この作品は、全米科学財団（賞番号IOS-1031416）からの助成金によって賄われていたし、ネイサン·ミラー、ローガン·ジョンソンとウィスコンシン大学のエドガースポルディングとブライアンBockelman、カールLundstedtとのデビッド·スワンソンと共同で行われているネブラスカ州のホランドコンピューティングセンターの大学。

1。画像取得プロトコル考慮事項： 1が単独で作業することが可能であるが、このプロトコルは、最も効率的に、2人で行っている。本研究室で最高の作業の配置は、スキャナのセットアップ上の別の作品は、両方のスキャナにプレートを配置し、スキャン処理を開始するために協力しながら、スキャンのためにプレートを準備するために1人のためだった。 それがこのプロジェクトのスキャナーが垂直スキャナ背面に載っスキャナ蓋を向いていることに注意することも重要です。カスタムサポートは、この垂直位置で食器を保持するために作られたと3Mコマンドストリップ（ 図2）とフラットベッドの表面に貼り付けた。このプロトコル（エプソンV700）で使用されるスキャナに付属している取り外し可能な原稿カバーは黒のフェルトを1面に並んでました。原稿カバーはバンジーコードにしてフラットベッドに接して配置した代わりにプレートを保持し、画像コントラスト（ 図3）を提供する。 十分な解像度の任意のスキャナは、画像キャプチャを使用することができる。エプソンパーフェクV700があるため、ベッドとふたの両方からスキャンすると赤外線チャネルを使用するために、その正方形のプロファイル（それが簡単に縦に配置することになる）、その高解像度、および追加オプション選択されまし​​た。これらの追加オプションについては、このプロトコルで使用されていませんでした。 プレートを成長チャンバから除去されると、プロトコルが終了し続けることが不可欠である。 プレートの準備 透明媒質10mlと各プレートの中央を横切って植えられた種子9を含む標準のペトリ皿を使用した。 ：プレートのラベル、メディアの準備と植栽のための手順を見つけることができます<a href="http://www.doane.edu/doane-phytomorph">http://www.doane.edu/doane-phytomorph</a> <ol><l私は&gt;最初の寒天プレートを取得し、キムワイプで寒天プレートの蓋の蓋とリム上で収集結露を吸収する。 </li><li>キムワイプで蓋にトリトンX-100（界面活性剤）を適用 - 寛大である。 （トリトンX-100は、プレートがスキャンされるように蓋に結露の蓄積を防ぐことができますので注意してください。蓋表面上に膜を作成するのに十分な寛大なアプリケーションは、（）蓋全体スキャナの実行を通して透明のままいることを確認する助けとなるでしょう。） </li><li>ふたを固定するために微小孔テープでプレートをラップし、換気を可能にするために。 </li></ol> スキャナのセットアップと画像収集 このプロトコルは、1以上のスキャナが使用されていることを前提としており、一台のコンピュータから複数のスキャナを開始する手順を説明します。 <ol start="4"><li>各スキャナから画像を保存するためのフォルダを作成します。各スキャナは、二つのプレートを保持するため、フォルダを作成するときには、このことを覚えていきます。 1このようなユニークな各プレートのID、苗の年齢、種子サイズ、および植え株式のIDなどのファイル名の構成要素として、メタデータを使用することを選択するかもしれません。これらのメタデータを含むデータの収集に使用されるフ​​ォルダ名の例は、「1652から2-SM-9から92-17-1653から2-LG-88-79から161」である。 </li><li>指定された収集時間のための出口タイマーを設定します（9時間、この研究室で使用された）。準備のための余分な時間（時間かそこら）を設定してください。 （VueScanをソフトウェアは、ユーザーが繰り返し画像を収集することができますが、それはユーザが収集するか、どのくらいの時間のために画像を収集する方法を多くの画像を示すことはできません。スキャナは取得時間を設定するために、コンセントのタイマーに接続する必要があることに注意してください。） </li><li>第1スキャナの電源をオンにして、その最初のウォームアップを通過するスキャナは約10秒待ちます。 </li><li>一度VueScanをプログラムを開きます。 VueScanをバージョン9.0.20は（材料表を参照）、このプロトコルで使用された、しかし、より最近のバージョンは少しmodificで使用することができますATION。 「詳細」ボタンは、後述のメニューオプションを表示するために、ユーザーインターフェイスの底面に押されたことを確認してください。 </li><li> オートリピートを設定します]ドロップダウンボックスをnoneに設定し、プレビュー領域Input]タブの下やクロップ ] タブの下で： 最大 （ 図4）。を押して「プレビュー」。 </li><li>クリックして、プレビュー画像上で関心領域をドラッグし、マウスを使用することによって、関心領域を捕捉するトリミングボックスを作成します。設定は、 クロップ ] タブで目的の領域のために変更することができる。クロップボックスのために使用される一般的な設定であった：0.675 Xオフセット、Yオフセットこれは、各スキャナの苗の領域をキャプチャするために調整したものの、中に1.924を。使用トリミングボックスのサイズは、高さ（ 図5）で1.1で広いで7.246だった。 </li><li>トリミングボックスを移動するには、マウスをドラッグしながらShiftキーを押したままにします。クロップボックスをすべてスキャンする苗プラスラベル（ 図5）に含まれている可能性があり、任意のメタデータが含まれていることを確認します。 </li><li> クロップ ] タブで、[プレビュー]領域を設定します。クロップボックスとプレス「プレビュー」に。 </li><li> [出力 ] タブに移動して、スキャナ用の正しいファイル（ 図5）を選択します。 </li><li>繰り返しは、1台のコンピュータのためのすべてのスキャナに1.7から1.12を繰り返します。 VueScanをの複数のインスタンスを開くかどうかを尋ねられたとき「はい」オプションを選択します。 </li><li>各タブを通過し、設定が正しいことを確認します。 （すべての仕様は、画像の色、解像度、 等を含む個々の研究室のニーズに合わせて変更することができることに留意されたい。しかしながら、このプロトコルで使用される設定は、パ直接に適用することができるVueScanをソフトウェアの共通のインターフェイスのために与えられた研究室のrticularスキャンウェア。 VueScanをバージョン9.0.20）を使用して、このプロジェクトで使用されるパラメータを表示するには、付属の仕様一覧を参照してください。 </li><li> [Input]タブの下でオートリピートでの連続選択します。フィールドを、または必要に応じて、画像間のより長い時間間隔を選択します。時間間隔は、スキャナが最後の画像を保存し、次の画像の収集を開始した後に一時停止時間の長さである。 連続モードでは、3〜4分間の解像度4,800 dpiで得ることができる。 </li><li>繰り返しは、単一のコンピュータに接続されているスキャナの残りの1.14から1.15を繰り返します。 </li><li>水平に向け苗で正しいスキャナ（gravistimulateはありません）で調製したプレートを置きます。 </li><li>彼らはプレキシグラステンプレートから落下しないように一時的に黒を置き、プレートに対して背景を感じました。すべてのスキャンの繰り返し純就学率。 （ 注：このプロジェクトでは、フェルトの黒い部分は、文書に添付されたまぶしさを防ぐために、ルート組織に対してコントラストを提供するために、装置に付属のカバーを使用する特定の背景色が画像化される組織の色に依存します。）。 </li><li> 1人は（プレートは、このプロトコルでは反時計回りになっていた）プレートを90°回転させ、すぐにフェルトの背景を交換している。 </li><li>彼らはすぐに「スキャン」ボタンを押すことができるように他の人がコンピュータの前に立っている必要があります。 </li><li>バンジーコード（ 図3）をスキャナに背景を固定します。 1人は別の位置バンジーコードしながら、所定の位置に背景を保持している。 （ 注：すぐgravistimulation（90°のプレートの回転）とフェルト背景を配置した後、「スキャン」を押す必要があります）。 </li><li>繰り返します、単一のコンピュ上でスキャナの残りの1.17から1.21ステップER。 </li><li>該当する場合を繰り返しスキャナの次のセットのための1.6から1.22を繰り返します。 </li><li>いくつかの画像は、彼らが正常に保存していることを確認するために収集されるまで、スキャナを放置しないでください。 </li><li>これは、指定されたスキャン時間のために乱れがないことになる領域にスキャナを維持するために理想的です。これは、理想的な表現型の応答を確実にするために、走査領域内の環境条件を考慮することも賢明である。 </li><li>データ収集が完了すると、各スキャナと一致している各VueScanを窓に緑の中止ボタンを押してください。 </li><li>コンピュータ上のすべてのプログラムの外に閉じます。 </li><li>コンピュータを再起動し、画像収集の別のラウンドを開始する前に、すべてのスキャナを遮断してください。 </li></ol>

