이 작품은 국립 과학 재단 (보너스 번호 IOS-1031416)에서 교부금에 의해 투자되었다 나단 밀러, 로건 존슨과 위스콘신 대학의 에드거 스폴딩와 브라이언 Bockelman, 칼 Lundstedt과 데이비드 스완과 공동으로 실시되었다 네브래스카의 홀랜드 컴퓨팅 센터의 대학.

1. 이미지 수집 프로토콜 고려 사항 : 하나는 혼자 작업하는 것이 가능하지만이 프로토콜은 가장 효율적으로 두 사람이 수행된다. 이 실험실에서 최고의 작업 배치는 스캐너 설정에 대한 또 다른 작품은 다음 두 스캐너에서 판을 배치하고 스캐닝 프로세스를 시작하기 위해 함께 작업하는 동안 스캔 판을 준비하는 한 사람이었다. 그것은이 프로젝트의 스캐너가 수직 스캐너 덮개가 스캐너의 뒷면에 쉬고 지향하는 것을주의하는 것도 중요합니다. 사용자 지정 지원이 수직으로 요리를 개최하기로 결정했습니다와 3M 명령 스트립과 평판의 표면 (그림 2)에 부착 하였다. 이 프로토콜 (엡손 V700)에 사용되는 스캐너와 함께 제공되는 이동할 수있는 문서 덮개는 검은 색 느낌으로 한쪽에 줄 지어 있었다. 문서 덮개는 번지 코드에와 평판에 위치했다장소에 접시를 잡고 이미지 대비 (그림 3)를 제공 할 수 있습니다. 충분한 해상도의 상관 스캐너는 이미지 캡쳐를 위해 사용될 수있다. 엡손 퍼펙션 V700 때문에, 침대와 덮개에서 모두 검사하는 적외선 채널을 사용하기 위해 정방형 (쉽게 수직 위치를 결정), 높은 해상도, 추가 옵션으로 선택되었다. 이러한 추가 옵션은이 프로토콜에 사용되지 않았다. 플레이트 성장 챔버로부터 제거되고 나면, 그것은 프로토콜 끝까지 계속하는 것이 필수적이다. 접시 준비 투명 매체의 10 ML 각 판의 중간에 걸쳐 심어 9 씨앗을 포함하는 표준 페트리 접시를 사용 하였다. : 판 라벨, 미디어 준비 및 파종 절차에서 찾을 수 있습니다 <a href="http://www.doane.edu/doane-phytomorph">http://www.doane.edu/doane-phytomorph</a> <ol><l난&gt; 첫 번째 한천 플레이트를 검색하고 킴 와이프와 한천 플레이트의 뚜껑의 뚜껑과 가장자리에 수집 된 응축을 흡수한다. </li><li> 킴 와이프와 뚜껑에 트리톤 X-100 (세제를) 적용 - 관대합니다. (트리톤 X-100이 판을 스캔으로 뚜껑에 결로의 발생을 방지 할 수 있습니다. 관대 한 응용 프로그램 (충분히 뚜껑 표면에 필름을 만들 수) 뚜껑 전체 스캐너 실행을 통하여 투명하게 유지 있는지 확인하는 데 도움이됩니다 .) </li><li> 뚜껑을 확보하기 위해 미세 테이프로 번호판을 버리고, 환기를 위해 할 수 있습니다. </li></ol> 스캐너 설치 및 이미지 모음 이 프로토콜은 1 개 이상의 스캐너가 사용되는 것으로 간주하고 하나의 컴퓨터에서 여러 개의 스캐너를 시작하는 지침을 제공합니다. <ol start="4"><li> 각 스캐너에서 이미지를 저장하는 폴더를 만듭니다. 각 스캐너는 두 접시를 개최, 그래서 폴더를 생성 할 때이 점을 염두에 보관됩니다. 한이러한 고유 한 각 플레이트 신분증, 모종의 나이, 종자 크기, 심 주식의 ID를 같은 파일 이름의 구성 요소로 메타 데이터를 사용하도록 선택할 수 있습니다. 이러한 메타 데이터를 포함하는 데이터 수집에 사용되는 폴더 이름의 예는 &quot;1652-2-SM-9-92-17-1653 -2 - LG-88-79-161&quot;이다. </li><li> 지정된 수집 시간 콘센트 타이머를 설정합니다 (9 시간이 실험에 사용되었다). 준비를 위해 여분의 시간 (시간 정도)을 설정해야합니다. VueScan은 소프트웨어가 사용자가 반복적으로 이미지를 수집 할 수 있지만 (. 스캐너는 수집 시간을 설정하기 위해 콘센트 타이머에 연결해야합니다, 사용자가 표시 할 수 없습니다 얼마나 많은 수집하는 이미지 나 방법에 대한 이미지를 수집 할 긴 .) </li><li> 첫 번째 스캐너의 전원을 켜고 초기 워밍업을 통해 갈 수있는 스캐너 약 10 초를 기다립니다. </li><li> 한 번 VueScan은 프로그램을 엽니 다. VueScan은 버전 9.0.20이 (재료 표 참조)이 프로토콜에 사용하지만 최신 버전은 작은 modific와 함께 사용할 수 있습니다ATION. &#39;기타&#39;버튼 후술 메뉴 옵션을 표시하기 위해 사용자 인터페이스의 바닥 패널에 눌러 졌는지 확인한다. </li><li> 자동 반복 설정 : 드롭 다운 상자를 없음으로 설정 미리보기 영역 입력 탭 및 자르기 탭 : 최대로 (그림 4). 