私たちは、統計分析のヘルプについては、優れた技術支援のために-80ハンマーとS. PapiolをN. Schwedhelm-Domeyerに感謝します。私たちの仕事は、ドイツ学術振興、ナノスケール顕微鏡のためのセンター、脳の分子生理学（CNMPB）、ゲッティンゲン、ドイツ、ゲッティンゲン大学のGGNBジュニアグループ奨学金により、マックス·プランク協会によって資金を供給される。

CGNをいずれか生後（P）5仔マウスまたはP6仔ラットから調製することができる。私たちは、有糸分裂後CGNを13を選択するために、有糸分裂阻害剤を使用していますBilimoriaらによって記述されたプロトコルを、従ってください。 倫理声明： 生きた動物を含むすべての実験は、ニーダーザクセン州、ドイツの「VerbraucherschutzウントLebensmittelsicherheit」で承認された動物プロトコルに従って行われてきた。 インビトロアッセイ： 1。リン酸カルシウムトランスフェクション法のためのDNAプラスミド、メディア、およびバッファの準備<ol><li>無菌、エンドトキシンを含まない水にプラスミドDNAを溶解させ、DMEM（高グルコース）; 2.5Mの塩化カルシウムを加える 。2X HBSSが（4グラムのNaCl、0.1775グラムのKCl、0.095グラム2 HPO 4•7H 2 O、0.675グラムのブドウ糖のNaを溶解させるそして250ミリリットル超純水に2.5グラムのHEPESおよび7.05、7.08、および7.11）にpHを調整する。注：準備するとき2X HBSS溶液、pHはプラスミドの特定の組み合わせのトランスフェクション効率についての最良の結果が得られ、テスト。 </li></ol> 2。培養神経細胞のトランスフェクション<img alt="図1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51070/51070fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51070/51070fig1.jpg" /> 図1。 in vitroでの軸索と樹状突起の成長アッセイのフローチャート。培養CGNを（ガラス製カバースリップした24ウェルプレート）、P6の仔ラットから単離され、（ 例えば 、GFP）の蛍光トランスフェクションマーカーを含むDNA沈殿物DIV 0または1でトランスフェクトされる。固定および免疫細胞化学の後、ニューロンは、盲検法で画像化されています。画像はImageJのにインポートされ、プロセスが測定される。測定値は、次に統計プログラムを用いて処理される。 <ol><li>シードCGNを（24ウェルプレートあたり20×10 6、BME、10％ウシ血清、2mMのペニシリン-Streptomycin-グルタミン（PSG）、25のKCl）メディア500μlで24ウェルプレート中の硝酸洗浄、ポリオルニチンでコーティングされた12ミリメートルのガラス製カバースリップ上、ウェルあたり。 </li><li> in vitroでの一日（DIV）0（めっき後少なくとも8時間）またはDIV 1に、増殖培地を収集し、37℃で維持あらかじめ温めておいたDMEM500μlで二回ニューロンを洗浄し、DMEM500μlのを追加します。 </li><li>インキュベーターに置きニューロン（37℃、5％CO 2）で45分間。 </li><li>混合することにより、各ウェル40μlのDNA沈殿物を準備したDNAを（2-2.5μgの/ウェル、全DNAの10％がトランスフェクトニューロンを可視化するトランスフェクションマーカー、例えば GFPであるべき）、（18μLまで）水、2μlのを追加2.5MのCaCl 2を 、よく混ぜると2XのHBSS 20μlを加える。 <ol><li> RTで5分間、DNA沈殿物をインキュベートする。 </li></ol></li><li>各ウェルにDNA沈殿物を追加し、インキュベーター内で18分間神経細胞を培養する。 </li><li> DMEM / DNA混合物を削除し、あらかじめ温めておいたDM500μlで二回ニューロンを洗うEM。 </li><li>ニューロンに戻ってステップ2.2から収集されたメディアを追加します。ニューロンは、炭素源を補充するDIV 3において、3日以上培養で25 mMグルコースで補足培地になる場合。 </li><li> 1-5日後、免疫細胞化学を受けるニューロンは、GFP抗体を用いた。 </li><li>画像、蛍光顕微鏡を用いて盲検法での条件ごとに少なくとも30個々のニューロン。 </li></ol> 3。 NeuronJと軸索と樹状突起を測定し、NIH ImageJのプラグイン重要：以下の比率が拡大し、画像の解像度に応じて、次の画像が適切なピクセルを使用してcorrectluyスケールされていることを確認します。 <ol><li> ImageJの8ビットに画像を変換：オープン画像は、「画像」を選択 - &gt; &#39;タイプ&#39; - &gt; &#39;8ビット &#39; - &gt;「保存」のイメージを。 </li><li> NeuronJプラグインを実行して、8ビットの画像を開きます。 <img alt="スクリーンショット" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51070/screenshot1.jpg" width="500px" /></li><li> CL：軸索を追跡するために、「追加の追跡」オプションを使用します軸索の冒頭で一度、マウスの左ボタンをICKし、プロセスに沿ってマウスを移動します。トレースが軸索形状と一致した場合、二重軸索の先端をクリックしてください。 <img alt="スクリーンショット" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51070/screenshot2.jpg" width="500px" /> 注：提案しトレースする必要が軸索の先端をダブルクリックして、軸索形状と異なる、トレースを固定する軸索のプロセスを一度クリックしてください。 </li><li>オプションキーを押し「ファイル名を指定して実行」「測定のトレースの表示」を選択し、「測定トレーシング」をクリックします。軸索の測定は、すべての新しいウィンドウに表示されます。樹状突起の場合は、「表示グループの測定オプション」を押して「ファイル名を指定して実行」を選択します。 <img alt="スクリーンショット" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51070/screenshot3.jpg" width="500px" /> 総デンドライト測定は、すべての新規ウィンドウに表示されます。任意のスプレッドシートプログラムで開くことができ、別のファイルとして保存。 </li><li>別の方法として、マニュアルトレースに、フィジーのソフトウェアを使用：右番目をクリックしてくださいE &#39;直線&#39;オプション、 &#39;フリーハンドライン」を選択し、 <img alt="スクリーンショット" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51070/screenshot4.jpg" width="500px" /> マウスの左ボタンを押した維持し、手動プロセスをトレース押し「Ctrlキー+ M &#39;は測定すること。 </li><li>条件ごとの平均軸索/樹状突起の長さを計算し、適切な統計的検定を使用しています。 生体内エレクトロポレーションの場合 ： </li></ol> 1。機器や試薬の調製<ol><li>あなたが30のG針、スペーサー（1-2 mm）で、注射器、デッドボリューム減速（DVR）、エレクトロ、そしてtweezertrodes、加熱パッドや赤外線加熱ランプ、グースネックランプおよびイソフルランを必要としています。 </li><li>針へのDVRを入れ、シリンジ針を取り付け、最終的には（ 図2）針の上にスペーサーを入れた。 <img alt="図2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51070/51070fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51070/51070fig2.jpg" /> 図2。針の調製。DVR 200μlのピペットチップを切断し、デッドボリュームを低減するために針内に配置されている。スペーサーは、200μlのローディング先端から導出され、約2mmの小脳への浸透の深さを調節するために、針の端部に配置されている。ルーラーの単位：センチ</li><li> PBS/0.03％ファストグリーンでDNAを溶解する。注：トランスフェクションマーカーとしては、ニューロンのみを可視化するために、ニューロン特異的プロモーター（ 例えば、シナプシン）下で蛍光タンパク質を使用することが有利で ​​ある。総プラスミド量の25％は、トランスフェクションマーカーをコードするプラスミドである必要があります。 </li><li> 70％エタノールを加えます。 </li><li>同等のOCTボリュームおよびPBSに溶解し、30％スクロースを混合する。 </li><li> DNA（PBS/0.03％ファストグリーンでのプラスミドDNA4μgの/μL）の4μlで注射器を埋める。 </li></ol> 2。ラット仔のIVE IVEのフローチャート。図3を参照してください。 <p class="jove_content" fo:keep-together.withinページ= &quot;常に&quot;&gt; <img alt="図3" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51070/51070fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51070/51070fig3.jpg" /> 図3。 インビボでのエレクトロポレーションのフローチャート。P4仔ラット（ 例えば GFP）蛍光トランスフェクションマーカーをコードするプラスミドDNAおよびイソフルランで麻酔し、5電気パルスへの暴露に続いて、小脳に注入される。 5日後、単離されたGFP陽性小脳を切断し、免疫組織化学に供される。画像は、共焦点顕微鏡を用いて捕捉し、IMARISソフトウェアを用いて分析される。データは統計プログラムで処理される。 <ol><li>アルビノ株（Wistar系またはロング·エヴァンス）からP4仔ラットを使用してください。 </li><li>子犬は、もはや移動するまで、1〜2分間（組織に浸し）イソフルラン200μlの小箱（ 例えば P1000ピペットチップボックス）内のイソフルランで子犬（続）麻酔ません。子犬ワット接触し得ることはありませんように注意してくださいIiquidイソフルラン番目。個々の仔が麻酔に対して異なる反応として近い時間を監視します。 </li><li> 70％エタノールでバック子犬の頭の殺菌。 </li><li>親指と人​​差し指の間で子犬の頭を固定し、アルビノ子犬の小脳を見つけるためにグースネックランプを使用しています。横洞が急激皮質半球から中脳（スーペリア、下丘）（ 図3）を画定する。小脳は、脳に隣接して位置しており、暗い影に表示されます。ドットで小脳を示すために、油性マジックを使用しています。重要：固定された位置に子犬をしてください！