<ol>
	<li>Miller, N. D., Brooks, T. L. D., Assadi, A. H., Spalding, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+a+gravitropism+phenotype+in+glutamate+receptor-like+3.3+mutants+of+Arabidopsis+thaliana+using+machine+vision+and+computation.">Detection of a gravitropism phenotype in glutamate receptor-like 3.3 mutants of Arabidopsis thaliana using machine vision and computation.</a> Genetics. 186, 585-593 (2010).</li><li>Clack, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+Tracking+of+Whiskers+in+Videos+of+Head+Fixed+Rodents.">Automated Tracking of Whiskers in Videos of Head Fixed Rodents.</a> PLoS Comp. Biol. 8, (2012).</li><li>Lussier, Y. 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Biol. 351, 241-251 (2006).</li><li>Miller, N. D., Parks, B. M., Spalding, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Computer-vision+analysis+of+seedling+responses+to+light+and+gravity.">Computer-vision analysis of seedling responses to light and gravity.</a> Plant J. 52, 374-381 (2007).</li><li>Iyer-Pascuzzi, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+and+Analysis+Platform+for+Automatic+Phenotyping+and+Trait+Ranking+of+Plant+Root+Systems.">Imaging and Analysis Platform for Automatic Phenotyping and Trait Ranking of Plant Root Systems.</a> Plant Physiol. 152, 1148-1157 (2010).</li><li>Houle, D., Mezey, J., Galpern, P., Carter, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+measurement+of+Drosophila+wings.">Automated measurement of Drosophila wings.</a> BMC Evol. Biol. 3, 25 (2003).</li><li>Jahnke, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combined+MRI-PET+dissects+dynamic+changes+in+plant+structures+and+functions.">Combined MRI-PET dissects dynamic changes in plant structures and functions.</a> Plant J. 59, 634-644 (2009).</li><li>Durham Brooks, T. L., Miller, N. D., Spalding, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasticity+of+Arabidopsis+Root+Gravitropism+throughout+a+Multidimensional+Condition+Space+Quantified+by+Automated+Image+Analysis.">Plasticity of Arabidopsis Root Gravitropism throughout a Multidimensional Condition Space Quantified by Automated Image Analysis.</a> Plant Physiol. 152, 206-216 (2010).</li><li>Perrin, R. 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H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ARL2,+ARG1+and+PIN3+define+a+gravity+signal+transduction+pathway+in+root+statocytes.">ARL2, ARG1 and PIN3 define a gravity signal transduction pathway in root statocytes.</a> Plant J. 53, 380-392 (2007).</li><li>Swarup, R., Bennett, M. J., Beeckman, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Root Development. , 157-174 .</li><li>French, A., Ubeda-Tom&#225;s, S., Holman, T. J., Bennett, M. 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P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+feature+counting+and+measurement+of+roots.">High-throughput feature counting and measurement of roots.</a> Bioinformatics. 27, 1337-1338 (2011).</li></ol>