을 눌러 &#39;미리보기&#39;. </li><li> 클릭하고 미리보기 이미지에 관심 영역에 걸쳐 끌어 마우스를 사용하여 관심 영역을 캡처 할 자르기 상자를 만듭니다. 설정 자르기 탭의 관심 영역에 대해 변경 될 수 있습니다. 자르기 상자에 사용되는 일반적인 설정은 : 0.675 x 오프셋, y 오프셋이 각 스캐너에 대한 모종의 영역을 캡처 조정했다지만,에 1.924을. 사용 자르기 상자의 크기는 (그림 5) 높이 1.1 폭 넓은에서 7.246이었다. </li><li> 마우스로 드래그하는 동안 자르기 상자를 이동하려면 Shift 키를 누른 상태. 자르기 상자가 모두 스캔 할 모종 플러스 라벨 (그림 5)에 포함될 수 있습니다 원하는 메타 데이터가 포함되어 있는지 확인합니다. </li><li> 자르기 탭에서 미리보기 영역을 설정 자르기 상자를 눌러 &#39;미리보기&#39;에. </li><li> 출력 탭으로 이동하여 스캐너의 올바른 파일 (그림 5)을 선택합니다. </li><li> 반복은 하나의 컴퓨터에 대한 모든 스캐너에서 1.7-1.12 단계를 반복합니다. VueScan은 하나 이상의 인스턴스를 열 것인지 묻는 메시지가 나타나면 &#39;예&#39;옵션을 선택합니다. </li><li> 각 탭을 통해 이동하여 설정이 올바른지 확인합니다. (모든 사양은 이미지의 색상, 해상도 등을 포함한 개별 실험의 목적에 맞게 변경 될 수 있습니다. 그러나이 프로토콜에서 사용되는 설정 직접 PA에 적용될 수있다rticular 인해 VueScan은 소프트웨어의 공통 인터페이스에 지정된 실험실의 하드웨어를 스캔. VueScan은 버전 9.0.20을 사용하여이 프로젝트에 사용되는 매개 변수를) 볼 수 첨부 된 사양 목록을 참조하십시오. </li><li> 입력 탭에서 자동 반복의 연속 선택 : 필드, 또는 원하는 경우 이미지 사이의 긴 시간 간격을 선택합니다. 시간 간격은 스캐너가 최종 이미지를 저장하고, 다음 화상의 수집을 시작 후에 일시 정지 시간의 길이이다. 연속 모드에서는, 3-4 분의 해상도는 4800 dpi의 해상도를 얻을 수있다. </li><li> 반복은 하나의 컴퓨터에 연결된 스캐너의 나머지 부분에 대한 1.14-1.15 단계를 반복합니다. </li><li> 가로 방향의 묘와 올바른 스캐너 (gravistimulate하지 않습니다)에서 제조 된 접시를 놓습니다. </li><li> 일시적으로 그들이 플렉시 템플릿에서 떨어지지 않도록 플레이트에 대한 배경을 느꼈다, 검은 색을 배치. 모든 검색에 대해 반복기획자. (참고 :이 프로젝트에서 느낌의 검은 색 조각이 문서가 눈부심을 방지하고 루트 조직에 대한 대비를 제공하기 위해 장비와 함께 제공되는 커버에 부착 된 사용되는 특정 배경 색상은 조직이 몇 군데의 색상에 따라 달라집니다.). </li><li> 한 사람이 (플레이트는이 프로토콜에서 반 시계 방향으로 돌린) 판을 90 ° 회전하고 즉시 펠트 배경을 교체해야합니다. </li><li> 그들이 바로 &#39;스캔&#39;버튼을 누를 수 있도록 다른 사람이 컴퓨터에 서해야합니다. </li><li> 번지 코드 (그림 3)와 스캐너에 배경을 고정합니다. 한 사람이 다른 위치 번지 동안 장소에 배경을 잡고있다. (참고 : 즉시 gravistimulation (90 ° 플레이트의 회전)와 펠트 배경 배치 한 후, &#39;스캔&#39;을 누르면해야합니다). </li><li> 반복은 하나의 comput에 스캐너의 나머지 부분에 대한 1.17-1.21 단계어. </li><li> 반복 해당하는 경우 스캐너의 다음 세트에 대해 1.6-1.22 단계를 반복합니다. </li><li> 여러 이미지가 올바르게 저장되어 있는지 확인하기 위해 수집 될 때까지 스캐너를 두지 마십시오. </li><li> 그것은 지정된 스캔 시간 동안 방해가 없어야합니다 영역에서 스캐너를 유지하는 것이 이상적이다. 그것은 이상적인 표현형 반응을 보장하기 위해 스캐닝 영역의 환경 조건을 고려하는 것이 현명하다. </li><li> 데이터 수집이 완료되면, 각 스캐너와 일치 각 VueScan은 창에있는 녹색 중단 버튼을 누릅니다. </li><li> 컴퓨터의 모든 프로그램 중 닫습니다. </li><li> 컴퓨터를 다시 시작하고 이미지 컬렉션의 또 다른 라운드를 시작하기 전에 모든 스캐너 전원을 종료합니다. </li></ol>