注：麻酔は、この手順の間、オフ着用しなければならない、前にDNAを注入するイソフルランに子犬を公開します。 </li><li>針（ 図3）を挿入し、ゆっくりと小脳へのDNAの3μLを注入。 </li><li> DNA溶液を30〜60秒間拡散してみましょう。 <ol><li>マイナス極が後頭部（小脳と接触するようにtweezertrodes間の子犬の頭を置くR領域）とします（ 図3）ヘッドの反対側のプラス極に接触すること。 </li><li> 5電気パルスを受ける子犬。彼らの生存率（ 表1）を損なうことなく、良好なエレクトロポレーションの効率を確保するために、仔の体重に電圧を調整します。 <table border="0"><tbody><tr><td>重さ</td><td>電圧</td><td>パルス</td><td>インターバル</td></tr><tr><td> 8〜9グラム</td><td> 160 V </td><td> 50ミリ秒</td><td> 950ミリ秒</td></tr><tr><td> 9〜10グラム</td><td> 165 V </td><td> 50ミリ秒</td><td> 950ミリ秒</td></tr><tr><td> &gt; 10グラム</td><td> 170 V </td><td> 50ミリ秒</td><td> 950ミリ秒</td></tr></tbody></table> 表1。 P4の仔ラットのエレクトロポレーション。 </li><li>子犬が加熱パッドの上に、赤外線ランプ下に回復しましょう​​。ダムへ子犬を返します。重要：加熱源は、任意の火傷を負わないようにしてください。 </li></ol></li><li>断頭続いCO 2に配置することにより、5日間エレクトロポレーション後の仔を生け贄に捧げる。 <ol><li>蛍光顕微鏡を用いた小脳GFP陽性もののため小脳し、画面を隔離する。 </li></ol></li><li>その後、小脳シンクまで、チューブの底に4℃で、30％スクロース中でインキュベート、4℃で4％PFA O / Nで小脳を修正します。 </li><li> OCT/30％ショ糖で小脳を埋め込み、クライオスタットを用いて、40μmの冠状切片を切る。注：盲検的にセクションごとに小脳を。 </li><li>テーマのセクションでは、GFP抗体を用いた免疫組織化学する。核色素（DAPIまたはヘキスト33258）と対比し、動物あたり少なくとも200トランスフェクションしたニューロンの局在を決定する。 </li><li>詳細な分析のために、MLおよび白質対向する下部IGLを対向する上部IGLで、その結果、半分にIGLを細分化し、各半分に存在するGFP陽性ニューロンをカウントします。注：盲検的に各セクションのGFP陽性ニューロンをカウントします。 </lI&gt; </ol> 3。デンドライトの長さを測定し、共焦点顕微鏡を使用して、X、Y、Z平面内のセクションの画像を取り込む注：例えば1μmのz stwpと40μmのセクション40の画像を使用しています。 <ol><li>ソフトウェアで開く画像シリーズ、IMARIS、樹状突起の3次元画像を生成する。 </li><li> 3Dでニューロンを表示するには、「サーパス」モードをクリックします。 <img alt="スクリーンショット" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51070/screenshot5.jpg" width="500px" /></li><li> &#39;新しいフィラメントを追加」を選択し、半自動トレースを開始するには「自動作成をスキップする」をクリックします。 <img alt="スクリーンショット" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51070/screenshot6.jpg" width="500px" /> 注：盲検様式で各3D画像を分析</li><li> 「ドロー」タブと「てAutoPath」を選択します。 <img alt="スクリーンショット" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51070/screenshot7.jpg" width="500px" /></li><li> Cの上にマウスカーソルを移動するエルの体およびShift +マウスの右のセル本体をクリックして選択します。注：ソフトウェアによる自動計算には数分が必要な場合があります。 <img alt="スクリーンショット" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51070/screenshot8.jpg" width="500px" /></li><li> Shiftキー+マウス左クリックを使用してフィラメント（デンドライト）にパスを追加。注：パスを、即座に可視化することができる。 <img alt="スクリーンショット" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51070/screenshot9.jpg" width="500px" /></li><li>フィラメント統計ウィンドウに移動し、「詳細」、「特定の値」と総樹状突起の長さの合計のための「フィラメントデンドライトの長さ（合計）」をクリックしてください。 <img alt="スクリーンショット" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51070/screenshot10.jpg" width="500px" /></li><li>データを分析するための適切な統計的検定を使用してください。 </li></ol>

