私たちは、統計分析のヘルプについては、優れた技術支援のために-80ハンマーとS. PapiolをN. Schwedhelm-Domeyerに感謝します。私たちの仕事は、ドイツ学術振興、ナノスケール顕微鏡のためのセンター、脳の分子生理学（CNMPB）、ゲッティンゲン、ドイツ、ゲッティンゲン大学のGGNBジュニアグループ奨学金により、マックス·プランク協会によって資金を供給される。

CGNをいずれか生後（P）5仔マウスまたはP6仔ラットから調製することができる。私たちは、有糸分裂後CGNを13を選択するために、有糸分裂阻害剤を使用していますBilimoriaらによって記述されたプロトコルを、従ってください。 倫理声明： 生きた動物を含むすべての実験は、ニーダーザクセン州、ドイツの「VerbraucherschutzウントLebensmittelsicherheit」で承認された動物プロトコルに従って行われてきた。 インビトロアッセイ： 1。リン酸カルシウムトランスフェクション法のためのDNAプラスミド、メディア、およびバッファの準備<ol><li>無菌、エンドトキシンを含まない水にプラスミドDNAを溶解させ、DMEM（高グルコース）; 2.5Mの塩化カルシウムを加える 。2X HBSSが（4グラムのNaCl、0.1775グラムのKCl、0.095グラム2 HPO 4•7H 2 O、0.675グラムのブドウ糖のNaを溶解させるそして250ミリリットル超純水に2.5グラムのHEPESおよび7.05、7.08、および7.11）にpHを調整する。注：準備するとき2X HBSS溶液、pHはプラスミドの特定の組み合わせのトランスフェクション効率についての最良の結果が得られ、テスト。 </li></ol> 2。培養神経細胞のトランスフェクション<img alt="図1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51070/51070fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51070/51070fig1.jpg" /> 図1。 in vitroでの軸索と樹状突起の成長アッセイのフローチャート。培養CGNを（ガラス製カバースリップした24ウェルプレート）、P6の仔ラットから単離され、（ 例えば 、GFP）の蛍光トランスフェクションマーカーを含むDNA沈殿物DIV 0または1でトランスフェクトされる。固定および免疫細胞化学の後、ニューロンは、盲検法で画像化されています。画像はImageJのにインポートされ、プロセスが測定される。測定値は、次に統計プログラムを用いて処理される。 <ol><li>シードCGNを（24ウェルプレートあたり20×10 6、BME、10％ウシ血清、2mMのペニシリン-Streptomycin-グルタミン（PSG）、25のKCl）メディア500μlで24ウェルプレート中の硝酸洗浄、ポリオルニチンでコーティングされた12ミリメートルのガラス製カバースリップ上、ウェルあたり。 </li><li> in vitroでの一日（DIV）0（めっき後少なくとも8時間）またはDIV 1に、増殖培地を収集し、37℃で維持あらかじめ温めておいたDMEM500μlで二回ニューロンを洗浄し、DMEM500μlのを追加します。 </li><li>インキュベーターに置きニューロン（37℃、5％CO 2）で45分間。 </li><li>混合することにより、各ウェル40μlのDNA沈殿物を準備したDNAを（2-2.5μgの/ウェル、全DNAの10％がトランスフェクトニューロンを可視化するトランスフェクションマーカー、例えば GFPであるべき）、（18μLまで）水、2μlのを追加2.5MのCaCl 2を 、よく混ぜると2XのHBSS 20μlを加える。 <ol><li> RTで5分間、DNA沈殿物をインキュベートする。 </li></ol></li><li>各ウェルにDNA沈殿物を追加し、インキュベーター内で18分間神経細胞を培養する。 </li><li> DMEM / DNA混合物を削除し、あらかじめ温めておいたDM500μlで二回ニューロンを洗うEM。 </li><li>ニューロンに戻ってステップ2.2から収集されたメディアを追加します。ニューロンは、炭素源を補充するDIV 3において、3日以上培養で25 mMグルコースで補足培地になる場合。 </li><li> 1-5日後、免疫細胞化学を受けるニューロンは、GFP抗体を用いた。 </li><li>画像、蛍光顕微鏡を用いて盲検法での条件ごとに少なくとも30個々のニューロン。 </li></ol> 3。 NeuronJと軸索と樹状突起を測定し、NIH ImageJのプラグイン重要：以下の比率が拡大し、画像の解像度に応じて、次の画像が適切なピクセルを使用してcorrectluyスケールされていることを確認します。 <ol><li> ImageJの8ビットに画像を変換：オープン画像は、「画像」を選択 - &gt; &#39;タイプ&#39; - &gt; &#39;8ビット &#39; - &gt;「保存」のイメージを。 </li><li> NeuronJプラグインを実行して、8ビットの画像を開きます。 <img alt="スクリーンショット" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51070/screenshot1.jpg" width="500px" /></li><li> CL：軸索を追跡するために、「追加の追跡」オプションを使用します軸索の冒頭で一度、マウスの左ボタンをICKし、プロセスに沿ってマウスを移動します。トレースが軸索形状と一致した場合、二重軸索の先端をクリックしてください。 <img alt="スクリーンショット" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51070/screenshot2.jpg" width="500px" /> 注：提案しトレースする必要が軸索の先端をダブルクリックして、軸索形状と異なる、トレースを固定する軸索のプロセスを一度クリックしてください。 </li><li>オプションキーを押し「ファイル名を指定して実行」「測定のトレースの表示」を選択し、「測定トレーシング」をクリックします。軸索の測定は、すべての新しいウィンドウに表示されます。樹状突起の場合は、「表示グループの測定オプション」を押して「ファイル名を指定して実行」を選択します。 <img alt="スクリーンショット" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51070/screenshot3.jpg" width="500px" /> 総デンドライト測定は、すべての新規ウィンドウに表示されます。任意のスプレッドシートプログラムで開くことができ、別のファイルとして保存。 </li><li>別の方法として、マニュアルトレースに、フィジーのソフトウェアを使用：右番目をクリックしてくださいE &#39;直線&#39;オプション、 &#39;フリーハンドライン」を選択し、 <img alt="スクリーンショット" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51070/screenshot4.jpg" width="500px" /> マウスの左ボタンを押した維持し、手動プロセスをトレース押し「Ctrlキー+ M &#39;は測定すること。 </li><li>条件ごとの平均軸索/樹状突起の長さを計算し、適切な統計的検定を使用しています。 生体内エレクトロポレーションの場合 ： </li></ol> 1。機器や試薬の調製<ol><li>あなたが30のG針、スペーサー（1-2 mm）で、注射器、デッドボリューム減速（DVR）、エレクトロ、そしてtweezertrodes、加熱パッドや赤外線加熱ランプ、グースネックランプおよびイソフルランを必要としています。 </li><li>針へのDVRを入れ、シリンジ針を取り付け、最終的には（ 図2）針の上にスペーサーを入れた。 <img alt="図2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51070/51070fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51070/51070fig2.jpg" /> 図2。針の調製。DVR 200μlのピペットチップを切断し、デッドボリュームを低減するために針内に配置されている。