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저자는 더 경쟁 재정적 이익이 없다는 것을 선언합니다.

정확한 표현형의 관찰은 생체 내 유전자 기능의 발현을 이해하는데 중요하다. 표현형 정보를 획득하는 한 가지 방법은 고해상도 화상 데이터의 캡처를 통해서이다. 가 개발 한 스캐너 기반의 플랫폼은 시간의 숫자를 통해 고해상도 (4,800 dpi로)에 여러 이미지 모음 (200 이미지 / 검사 기간)를 사용할 수있다. 또한,이 플랫폼은 쉽게 인해 공통 인터페이스 (18)를 사용하여 다른 스캐너의 수천을 실행하는 VueScan은 소프트웨어의 유연성에 실험실 및 교실 환경의 다양한 구성된다. 여기에 제시된 방법은 대규모 표현형 시설과 하나의 실험실에서 구현 가능한 자동화 된 시스템에서 확장 높은 처리량의 이미지 캡처에 빈 공간을 채 웁니다. 현재 사용 가능한 높은 처리량 플랫폼 (P)의 고해상도 영상을 캡처하는 로봇 지지대에 장착 된 카메라를 포​​함한 특수화 된 이미징 하드웨어를 사용하는 경향rimarily 지상 식물 조직 (LemnaTec으로 공장 통합 기술 및 Scanalyzer HTS에 대한 예를 들어, 센터) 20, 21 위. 그들은 토양 환경 (공장 통합 기술에 대한 예를 들어, 센터) 11,22,23 성장으로 X-레이와 MRI 기술을 사용하여 전문적인 영상 시스템은 뛰어난 해상도로 지상 조직 아래 이미지로 개발되었다. 더 특수화 된 기술이 개발 동적 표현형 연구가 더욱 어려워 처리량의 비용으로 일반적이다. 중요한 것은, 이러한 하이 엔드 플랫폼을위한 비용 및 인프라 요구는 작은 실험실에서 구현하기에 대부분 실행할 수 없게합니다. 플랫폼은 또한 더 표준 촬상 기술을 사용하여도 같은 중력 자극에 대한 응답으로 루트 동적 응답의 측정에 적합한 개발되었다. 예를 들어, CCD 카메라에서의 높은 빛과 중력에 개별적인 모종 응답을 캡처하는 데 사용 된공간 및 시간 해상도 1,8,12. 다른 시스템은 하나의 이미지 (iPlant 협력하여 예 RootTipMulti) 17,24에서 여러 뿌리의 뿌리 끝 방향을 측정 할 수 있도록 개발되었다. 전자의 경우에, 처리량은 비교적 낮은 후자의 경우 처리량이 높은 상태에서, 단지 하나의 모종이 한번에 각각의 카메라에 의해 촬영되는 관련 있지만, 일반적으로 해상도의 비용으로된다. 이 문서에서 설명하는 절차는 장비와 쉽게 사용할 상대적으로 저렴하고 소프트웨어와 함께 높은 처리량의 고해상도 이미지를 캡처를위한 플랫폼을 제공합니다. 이 설정을 사용하여 1,080 개별 루트 응답은 여섯 스캐너의 은행에 장착 된 하나의 실험실에서 매주 수집 할 수 있습니다. 주당 864 개인 응답의 평균을 수집 15 개월, 41,625 모종의 총 게놈 연구를 검사 하였다. 개인 컬렉션의 약 15 %는 잘못된 설정 오류, netwo를 실패RK 고장이나 장비의 고장. 또 다른 22 % 응답은 성장 반응을 유도하기 때문에 발아 또는 불충분 한 뿌리 성장의 부족으로 실패했습니다. 최종 데이터 세트는 163 재조합 근친 라인에서 중력 자극에 27,475 개별 모종 응답 플러스 99 근처 동질 라인으로 구성되어 있습니다. 이 데이터는 매우 높은 처리량 접근법 만드는 단일 실험실에서 수집 하였다. 심지어 인수에 사용되는 장비가 심한 경우에도 사용과 2 년에 안정적으로 작용하고있다, 상대적으로 저렴한 것이 없습니다. 이 프로토콜은이 그룹의 연구 목적에 매우 유용 하였지만, 몇 가지 제한 사항이 여전히 존재한다. 때문에 하루 비 압축 화상 데이터의 50GB 정도의 처리량의 효과적 압축 방식이 개발 될 수 않는 많은 양의 공간이 집의 이미지에 필요했던 것이 명백했다. 저장 문제는 일시적으로 각 컴퓨터에 외장 하드 드라이브를 구입하여 해결 하였다. 또,이 10 TB 네트워크에 연결된 저장 장치 구입 하였다. 상술 한 바와 같이 나중에 압축 알고리즘은 최대 60 % (그림 8)에 의해 데이터의 크기를 줄일 수있는, 개발되었다. 이는 데이터 네트워크에 연결된 저장 장치에 저장 될 수있는 속도는 네트워크 연결의 속도에 의존하는 것을 주목하는 것이 중요하다. 압축 방식은 또한 인하여 화상 데이터의 손실을 방지하려는 열망에 구속되었다. 스캐너 기반의 영상 시스템에 관련된 다른 제한도 고려되고있다. 예를 들어, 스캐너 기반의 접근법에서 묘 각 스캔 동안 흰색 잠재적​​ 적외선 범위에서 높은 강도의 광에 노출된다. 모종은 여전히 (그림 7) 중력 자극에 강력한 반응을 받아야 관찰 할 수 있지만이 가능성이 모종의 성장에 영향을 미칩니다. 미래의 개선은 적외선 LED가 활성화되어 있는지 스캐너를 프로그래밍 포함 할 수 있습니다. 활성 developmen에있는 지역t 확실히 이러한 화상 데이터의 해상도 및 스루풋에 매칭 분석 알고리즘의 창조이다. 이 스캐너 기반의 방법에 의해 생성 된 큰 데이터 세트는 모종 화상 높은 처리량 표현형을위한 강력한 도구의 개발을위한 이상적인왔다. 도 7에 도시 된 이러한 이미지에 사용될 압축 알고리즘들은 이미지 분석 애플리케이션 의무임을 주장을 지원한다. 또한, 생성 된 이미지들이 더 낮은 해상도 (이하 1200 dpi로)에서 수집되는 경우, 이전에 발행 된 알고리즘 RootTrace 17,24 의해 분석 될 수 있고, 개별적인 모종은 분석 전에 상기 압축 알고리즘을 사용하여 이미지에서 분할된다. 뿌리 성장 데이터는 끝 각도 데이터가 900 dpi로 (게시되지 않은 관찰)로 감소 이미지에서 추출 할 수있는 동안 1,200 dpi로 감소 이미지에서 추출 할 수 있습니다. 이 문서에서 설명하는 절차는 타나로 오의 세계에서 자신의 틈새 시장에 맞는여전히 상대적으로 경제적이면서 높은 처리량과 높은 해상도 인 것을 t 촬상​​. 이러한 접근 방식의 추가적인 이점은 간단하게 특정 연구 그룹의 촬상 요구를 수용하도록 정의 할 수 있다는 것이다.