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V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+CaMKIIbeta+signaling+pathway+at+the+centrosome+regulates+dendrite+patterning+in+the+brain.">A CaMKIIbeta signaling pathway at the centrosome regulates dendrite patterning in the brain.</a> Nat. Neurosci. , (2011).</li><li>Jia, Y., Zhou, J., Tai, Y., Wang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TRPC+channels+promote+cerebellar+granule+neuron+survival.">TRPC channels promote cerebellar granule neuron survival.</a> Nat. Neurosci. 10, 559-567 (2007).</li><li>Huynh, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+isoform-specific+SnoN1-FOXO1+repressor+complex+controls+neuronal+morphogenesis+and+positioning+in+the+mammalian+brain.">An isoform-specific SnoN1-FOXO1 repressor complex controls neuronal morphogenesis and positioning in the mammalian brain.</a> Neuron. 69, 930-944 (2011).</li><li>de la Torre-Ubieta, L., Bonni, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+regulation+of+neuronal+polarity+and+morphogenesis+in+the+mammalian+brain.">Transcriptional regulation of neuronal polarity and morphogenesis in the mammalian brain.</a> Neuron. 72, 22-40 (2011).</li><li>Calissano, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombinant+human+insulin-like+growth+factor+I+exerts+a+trophic+action+and+confers+glutamate+sensitivity+on+glutamate-resistant+cerebellar+granule+cells.">Recombinant human insulin-like growth factor I exerts a trophic action and confers glutamate sensitivity on glutamate-resistant cerebellar granule cells.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90, 8752-8756 (1993).</li></ol>