スペーサーは、200μlのローディング先端から導出され、約2mmの小脳への浸透の深さを調節するために、針の端部に配置されている。ルーラーの単位：センチ</li><li> PBS/0.03％ファストグリーンでDNAを溶解する。注：トランスフェクションマーカーとしては、ニューロンのみを可視化するために、ニューロン特異的プロモーター（ 例えば、シナプシン）下で蛍光タンパク質を使用することが有利で ​​ある。総プラスミド量の25％は、トランスフェクションマーカーをコードするプラスミドである必要があります。 </li><li> 70％エタノールを加えます。 </li><li>同等のOCTボリュームおよびPBSに溶解し、30％スクロースを混合する。 </li><li> DNA（PBS/0.03％ファストグリーンでのプラスミドDNA4μgの/μL）の4μlで注射器を埋める。 </li></ol> 2。ラット仔のIVE IVEのフローチャート。図3を参照してください。 <p class="jove_content" fo:keep-together.withinページ= &quot;常に&quot;&gt; <img alt="図3" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51070/51070fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51070/51070fig3.jpg" /> 図3。 インビボでのエレクトロポレーションのフローチャート。P4仔ラット（ 例えば GFP）蛍光トランスフェクションマーカーをコードするプラスミドDNAおよびイソフルランで麻酔し、5電気パルスへの暴露に続いて、小脳に注入される。 5日後、単離されたGFP陽性小脳を切断し、免疫組織化学に供される。画像は、共焦点顕微鏡を用いて捕捉し、IMARISソフトウェアを用いて分析される。データは統計プログラムで処理される。 <ol><li>アルビノ株（Wistar系またはロング·エヴァンス）からP4仔ラットを使用してください。 </li><li>子犬は、もはや移動するまで、1〜2分間（組織に浸し）イソフルラン200μlの小箱（ 例えば P1000ピペットチップボックス）内のイソフルランで子犬（続）麻酔ません。子犬ワット接触し得ることはありませんように注意してくださいIiquidイソフルラン番目。個々の仔が麻酔に対して異なる反応として近い時間を監視します。 </li><li> 70％エタノールでバック子犬の頭の殺菌。 </li><li>親指と人​​差し指の間で子犬の頭を固定し、アルビノ子犬の小脳を見つけるためにグースネックランプを使用しています。横洞が急激皮質半球から中脳（スーペリア、下丘）（ 図3）を画定する。小脳は、脳に隣接して位置しており、暗い影に表示されます。ドットで小脳を示すために、油性マジックを使用しています。重要：固定された位置に子犬をしてください！注：麻酔は、この手順の間、オフ着用しなければならない、前にDNAを注入するイソフルランに子犬を公開します。 </li><li>針（ 図3）を挿入し、ゆっくりと小脳へのDNAの3μLを注入。 </li><li> DNA溶液を30〜60秒間拡散してみましょう。 <ol><li>マイナス極が後頭部（小脳と接触するようにtweezertrodes間の子犬の頭を置くR領域）とします（ 図3）ヘッドの反対側のプラス極に接触すること。 </li><li> 5電気パルスを受ける子犬。彼らの生存率（ 表1）を損なうことなく、良好なエレクトロポレーションの効率を確保するために、仔の体重に電圧を調整します。 <table border="0"><tbody><tr><td>重さ</td><td>電圧</td><td>パルス</td><td>インターバル</td></tr><tr><td> 8〜9グラム</td><td> 160 V </td><td> 50ミリ秒</td><td> 950ミリ秒</td></tr><tr><td> 9〜10グラム</td><td> 165 V </td><td> 50ミリ秒</td><td> 950ミリ秒</td></tr><tr><td> &gt; 10グラム</td><td> 170 V </td><td> 50ミリ秒</td><td> 950ミリ秒</td></tr></tbody></table> 表1。 P4の仔ラットのエレクトロポレーション。 </li><li>子犬が加熱パッドの上に、赤外線ランプ下に回復しましょう​​。ダムへ子犬を返します。重要：加熱源は、任意の火傷を負わないようにしてください。 </li></ol></li><li>断頭続いCO 2に配置することにより、5日間エレクトロポレーション後の仔を生け贄に捧げる。 <ol><li>蛍光顕微鏡を用いた小脳GFP陽性もののため小脳し、画面を隔離する。 </li></ol></li><li>その後、小脳シンクまで、チューブの底に4℃で、30％スクロース中でインキュベート、4℃で4％PFA O / Nで小脳を修正します。 </li><li> OCT/30％ショ糖で小脳を埋め込み、クライオスタットを用いて、40μmの冠状切片を切る。注：盲検的にセクションごとに小脳を。 </li><li>テーマのセクションでは、GFP抗体を用いた免疫組織化学する。核色素（DAPIまたはヘキスト33258）と対比し、動物あたり少なくとも200トランスフェクションしたニューロンの局在を決定する。 </li><li>詳細な分析のために、MLおよび白質対向する下部IGLを対向する上部IGLで、その結果、半分にIGLを細分化し、各半分に存在するGFP陽性ニューロンをカウントします。注：盲検的に各セクションのGFP陽性ニューロンをカウントします。 </lI&gt; </ol> 3。デンドライトの長さを測定し、共焦点顕微鏡を使用して、X、Y、Z平面内のセクションの画像を取り込む注：例えば1μmのz stwpと40μmのセクション40の画像を使用しています。 <ol><li>ソフトウェアで開く画像シリーズ、IMARIS、樹状突起の3次元画像を生成する。 </li><li> 3Dでニューロンを表示するには、「サーパス」モードをクリックします。 <img alt="スクリーンショット" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51070/screenshot5.jpg" width="500px" /></li><li> &#39;新しいフィラメントを追加」を選択し、半自動トレースを開始するには「自動作成をスキップする」をクリックします。 <img alt="スクリーンショット" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51070/screenshot6.jpg" width="500px" /> 注：盲検様式で各3D画像を分析</li><li> 「ドロー」タブと「てAutoPath」を選択します。 <img alt="スクリーンショット" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51070/screenshot7.jpg" width="500px" /></li><li> Cの上にマウスカーソルを移動するエルの体およびShift +マウスの右のセル本体をクリックして選択します。注：ソフトウェアによる自動計算には数分が必要な場合があります。 <img alt="スクリーンショット" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51070/screenshot8.jpg" width="500px" /></li><li> Shiftキー+マウス左クリックを使用してフィラメント（デンドライト）にパスを追加。注：パスを、即座に可視化することができる。 <img alt="スクリーンショット" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51070/screenshot9.jpg" width="500px" /></li><li>フィラメント統計ウィンドウに移動し、「詳細」、「特定の値」と総樹状突起の長さの合計のための「フィラメントデンドライトの長さ（合計）」をクリックしてください。 <img alt="スクリーンショット" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51070/screenshot10.jpg" width="500px" /></li><li>データを分析するための適切な統計的検定を使用してください。 </li></ol>