著者は、彼らが競合する経済的利益を持っていないことを宣言します。

正確な表現型の観察は、生物内で遺伝子機能の症状を理解するのに非常に重要です。表現型情報を獲得する一つの方法は、高解像度の画像データの取り込みによるものである。開発されたスキャナ·ベースのプラットフォームは、数時間にわたり高解像度（4,800 dpi）の時に多くの画像（200枚/スキャン周期）の収集が可能となった。さらに、このプラットフォームは、簡単に共通のインターフェース18を使用して異なるスキャナの数千を実行するためにVueScanをソフトウェアの柔軟性のために研究室や教室でさまざまな環境に適応している。 ここで紹介する方法は、大規模な表現型施設や、単一の研究室で実施可能な自動化されたシステムから延びて高スループットの画像キャプチャ内の空隙を埋める。現在入手可能なハイスループットプラットフォームは、pの高解像度の画像をキャプチャするために、ロボットの支持体上に取り付けられたカメラを含む特殊なイメージングハードウェアを使用する傾向があるrimarily地上植物組織上（LemnaTecによる植物統合技術とScanalyzer HTSに例えばセンター）20,21。彼らは土壌環境（工場統合テクノロジーなどセンター）11,22,23に成長するにつれ、X線やMRI技術を使用して、特殊な画像処理システムは、また驚くべき解像度で地面組織下の画像に開発されている。より特化した技術のこの発展は、動的表現型の研究はより困難に、スループットを犠牲にして、一般的である。重要なことに、これらのハイエンド·プラットフォームのためのコストとインフラニーズが小さな実験室での実施のために、それらはほとんど不可能にする。 プラットフォームはまた、より標準的な画像キャプチャ技術を使用すると、重力刺激に対するルート応答として動的応答の測定によく適しているが開発されている。例えば、CCDカメラは高で光や重力に対する個々の苗応答を捕捉するために使用されている空間的および時間的分解能1,8,12。他のシステムでは、単一のイメージ（iPlantコラボレーションするなどRootTipMulti）17,24から複数の根の根端の向きを測定することができるように開発されている。前者の場合、スループットは、後者の場合にはスループットが高いが、一般に解像度を犠牲にしながら、唯一の苗は、一度に各カメラで撮像されていることが指定されて比較的低い。 本論文で概説された手順は、容易に入手可能であり、比較的手頃な価格の機器やソフトウェアを高スループットで高解像度の画像を撮影するためのプラットフォームを提供します。このセットアップを使用して、1,080個々のルートの応答は6スキャナの銀行を搭載した単一の研究室で毎週収集することができる。週864個々の応答の平均を収集する15ヶ月で、41625苗の合計ゲノミクス研究のためにスキャンした。個々のコレクションの約15％は、セットアップエラー、ネットワークや通信システムに障害が発生したRKの障害や機器の誤作動。別の22％の応答は、増殖応答を誘発するため、発芽又は不十分な根の成長の欠如のために失敗しました。最終的なデータセットは、27475個々の苗163組換え自殖系統からの重力刺激に対する応答を加えた同質遺伝子系統に近い99から構成されています。データは、この非常にハイスループットアプローチを作り、単一の実験室で回収した。でも、取得のために使用される装置は、比較的安価であることを考えると、それも大量使用して2年以上に渡って確実に機能してきた。 このプロトコルは、このグループの研究目的のために非常に有用であったが、いくつかの制限がまだ存在しています。なぜなら日当たり非圧縮画像データの約50ギガバイトのスループットのではなく、有効圧縮スキームが開発される可能性がない限り、大量のスペースが家の画像に必要であったことが明らかであった。ストレージの問題は、一時的に各コンピュータの外付けハードドライブを購入することで解決した。さらに、2つ10 TBネットワークに関連するストレージ·デバイスを購入した。上記のように後で、圧縮アルゴリズムは、最大60％（ 図8）によりデータサイズを削減することができ、開発された。これは、データがネットワーク関連する記憶装置に保存することができる速度は、ネットワーク接続の速度に依存することに留意することが重要である。圧縮スキームはまた、画像データの損失を防止する要望に制約されてきた。 スキャナベースの撮像システムに固有のその他の制限も検討されている。例えば、スキャナベースのアプローチで実生を各走査中に、白と潜在的に赤外線範囲で高強度の光に曝される。苗はまだ（ 図7）、重力刺激に堅牢な対応を受けることが観察できるが、これはおそらく、苗の成長に影響を与えます。今後の改善が唯一の赤外LEDがアクティブであることを、スキャナをプログラミング伴う可能性があります。アクティブ開発ボードユーザーズガイド内の領域tは同様にこれらの画像データの解像度およびスループットに合わせた解析アルゴリズムの作成である。このスキャナベースの方法を使用して発生する大きなデータセットには、苗画像のハイスループット表現型決定のためのロバストなツールの開発のための理想的であった。 図7に示し、これらのイメージに使用される圧縮アルゴリズムは、それらが画 ​​像解析アプリケーションに適しているという主張をサポートしています。さらに、生成された画像は、それらがより低い解像度（1,200未満の解像度）で収集された場合、以前に公開されたアルゴリズムは、RootTrace 17,24によって分析することができ、個々の苗は、分析の前に、上述の圧縮アルゴリズムを用いて画像からセグメント化される。根の成長データは、先端角データ900解像度（未発表の観察）に還元された画像から抽出することができ、一方1,200 dpiに縮小画像から抽出することができる。 本論文で概説された手順は、カンガルーの世界で独自のニッチに収まるまだ比較的手頃な価格でありながら、高スループットと高解像度であることをTイメージング。このアプローチのさらなる利点は、それが容易に特定の研究グループの撮像ニーズに対応するようにカスタマイズすることができることである。