고해상도 표현형 데이터의 수집은 유기체의 기능 1,2를 매개로 유전자의 상호 작용과 환경을 이해하는 것을 목표로 연구에 유용하다. 이 자연의 연구는 추가로 필요한 이러한 맥락에서 표현형을 측정하기 위해 사용되는 방법은 처리량 3,4 높은 것이 제작 규모도 본질적으로 크다. phenomics 규모의 연구를위한 방법을 수립, 처리 속도 및 해상도 사이의 트레이드 오프가 따라 와요. 처리량이 높은 방법으로는 더욱 어렵게 유전학 또는 환경 5 작은 효과를 검출하도록 만드는 해상도 낮은 경향이있다. 또한, 더 신중하게 원하는 표현형을 측정하는 방법은 어려운 크게 유전과 환경에 미치는 영향을 조사하기 위해 만들어 처리량 낮은 경향이있다. 또한, 육안 검사 등의 정량화 표현형, 수동 방법으로 인해 인간의 기준의 차이에 변화의 대상이 될 수 있습니다ception 6. 이미징 기술은 표현형 관찰에게 7-9 획득 처리량과 해상도 사이의 유용한 다리를 제공 할 수 있습니다. 일반적으로, 이미지는 처리를 용이하게 포착하기가 비교적 용이하고, 충분한 해상도로 촬영하면, 미묘한 표현형은 1,2,7을 검출 할 수 있습니다. 이미징 기술이 관심의 시스템이나 프로세스에 맞게 수정하는 경향이 10-12 일반적으로 확장됩니다. 이 때문에, 이미징 기술은 유기체 함수의 대규모 연구 개발에 이상적이다. 중력 자극에 대한 기본 루트의 반응은 형태 학적으로 간단한 기관 내에서 발생하는 복잡한 생리적 과정이다. 응답은 루트 장기를 통해 전파하고 그 진행은 환경에 좌우 12-14 유전 적 요인 등의 환경 및 유전 적 요인에 의해 결정되는 신호 전달 경로의 활성화를 수반 </suP&gt;. 중력 자극에 대한 기본 루트의 반응은 다윈 이후 적어도 연구되고있다, 그러나 그것이 작동하는 방법에 대해 배울 수있는 많은 특히 초기 신호 이벤트에 응답 소성 12,14,15을 매개 요인에있다. 이 응답의 역학에 대한 자세한 이해를 얻는 것은 성공적으로 주어진 환경 (16) 내에 설치 될 수있는 모종의 능력을 향상시킬 수있는 방법을 찾는 것이 중요합니다. 또한, 루트의 형상은 의무 화상 처리 애플리케이션 8,12,17있게. 종합적 루트 gravitropic 응답 유기체 기능 유전체학 수준 연구를 수행하기위한 목적 높은 처리량 이미징 기술의 개발을위한 이상적인 시스템이다. 이 보고서에서, 저렴 시판 플랫 베드 스캐너를 사용하여 루트 gravitropic 응답의 촬상을위한 높은 처리량의, 고해상도의 방법이 제시된다. 의 개요프로토콜은도 1에 도시된다. 한천 플레이트에 심은 모종은 사용자 정의 플렉시 유리 접시 홀더가 장착되어 수직으로 지향 플랫 베드 스캐너에 위치했다. 이미지는 4,800 dpi 해상도에서 몇 분 간격으로 수집하고 로컬 드라이브 또는 데이터 서버에 저장되었다. 각각의 이미지 시리즈와 관련된 메타 데이터는 데이터베이스에 저장되고, 저장된 이미지가 처리됩니다. 접근 방식은 이미지 캡처를위한 VueScan은 소프트웨어를 사용합니다. VueScan은은 (재료 표 참조) 윈도우, Mac 또는 Linux 운영 체제에서 2,100 개 이상의 서로 다른 스캐너를 실행할 수 있습니다. 4800 dpi로의 스캐너 해상도는 고정 된 CCD 카메라를 사용 1,8,12 이전 연구에서 달성 해상도와 일치하도록 본 출원에 사용 하였다. 공통 인터페이스와 함께 VueScan은 소프트웨어의 유연성은 그것이 사용자가 쉽게 본 논문에서 제시 한 프로토콜에 충분한 해상도의 거의 모든 스캐너 하드웨어를 채택 할 수 있도록 실행하는 모든 스캐너 사용합니다. 현재 처리량의 수집을 허용하루에 216 개인 응답. 기술 대학을 조회 고등학교에 이르기까지 기관에서 사용하기위한 적응과 확장 성이다. 또한, 수집 된 이미지를 이미지 분석 애플리케이션을위한 충분한 품질의이다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="798">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Epson Perfection V700 Photo Scanners</td>
			<td>Epson</td>
			<td>B11B178011</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plexiglas Scanner Template</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Custom made. See Figure 2.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Smart Strap Bungee Cords</td>
			<td>SmartStraps</td>
			<td>Wal-Mart 1079478</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brinks Digital Outdoor Timers</td>
			<td>Brinks</td>
			<td>Wal-Mart 42-1014-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VueScan Software</td>
			<td>Hamrick Software</td>
			<td><a href="http://www.hamrick.com/">http://www.hamrick.com</a></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Segmentation Software</td>
			<td>Chris Wentworth, Doane College</td>
			<td></td>
			<td>https://sites.google.com/a/doane.edu/compphy-doane/projects/root-gravitropism/image-segmentation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3M Micropore Tape</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>19-061-655</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Holding racks</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Custom made by gluing two cookie racks together.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using flatbed scanners to collect high-resolution time-lapsed images of the arabidopsis root gravitropic response

생물학 연구 노력이 점점 고해상도 데이터의 대용량 컬렉션을 활성화 방법의 사용을 요구한다. 연구소가 직면 할 수있는 문제는 이러한 방법의 개발과 달성이다. 그 과정에서 표현형의 관찰은 유전자 기능을 연구 연구소의 일반적인 목적이며,이 종종 이미지 캡처를 통해 달성된다. 이미징 방법을 사용하여 관찰하는 의무가 특정 프로세스는 중력 벡터와 정렬에서 변위 된 모종의 루트의 시정 성장이다. 루트 gravitropic 응답을 측정하는 데 사용되는 이미징 플랫폼은 비용 처리에서 상대적으로 낮은 및 / 또는 노동 집약적 일 수있다. 이러한 문제는 저렴하면서도 고해상도, 플랫 베드 스캐너를 이용하여 높은 처리량 촬상 현상 방법에 의해 해결되었다. 이 방법을 사용하면 이미지가 4,800 dpi 해상도에서 몇 분 간격으로 캡처 할 수 있습니다. 현재 설정은 (216) 개별 연구의 수집을 가능하게하루 esponses. 수집 된 이미지 데이터는 이미지 분석 애플리케이션을위한 충분한 품질이다.