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	<li>Cajal, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Histology of the nervous system of man and vertebrates. , (1995).</li><li>Altman, J., Bayer, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Development of the cerebellar system : in relation to its evolution, structure, and functions. , (1997).</li><li>White, J. J., Reeber, S. L., Hawkes, R., Sillitoe, R. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wholemount+immunohistochemistry+for+revealing+complex+brain+topography.">Wholemount immunohistochemistry for revealing complex brain topography.</a> J. Vis. Exp. , (2012).</li><li>Palay, S. L., Chan-Palay, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Cerebellar cortex: cytology and organization. , (1974).</li><li>Hatten, M. E., Alder, J., Zimmerman, K., Heintz, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genes+involved+in+cerebellar+cell+specification+and+differentiation.">Genes involved in cerebellar cell specification and differentiation.</a> Curr. Opin. Neurobiol. 7, 40-47 (1997).</li><li>Hatten, M. E., Heintz, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+neural+patterning+and+specification+in+the+developing+cerebellum.">Mechanisms of neural patterning and specification in the developing cerebellum.</a> Annu. Rev. Neurosci. 18, 385-408 (1995).</li><li>Sillitoe, R. V., Joyner, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphology+molecular+codes,+and+circuitry+produce+the+three-dimensional+complexity+of+the+cerebellum.">Morphology molecular codes, and circuitry produce the three-dimensional complexity of the cerebellum.</a> Ann. Rev. Dev. Biol. 23, 549-577 (2007).</li><li>Zervas, M., Millet, S., Ahn, S., Joyner, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+behaviors+and+genetic+lineages+of+the+mesencephalon+and+rhombomere+1.">Cell behaviors and genetic lineages of the mesencephalon and rhombomere 1.</a> Neuron. 43, 345-357 (2004).</li><li>Wingate, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+rhombic+lip+and+early+cerebellar+development.">The rhombic lip and early cerebellar development.</a> Curr. Opin. Neurobiol. 11, 82-88 (2001).</li><li>Kawaji, K., Umeshima, H., Eiraku, M., Hirano, T., Kengaku, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual+phases+of+migration+of+cerebellar+granule+cells+guided+by+axonal+and+dendritic+leading+processes.">Dual phases of migration of cerebellar granule cells guided by axonal and dendritic leading processes.</a> Mol. Cell Neurosci. 25, 228-240 (2004).</li><li>Hatten, M. E., Gao, W. -. Q., Morrison, M. E., Mason, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+and+molecular+neuroscience.">Cellular and molecular neuroscience.</a> , 419-41 .</li><li>Lee, H. Y., Greene, L. A., Mason, C. A., Manzini, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+post-natal+mouse+cerebellar+granule+neuron+progenitor+cells+and+neurons.">Isolation and culture of post-natal mouse cerebellar granule neuron progenitor cells and neurons.</a> J. Vis. Exp. , (2009).</li><li>Bilimoria, P. M., Bonni, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cultures+of+cerebellar+granule+neurons.">Cultures of cerebellar granule neurons.</a> CSH Protoc. 2008, (2008).</li><li>Rivas, R. J., Hatten, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Motility+and+cytoskeletal+organization+of+migrating+cerebellar+granule+neurons.">Motility and cytoskeletal organization of migrating cerebellar granule neurons.</a> J. Neurosci. 15, 981-989 (1995).</li><li>Kuhar, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changing+patterns+of+gene+expression+define+four+stages+of+cerebellar+granule+neuron+differentiation.">Changing patterns of gene expression define four stages of cerebellar granule neuron differentiation.</a> Development. 117, 97-104 (1993).</li><li>Baird, D. H., Hatten, M. E., Mason, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cerebellar+target+neurons+provide+a+stop+signal+for+afferent+neurite+extension+in+vitro.">Cerebellar target neurons provide a stop signal for afferent neurite extension in vitro.</a> J. Neurosci. 12, 619-634 (1992).</li><li>Segal, R. A., Pomeroy, S. L., Stiles, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axonal+growth+and+fasciculation+linked+to+differential+expression+of+BDNF+and+NT3+receptors+in+developing+cerebellar+granule+cells.">Axonal growth and fasciculation linked to differential expression of BDNF and NT3 receptors in developing cerebellar granule cells.</a> J. Neurosci. 15, 4970-4981 (1995).</li><li>Gallo, V., Ciotti, M. T., Coletti, A., Aloisi, F., Levi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+release+of+glutamate+from+cerebellar+granule+cells+differentiating+in+culture.">Selective release of glutamate from cerebellar granule cells differentiating in culture.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 79, 7919-7923 (1982).</li><li>Smith, T. C., Wang, L. Y., Howe, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+kainate+receptor+phenotypes+in+immature+and+mature+mouse+cerebellar+granule+cells.">Distinct kainate receptor phenotypes in immature and mature mouse cerebellar granule cells.