高解像度の表現型データの収集は、生物機能1,2を媒介する遺伝と環境の相互作用を理解することを目指して研究に有用である。この種の研究は、それが追加的に必要な、この文脈での表現型を測定するために用いられる方法は、スループット3,4において高いことが作り、規模においても本質的に大きい。フェノミクス的な研究のための方法を確立する上で、スループットと分解能の間のトレードオフが遊びに来る。スループットが高くなる方法はまた、それがより困難に遺伝または環境5の小さな効果を検出すること、解像度が低下する傾向にある。代替的には、より慎重に所望の表現型を測定する方法はまた、それが困難広く遺伝的および環境への影響を調査すること、スループットが低下する傾向にある。さらに、目視検査などの表現型を、定量化するための手動の方法は、人間のあたりの違いによる変動を受けることができますception 6。 イメージング技術は、表現型の観察7-9を得ることにスループットと分解能の便利なブリッジを提供することができます。一般的に、画像は、スループットを容易に取り込むことが比較的容易であり、十分な解像度で撮影されたときに、微妙な表現型は1,2,7を検出することができる。イメージング技術は、関心のあるシステムまたはプロセスに適合するように変更可能である傾向があり、一般に10-12スケーラブルである。このため、画像化技術は、生物の機能の大規模な研究開発のために理想的である。 重力刺激に対する一次根の応答は、形態学的に単純な器官内に発生し、複雑な生理的過程である。レスポンスは、ルートの臓器を介して伝播し、その進行は、環境の影響を受けて12月14日遺伝的要因などの環境的および遺伝的要因によって決定されたシグナル伝達経路の活性化が関与している</suP&gt;。重力刺激に対する一次根の応答はダーウィン以来、少なくとも研究されてきた、まだそれがどのように機能するかについて学ぶために多くの、特に初期のシグナル伝達事象に、応答塑性12,14,15の媒介要因がある。この応答の動態を詳細に理解を得ることに成功し、与えられた環境16内に確立さになる苗の能力を改善する方法を見つけることは重要である。また、ルートの形状は、それが適した画像処理アプリケーション8,12,17できるようになります。一緒になって、根の重力応答は、生物機能ゲノミクスのレベルの研究を行う目的のための高スループット画像化技術の開発のための理想的なシステムである。 本報告では、安価な市販のフラットベッドスキャナを使用して、ルート応答重力屈性の画像キャプチャのための高スループット、高分解能の方法が提示される。の概要プロトコルは、図1に示されている。寒天プレートに植えられた苗木は、カスタムプレキシプレートホルダーを装備し、垂直指向のフラットベッドスキャナー上に配置された。画像は4,800 dpiで数分ごとに収集され、ローカルドライブまたはデータサーバに保存された。各画像系列に関連付けられたメタデータは、データベースに格納され、格納された画像が処理される。アプローチは、画像取り込み用のVueScanをソフトウェアを使用しています。 VueScanをは（材料表を参照）は、Windows、Mac、またはLinuxオペレーティング·システム上で2100種類以上のスキャナを実行するために使用することができます。 4,800 dpiの解像度のスキャナは、固定CCDカメラを用いて1,8,12以前の研究において達成解像度に合わせて、本出願で使用した。共通のインターフェイスと一緒にVueScanをソフトウェアの柔軟性は、それはそれは、ユーザーが容易に本稿のプロトコルに十分な解像度の事実上すべてのスキャナのハードウェアを採用することができます実行するすべてのスキャナに使用する。現在のスループットは、コレクションのために可能にする一日あたり216個々の応答。技術は高校からの研究大学までの教育機関での使用に適合可能で拡張性のある。さらに、収集された画像は、画像解析アプリケーションのために十分な品質のものである。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="798">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Epson Perfection V700 Photo Scanners</td>
			<td>Epson</td>
			<td>B11B178011</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plexiglas Scanner Template</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Custom made. See Figure 2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Smart Strap Bungee Cords</td>
			<td>SmartStraps</td>
			<td>Wal-Mart 1079478</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brinks Digital Outdoor Timers</td>
			<td>Brinks</td>
			<td>Wal-Mart 42-1014-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VueScan Software</td>
			<td>Hamrick Software</td>
			<td><a href="http://www.hamrick.com/">http://www.hamrick.com</a></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Segmentation Software</td>
			<td>Chris Wentworth, Doane College</td>
			<td></td>
			<td>https://sites.google.com/a/doane.edu/compphy-doane/projects/root-gravitropism/image-segmentation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3M Micropore Tape</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>19-061-655</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Holding racks</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Custom made by gluing two cookie racks together.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using flatbed scanners to collect high-resolution time-lapsed images of the arabidopsis root gravitropic response

生物学における研究努力がますます高解像度データの大量のコレクションを有効な方法論の使用を必要とする。研究所が直面することができます課題は、これらのメソッドの開発と達成です。関心対象の方法における表現型の観察は、遺伝子機能を研究する研究室の代表的な目的であり、これはしばしば、画像キャプチャによって達成される。イメージング手法を用いた観察に適している特定のプロセスは、重力ベクトルと位置合わせから変位した苗の根の成長補正である。ルート重力屈性応答を測定するために使用されるイメージングプラットフォームは、スループットが比較的低く、高価で、および/または労働集約的であることができる。これらの問題は、安価でありながら高解像度、フラットベッドスキャナを用いた高スループット撮像法を開発することによって対処されている。この方法を使用して、画像は、4,800 dpiで、数分ごとに捕捉することができる。現在の設定は216個々のRの収集を可能にする一日あたりのesponses。収集された画像データは、画像解析アプリケーションのための十分な品質である。