대표 이미지 이 접근법은 애기 모종 성장 고해상도 시계열의 신속한 생산을 가능하게한다. 스캐너 실행의 첫 번째와 마지막 이미지가도 7a 및도 7b에 표시됩니다. (c)와 (d)는 전체 스캐너 이미지의 절반에서 최적의 결과를 보여준다. 이미지 품질에 영향을 미칠 수있는 몇 가지 문제는도 7a 및도 7b에 나타낸다. 이러한 문제는 발아의 변화, 실행의 시작에서 성장 궤도 모종의 변화, 스캔하는 동안 응축의 형성을 포함한다. 응축 큰폭 접시 뚜껑의 안쪽에인가 트리톤 X-100의 양을 증가시킴으로써 해결 될 수있다. 정확한 이미지 수집을 억제 할 수있는 다른 요인들이 자르기 상자에 대하여 왜곡되도록 플레이트 위치 및 측위 플레이트에 대한 자르기 상자의 잘못된 구성이다. 이미지 분석 응용 프로그램 : 이미지 압축 스캐너 화상의 시간적 순서가 수득되면, 그것은 안전하게 이미지 분석을 용이하게하기 위해 네트워크 액세스 방법으로 저장되어야한다. 개별 스캐너 실행과 관련된 이미지 파일은 하드 드라이브의 상당한 공간을 차지한다. 4,800 dpi로에서 수집 된 하나의 TIFF 파일은 약 220 MB입니다 전형적인 스캐너를 실행 (200) 이미지 파일을 생성합니다. 따라서, 하드 드라이브 공간에 대한 44기가바이트는 실행마다 필요합니다. 이미지 분석과 연관된 스토리지 및 네트워크 전송 비용을 절감 할 수는 동시에 데이터 손실을 최소화하면서 이미지 데이터를 저장하는데 필요한 공간의 양을 감소시키는 것이 바람직하다. 다운 스트림 분석 실험 실행과 관련된 후속 이미지 파일의 각 모종의 식별을 포함 할 것이다. 따라서, 스캐너 화상으로부터 단일 모종을 분할하는 것은 하류의 분석을 용이하게 할 수있다. 때문에 떨어져 일의 나머지 모종의 분할전자 화상은도 크게 불필요한 배경 픽셀의 저장을 감소시킬 수 있고,이 방법은 또한 데이터 사이즈의 상당한 감소에 이르게한다. 하류 분석 뿌리 조직에 집중되는 경우 또한, 루트 픽셀들은 컬러 공간에 비교적 협소하기 때문에 색 정보를 유지하기 위해 필요하지 않을 수도있다. 컴퓨터 화상 처리 및 프로토콜 모두 개별적인 모종을 분할하고 회색조 이미지를 변환함으로써 데이터의 크기를 줄일 수있는 코드가 개발되었다. 접근법은 스토리지 공간 요구에 60 % 감소를 초래한다. 이 데이터 압축을 달성하기 위해 사용되는 흐름은 다음 단계에서 설명한다 : <ol><li> 단일 폴더에 스캐너 화상 파일의 시계열 시작. </li><li> 각각의 이미지를 들어, (그림 8, 상단) 규모를 회색으로 RGB 변환. </li><li> 좌우로 화상을 분할. </li><li> 자신의 파일 (그림 8)로 이미지에서 각 모종의 압축을 풉니 다.이것은 검은 색 또는 흰색과 각 화상 행의 전체 픽셀의 강도를 계산하는 픽셀로 변환하는 임계 값을 적용하여 수행된다. 가장 높은 강도를 가진 행을 식별하고 각 픽셀은 &#39;식물&#39;또는 이웃의 강도에 따라 &#39;nonplant&#39;로 분류됩니다. 이 행에있는 각 &#39;공장&#39;의 중심이 발견되고, 그 시점에서 소정의 크기의 자르기 상자 (그림 8, 아래)이 그려져 있습니다. </li><li> 개별 시계열 이미지 파일의 저장을 위해 각 모종에 대해 별도의 하위 폴더와 이미지 (왼쪽 및 오른쪽)의 각 측면에 대해 별도의 폴더를 만듭니다. </li><li> 압축 된 ZIP 파일로 생성 된 폴더를 보관합니다. </li></ol> 다음 단계를 수행 코드는 프로그래밍 언어 파이썬 (20)을 사용하여 개발되었다. 알고리즘은 데이터 크기의 약 60 % 감소를 허용하고 스캐너 IMAG의 90 %에서 모든 개별적인 모종을 식별하는 데 성공전자 파일은 지금까지 분석 하였다. 코드는 (재료 표 참조) GNU 일반 공중 사용 허가서 버전 3에서 다운로드 자유롭게 사용할 수 있습니다. <img alt="그림 1" fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/50878/50878fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50878/50878fig1.jpg" width="500px" /> 그림 1. 검사 절차는 씨앗 심기 (접시 당 최대 9 애기 씨)로 시작하고 데이터 저장 및 이미지 처리로 끝납니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50878/50878fig1highres.jpg" target="_blank">더 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오</a> . <img alt="그림 2" fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/50878/50878fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50878/50878fig2.jpg" width="500px" /> 페트리 접시 지원의 건설을위한 그림 2. T의 emplate. Ple는<html> xiglas는 폭 (이 경우 227mm 소재) 평판에 피트되도록 잘라 길이는 128mm이었다. 88 mm 직경의 두 동그라미들은 균등하게 지원의 폭과 길이를 따라 분포되어 있도록 남은 조각을 잘라했다. 지원은 3M 명령 스트립 평판에 부착되었다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50878/50878fig2highres.jpg" target="_blank">더 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오</a> . <img alt="그림 3" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50878/50878fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50878/50878fig3.jpg" width="500px" /> 모종 gravistimulated되어 있고 문서 덮개가 위치 그림 3. 스캐너 구성 후.이 스캐너의 설치 및 이미지 모음의 단계 1.21에서 스캐너의 구성입니다.&quot;_blank&quot;&gt; 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오. <img alt="그림 4" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50878/50878fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50878/50878fig4.jpg" width="500px" /> 스캐너 설치 및 이미지 모음의 단계 1.8 선택 설정 그림 4. 스크린 샷. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50878/50878fig4highres.jpg" target="_blank">더 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오</a> . <img alt="그림 5" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50878/50878fig5highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50878/50878fig5.jpg" width="500px" /> 파란색 상자가 FO 특정 설정을 강조하면서 그림 5. 단계 1.9 및 스캐너 설정 및 이미지 모음 1.10 동안 VueScan은 소프트웨어의 스크린 샷. 빨간색 상자 자르기 크기를 강조<html> R x-및 y 오프셋 모종 및 라벨 정보를 캡처하기 위해 사용된다. 스캔 할 수있는 평판의 영역이 미리보기 영역에 점선으로 표시됩니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50878/50878fig5highres.jpg" target="_blank">더 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오</a> . <img alt="그림 6" fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/50878/50878fig6highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50878/50878fig6.jpg" width="400px" /> 그림 6. 스캐너 설정 및 이미지 수집의 단계 1.12에 대한 대상 폴더의 선택. 다음 기본 폴더 대화 상자 (빨간색 화살표)에 @ 버튼을 누르면 사용자가 해당 대상 폴더를 선택할 수 있도록하는 것은. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50878/50878fig6highres.jpg" target="_blank">더 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오</a> . 7 다시 &quot;FO : 콘텐츠 너비 =&quot; &quot;FO : SRC =&quot;5 인치 / files/ftp_upload/50878/50878fig7highres.jpg &quot;SRC =&quot;/ files/ftp_upload/50878/50878fig7.jpg &quot;폭 =&quot;600PX &quot;/&gt; 그림 7 (AD). 위의 이미지는이 문서에서 설명하는 방법을 사용하여 수집 된 사람들의 예입니다. 패널 A, B 및 C, D는 하나의 스캔주기에서 각각 첫 번째와 마지막 이미지입니다. A, B가 보여 전체 C, D는 하나의 접시를 게재, 스캔 영역의 자른 부분 동안, 지역을 검사했습니다. 몇 가지 불일치가 관찰 할 수있다. 패널은 발아 및 성장 궤도의 변화를 보여줍니다. 패널 B (이미지와 같은 모종, 9 시간 이상) 판 결로를 축적 할 수 있음을 보여줍니다. 패널 C와 D는 강력한 성장 O로 인해 좋은 결과로 간주됩니다F 모종과 실행 전반에 걸쳐 이미지 품질. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50878/50878fig7highres.jpg" target="_blank">더 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오</a> . <img alt="그림 8" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50878/50878fig8highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50878/50878fig8.jpg" width="600px" /> 그림 8. 개발 한 영상 압축 알고리즘은 스케일 (위) 회색으로 스캐너의 이미지를 변환합니다. 이미지는 좌우 절반으로 분할되고 화상은 테두리 (도시하지 않음)이 제거된다. 각 반에 개별 모종의 위치는 가장 큰 총 픽셀 강도로 행을 찾아 식별됩니다. 그 위치는 플레이트 (바닥)의 모든 모종에 적용되는 새로운 작물의 영역을 정의하는 데 사용됩니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50878/50878fig8highres.jpg" target="_blank">더 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오</a> .

