この方法は、ヒト原始生殖細胞のゲノムの損傷がどのように作成または修復されるかなど、ヒト生殖細胞毒物学分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、ヒト原始胚芽細胞が遺伝的背景の疾患素因を有するプライミング多能性iPS細胞から2週間で生成できることである。この技術の意味は、ヒト生殖細胞のゲノム障害の予防に及び、当社の細胞培養モデルは治療薬の生殖細胞毒性を低減するのに役立つからです。
ヒト原始生殖細胞様細胞、またはヒトGCLCの生成から始めるため、テキストプロトコルに記載されているように、ヒトiPSCの細胞外マトリックスタンパク質被覆プレートおよび細胞懸濁液を調製する。Y-27632 Rhoキナーゼ阻害剤を含むmTeSR1培地中に、プライミング多能性ヒトiPSCの単細胞懸濁液を調製する。慎重に1ミリリットル当たり100,000細胞に細胞密度を調整します。
6ウェルプレートをコーティングした細胞外マトリックスタンパク質の各ウェルにプライミングされたヒトiPSCの細胞懸濁液を2ミリリットル接種し、プレートを垂直および水平に振って細胞が均等に分配されるようにする。37°Cの三ガスCO2インキュベーターでプレートをインキュベートします。6ウェルプレートの各ウェルに正確に200,000個の細胞を接種することは非常に重要です。
細胞の正確なカウントは非常に重要です。一時的な多能性への一時的な変換が完了した後、細胞は正常である過剰コンフルエントを見る必要があります。ヒトのPGCLCの高い時期と実験再現性を達成するには、中程度の変化の正確なタイミングが重要です。
4i hiPSC培養の密度は、これらの条件下で高く、接種後48〜72時間で細胞がコンフルエントになることが期待される。接種後24時間、Y27632を使用せずにmTeSR1培地のウェル当たり2ミリリットルで培地を交換する。プライミング多能性状態ヒトiPSCを4iナイーブ多能性幹細胞に変換し始め、摂氏37度の水浴で4i完全培地50ミリリットルを15分間温める。
接種後48時間および72時間後に、プレートをインキュベーターから取り出し、4i完全培地のウェルあたり2ミリリットルで培地を交換する。遠心分離剤は、室温で5分間1,000gのマイクロウェルプレートをコーティングした。逆の顕微鏡で井戸を点検し、気泡がないことを確認します。
テキストプロトコルに記載されているようにウェルをすすい、遠心分離を繰り返します。すすがった井戸に4i完全な培地を加えます。プレートを室温で5分間1,000gで遠心し、再び井戸を点検します。
マイクロウェルプレートに4i人のiPSCを接種するには、プロトコルに記載されているようにヒトiPSC細胞懸濁液を調製する。この細胞懸濁液を40マイクロメートルの孔径セルストレーナーでフィルターして、細胞凝集体を除去します。ストレーナーを1ミリリットルのプリ温めた4i完全培地で3回洗浄し、ストレーナーからすべての細胞を採取し、培養カウンターで細胞を数える。
次に、この単一細胞懸濁液4i素数ヒトiPSCを、Y27632を含む9ミリリットルの4i完全培地で27〜3240万個の細胞に希釈する。トリガスインキュベーターから、4i完全培地1ミリリットルを含む以前に調製したマイクロウェルプレートを取り除きます。4iナイーブヒトiPSC懸濁液を1ミリリットルずつ各ウェルに接種し、ウェルあたり3.0〜360万個の細胞の濃度を達成した。
ピペットを軽くして細胞を均等に分配する。プレートを室温で3分間100gで遠心します。プレートを三ガスCO2インキュベーターに入れ、マイクロウェルにペレット化された細胞を邪魔しないようにし、一晩のインキュベーションはタイトな胚体またはEBの形成には不十分であるため、24〜30時間インキュベートします。