代表的な画像 このアプローチは、シロイヌナズナ実生の成長の高解像度の時系列の迅速な生産を可能にします。スキャナランの最初と最後の画像は、 図7Aおよび7Bに示されている図7Cおよび7Dは、フルスキャナの半分より最適な結果を示している。画像品質に影響を与えることができるいくつかの問題は、 図7Aおよび7Bに示されている。これらの問題は、発芽のばらつき、実行の開始時に苗の成長軌道の変化、スキャン時の結露の蓄積があります。縮合は、主に、プレートの蓋の内側に塗布トリトンX-100の量を増加させることによって解決することができる。正確な画像コレクションを阻害し得るその他の要因は、それらがクロップボックスに関してスキューされるようにプレート位置と位置決めプレートに関してクロップボックスの誤った構成である。 画像解析アプリケーション：イメージの圧縮 スキャナ画像の時間シーケンスが得られたら、それは確実に画像解析を容易にするために、ネットワークアクセス可能な方法で格納されなければならない。個々のスキャナの実行に関連した画像ファイルは、ハードドライブの空き容量のかなりの量を占めている。 4,800 dpiで収集された単一のTIFFファイルは約220メガバイトであり、典型的なスキャナの実行には、200の画像ファイルを生成します。そのため、ハードドライブの空き容量の約44ギガバイトは、実行ごとに必要です。画像解析に関連するストレージやネットワーク伝送コストを削減するために、同時にデータ損失を最小限に抑えつつ、画像データの格納に必要なスペースの量を低減することが望ましい。下流の分析は、実験操作に関連付けられた後続の画像ファイルに各苗の同定を伴う。したがって、スキャナから単一実生をセグメント化することは、下流の分析を容易にすることができる。なぜなら離れて目の残りの部分から苗のセグメンテーション電子画像はまた、有意に不要な背景画素の蓄積を減らすことができ、このアプローチでは、データサイズの有意な減少をもたらす。下流分析が根組織に焦点を当てている場合は、ルートピクセルは、その色空間が比較的狭いので、色情報を保持する必要はないかもしれない。コンピュータ画像処理プロトコルとの両方が、個々の苗をセグメント化し、グレースケール画像を変換してデータサイズを小さくするためのコードが開発されている。アプローチは、ストレージスペース要件の60％の減少をもたらす。 このデータ圧縮を達成するために使用されるワークフローは、以下の手順に記載されている。 <ol><li> 1つのフォルダにスキャナ画像ファイルの時系列で始まる。 </li><li>画像ごとに、（ 図8、上部）をグレースケールにRGBから変換します。 </li><li>左右に画像を分割します。 </li><li>独自のファイル（ 図8）内に画像から各苗を抽出します。これは、黒または白のピクセルに変換するために閾値を適用し、各イメージ行の全画素強度を計算することによって行われる。最高強度を持つ行が識別され、各画素は「植物」またはその近傍の強度に基づいて「nonplant」として分類される。この行内の各「植物」の中心が発見され、その時点からの所定の大きさのクロップボックス（ 図8、下）描かれている。 </li><li>個々の時系列画像ファイルを格納するための各苗に別々のサブフォルダに（左右）画像の各辺ごとに個別のフォルダを作成します。 </li><li>圧縮されたZIPファイルに結果のフォルダをアーカイブします。 </li></ol>これらのステップを達成するコードは、プログラミング言語Pythonの20を使用して開発されました。アルゴリズムは、データサイズが約60％削減を可能にし、スキャナIMAGの90％の全ての個々の苗を識別することに成功しEファイルは、これまでに分析した。コー​​ドは、（材料表を参照）、GNU一般公衆利用許諾契約書バージョン3の下で無料でダウンロードすることが可能です。 <img alt="図1" fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/50878/50878fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50878/50878fig1.jpg" width="500px" /> 図1。走査手順は、シード植栽（プレートあたり最大9シロイヌナズナの種子）から始まり、データ保存や画像処理で終了します。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50878/50878fig1highres.jpg" target="_blank">拡大画像を表示するには、ここをクリックしてください</a> 。 <img alt="図2" fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/50878/50878fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50878/50878fig2.jpg" width="500px" /> ペトリ皿のサポートを構築するための図2。のT エンプレート。プルツー<html> xiglasは幅がフラットベッドに合うように切断（この場合は227ミリメートル）、長さは128ミリメートルであった。 88ミリメートルの直径を有する二つの円は、それらが均一に支持体の幅及び長さに沿って分布したように、残りの片を切り出した。サポートは、3Mのコマンドストリップでフラットベッドに貼り付けた。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50878/50878fig2highres.jpg" target="_blank">拡大画像を表示するには、ここをクリックしてください</a> 。 <img alt="図3" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50878/50878fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50878/50878fig3.jpg" width="500px" /> 図3。スキャナ構成苗はgravistimulatedされ、原稿カバーを位置決めした後 、 これはスキャナのセットアップと画像収集のステップ1.21で、スキャナの構成である。&quot;_blank&quot;&gt;拡大画像を表示するにはここをクリックしてください。 <img alt="図4" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50878/50878fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50878/50878fig4.jpg" width="500px" /> 図4。スキャナのセットアップと画像収集の段階1.8のために選択した設定のスクリーンショット。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50878/50878fig4highres.jpg" target="_blank">拡大画像を表示するには、ここをクリックしてください</a> 。 <img alt="図5" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50878/50878fig5highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50878/50878fig5.jpg" width="500px" /> 青いボックスがFO特定の設定に焦点を当てながら、 図5のステップ1.9とスキャナのセットアップと画像収集の1.10の間にVueScanをソフトウェアのスクリーンショット。赤いボックスは、作物の大きさを強調して<html> rはx軸とyオフセット実生およびラベル情報を捕捉するために用いられる。スキャンするフラットベッドの領域がプレビューエリアに点線で示されている。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50878/50878fig5highres.jpg" target="_blank">拡大画像を表示するには、ここをクリックしてください</a> 。 <img alt="図6" fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/50878/50878fig6highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50878/50878fig6.jpg" width="400px" /> 図6。スキャナのセットアップと画像収集ステップ1.12のインストール先フォルダの選択。次のデフォルトのフォルダ]ダイアログボックス（赤い矢印）に@ボタンを押すと、ユーザーが適切な保存先フォルダを選択することができます。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50878/50878fig6highres.jpg" target="_blank">拡大画像を表示するには、ここをクリックしてください</a> 。 7再 &quot;FO：コンテンツの幅=&quot; &quot;FO：SRC =&quot; 5インチ/ files/ftp_upload/50878/50878fig7highres.jpg &quot;SRC =&quot; / files/ftp_upload/50878/50878fig7.jpg &quot;幅=&quot; 600PX &quot;/&gt; 図7（AD）上記画像は、本稿に記載された方法を用いて収集したものの一例である。パネルA、BおよびC、Dは、単一の走査期間から、それぞれ、最初と最後の画像である。A、Bを示してフルスキャンされた領域、C、Dは 、単板を示す、走査領域のクロッピングされた領域であるが。いくつかの不整合を観察することができる。パネルAは、発芽して成長軌道の変化を示している。パネルBは、（画像Aと同じ苗; 9時間後に）プレートが結露を蓄積することができることを示しています。パネルC及びDは、堅固な成長に起因oを良好な結果であると考えられているF苗と実行を通じて、画質が。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50878/50878fig7highres.jpg" target="_blank">拡大画像を表示するには、ここをクリックしてください</a> 。 <img alt="図8" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50878/50878fig8highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50878/50878fig8.jpg" width="600px" /> 図8現像された画像圧縮アルゴリズムは、スケール（上部）を灰色にスキャナ画像に変換する 。画像は、右と左半分に分割され、画像の境界線（図示せず）が除去される。各半分上の個々の苗木の位置が最大の総ピクセル強度を持つ行を見つけることによって識別されます。これらの位置は、新しいトリミング領域を定義するために使用され、プレート（下）上のすべての苗に適用。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50878/50878fig8highres.jpg" target="_blank">拡大画像を表示するには、ここをクリックしてください</a> 。

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Using Flatbed Scanners to Collect High-resolution Time-lapsed Images of the Arabidopsis Root Gravitropic Response

このプロトコルは、市販のフラットベッドスキャナを使用して、重力刺激に応答するシロイヌナズナ実生の画像を迅速に収集するためのプロセスを説明します。この方法は、下流の分析アルゴリズムのために適した高解像度画像の安価な大容量の捕捉を可能にする。

シロイヌナズナ根重力屈性反応の高分解能時間経過画像を収集するためにフラットベッドスキャナを使用して

Research efforts in biology increasingly require use of methodologies that enable high-volume collection of high-resolution data. A challenge laboratories ...