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Using Flatbed Scanners to Collect High-resolution Time-lapsed Images of the Arabidopsis Root Gravitropic Response

이 프로토콜은 시중에서 구입할 수있는 평판 스캐너를 사용하여 중력 자극에 응답 애기 모종의 이미지를 신속하게 수집을위한 프로세스를 설명합니다. 방법은 다운 스트림 분석 알고리즘에 대한 의무 고해상도 이미지의 저렴한 대용량 포착을 허용한다.

애기 장대 루트 Gravitropic 응답의 고해상도 시간 경과 이미지를 수집하는 평판 스캐너를 사용하여

Research efforts in biology increasingly require use of methodologies that enable high-volume collection of high-resolution data. A challenge laboratories ...

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Research

JoVE Journal

Biology

12.3K 조회수.  Doane College.  이 프로토콜은 시중에서 구입할 수있는 평판 스캐너를 사용하여 중력 자극에 응답 애기 모종의 이미지를 신속하게 수집을위한 프로세스를 설명합니다. 방법은 다운 스트림 분석 알고리즘에 대한 의무 고해상도 이미지의 저렴한 대용량 포착을 허용한다. 

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Using the optokinetic response to study visual function of zebrafish

Optokinetic response (OKR) is a behavior that an animal vibrates its eyes to follow a rotating grating around it. It has been widely used to assess the visual functions of larval zebrafish1-5. Nevertheless, the standard protocol for larval fish is not yet readily applicable in adult zabrafish. Here, we introduce how to measure the OKR of adult zebrafish with our simple custom-built apparatus using a new protocol which is established in our lab. Both our apparatus and step-by-step procedure of OKR in adult zebrafish are illustrated in this video. In addition, the measurements of the larval OKR, as well as the optomotor response (OMR) test of adult zebrafish, are also demonstrated in this video. This OKR assay of adult zebrafish in our experiment may last for up to 4 hours. Such OKR test applied in adult fish will benefit to visual function investigation more efficiently when the adult fish vision system is manipulated.
Su-Qi Zou and Wu Yin contributed equally to this paper.

Optokinetic response has been widely used to assess the visual functions of larval zebrafish. Nevertheless, the standard protocol for larval fish is not yet readily applicable in adults1-5. Here, we introduce how to measure the OKR of adult zebrafish using a new protocol which is established in our lab.

zebrafish의 시각 기능을 연구하기 위해 optokinetic 응답을 사용하여

Optokinetic response (OKR) is a behavior that an animal vibrates its eyes to follow a rotating grating around it. It has been widely used to assess the ...

연구

생물학

Quantification of &gamma;H2AX Foci in Response to Ionising Radiation

DNA double-strand breaks (DSBs), which are induced by either endogenous metabolic processes or by exogenous sources, are one of the most critical DNA lesions with respect to survival and preservation of genomic integrity. An early response to the induction of DSBs is phosphorylation of the H2A histone variant, H2AX, at the serine-139 residue, in the highly conserved C-terminal SQEY motif, forming &gamma;H2AX1. Following induction of DSBs, H2AX is rapidly phosphorylated by the phosphatidyl-inosito 3-kinase (PIKK) family of proteins, ataxia telangiectasia mutated (ATM), DNA-protein kinase catalytic subunit and ATM and RAD3-related (ATR)2. Typically, only a few base-pairs (bp) are implicated in a DSB, however, there is significant signal amplification, given the importance of chromatin modifications in DNA damage signalling and repair. Phosphorylation of H2AX mediated predominantly by ATM spreads to adjacent areas of chromatin, affecting approximately 0.03% of total cellular H2AX per DSB2,3. This corresponds to phosphorylation of approximately 2000 H2AX molecules spanning ~2 Mbp regions of chromatin surrounding the site of the DSB and results in the formation of discrete &gamma;H2AX foci which can be easily visualized and quantitated by immunofluorescence microscopy2. The loss of &gamma;H2AX at DSB reflects repair, however, there is some controversy as to what defines complete repair of DSBs; it has been proposed that rejoining of both strands of DNA is adequate however, it has also been suggested that re-instatement of the original chromatin state of compaction is necessary4-8. The disappearence of &gamma;H2AX involves at least in part, dephosphorylation by phosphatases, phosphatase 2A and phosphatase 4C5,6. Further, removal of &gamma;H2AX by redistribution involving histone exchange with H2A.Z has been implicated7,8. Importantly, the quantitative analysis of &gamma;H2AX foci has led to a wide range of applications in medical and nuclear research. Here, we demonstrate the most commonly used immunofluorescence method for evaluation of initial DNA damage by detection and quantitation of &gamma;H2AX foci in &gamma;-irradiated adherent human keratinocytes9.

Quantification of &amp;#947;H2AX Foci in Response to Ionising Radiation

Quantification of DNA double-strand streaks using &gamma;H2AX formation as a molecular marker has become an invaluable tool in radiation biology. Here we demonstrate the use of an immunofluorescence assay for quantification of &gamma;H2AX foci after exposure of cells to radiation.

Ionising 방사선에 대한 응답으로 γH2AX Foci의 부량

DNA double-strand breaks (DSBs), which are induced by either endogenous metabolic processes or by exogenous sources, are one of the most critical DNA ...

Long-term, High-resolution Confocal Time Lapse Imaging of Arabidopsis Cotyledon Epidermis during Germination

Imaging in vivo dynamics of cellular behavior throughout a developmental sequence can be a powerful technique for understanding the mechanics of tissue patterning. During animal development, key cell proliferation and patterning events occur very quickly. For instance, in Caenorhabditis elegans all cell divisions required for the larval body plan are completed within six hours after fertilization, with seven mitotic cycles1; the sixteen or more mitoses of Drosophila embryogenesis occur in less than 24 hr2. In contrast, cell divisions during plant development are slow, typically on the order of a day 3,4,5 . This imposes a unique challenge and a need for long-term live imaging for documenting dynamic behaviors of cell division and differentiation events during plant organogenesis. Arabidopsis epidermis is an excellent model system for investigating signaling, cell fate, and development in plants. In the cotyledon, this tissue consists of air- and water-resistant pavement cells interspersed with evenly distributed stomata, valves that open and close to control gas exchange and water loss. Proper spacing of these stomata is critical to their function, and their development follows a sequence of asymmetric division and cell differentiation steps to produce the organized epidermis (Fig. 1).
This protocol allows observation of cells and proteins in the epidermis over several days of development. This time frame enables precise documentation of stem-cell divisions and differentiation of epidermal cells, including stomata and epidermal pavement cells. Fluorescent proteins can be fused to proteins of interest to assess their dynamics during cell division and differentiation processes. This technique allows us to understand the localization of a novel protein, POLAR6, during the proliferation stage of stomatal-lineage cells in the Arabidopsis cotyledon epidermis, where it is expressed in cells preceding asymmetric division events and moves to a characteristic area of the cell cortex shortly before division occurs. Images can be registered and streamlined video easily produced using public domain software to visualize dynamic protein localization and cell types as they change over time.