著者らは、競合する経済的利益を宣言していません。

利点およびインビトロおよびインビボ方法に記載の制限： マウスやラットから培養CGNを、形態学的分析のために均等に適しています。ラットの小脳の大きいサイズのために、仔ラットからCNGSの収率は、仔マウス3〜4倍のそれを超えています。 CGNを脇から、皮質及び海馬ニューロンは、同様に培養系として使用することができる。リン酸カルシウム法?...

小脳は、軸索の成長と移動のメカニズムを研究するための優れたシステムです。小脳は、脳科学1の黎明期から解剖学の研究の対象となっている。現代の顕微鏡検査および免疫組織化学的技術が大幅に拡大し、サンティアゴ、ラモン、およびカハール2-4初期の発見に磨きをかけてきました。マウス遺伝学と分子の研究では、小脳顆粒ニューロン（CGNを）5-7を含むニューロンの様々なタイプの適切な配線に必要な重要なイベントのより深い理解につながった、小脳発生の制御に必須の増殖および転写因子を発見した。 小脳は、途上後脳8のrhombomere 1の誘導体である。で最も多くニューロン集団を構成する4 番目の心室の屋根の一部である菱形リップ、小脳顆粒ニューロン前駆細胞を生じさせる、大人の小脳9。吻側移行後、彼らは小脳原基に定住。ここで、顆粒ニューロン前駆体の有糸分裂は、げっ歯類において出生後に行われる外顆粒層（EGL）の劇的な拡大をもたらす。 EGLから、神経細胞は、最終的には、内部顆粒層（IGL 2）に居を取るためにプルキンエ細胞層を越えて、分子層（ML）を介して内側への移行を開始。この渡り鳥プロセスの間に、彼らは、ML内に延びる2軸索を有するバイポーラ形を獲得する。さらに、移行の際に、細胞体、軸索から離れて移動し、二つのプロセスは、一分岐した、T字型の軸索10を形成するために融合。その後、これらの軸索は束生のと平行線維と呼ばれている。 IGLに定住した、CGNをは苔状線維とシナプスを確立するために、樹枝状の爪を形成する樹状突起を、育つ。開発小脳において基本的なプロセスを検討するために、in vitroおよびin vivo approac で組み合わせるHは、信頼性の高い結果と結論することができます。 CGNを、小脳のが、脳全体の中で最も数多くの神経細胞であるだけでなく、高純度11月13日に培養することができる。文化では、この非常に均質なニューロン集団は、急速に分裂後になり、容易に識別軸索と樹状突起を有する極性形態を獲得する。培養されたCGNを、前駆増殖、分化、軸索および樹状突起の発達、神経細胞遊走、アポトーシスおよび電気生理学的特性（14-19および多くの他）を含む神経発達の様々な側面を研究することは非常に有用であることが証明されている。遺伝子操作の使用は、培養たCGNの汎用性を拡大し、前述のイベントへのさらなる機械論的な洞察を可能にした。極性マーカーまたはソフトウェアでサポートされている解析設備などで免疫細胞化学、続いて低効率リン酸カルシウムまたは親油性の方法を用いて培養されたニューロンのトランスフェクション密な神経細胞培養液中の個々のニューロンの形態学などの評価をtates。このアプローチでは、軸索または樹状突起成長中の目的のタンパク質の役割は20-25,26-28を研究することができる。移行は、高密度培養では非常に限られており、共培養を必要とするので、この培養系は、しかしながら、ニューロン移動を分析するあまり有用である。軸索と樹状突起成長のインビトロ分析も過剰発現または小分子、RNA干渉（i）の組合せを使用してシグナル伝達経路の相互接続されたタンパク質の調査を可能にする。 軸索と樹状突起の成長制御やニューロン移動における目的のタンパク質の関連性を確立するために、in vivoでのエレクトロポレーション（IVE）技術が発達小脳皮質での分析を可能にする。げっ歯類における小脳開発は最初の2週間、生後に道を拡張するという事実のために、小脳はaccessibを表し軸索と樹状突起、ニューロン移動、シナプス形成およびアポトーシス20-24,29,30,26,27,31-34の開発を検討する遺伝子操作のためのル·脳構造。また、このモデル系はまた、軸索経路探索、配線と合わせて考えると、ニューロンとニューロン-グリア相互作用の接続などそのまま小脳皮質を必要とする神経発達の他の側面に有用であり、このプロトコルは、in vitroおよびin vivo技術は取り組むために提供して神経細胞の形態形成および移行に関する補完的なアプローチ。