</a> Physiol. 517 (1), 51-58 (1999).</li><li>Konishi, Y., Stegmuller, J., Matsuda, T., Bonni, S., Bonni, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cdh1-APC+controls+axonal+growth+and+patterning+in+the+mammalian+brain).">Cdh1-APC controls axonal growth and patterning in the mammalian brain).</a> Science. 303, 1026-1030 (2004).</li><li>Stegmuller, J., Huynh, M. A., Yuan, Z., Konishi, Y., Bonni, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TGFbeta-Smad2+signaling+regulates+the+Cdh1-APC/SnoN+pathway+of+axonal+morphogenesis.">TGFbeta-Smad2 signaling regulates the Cdh1-APC/SnoN pathway of axonal morphogenesis.</a> J. Neurosci. 28, 1961-1969 (2008).</li><li>Stegmuller, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-intrinsic+regulation+of+axonal+morphogenesis+by+the+Cdh1-APC+target+SnoN.">Cell-intrinsic regulation of axonal morphogenesis by the Cdh1-APC target SnoN.</a> Neuron. 50, 389-400 (2006).</li><li>Kannan, M., Lee, S. J., Schwedhelm-Domeyer, N., Nakazawa, T., Stegmuller, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=p250GAP+is+a+novel+player+in+the+Cdh1-APC/Smurf1+pathway+of+axon+growth+regulation.">p250GAP is a novel player in the Cdh1-APC/Smurf1 pathway of axon growth regulation.</a> PLoS One. 7, (2012).</li><li>Kannan, M., Lee, S. J., Schwedhelm-Domeyer, N., Stegmuller, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+E3+ligase+Cdh1-anaphase+promoting+complex+operates+upstream+of+the+E3+ligase+Smurf1+in+the+control+of+axon+growth.">The E3 ligase Cdh1-anaphase promoting complex operates upstream of the E3 ligase Smurf1 in the control of axon growth.</a> Development. 139, 3600-3612 (2012).</li><li>Gaudilliere, B., Konishi, Y., de la Iglesia, N., Yao, G., Bonni, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CaMKII-NeuroD+Signaling+Pathway+Specifies+Dendritic+Morphogenesis.">CaMKII-NeuroD Signaling Pathway Specifies Dendritic Morphogenesis.</a> Neuron. 41, 229-241 (2004).</li><li>Yang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Cdc20-APC+ubiquitin+signaling+pathway+regulates+presynaptic+differentiation.">A Cdc20-APC ubiquitin signaling pathway regulates presynaptic differentiation.</a> Science. 326, 575-578 (2009).</li><li>Litterman, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+OBSL1-Cul7Fbxw8+ubiquitin+ligase+signaling+mechanism+regulates+Golgi+morphology+and+dendrite+patterning.">An OBSL1-Cul7Fbxw8 ubiquitin ligase signaling mechanism regulates Golgi morphology and dendrite patterning.</a> PLoS Biol. 9, (2011).</li><li>Kim, A. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+centrosomal+Cdc20-APC+pathway+controls+dendrite+morphogenesis+in+postmitotic+neurons.">A centrosomal Cdc20-APC pathway controls dendrite morphogenesis in postmitotic neurons.</a> Cell. 136, 322-336 (2009).</li><li>Shalizi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+calcium-regulated+MEF2+sumoylation+switch+controls+postsynaptic+differentiation.">A calcium-regulated MEF2 sumoylation switch controls postsynaptic differentiation.</a> Science. 311, 1012-1017 (2006).</li><li>Vadhvani, M., Schwedhelm-Domeyer, N., Mukherjee, C., Stegmuller, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Centrosomal+E3+Ubiquitin+Ligase+FBXO31-SCF+Regulates+Neuronal+Morphogenesis+and+Migration.">The Centrosomal E3 Ubiquitin Ligase FBXO31-SCF Regulates Neuronal Morphogenesis and Migration.</a> PLoS One. 8, (2013).</li><li>Puram, S. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+CaMKIIbeta+signaling+pathway+at+the+centrosome+regulates+dendrite+patterning+in+the+brain.">A CaMKIIbeta signaling pathway at the centrosome regulates dendrite patterning in the brain.</a> Nat. Neurosci. , (2011).</li><li>Jia, Y., Zhou, J., Tai, Y., Wang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TRPC+channels+promote+cerebellar+granule+neuron+survival.">TRPC channels promote cerebellar granule neuron survival.</a> Nat. Neurosci. 10, 559-567 (2007).</li><li>Huynh, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+isoform-specific+SnoN1-FOXO1+repressor+complex+controls+neuronal+morphogenesis+and+positioning+in+the+mammalian+brain.">An isoform-specific SnoN1-FOXO1 repressor complex controls neuronal morphogenesis and positioning in the mammalian brain.</a> Neuron. 69, 930-944 (2011).</li><li>de la Torre-Ubieta, L., Bonni, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+regulation+of+neuronal+polarity+and+morphogenesis+in+the+mammalian+brain.">Transcriptional regulation of neuronal polarity and morphogenesis in the mammalian brain.</a> Neuron. 72, 22-40 (2011).</li><li>Calissano, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombinant+human+insulin-like+growth+factor+I+exerts+a+trophic+action+and+confers+glutamate+sensitivity+on+glutamate-resistant+cerebellar+granule+cells.">Recombinant human insulin-like growth factor I exerts a trophic action and confers glutamate sensitivity on glutamate-resistant cerebellar granule cells.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90, 8752-8756 (1993).</li></ol>