Long-term, High-resolution Confocal Time Lapse Imaging of Arabidopsis Cotyledon Epidermis during Germination

We describe a protocol using chamber slides and media to immobilize plant cotyledons for confocal imaging of the epidermis over several days of development, documenting stomatal differentiation. Fluorophore-tagged proteins can be tracked dynamically by expression and subcellular localization, increasing understanding of their possible roles during cell division and cell-type differentiation.

의 장기, 고해상도 공 촛점 시간 경과 영상<em&gt; Arabidopsis 떡잎</em발아시&gt; 표피

Imaging in vivo dynamics of cellular behavior throughout a developmental sequence can be a powerful technique for understanding the mechanics of tissue ...

Using High Resolution Computed Tomography to Visualize the Three Dimensional Structure and Function of Plant Vasculature

High resolution x-ray computed tomography (HRCT) is a non-destructive diagnostic imaging technique with sub-micron resolution capability that is now being used to evaluate the structure and function of plant xylem network in three dimensions (3D) (e.g. Brodersen et al. 2010; 2011; 2012a,b). HRCT imaging is based on the same principles as medical CT systems, but a high intensity synchrotron x-ray source results in higher spatial resolution and decreased image acquisition time. Here, we demonstrate in detail how synchrotron-based HRCT (performed at the Advanced Light Source-LBNL Berkeley, CA, USA) in combination with Avizo software (VSG Inc., Burlington, MA, USA) is being used to explore plant xylem in excised tissue and living plants. This new imaging tool allows users to move beyond traditional static, 2D light or electron micrographs and study samples using virtual serial sections in any plane. An infinite number of slices in any orientation can be made on the same sample, a feature that is physically impossible using traditional microscopy methods.
Results demonstrate that HRCT can be applied to both herbaceous and woody plant species, and a range of plant organs (i.e. leaves, petioles, stems, trunks, roots). Figures presented here help demonstrate both a range of representative plant vascular anatomy and the type of detail extracted from HRCT datasets, including scans for coast redwood (Sequoia sempervirens), walnut (Juglans spp.), oak (Quercus spp.), and maple (Acer spp.) tree saplings to sunflowers (Helianthus annuus), grapevines (Vitis spp.), and ferns (Pteridium aquilinum and Woodwardia fimbriata). Excised and dried samples from woody species are easiest to scan and typically yield the best images. However, recent improvements (i.e. more rapid scans and sample stabilization) have made it possible to use this visualization technique on green tissues (e.g. petioles) and in living plants. On occasion some shrinkage of hydrated green plant tissues will cause images to blur and methods to avoid these issues are described. These recent advances with HRCT provide promising new insights into plant vascular function.

High resolution x-ray computed tomography (HRCT) is a non-destructive diagnostic imaging technique that can be used to study the structure and function of plant vasculature in 3D. We demonstrate how HRCT facilitates exploration of xylem networks across a wide range of plant tissues and species.

공장 Vasculature의 3 차원 구조 및 기능을 시각화하기 위해 높은 해상도로 계산 된 단층 촬영을 사용하여

High resolution x-ray computed tomography (HRCT) is a non-destructive diagnostic imaging technique with sub-micron resolution capability that is now being ...

Lateral Root Inducible System in Arabidopsis and Maize

Lateral root development contributes significantly to the root system, and hence is crucial for plant growth. The study of lateral root initiation is however tedious, because it occurs only in a few cells inside the root and in an unpredictable manner. To circumvent this problem, a Lateral Root Inducible System (LRIS) has been developed. By treating seedlings consecutively with an auxin transport inhibitor and a synthetic auxin, highly controlled lateral root initiation occurs synchronously in the primary root, allowing abundant sampling of a desired developmental stage. The LRIS has first been developed for Arabidopsis thaliana, but can be applied to other plants as well. Accordingly, it has been adapted for use in maize (Zea mays). A detailed overview of the different steps of the LRIS in both plants is given. The combination of this system with comparative transcriptomics made it possible to identify functional homologs of Arabidopsis lateral root initiation genes in other species as illustrated here for the CYCLIN B1;1 (CYCB1;1) cell cycle gene in maize. Finally, the principles that need to be taken into account when an LRIS is developed for other plant species are discussed.

Lateral Root Inducible System in Arabidopsis and Maize

The Lateral Root Inducible System (LRIS) allows for synchronous induction of lateral roots and is presented for Arabidopsis thaliana and maize.

의 측면 루트 유도 성 시스템<em&gt; 애기 장대</em&gt;과 옥수수

Lateral root development contributes significantly to the root system, and hence is crucial for plant growth. The study of lateral root initiation is ...

High Resolution Quantification of Crystalline Cellulose Accumulation in Arabidopsis Roots to Monitor Tissue-specific Cell Wall Modifications

Plant cells are surrounded by a cell wall, the composition of which determines their final size and shape. The cell wall is composed of a complex matrix containing polysaccharides that include cellulose microfibrils that form both crystalline structures and cellulose chains of amorphous organization. The orientation of the cellulose fibers and their concentrations dictate the mechanical properties of the cell. Several methods are used to determine the levels of crystalline cellulose, each bringing both advantages and limitations. Some can distinguish the proportion of crystalline regions within the total cellulose. However, they are limited to whole-organ analyses that are deficient in spatiotemporal information. Others relying on live imaging, are limited by the use of imprecise dyes. Here, we report a sensitive polarized light-based system for specific quantification of relative light retardance, representing crystalline cellulose accumulation in cross sections of Arabidopsis thaliana roots. In this method, the cellular resolution and anatomical data are maintained, enabling direct comparisons between the different tissues composing the growing root. This approach opens a new analytical dimension, shedding light on the link between cell wall composition, cellular behavior and whole-organ growth.

High Resolution Quantification of Crystalline Cellulose Accumulation in Arabidopsis Roots to Monitor Tissue-specific Cell Wall Modifications

Crystalline cellulose is an important constituent of the plant cell wall. However, its quantification at a cellular resolution is technically challenging. Here, we report the use of polarized light technology and root cross sections to obtain information of cell wall composition at a spatiotemporal resolution.

에서 결정 셀룰로오스 축적의 높은 해상도 정량<em&gt; 애기 장대</em&gt; 뿌리 조직 특이 세포 벽 수정을 모니터링하는

Plant cells are surrounded by a cell wall, the composition of which determines their final size and shape. The cell wall is composed of a complex matrix ...