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td>11960-044</td><td></td></tr><tr><td>BME</td><td>Gibco</td><td>41010-026</td><td></td></tr><tr><td>Insulin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Si-1-4011</td><td></td></tr><tr><td>Poly-L-Ornithine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P-2533</td><td></td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Appli-Chem</td><td>A3652</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Actavis Deutschland</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tissue-Tek OCT</td><td>Sakura</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ECM 830 and tweezertrodes</td><td>Harvard Apparatus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Epifluorescence microscope and camera</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SP2 confocal microscope</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>NIH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Imaris 7.4.2</td><td>Bitplane, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>GraphPad Prism</td><td>GraphPad Software, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MS Excel</td><td>Microsoft</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Loading tip 1-200 &amp;micro;l</td><td>Costar</td><td>4853</td><td></td></tr><tr><td>Pipette tip 200 &amp;micro;l</td><td>Sarstedt</td><td>70.760.502</td><td></td></tr><tr><td>Microlance 3 needle, 30 G</td><td>BD</td><td>302200</td><td></td></tr><tr><td>50 &amp;micro;l gastight Syringe 1705</td><td>Hamilton</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glass coverslips&amp;nbsp;</td><td>Thermo Scientific Menzel Glaeser</td><td>CB00120RA1</td><td></td></tr></tbody></table>

genetic manipulation of cerebellar granule neurons in vitro and in vivo to study neuronal morphology and migration

神経細胞の形態形成および移行を含む脳の発達のイベントは、高度のプロセスを組織化している。、in vitroおよびin vivoでこれらのイベントに関与する経路を特定するために、詳細な特性評価を可能に分析しています。現像小脳に由来する小脳顆粒ニューロン（CGNを）は、形態学的分析を可能にする理想的なモデル系である。ここでは、遺伝的にCGNを操作する方法の方法とどのように個々のニューロンの軸索と樹状突起を研究するについて説明します。この方法ではRNA干渉、過剰発現または低分子の効果は、ニューロンを制御するために比較することができる。また、齧歯類小脳皮質は、その支配的な出生後の発達により、生体システムにおいて簡単にアクセスできます。我々はまた、遺伝的に開発小脳を操作し、その後の小脳を記述するために、生体内エレクトロポレーション法を提示すると、神経形態aを評価するために分析し、ND移行。

上記のように、異なる培養条件に応答したCGNの形態を分析するために、我々は、DIV 0でニューロンをトランスフェクトした。トランスフェクションの後、我々は完全培地（BME、10％ウシ血清、2mMのPSG、25のKCl）および最小培地を含有するインスリンへの別のセット（BME、25mMグルコース、2mMのPSG、10μgの/への神経細胞の一組に配置mlのインスリン）。私たちは、ディビジョン1、2のGFP抗体を用い?...

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Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

神経細胞の形態形成および移行が適切な脳の発達の基礎となる重要なイベントです。ここでは、遺伝的に培養した小脳顆粒ニューロンおよび形態や神経細胞の遊走特性の評価のための開発小脳を操作する方法を説明します。

小脳顆粒ニューロンの遺伝子操作<em&gt;体外</em&gt;と<em&gt;インビボ</em&gt;ニューロンの形態と移行を研究するために、

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow ...

genetic-manipulation-cerebellar-granule-neurons-vitro-vivo-to-study

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

13.7K ビュー.  Max Planck Institute of Experimental Medicine. 神経細胞の形態形成および移行が適切な脳の発達の基礎となる重要なイベントです。ここでは、遺伝的に培養した小脳顆粒ニューロンおよび形態や神経細胞の遊走特性の評価のための開発小脳を操作する方法を説明します。 

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Ex Vivo Culture of Chick Cerebellar Slices and Spatially Targeted Electroporation of Granule Cell Precursors