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Research

JoVE Journal

Biology

12.3K ビュー.  Doane College. このプロトコルは、市販のフラットベッドスキャナを使用して、重力刺激に応答するシロイヌナズナ実生の画像を迅速に収集するためのプロセスを説明します。この方法は、下流の分析アルゴリズムのために適した高解像度画像の安価な大容量の捕捉を可能にする。 

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Using the optokinetic response to study visual function of zebrafish

Optokinetic response (OKR) is a behavior that an animal vibrates its eyes to follow a rotating grating around it. It has been widely used to assess the visual functions of larval zebrafish1-5. Nevertheless, the standard protocol for larval fish is not yet readily applicable in adult zabrafish. Here, we introduce how to measure the OKR of adult zebrafish with our simple custom-built apparatus using a new protocol which is established in our lab. Both our apparatus and step-by-step procedure of OKR in adult zebrafish are illustrated in this video. In addition, the measurements of the larval OKR, as well as the optomotor response (OMR) test of adult zebrafish, are also demonstrated in this video. This OKR assay of adult zebrafish in our experiment may last for up to 4 hours. Such OKR test applied in adult fish will benefit to visual function investigation more efficiently when the adult fish vision system is manipulated.
Su-Qi Zou and Wu Yin contributed equally to this paper.

Optokinetic response has been widely used to assess the visual functions of larval zebrafish. Nevertheless, the standard protocol for larval fish is not yet readily applicable in adults1-5. Here, we introduce how to measure the OKR of adult zebrafish using a new protocol which is established in our lab.

ゼブラフィッシュの視覚機能を研究するために視運動性応答を使用して

Optokinetic response (OKR) is a behavior that an animal vibrates its eyes to follow a rotating grating around it. It has been widely used to assess the ...

生物学

Long-term, High-resolution Confocal Time Lapse Imaging of Arabidopsis Cotyledon Epidermis during Germination

Imaging in vivo dynamics of cellular behavior throughout a developmental sequence can be a powerful technique for understanding the mechanics of tissue patterning. During animal development, key cell proliferation and patterning events occur very quickly. For instance, in Caenorhabditis elegans all cell divisions required for the larval body plan are completed within six hours after fertilization, with seven mitotic cycles1; the sixteen or more mitoses of Drosophila embryogenesis occur in less than 24 hr2. In contrast, cell divisions during plant development are slow, typically on the order of a day 3,4,5 . This imposes a unique challenge and a need for long-term live imaging for documenting dynamic behaviors of cell division and differentiation events during plant organogenesis. Arabidopsis epidermis is an excellent model system for investigating signaling, cell fate, and development in plants. In the cotyledon, this tissue consists of air- and water-resistant pavement cells interspersed with evenly distributed stomata, valves that open and close to control gas exchange and water loss. Proper spacing of these stomata is critical to their function, and their development follows a sequence of asymmetric division and cell differentiation steps to produce the organized epidermis (Fig. 1).
This protocol allows observation of cells and proteins in the epidermis over several days of development. This time frame enables precise documentation of stem-cell divisions and differentiation of epidermal cells, including stomata and epidermal pavement cells. Fluorescent proteins can be fused to proteins of interest to assess their dynamics during cell division and differentiation processes. This technique allows us to understand the localization of a novel protein, POLAR6, during the proliferation stage of stomatal-lineage cells in the Arabidopsis cotyledon epidermis, where it is expressed in cells preceding asymmetric division events and moves to a characteristic area of the cell cortex shortly before division occurs. Images can be registered and streamlined video easily produced using public domain software to visualize dynamic protein localization and cell types as they change over time.

Long-term, High-resolution Confocal Time Lapse Imaging of Arabidopsis Cotyledon Epidermis during Germination

We describe a protocol using chamber slides and media to immobilize plant cotyledons for confocal imaging of the epidermis over several days of development, documenting stomatal differentiation. Fluorophore-tagged proteins can be tracked dynamically by expression and subcellular localization, increasing understanding of their possible roles during cell division and cell-type differentiation.

の長期、高分解能共焦点タイムラプスイメージング<em&gt;シロイヌナズナ子葉</em発芽過程&gt;表皮

Imaging in vivo dynamics of cellular behavior throughout a developmental sequence can be a powerful technique for understanding the mechanics of tissue ...

Using High Resolution Computed Tomography to Visualize the Three Dimensional Structure and Function of Plant Vasculature

High resolution x-ray computed tomography (HRCT) is a non-destructive diagnostic imaging technique with sub-micron resolution capability that is now being used to evaluate the structure and function of plant xylem network in three dimensions (3D) (e.g. Brodersen et al. 2010; 2011; 2012a,b). HRCT imaging is based on the same principles as medical CT systems, but a high intensity synchrotron x-ray source results in higher spatial resolution and decreased image acquisition time. Here, we demonstrate in detail how synchrotron-based HRCT (performed at the Advanced Light Source-LBNL Berkeley, CA, USA) in combination with Avizo software (VSG Inc., Burlington, MA, USA) is being used to explore plant xylem in excised tissue and living plants. This new imaging tool allows users to move beyond traditional static, 2D light or electron micrographs and study samples using virtual serial sections in any plane. An infinite number of slices in any orientation can be made on the same sample, a feature that is physically impossible using traditional microscopy methods.
Results demonstrate that HRCT can be applied to both herbaceous and woody plant species, and a range of plant organs (i.e. leaves, petioles, stems, trunks, roots). Figures presented here help demonstrate both a range of representative plant vascular anatomy and the type of detail extracted from HRCT datasets, including scans for coast redwood (Sequoia sempervirens), walnut (Juglans spp.), oak (Quercus spp.), and maple (Acer spp.) tree saplings to sunflowers (Helianthus annuus), grapevines (Vitis spp.), and ferns (Pteridium aquilinum and Woodwardia fimbriata). Excised and dried samples from woody species are easiest to scan and typically yield the best images. However, recent improvements (i.e. more rapid scans and sample stabilization) have made it possible to use this visualization technique on green tissues (e.g. petioles) and in living plants. On occasion some shrinkage of hydrated green plant tissues will cause images to blur and methods to avoid these issues are described. These recent advances with HRCT provide promising new insights into plant vascular function.