著者らは、競合する経済的利益を宣言していません。

利点およびインビトロおよびインビボ方法に記載の制限： マウスやラットから培養CGNを、形態学的分析のために均等に適しています。ラットの小脳の大きいサイズのために、仔ラットからCNGSの収率は、仔マウス3〜4倍のそれを超えています。 CGNを脇から、皮質及び海馬ニューロンは、同様に培養系として使用することができる。リン酸カルシウム法?...

小脳は、軸索の成長と移動のメカニズムを研究するための優れたシステムです。小脳は、脳科学1の黎明期から解剖学の研究の対象となっている。現代の顕微鏡検査および免疫組織化学的技術が大幅に拡大し、サンティアゴ、ラモン、およびカハール2-4初期の発見に磨きをかけてきました。マウス遺伝学と分子の研究では、小脳顆粒ニューロン（CGNを）5-7を含むニューロンの様々なタイプの適切な配線に必要な重要なイベントのより深い理解につながった、小脳発生の制御に必須の増殖および転写因子を発見した。 小脳は、途上後脳8のrhombomere 1の誘導体である。で最も多くニューロン集団を構成する4 番目の心室の屋根の一部である菱形リップ、小脳顆粒ニューロン前駆細胞を生じさせる、大人の小脳9。吻側移行後、彼らは小脳原基に定住。ここで、顆粒ニューロン前駆体の有糸分裂は、げっ歯類において出生後に行われる外顆粒層（EGL）の劇的な拡大をもたらす。 EGLから、神経細胞は、最終的には、内部顆粒層（IGL 2）に居を取るためにプルキンエ細胞層を越えて、分子層（ML）を介して内側への移行を開始。この渡り鳥プロセスの間に、彼らは、ML内に延びる2軸索を有するバイポーラ形を獲得する。さらに、移行の際に、細胞体、軸索から離れて移動し、二つのプロセスは、一分岐した、T字型の軸索10を形成するために融合。その後、これらの軸索は束生のと平行線維と呼ばれている。 IGLに定住した、CGNをは苔状線維とシナプスを確立するために、樹枝状の爪を形成する樹状突起を、育つ。開発小脳において基本的なプロセスを検討するために、in vitroおよびin vivo approac で組み合わせるHは、信頼性の高い結果と結論することができます。 CGNを、小脳のが、脳全体の中で最も数多くの神経細胞であるだけでなく、高純度11月13日に培養することができる。文化では、この非常に均質なニューロン集団は、急速に分裂後になり、容易に識別軸索と樹状突起を有する極性形態を獲得する。培養されたCGNを、前駆増殖、分化、軸索および樹状突起の発達、神経細胞遊走、アポトーシスおよび電気生理学的特性（14-19および多くの他）を含む神経発達の様々な側面を研究することは非常に有用であることが証明されている。遺伝子操作の使用は、培養たCGNの汎用性を拡大し、前述のイベントへのさらなる機械論的な洞察を可能にした。極性マーカーまたはソフトウェアでサポートされている解析設備などで免疫細胞化学、続いて低効率リン酸カルシウムまたは親油性の方法を用いて培養されたニューロンのトランスフェクション密な神経細胞培養液中の個々のニューロンの形態学などの評価をtates。このアプローチでは、軸索または樹状突起成長中の目的のタンパク質の役割は20-25,26-28を研究することができる。移行は、高密度培養では非常に限られており、共培養を必要とするので、この培養系は、しかしながら、ニューロン移動を分析するあまり有用である。軸索と樹状突起成長のインビトロ分析も過剰発現または小分子、RNA干渉（i）の組合せを使用してシグナル伝達経路の相互接続されたタンパク質の調査を可能にする。 軸索と樹状突起の成長制御やニューロン移動における目的のタンパク質の関連性を確立するために、in vivoでのエレクトロポレーション（IVE）技術が発達小脳皮質での分析を可能にする。げっ歯類における小脳開発は最初の2週間、生後に道を拡張するという事実のために、小脳はaccessibを表し軸索と樹状突起、ニューロン移動、シナプス形成およびアポトーシス20-24,29,30,26,27,31-34の開発を検討する遺伝子操作のためのル·脳構造。また、このモデル系はまた、軸索経路探索、配線と合わせて考えると、ニューロンとニューロン-グリア相互作用の接続などそのまま小脳皮質を必要とする神経発達の他の側面に有用であり、このプロトコルは、in vitroおよびin vivo技術は取り組むために提供して神経細胞の形態形成および移行に関する補完的なアプローチ。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="541">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:160px;">DMEM</td>
			<td style="width:125px;">Gibco</td>
			<td style="width:88px;">11960-044</td>
			<td style="width:168px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:160px;">BME</td>
			<td style="width:125px;">Gibco</td>
			<td style="width:88px;">41010-026</td>
			<td style="width:168px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:160px;">Insulin</td>
			<td style="width:125px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:88px;">Si-1-4011</td>
			<td style="width:168px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:160px;">Poly-L-Ornithine</td>
			<td style="width:125px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:88px;">P-2533</td>
			<td style="width:168px;"></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:160px;">CaCl2</td>
			<td style="width:125px;">Appli-Chem</td>
			<td style="width:88px;">A3652</td>
			<td style="width:168px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:160px;">Isofluorane</td>
			<td style="width:125px;">Actavis Deutschland</td>
			<td style="width:88px;"></td>
			<td style="width:168px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:160px;">Tissue-Tek OCT</td>
			<td style="width:125px;">Sakura</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="44">
			<td height="44" style="height:44px;width:160px;">Material Name</td>
			<td style="width:125px;">Company</td>
			<td style="width:88px;">Catalogue Number</td>
			<td style="width:168px;">Comments (optional)</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:160px;">ECM 830 and tweezertrodes</td>
			<td style="width:125px;">Harvard Apparatus</td>
			<td style="width:88px;"></td>
			<td style="width:168px;"></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:160px;">Epifluorescence microscope and camera</td>
			<td style="width:125px;">Nikon</td>
			<td style="width:88px;"></td>
			<td style="width:168px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:160px;">SP2 confocal microscope</td>
			<td style="width:125px;">Leica</td>
			<td style="width:88px;"></td>
			<td style="width:168px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:160px;">ImageJ</td>
			<td style="width:125px;">NIH</td>
			<td style="width:88px;"></td>
			<td style="width:168px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:160px;">Imaris 7.4.2</td>
			<td style="width:125px;">Bitplane, Inc.</td>
			<td style="width:88px;"></td>
			<td style="width:168px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:160px;">GraphPad Prism</td>
			<td style="width:125px;">GraphPad Software, Inc.</td>
			<td style="width:88px;"></td>
			<td style="width:168px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:160px;">MS Excel</td>
			<td style="width:125px;">Microsoft</td>
			<td style="width:88px;"></td>
			<td style="width:168px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:160px;">Loading tip 1-200 &#181;l</td>
			<td style="width:125px;">Costar</td>
			<td style="width:88px;">4853</td>
			<td style="width:168px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:160px;">Pipette tip 200 &#181;l</td>
			<td style="width:125px;">Sarstedt</td>
			<td style="width:88px;">70.760.502</td>
			<td style="width:168px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:160px;">Microlance 3 needle, 30 gauge</td>
			<td style="width:125px;">BD</td>
			<td style="width:88px;">302200</td>
			<td style="width:168px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:160px;">50 &#181;l gastight Syringe 1705</td>
			<td style="width:125px;">Hamilton</td>
			<td style="width:88px;"></td>
			<td style="width:168px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:160px;">Glass coverslips&#160;</td>
			<td style="width:125px;">Thermo Scientific Menzel Glaeser</td>
			<td>CB00120RA1</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

genetic manipulation of cerebellar granule neurons in vitro and in vivo to study neuronal morphology and migration

神経細胞の形態形成および移行を含む脳の発達のイベントは、高度のプロセスを組織化している。、in vitroおよびin vivoでこれらのイベントに関与する経路を特定するために、詳細な特性評価を可能に分析しています。現像小脳に由来する小脳顆粒ニューロン（CGNを）は、形態学的分析を可能にする理想的なモデル系である。ここでは、遺伝的にCGNを操作する方法の方法とどのように個々のニューロンの軸索と樹状突起を研究するについて説明します。この方法ではRNA干渉、過剰発現または低分子の効果は、ニューロンを制御するために比較することができる。また、齧歯類小脳皮質は、その支配的な出生後の発達により、生体システムにおいて簡単にアクセスできます。我々はまた、遺伝的に開発小脳を操作し、その後の小脳を記述するために、生体内エレクトロポレーション法を提示すると、神経形態aを評価するために分析し、ND移行。

上記のように、異なる培養条件に応答したCGNの形態を分析するために、我々は、DIV 0でニューロンをトランスフェクトした。トランスフェクションの後、我々は完全培地（BME、10％ウシ血清、2mMのPSG、25のKCl）および最小培地を含有するインスリンへの別のセット（BME、25mMグルコース、2mMのPSG、10μgの/への神経細胞の一組に配置mlのインスリン）。私たちは、ディビジョン1、2のGFP抗体を用い?...

