecular studies are facilitated by relatively large cell numbers that can be obtained. 
A limitation for the application of iTregs is the relative instability of FOXP3 expression in these cells compared to nTregs. iTregs generated by these protocols can also be used for functional assays such as studying their suppressive function, in which iTregs induced by TGF-&#946; plus retinoic acid and rapamycin display superior suppressive activity. However, the suppressive capacity of iTregs can differ from nTregs and the use of appropriate controls is crucial.

&lt;em&gt;In Vitro&lt;/em&gt; Differentiation of Human CD4&lt;sup&gt;+&lt;/sup&gt;FOXP3&lt;sup&gt;+&lt;/sup&gt; Induced Regulatory T Cells (iTregs) from Na&amp;#239;ve CD4&lt;sup&gt;+&lt;/sup&gt; T Cells Using a TGF-&amp;#946;-containing Protocol

This protocol describes the reproducible generation and phenotyping of human induced regulatory T cells (iTregs) from na&#239;ve CD4+ T cells in vitro. Different protocols for FOXP3 induction allow for the study of specific iTreg phenotypes obtained with respective protocols.