High resolution x-ray computed tomography (HRCT) is a non-destructive diagnostic imaging technique that can be used to study the structure and function of plant vasculature in 3D. We demonstrate how HRCT facilitates exploration of xylem networks across a wide range of plant tissues and species.

プラントの脈管構造の三次元構造と機能を可視化するために、高分解能CTを用いた

High resolution x-ray computed tomography (HRCT) is a non-destructive diagnostic imaging technique with sub-micron resolution capability that is now being ...

Lateral Root Inducible System in Arabidopsis and Maize

Lateral root development contributes significantly to the root system, and hence is crucial for plant growth. The study of lateral root initiation is however tedious, because it occurs only in a few cells inside the root and in an unpredictable manner. To circumvent this problem, a Lateral Root Inducible System (LRIS) has been developed. By treating seedlings consecutively with an auxin transport inhibitor and a synthetic auxin, highly controlled lateral root initiation occurs synchronously in the primary root, allowing abundant sampling of a desired developmental stage. The LRIS has first been developed for Arabidopsis thaliana, but can be applied to other plants as well. Accordingly, it has been adapted for use in maize (Zea mays). A detailed overview of the different steps of the LRIS in both plants is given. The combination of this system with comparative transcriptomics made it possible to identify functional homologs of Arabidopsis lateral root initiation genes in other species as illustrated here for the CYCLIN B1;1 (CYCB1;1) cell cycle gene in maize. Finally, the principles that need to be taken into account when an LRIS is developed for other plant species are discussed.

Lateral Root Inducible System in Arabidopsis and Maize

The Lateral Root Inducible System (LRIS) allows for synchronous induction of lateral roots and is presented for Arabidopsis thaliana and maize.

側根誘導系で<em&gt;シロイヌナズナ</em&gt;とトウモロコシ

Lateral root development contributes significantly to the root system, and hence is crucial for plant growth. The study of lateral root initiation is ...

High Resolution Quantification of Crystalline Cellulose Accumulation in Arabidopsis Roots to Monitor Tissue-specific Cell Wall Modifications

Plant cells are surrounded by a cell wall, the composition of which determines their final size and shape. The cell wall is composed of a complex matrix containing polysaccharides that include cellulose microfibrils that form both crystalline structures and cellulose chains of amorphous organization. The orientation of the cellulose fibers and their concentrations dictate the mechanical properties of the cell. Several methods are used to determine the levels of crystalline cellulose, each bringing both advantages and limitations. Some can distinguish the proportion of crystalline regions within the total cellulose. However, they are limited to whole-organ analyses that are deficient in spatiotemporal information. Others relying on live imaging, are limited by the use of imprecise dyes. Here, we report a sensitive polarized light-based system for specific quantification of relative light retardance, representing crystalline cellulose accumulation in cross sections of Arabidopsis thaliana roots. In this method, the cellular resolution and anatomical data are maintained, enabling direct comparisons between the different tissues composing the growing root. This approach opens a new analytical dimension, shedding light on the link between cell wall composition, cellular behavior and whole-organ growth.

High Resolution Quantification of Crystalline Cellulose Accumulation in Arabidopsis Roots to Monitor Tissue-specific Cell Wall Modifications

Crystalline cellulose is an important constituent of the plant cell wall. However, its quantification at a cellular resolution is technically challenging. Here, we report the use of polarized light technology and root cross sections to obtain information of cell wall composition at a spatiotemporal resolution.

結晶セルロース蓄積中の高解像度の定量化<em&gt;シロイヌナズナ</em&gt;ルーツは、組織特異的な細胞壁の変更を監視します

Plant cells are surrounded by a cell wall, the composition of which determines their final size and shape. The cell wall is composed of a complex matrix ...

A High Resolution Method to Monitor Phosphorylation-dependent Activation of IRF3

The IRF3 transcription factor is critical for the first line of defense against pathogens mainly through interferon &#946; and antiviral gene expression. A detailed analysis of IRF3 activation is essential to understand how pathogens induce or evade the innate antiviral response. Distinct activated forms of IRF3 can be distinguished based on their phosphorylation and monomer vs dimer status. In vivo discrimination between the different activated species of IRF3 can be achieved through the separation of IRF3 phosphorylated forms based on their mobility shifts on SDS-PAGE. Additionally, the levels of IRF3 monomer and dimer can be monitored using non-denaturing electrophoresis. Here, we detail a procedure to reach the highest resolution to gain the most information regarding IRF3 activation status. This is achieved through the combination of a high resolution SDS-PAGE and a native-PAGE coupled to immunoblots using multiple total and phosphospecific antibodies. This experimental strategy constitutes an affordable and sensitive approach to acquire all the necessary information for a complete analysis of the phosphorylation-mediated activation of IRF3.

Here we describe a procedure allowing a detailed analysis of the phosphorylation-dependent activation of the IRF3 transcription factor. This is achieved through the combination of a high resolution SDS-PAGE and a native-PAGE coupled to immunoblots using multiple phosphospecific antibodies.

IRF3のリン酸化依存性活性化を監視するために、高解像度の方法

The IRF3 transcription factor is critical for the first line of defense against pathogens mainly through interferon &#946; and antiviral gene expression. ...

High-resolution Optical Mapping of the Mouse Sino-atrial Node

Sino-atrial node (SAN) dysfunctions and associated complications constitute important causes of morbidity in patients with cardiac diseases. The development of novel pharmacological therapies to cure these patients relies on the thorough understanding of both normal physiology and pathophysiology of the SAN. Among the studies of cardiac pacemaking, the mouse SAN is widely used due to its feasibility for modifications in the expression of different genes that encode SAN ion channels or calcium handling proteins. Emerging evidence from electrophysiological and histological studies has also proved the representativeness and similarity of the mouse SAN structure and functions to larger mammals, including the presence of specialized conduction pathways from the SAN to the atrium and a complex pacemakers' hierarchy within the SAN. Recently, the technique of optical mapping has greatly facilitated the exploration and investigation of the origin of excitation and conduction within and from the mouse SAN, which in turn has extended the understanding of the SAN and benefited clinical treatments of SAN dysfunction associated diseases. In this manuscript, we have described in detail how to perform the optical mapping of the mouse SAN from the intact, Langendorff-perfused heart and from the isolated atrial preparation. This protocol is a useful tool to enhance the understanding of mouse SAN physiology and pathophysiology.