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Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

神経細胞の形態形成および移行が適切な脳の発達の基礎となる重要なイベントです。ここでは、遺伝的に培養した小脳顆粒ニューロンおよび形態や神経細胞の遊走特性の評価のための開発小脳を操作する方法を説明します。

小脳顆粒ニューロンの遺伝子操作<em&gt;体外</em&gt;と<em&gt;インビボ</em&gt;ニューロンの形態と移行を研究するために、

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

13.6K ビュー.  Max Planck Institute of Experimental Medicine. 神経細胞の形態形成および移行が適切な脳の発達の基礎となる重要なイベントです。ここでは、遺伝的に培養した小脳顆粒ニューロンおよび形態や神経細胞の遊走特性の評価のための開発小脳を操作する方法を説明します。 

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Automated Sholl Analysis of Digitized Neuronal Morphology at Multiple Scales

Neuronal morphology plays a significant role in determining how neurons function and communicate1-3. Specifically, it affects the ability of neurons to receive inputs from other cells2 and contributes to the propagation of action potentials4,5. The morphology of the neurites also affects how information is processed. The diversity of dendrite morphologies facilitate local and long range signaling and allow individual neurons or groups of neurons to carry out specialized functions within the neuronal network6,7. Alterations in dendrite morphology, including fragmentation of dendrites and changes in branching patterns, have been observed in a number of disease states, including Alzheimer's disease8, schizophrenia9,10, and mental retardation11. The ability to both understand the factors that shape dendrite morphologies and to identify changes in dendrite morphologies is essential in the understanding of nervous system function and dysfunction.
Neurite morphology is often analyzed by Sholl analysis and by counting the number of neurites and the number of branch tips. This analysis is generally applied to dendrites, but it can also be applied to axons. Performing this analysis by hand is both time consuming and inevitably introduces variability due to experimenter bias and inconsistency. The Bonfire program is a semi-automated approach to the analysis of dendrite and axon morphology that builds upon available open-source morphological analysis tools. Our program enables the detection of local changes in dendrite and axon branching behaviors by performing Sholl analysis on subregions of the neuritic arbor. For example, Sholl analysis is performed on both the neuron as a whole as well as on each subset of processes (primary, secondary, terminal, root, etc.) Dendrite and axon patterning is influenced by a number of intracellular and extracellular factors, many acting locally. Thus, the resulting arbor morphology is a result of specific processes acting on specific neurites, making it necessary to perform morphological analysis on a smaller scale in order to observe these local variations12.
The Bonfire program requires the use of two open-source analysis tools, the NeuronJ plugin to ImageJ and NeuronStudio. Neurons are traced in ImageJ, and NeuronStudio is used to define the connectivity between neurites. Bonfire contains a number of custom scripts written in MATLAB (MathWorks) that are used to convert the data into the appropriate format for further analysis, check for user errors, and ultimately perform Sholl analysis. Finally, data are exported into Excel for statistical analysis. A flow chart of the Bonfire program is shown in Figure 1.

We have developed a computer program to analyze neuronal morphology. In combination with two existing open source analysis tools, our program performs Sholl analysis and determines the number of neurites, branch points, and neurite tips. The analyses are performed so that local changes in neurite morphology can be observed.

複数のスケールでデジタル化された神経形態の自動化されたショールの分析

Neuronal morphology plays a significant role in determining how neurons function and communicate1-3.  Specifically, it affects the ability of neurons to ...

神経科学

Lentivirus-mediated Genetic Manipulation and Visualization of Olfactory Sensory Neurons in vivo

Development of a precise olfactory circuit relies on accurate projection of olfactory sensory neuron (OSN) axons to their synaptic 
targets in the olfactory bulb (OB). The molecular mechanisms of OSN axon growth and targeting are not well understood. Manipulating gene expression and subsequent 
visualizing of single OSN axons and their terminal arbor morphology have thus far been challenging. To study gene function at the single cell level within a specified 
time frame, we developed a lentiviral based technique to manipulate gene expression in OSNs in vivo. Lentiviral particles are delivered to OSNs by microinjection 
into the olfactory epithelium (OE). Expression cassettes are then permanently integrated into the genome of transduced OSNs. Green fluorescent protein expression 
identifies infected OSNs and outlines their entire morphology, including the axon terminal arbor. Due to the short turnaround time between microinjection and 
reporter detection, gene function studies can be focused within a very narrow period of development. With this method, we have detected GFP expression within as 
few as three days and as long as three months following injection. We have achieved both over-expression and shRNA mediated knock-down by lentiviral microinjection. 
This method provides detailed morphologies of OSN cell bodies and axons at the single cell level in vivo, and thus allows characterization of candidate gene function 
during olfactory development.

Lentivirus-mediated Genetic Manipulation and Visualization of Olfactory Sensory Neurons in vivo

We present a lentiviral technique for genetic manipulation and visualization of single olfactory sensory neuron axon and its terminal arborization in vivo.

嗅神経細胞のレンチウイルスを介した遺伝子操作と可視化 in vivoで</em

Development of a precise olfactory circuit relies on accurate projection of olfactory sensory neuron (OSN) axons to their synaptic 
targets in the ...

Quantitative Analysis of Synaptic Vesicle Pool Replenishment in Cultured Cerebellar Granule Neurons using FM Dyes

After neurotransmitter release in central nerve terminals, SVs are rapidly retrieved by endocytosis. Retrieved SVs are then refilled with neurotransmitter and rejoin the recycling pool, defined as SVs that are available for exocytosis1,2. The recycling pool can generally be subdivided into two distinct pools - the readily releasable pool (RRP) and the reserve pool (RP). As their names imply, the RRP consists of SVs that are immediately available for fusion while RP SVs are released only during intense stimulation1,2. It is important to have a reliable assay that reports the differential replenishment of these SV pools in order to understand 1) how SVs traffic after different modes of endocytosis (such as clathrin-dependent endocytosis and activity-dependent bulk endocytosis) and 2) the mechanisms controlling the mobilisation of both the RRP and RP in response to different stimuli.
FM dyes are routinely employed to quantitatively report SV turnover in central nerve terminals3-8. They have a hydrophobic hydrocarbon tail that allows reversible partitioning in the lipid bilayer, and a hydrophilic head group that blocks passage across membranes. The dyes have little fluorescence in aqueous solution, but their quantum yield increases dramatically when partitioned in membrane9. Thus FM dyes are ideal fluorescent probes for tracking actively recycling SVs. The standard protocol for use of FM dye is as follows. First they are applied to neurons and are taken up during endocytosis (Figure 1). After non-internalised dye is washed away from the plasma membrane, recycled SVs redistribute within the recycling pool. These SVs are then depleted using unloading stimuli (Figure 1). Since FM dye labelling of SVs is quantal10, the resulting fluorescence drop is proportional to the amount of vesicles released. Thus, the recycling and fusion of SVs generated from the previous round of endocytosis can be reliably quantified.
Here, we present a protocol that has been modified to obtain two additional elements of information. Firstly, sequential unloading stimuli are used to differentially unload the RRP and the RP, to allow quantification of the replenishment of specific SV pools. Secondly, each nerve terminal undergoes the protocol twice. Thus, the response of the same nerve terminal at S1 can be compared against the presence of a test substance at phase S2 (Figure 2), providing an internal control. This is important, since the extent of SV recycling across different nerve terminals is highly variable11.
Any adherent primary neuronal cultures may be used for this protocol, however the plating density, solutions and stimulation conditions are optimised for cerebellar granule neurons (CGNs)12,13.