ヒトPGCLC基底媒体のプレウォーム5ミリリットルおよび37°Cの水浴で少なくとも5分間のヒトPGCLC完全培地の20ミリリットルは慎重に50ミリリットルのポリプロピレンコンニカルチューブの上に逆さまに40マイクロメートルの細孔サイズのセルストレーナーを置きます。マイクロウェルからEBを取り外すには、プレートの各ウェルを穏やかにピペットします。EBsに組み込まれていない細胞を除去するには、細胞ストレーナーを通してすべてのウェルの内容物をフィルタリングする。
細胞ストレーナーの膜に保持されたEBを、あらかじめ温めたヒトPGCLC基底培地1ミリリットルで静かに洗浄し、洗浄を5回繰り返します。新鮮な50ミリリットルの円錐チューブを細胞ストレーナーに置き、セルストレーナーが新しいチューブの右側に配置されるようにします。新しいチューブで細胞ストレーナーを素早く反転させると、細胞ストレーナーの膜の下にEBが配置されます。
あらかじめ温めたヒトPGCLC完全培地を細胞ストレーナーの膜に18ミリリットル加え、円錐管に脳を集める。その後、EBの懸濁液のウェルあたり3ミリリットルを低い取り付け6ウェルプレートの井戸にプレートします。プレートを3ガスインキュベーターのシーソームーブロッカーに置き、1分間に約20ターンのロッキング速度を慎重に設定します。
実験の7日目から13日目に、毎日20ミリリットルのヒトPGCLC完全培地を新たに調製する。ロッカーからプレートを取り外すと、井戸の底にRBが沈みます。約0.2ミリリットルの古い培地が各井戸に残るように、IBを乾燥させることなく古い媒体を取り除きます。
毎日古い培地を取り除いた後、新鮮なヒトPGCLC完全培地の井戸あたり3ミリリットルを追加します。ヒトPGCLCをOCT4陽性細胞として同定するために、EBを1.5ミリリットルの低結合マイクロ遠心分離管に収穫する。EBを室温で底に沈め、培地を捨てます。
氷冷1X PBSでEJBをリンスします。PBSを取り除いた後、氷上のPBS中のアジドナトリウムの体積で1ミリリットルの氷冷1%重量で5分間培養します。EBを室温で底に沈めます。
上清を捨て、氷冷PBSでEBをすすいだ。氷上の細胞外マトリックスタンパク質の200マイクロリットルを解凍します。タンパク質をEBを含むチューブに加えます。
ゲルが固まり、そして、EBが埋め込まれるまで、ほぼ10分間、室温でチューブを放置します。EBを固定するには、PBSに4%ホルムアルデヒドを1ミリリットル加え、穏やかな揺れで15分間室温でインキュベートします。その後、ホルムアルデヒドを捨て、氷冷PBSで一度EJBをすすいだ。
70%エタノールの1ミリリットルを加えます。摂氏4度で70%エタノールで1週間保存するか、標準のFFPEプロトコルで処理してください。細胞密度、各ウェル上の細胞の分布さえも重要です。
6ウェルプレートのウェルあたり2ミリリットルのY27632補充培地におけるヒトIPSCは、24時間後に20〜30%の合流に達する。mTeSR1培地でのさらなる24時間培養後、Y27632の不在時に、細胞が凝集し、コロニーを形成し、成長面積の約30%を占める。4iリプログラミング培地で24時間培養した後、細胞は合流に達した。
4i培地でさらに24時間培養した後、細胞はより密に詰まった。4iリプログラミング培地におけるマイクロウェルでの24時間のインキュベーションの後、細胞は接種後24〜30時間で円形の輪郭を見えるエブを形成した。ヒトPGCLC培地中に保管された脳は、非接着性の状態で、24時間後に凝集することなく球形を維持した。
192時間後、同じ形態を維持して、より大きかった。5日後、細胞は、8日後に、その数を増加させる、EBの表面上の細胞を発現するOCT4として出現した。ヒトPGCLCの単細胞懸濁液からの細胞は、FACSによってCD38陽性細胞として濃縮された。
CD38を発現しない細胞は陰性対照であった。汚染を避けるために、FACSゲートCD38陽性およびCD38陰性細胞を広いマージンで分離した。この手順を試みる間、その重要な正確なセルカウントと中程度の変化のタイミングに従う。
1日でも培地変化を省略したり、任意のステップでその培地の体積を減らしたりすると、大量の細胞死を引き起こすことがある。胚体の揺れる培養の速度は慎重に最適化されなければならない。