Here, we present a protocol for optical mapping of electrical activity from the mouse right atrium and especially the sino-atrial node, at a high spatial and temporal resolution.

マウス洞房結節の高分解能光学マッピング

Sino-atrial node (SAN) dysfunctions and associated complications constitute important causes of morbidity in patients with cardiac diseases. The ...

Standardized Method for High-throughput Sterilization of Arabidopsis Seeds

Arabidopsis thaliana (Arabidopsis) seedlings often need to be grown on sterile media. This requires prior seed sterilization to prevent the growth of microbial contaminants present on the seed surface. Currently, Arabidopsis seeds are sterilized using two distinct sterilization techniques in conditions that differ slightly between labs and have not been standardized, often resulting in only partially effective sterilization or in excessive seed mortality. Most of these methods are also not easily scalable to a large number of seed lines of diverse genotypes. As technologies for high-throughput analysis of Arabidopsis continue to proliferate, standardized techniques for sterilizing large numbers of seeds of different genotypes are becoming essential for conducting these types of experiments. The response of a number of Arabidopsis lines to two different sterilization techniques was evaluated based on seed germination rate and the level of seed contamination with microbes and other pathogens. The treatments included different concentrations of sterilizing agents and times of exposure, combined to determine optimal conditions for Arabidopsis seed sterilization. Optimized protocols have been developed for two different sterilization methods: bleach (liquid-phase) and chlorine (Cl2) gas (vapor-phase), both resulting in high seed germination rates and minimal microbial contamination. The utility of these protocols was illustrated through the testing of both wild type and mutant seeds with a range of germination potentials. Our results show that seeds can be effectively sterilized using either method without excessive seed mortality, although detrimental effects of sterilization were observed for seeds with lower than optimal germination potential. In addition, an equation was developed to enable researchers to apply the standardized chlorine gas sterilization conditions to airtight containers of different sizes. The protocols described here allow easy, efficient, and inexpensive seed sterilization for a large number of Arabidopsis lines.

The objective of this study was to determine the effects of bleach and chlorine gas sterilization on seed germination of a range of Arabidopsis genotypes grown on sterile media. Optimized sterilization protocols have been developed to prevent the growth of microbial contaminants while providing satisfactory seed survival.

高スループット シロイヌナズナ種子の殺菌のための標準化された方法

Arabidopsis thaliana (Arabidopsis) seedlings often need to be grown on sterile media. This requires prior seed sterilization to prevent the growth of ...

Plant-Microbe Interaction: Transcriptional Response of Bacillus Mycoides to Potato Root Exudates

Beneficial plant-associated bacteria play an important role in promoting growth and preventing disease in plants. The application of plant growth-promoting rhizobacteria (PGPR) as biofertilizers or biocontrol agents has become an effective alternative to the use of conventional fertilizers and can increase crop productivity at low cost. Plant-microbe interactions depend upon host plant-secreted signals and a reaction hereon by their associated bacteria. However, the molecular mechanisms of how beneficial bacteria respond to their associated plant-derived signals are not fully understood. Assessing the transcriptomic response of bacteria to root exudates is a powerful approach to determine the bacterial gene expression and regulation under rhizospheric conditions. Such knowledge is necessary to understand the underlying mechanisms involved in plant-microbe interactions. This paper describes a detailed protocol to study the transcriptomic response of B. mycoides EC18, a strain isolated from the potato endosphere, to potato root exudates. With the help of recent high-throughput sequencing technology, this protocol can be performed in several weeks and produce massive datasets. First, we collect the root exudates under sterile conditions, after which they are added to B. mycoides cultures. The RNA from these cultures is isolated using a phenol/chloroform method combined with a commercial kit and subjected to quality control by an automated electrophoresis instrument. After sequencing, data analysis is performed with the web-based T-REx pipeline and a group of differentially expressed genes is identified. This method is a useful tool to facilitate new discoveries on the bacterial genes involved in plant-microbe interactions.

Plant-Microbe Interaction: Transcriptional Response of Bacillus Mycoides to Potato Root Exudates

The goal of the protocol presented here is to study the transcriptomic response of endosphere-isolated Bacillus mycoides to potato root exudates. This method facilitates the identification of important bacterial genes involved in plant-microbe interactions and is in principle applicable to other endophytes and plants, with minor adjustments.

植物と微生物の相互作用: ジャガイモ根分泌物に細菌 Mycoidesの転写応答

Beneficial plant-associated bacteria play an important role in promoting growth and preventing disease in plants. The application of plant ...

High-Resolution Respirometry to Assess Bioenergetics in Cells and Tissues Using Chamber- and Plate-Based Respirometers

High-resolution respirometry (HRR) allows monitoring oxidative phosphorylation in real-time for analysis of individual cellular energy states and assessment of respiratory complexes using diversified substrate-uncoupler-inhibitor titration (SUIT) protocols. Here, the usage of two high-resolution respirometry devices is demonstrated, and a basic collection of protocols applicable for the analysis of cultured cells, skeletal and heart muscle fibers, and soft tissues such as the brain and liver are presented. Protocols for cultured cells and tissues are provided for a chamber-based respirometer and cultured cells for a microplate-based respirometer, both encompassing standard respiration protocols. For comparative purposes, CRISPR-engineered HEK293 cells deficient in mitochondrial translation causing multiple respiratory system deficiency are used with both devices to demonstrate cellular defects in respiration. Both respirometers allow for comprehensive measurement of cellular respiration with their respective technical merits and suitability dependent on the research question and model under study.

Assessing oxidative phosphorylation using high-resolution respirometers has become an integral part of the functional analysis of mitochondria and cellular energy metabolism. Here, we present protocols for the analysis of cellular energy metabolism using chamber and microplate-based high-resolution respirometers and discuss the key benefits of each device.