A live fluorescence imaging technique to quantify the replenishment and mobilisation of specific synaptic vesicle (SV) pools in central nerve terminals is described. Two rounds of SV recycling are monitored in the same nerve terminals providing an internal control.

FM染料を用いて培養小脳顆粒神経細胞のシナプス小胞プールの補充の定量分析

After neurotransmitter release in central nerve terminals, SVs are rapidly retrieved by endocytosis.  Retrieved SVs are then refilled with ...

Fast Micro-iontophoresis of Glutamate and GABA: A Useful Tool to Investigate Synaptic Integration

One of the fundamental interests in neuroscience is to understand the integration of excitatory and inhibitory inputs along the very complex structure of the dendritic tree, which eventually leads to neuronal output of action potentials at the axon. The influence of diverse spatial and temporal parameters of specific synaptic input on neuronal output is currently under investigation, e.g. the distance-dependent attenuation of dendritic inputs, the location-dependent interaction of spatially segregated inputs, the influence of GABAergig inhibition on excitatory integration, linear and non-linear integration modes, and many more.
With fast micro-iontophoresis of glutamate and GABA it is possible to precisely investigate the spatial and temporal integration of glutamatergic excitation and GABAergic inhibition. Critical technical requirements are either a triggered fluorescent lamp, light-emitting diode (LED), or a two-photon scanning microscope to visualize dendritic branches without introducing significant photo-damage of the tissue. Furthermore, it is very important to have a micro-iontophoresis amplifier that allows for fast capacitance compensation of high resistance pipettes. Another crucial point is that no transmitter is involuntarily released by the pipette during the experiment.
Once established, this technique will give reliable and reproducible signals with a high neurotransmitter and location specificity. Compared to glutamate and GABA uncaging, fast iontophoresis allows using both transmitters at the same time but at very distant locations without limitation to the field of view. There are also advantages compared to focal electrical stimulation of axons: with micro-iontophoresis the location of the input site is definitely known and it is sure that only the neurotransmitter of interest is released. However it has to be considered that with micro-iontophoresis only the postsynapse is activated and presynaptic aspects of neurotransmitter release are not resolved. In this article we demonstrate how to set up micro-iontophoresis in brain slice experiments.

In this article we introduce fast micro-iontophoresis of neurotransmitters as a technique to investigate integration of postsynaptic signals with high spatial and temporal precision.

グルタミン酸とGABAの高速マイクロイオン導入：シナプス統合を調査するために便利なツール

One of the fundamental interests in neuroscience is to understand the integration of excitatory and inhibitory inputs along the very complex structure of ...

Nucleofection of Rodent Neuroblasts to Study Neuroblast Migration In vitro

The subventricular zone (SVZ) located in the lateral wall of the lateral ventricles plays a fundamental role in adult neurogenesis. In this restricted area of the brain, neural stem cells proliferate and constantly generate neuroblasts that migrate tangentially in chains along the rostral migratory stream (RMS) to reach the olfactory bulb (OB). Once in the OB, neuroblasts switch to radial migration and then differentiate into mature neurons able to incorporate into the preexisting neuronal network. Proper neuroblast migration is a fundamental step in neurogenesis, ensuring the correct functional maturation of newborn neurons. Given the ability of SVZ-derived neuroblasts to target injured areas in the brain, investigating the intracellular mechanisms underlying their motility will not only enhance the understanding of neurogenesis but may also promote the development of neuroregenerative strategies.
This manuscript describes a detailed protocol for the transfection of primary rodent RMS postnatal neuroblasts and the analysis of their motility using a 3D in vitro migration assay recapitulating their mode of migration observed in vivo. Both rat and mouse neuroblasts can be quickly and efficiently transfected via nucleofection with either plasmid DNA, small hairpin (sh)RNA or short interfering (si)RNA oligos targeting genes of interest. To analyze migration, nucleofected cells are reaggregated in &#39;hanging drops&#39; and subsequently embedded in a three-dimensional matrix. Nucleofection per se does not significantly impair the migration of neuroblasts. Pharmacological treatment of nucleofected and reaggregated neuroblasts can also be performed to study the role of signaling pathways involved in neuroblast migration.

Nucleofection of Rodent Neuroblasts to Study Neuroblast Migration In vitro

Neuroblast migration is a crucial step in postnatal neurogenesis. The protocol described here can be used to investigate the role of candidate regulators of neuroblast migration by employing DNA/small hairpin RNA (shRNA) nucleofection and a 3D migration assay with neuroblasts isolated from the rodent postnatal rostral migratory stream.

神経芽細胞の移行を検討するために、げっ歯類神経芽細胞のクレオ<em&gt;インビトロ</em

The subventricular zone (SVZ) located in the lateral wall of the lateral ventricles plays a fundamental role in adult neurogenesis. In this restricted ...

Inducing Plasticity of Astrocytic Receptors by Manipulation of Neuronal Firing Rates

Close to two decades of research has established that astrocytes in situ and in vivo express numerous G protein-coupled receptors (GPCRs) that can be stimulated by neuronally-released transmitter. However, the ability of astrocytic receptors to exhibit plasticity in response to changes in neuronal activity has received little attention. Here we describe a model system that can be used to globally scale up or down astrocytic group I metabotropic glutamate receptors (mGluRs) in acute brain slices. Included are methods on how to prepare parasagittal hippocampal slices, construct chambers suitable for long-term slice incubation, bidirectionally manipulate neuronal action potential frequency, load astrocytes and astrocyte processes with fluorescent Ca2+ indicator, and measure changes in astrocytic Gq GPCR activity by recording spontaneous and evoked astrocyte Ca2+ events using confocal microscopy. In essence, a &#8220;calcium roadmap&#8221; is provided for how to measure plasticity of astrocytic Gq GPCRs. Applications of the technique for study of astrocytes are discussed. Having an understanding of how astrocytic receptor signaling is affected by changes in neuronal activity has important implications for both normal synaptic function as well as processes underlying neurological disorders and neurodegenerative disease.

Here we describe an adaptation of protocols used to induce homeostatic plasticity in neurons for the study of plasticity of astrocytic G protein-coupled receptors. Recently used to examine changes in astrocytic group I mGluRs in juvenile mice, the method can be applied to measure scaling of various astrocytic GPCRs, in tissue from adult mice in situ and in vivo, and to gain a better appreciation of the sensitivity of astrocytic receptors to changes in neuronal activity.

神経発火率を操作することによってアストロサイト受容体の可塑性を誘導すること

Close to two decades of research has established that astrocytes in situ and in vivo express numerous G protein-coupled receptors (GPCRs) that can be ...