A High Resolution Method to Monitor Phosphorylation-dependent Activation of IRF3

The IRF3 transcription factor is critical for the first line of defense against pathogens mainly through interferon &#946; and antiviral gene expression. A detailed analysis of IRF3 activation is essential to understand how pathogens induce or evade the innate antiviral response. Distinct activated forms of IRF3 can be distinguished based on their phosphorylation and monomer vs dimer status. In vivo discrimination between the different activated species of IRF3 can be achieved through the separation of IRF3 phosphorylated forms based on their mobility shifts on SDS-PAGE. Additionally, the levels of IRF3 monomer and dimer can be monitored using non-denaturing electrophoresis. Here, we detail a procedure to reach the highest resolution to gain the most information regarding IRF3 activation status. This is achieved through the combination of a high resolution SDS-PAGE and a native-PAGE coupled to immunoblots using multiple total and phosphospecific antibodies. This experimental strategy constitutes an affordable and sensitive approach to acquire all the necessary information for a complete analysis of the phosphorylation-mediated activation of IRF3.

Here we describe a procedure allowing a detailed analysis of the phosphorylation-dependent activation of the IRF3 transcription factor. This is achieved through the combination of a high resolution SDS-PAGE and a native-PAGE coupled to immunoblots using multiple phosphospecific antibodies.

고해상도 방법 IRF3의 인산화에 의존 활성화를 모니터링하려면

The IRF3 transcription factor is critical for the first line of defense against pathogens mainly through interferon &#946; and antiviral gene expression. ...

High-resolution Optical Mapping of the Mouse Sino-atrial Node

Sino-atrial node (SAN) dysfunctions and associated complications constitute important causes of morbidity in patients with cardiac diseases. The development of novel pharmacological therapies to cure these patients relies on the thorough understanding of both normal physiology and pathophysiology of the SAN. Among the studies of cardiac pacemaking, the mouse SAN is widely used due to its feasibility for modifications in the expression of different genes that encode SAN ion channels or calcium handling proteins. Emerging evidence from electrophysiological and histological studies has also proved the representativeness and similarity of the mouse SAN structure and functions to larger mammals, including the presence of specialized conduction pathways from the SAN to the atrium and a complex pacemakers' hierarchy within the SAN. Recently, the technique of optical mapping has greatly facilitated the exploration and investigation of the origin of excitation and conduction within and from the mouse SAN, which in turn has extended the understanding of the SAN and benefited clinical treatments of SAN dysfunction associated diseases. In this manuscript, we have described in detail how to perform the optical mapping of the mouse SAN from the intact, Langendorff-perfused heart and from the isolated atrial preparation. This protocol is a useful tool to enhance the understanding of mouse SAN physiology and pathophysiology.

Here, we present a protocol for optical mapping of electrical activity from the mouse right atrium and especially the sino-atrial node, at a high spatial and temporal resolution.

마우스 중국 - 심방 노드의 고해상도 광학 매핑

Sino-atrial node (SAN) dysfunctions and associated complications constitute important causes of morbidity in patients with cardiac diseases. The ...

Standardized Method for High-throughput Sterilization of Arabidopsis Seeds

Arabidopsis thaliana (Arabidopsis) seedlings often need to be grown on sterile media. This requires prior seed sterilization to prevent the growth of microbial contaminants present on the seed surface. Currently, Arabidopsis seeds are sterilized using two distinct sterilization techniques in conditions that differ slightly between labs and have not been standardized, often resulting in only partially effective sterilization or in excessive seed mortality. Most of these methods are also not easily scalable to a large number of seed lines of diverse genotypes. As technologies for high-throughput analysis of Arabidopsis continue to proliferate, standardized techniques for sterilizing large numbers of seeds of different genotypes are becoming essential for conducting these types of experiments. The response of a number of Arabidopsis lines to two different sterilization techniques was evaluated based on seed germination rate and the level of seed contamination with microbes and other pathogens. The treatments included different concentrations of sterilizing agents and times of exposure, combined to determine optimal conditions for Arabidopsis seed sterilization. Optimized protocols have been developed for two different sterilization methods: bleach (liquid-phase) and chlorine (Cl2) gas (vapor-phase), both resulting in high seed germination rates and minimal microbial contamination. The utility of these protocols was illustrated through the testing of both wild type and mutant seeds with a range of germination potentials. Our results show that seeds can be effectively sterilized using either method without excessive seed mortality, although detrimental effects of sterilization were observed for seeds with lower than optimal germination potential. In addition, an equation was developed to enable researchers to apply the standardized chlorine gas sterilization conditions to airtight containers of different sizes. The protocols described here allow easy, efficient, and inexpensive seed sterilization for a large number of Arabidopsis lines.

The objective of this study was to determine the effects of bleach and chlorine gas sterilization on seed germination of a range of Arabidopsis genotypes grown on sterile media. Optimized sterilization protocols have been developed to prevent the growth of microbial contaminants while providing satisfactory seed survival.

애기 씨의 높은 처리 살 균에 대 한 표준화 된 방법

Arabidopsis thaliana (Arabidopsis) seedlings often need to be grown on sterile media. This requires prior seed sterilization to prevent the growth of ...

Plant-Microbe Interaction: Transcriptional Response of Bacillus Mycoides to Potato Root Exudates

Beneficial plant-associated bacteria play an important role in promoting growth and preventing disease in plants. The application of plant growth-promoting rhizobacteria (PGPR) as biofertilizers or biocontrol agents has become an effective alternative to the use of conventional fertilizers and can increase crop productivity at low cost. Plant-microbe interactions depend upon host plant-secreted signals and a reaction hereon by their associated bacteria. However, the molecular mechanisms of how beneficial bacteria respond to their associated plant-derived signals are not fully understood. Assessing the transcriptomic response of bacteria to root exudates is a powerful approach to determine the bacterial gene expression and regulation under rhizospheric conditions. Such knowledge is necessary to understand the underlying mechanisms involved in plant-microbe interactions. This paper describes a detailed protocol to study the transcriptomic response of B. mycoides EC18, a strain isolated from the potato endosphere, to potato root exudates. With the help of recent high-throughput sequencing technology, this protocol can be performed in several weeks and produce massive datasets. First, we collect the root exudates under sterile conditions, after which they are added to B. mycoides cultures. The RNA from these cultures is isolated using a phenol/chloroform method combined with a commercial kit and subjected to quality control by an automated electrophoresis instrument. After sequencing, data analysis is performed with the web-based T-REx pipeline and a group of differentially expressed genes is identified. This method is a useful tool to facilitate new discoveries on the bacterial genes involved in plant-microbe interactions.

Plant-Microbe Interaction: Transcriptional Response of Bacillus Mycoides to Potato Root Exudates

The goal of the protocol presented here is to study the transcriptomic response of endosphere-isolated Bacillus mycoides to potato root exudates. This method facilitates the identification of important bacterial genes involved in plant-microbe interactions and is in principle applicable to other endophytes and plants, with minor adjustments.