The Olfactory System as a Model to Study Axonal Growth Patterns and Morphology In Vivo

The olfactory system has the unusual capacity to generate new neurons throughout the lifetime of an organism. Olfactory stem cells in the basal portion of the olfactory epithelium continuously give rise to new sensory neurons that extend their axons into the olfactory bulb, where they face the challenge to integrate into existing circuitry. Because of this particular feature, the olfactory system represents a unique opportunity to monitor axonal wiring and guidance, and to investigate synapse formation. Here we describe a procedure for in vivo labeling of sensory neurons and subsequent visualization of axons in the olfactory system of larvae of the amphibian Xenopus laevis. To stain sensory neurons in the olfactory organ we adopt the electroporation technique. In vivo electroporation is an established technique for delivering fluorophore-coupled dextrans or other macromolecules into living cells. Stained sensory neurons and their axonal processes can then be monitored in the living animal either using confocal laser-scanning or multiphoton microscopy. By reducing the number of labeled cells to few or single cells per animal, single axons can be tracked into the olfactory bulb and their morphological changes can be monitored over weeks by conducting series of in vivo time lapse imaging experiments. While the described protocol exemplifies the labeling and monitoring of olfactory sensory neurons, it can also be adopted to other cell types within the olfactory and other systems.

The Olfactory System as a Model to Study Axonal Growth Patterns and Morphology In Vivo

We describe a protocol for in vivo labeling of olfactory sensory neurons by electroporation and subsequent confocal laser-scanning or multiphoton microscopy to visualize neuronal morphology and its development over time.

モデルとしての嗅覚系は、軸索の成長パターンと形態を研究する<em&gt;インビボ</em

The olfactory system has the unusual capacity to generate new neurons throughout the lifetime of an organism. Olfactory stem cells in the basal portion of ...

Ex Vivo Imaging of Postnatal Cerebellar Granule Cell Migration Using Confocal Macroscopy

During postnatal development, immature granule cells (excitatory interneurons) exhibit tangential migration in the external granular layer, and then radial migration in the molecular layer and the Purkinje cell layer to reach the internal granular layer of the cerebellar cortex. Default in migratory processes induces either cell death or misplacement of the neurons, leading to deficits in diverse cerebellar functions. Centripetal granule cell migration involves several mechanisms, such as chemotaxis and extracellular matrix degradation, to guide the cells towards their final position, but the factors that regulate cell migration in each cortical layer are only partially known. In our method, acute cerebellar slices are prepared from P10 rats, granule cells are labeled with a fluorescent cytoplasmic marker and tissues are cultured on membrane inserts from 4 to 10 hr before starting real-time monitoring of cell migration by confocal macroscopy at 37 &#176;C in the presence of CO2. During their migration in the different cortical layers of the cerebellum, granule cells can be exposed to neuropeptide agonists or antagonists, protease inhibitors, blockers of intracellular effectors or even toxic substances such as alcohol or methylmercury to investigate their possible role in the regulation of neuronal migration.

Ex Vivo Imaging of Postnatal Cerebellar Granule Cell Migration Using Confocal Macroscopy

During postnatal cerebellum development, immature granule cells originating from the germinal zone exhibit distinct modalities of migration to reach their final destination and to establish neuronal networks. This protocol describes the preparation of cerebellar slices and the confocal macroscopic approach used to investigate the factors that regulate neuronal migration.

共焦点肉眼検査を使用した生後小脳顆粒細胞の移動のex vivoイメージング

During postnatal development, immature granule cells (excitatory interneurons) exhibit tangential migration in the external granular layer, and then ...

Analyzing Dendritic Morphology in Columns and Layers

In many regions of the central nervous systems, such as the fly optic lobes and the vertebrate cortex, synaptic circuits are organized in layers and columns to facilitate brain wiring during development and information processing in developed animals. Postsynaptic neurons elaborate dendrites in type-specific patterns in specific layers to synapse with appropriate presynaptic terminals. The fly medulla neuropil is composed of 10 layers and about 750 columns; each column is innervated by dendrites of over 38 types of medulla neurons, which match with the axonal terminals of some 7 types of afferents in a type-specific fashion. This report details the procedures to image and analyze dendrites of medulla neurons. The workflow includes three sections: (i) the dual-view imaging section combines two confocal image stacks collected at orthogonal orientations into a high-resolution 3D image of dendrites; (ii) the dendrite tracing and registration section traces dendritic arbors in 3D and registers dendritic traces to the reference column array; (iii) the dendritic analysis section analyzes dendritic patterns with respect to columns and layers, including layer-specific termination and planar projection direction of dendritic arbors, and derives estimates of dendritic branching and termination frequencies. The protocols utilize custom plugins built on the open-source MIPAV (Medical Imaging Processing, Analysis, and Visualization) platform and custom toolboxes in the matrix laboratory language. Together, these protocols provide a complete workflow to analyze the dendritic routing of Drosophila medulla neurons in layers and columns, to identify cell types, and to determine defects in mutants.

Here, we show how to analyze dendritic routing of Drosophila medulla neurons in columns and layers. The workflow includes a dual-view imaging technique to improve the image quality and computational tools for tracing, registering dendritic arbors to the reference column array and for analyzing the dendritic structures in 3D space.

列およびレイヤーで樹状形態を分析します

In many regions of the central nervous systems, such as the fly optic lobes and the vertebrate cortex, synaptic circuits are organized in layers and ...

Assessment of Neuronal Viability Using Fluorescein Diacetate-Propidium Iodide Double Staining in Cerebellar Granule Neuron Culture

Primary cultured Cerebellar Granule Neurons (CGNs) have been widely used as an in vitro model in neuroscience and neuropharmacology research. However, the co-existence of glial cells and neurons in CGN culture might lead to biases in the accurate assessment of neuronal viability. Fluorescein diacetate (FDA) and Propidium Iodide (PI) double staining has been used to measure cell viability by simultaneously evaluating the viable and dead cells. We used FDA-PI double staining to improve the sensitivities of the colorimetric assays and to evaluate neuronal viability in CGNs. Furthermore, we added blue fluorescent DNA stains (e.g., Hoechst) to improve the accuracy. This protocol describes how to improve the accuracy of assessment of neuronal viability by using these methods in CGN culture. Using this protocol, the number of glial cells can be excluded by using fluorescence microscopy. A similar strategy can be applied to distinguish the unwanted glial cells from neurons in various mixed cell cultures, such as primary cortical culture and hippocampal culture.

This protocol describes how to accurately measure neuronal viability using Fluorescein diacetate (FDA) and Propidium Iodide (PI) double staining in cultured cerebellar granule neurons, a primary neuronal culture used as an in vitro model in neuroscience and neuropharmacology research.

小脳顆粒ニューロン培養におけるFluorescein Diacetate-Propidium Iodide二重染色を用いたニューロン生存率の評価

Primary cultured Cerebellar Granule Neurons (CGNs) have been widely used as an in vitro model in neuroscience and neuropharmacology research. However, the ...