The cerebellar external granule layer (EGL) is the site of the largest transit amplification in the developing brain, and an excellent model for studying neuronal proliferation and differentiation. In addition, evolutionary modifications of its proliferative capability have been responsible for the dramatic expansion of cerebellar size in the amniotes, making the cerebellum an excellent model for evo-devo studies of the vertebrate brain. The constituent cells of the EGL, cerebellar granule progenitors, also represent a significant cell of origin for medulloblastoma, the most prevalent paediatric neuronal tumour. Following transit amplification, granule precursors migrate radially into the internal granular layer of the cerebellum where they represent the largest neuronal population in the mature mammalian brain. In chick, the peak of EGL proliferation occurs towards the end of the second week of gestation. In order to target genetic modification to this layer at the peak of proliferation, we have developed a method for genetic manipulation through ex vivo electroporation of cerebellum slices from embryonic Day 14 chick embryos. This method recapitulates several important aspects of in vivo granule neuron development and will be useful in generating a thorough understanding of cerebellar granule cell proliferation and differentiation, and thus of cerebellum development, evolution and disease.

Ex Vivo Culture of Chick Cerebellar Slices and Spatially Targeted Electroporation of Granule Cell Precursors

The cerebellar external granule layer is the site of the largest transit amplification in the developing brain. Here, we present a protocol to target genetic modification to this layer at the peak of proliferation using ex vivo electroporation and culture of cerebellar slices from embryonic Day 14 chick embryos.

チック小脳スライスと顆粒細胞前駆体の空間的にターゲットを絞ったエレクトロポレーションの ex vivo培養

The cerebellar external granule layer (EGL) is the site of the largest transit amplification in the developing brain, and an excellent model for studying ...

発生生物学

Methods for Study of Neuronal Morphogenesis: Ex vivo RNAi Electroporation in Embryonic Murine Cerebral Cortex

The cerebral cortex directs higher cognitive functions. This six layered structure is generated in an inside-first, outside-last manner, in which the first born neurons remain closer to the ventricle while the last born neurons migrate past the first born neurons towards the surface of the brain1. In addition to neuronal migration2, a key process for normal cortical function is the regulation of neuronal morphogenesis3. While neuronal morphogenesis can be studied in vitro in primary cultures, there is much to be learned from how these processes are regulated in tissue environments.
We describe techniques to analyze neuronal migration and/or morphogenesis in organotypic slices of the cerebral cortex4,6. A pSilencer modified vector is used which contains both a U6 promoter that drives the double stranded hairpin RNA and a separate expression cassette that encodes GFP protein driven by a CMV promoter7-9. Our approach allows for the rapid assessment of defects in neurite outgrowth upon specific knockdown of candidate genes and has been successfully used in a screen for regulators of neurite outgrowth8. Because only a subset of cells will express the RNAi constructs, the organotypic slices allow for a mosaic analysis of the potential phenotypes. Moreover, because this analysis is done in a near approximation of the in vivo environment, it provides a low cost and rapid alternative to the generation of transgenic or knockout animals for genes of unknown cortical function. Finally, in comparison with in vivo electroporation technology, the success of ex vivo electroporation experiments is not dependant upon proficient surgery skill development and can be performed with a shorter training time and skill.

Methods for Study of Neuronal Morphogenesis: Ex vivo RNAi Electroporation in Embryonic Murine Cerebral Cortex

To conduct a rapid assessment of the function of genes in the development of cerebral cortex, we describe methods involving the ex vivo electroporation of plasmids co-expressing inhibitory RNA (RNAi) and GFP in murine embryonic cortex. This protocol is amenable to the study of various aspects of neurodevelopment such as neurogenesis, neuronal migration and neuronal morphogenesis including dendrite and axon outgrowth.

神経形態形成の研究のための方法：<em&gt;エキソビボ</em胎児マウス大脳皮質&gt; RNAiのエレクトロポレーション

The cerebral cortex directs higher cognitive functions. This six layered structure is generated in an inside-first, outside-last manner, in which the ...

神経科学

Isolation and Culture of Post-Natal Mouse Cerebellar Granule Neuron Progenitor Cells and Neurons 

The cerebellar cortex is a well described structure that provides unique opportunities for studying neuronal properties and development1,2. Of the cerebellar neuronal types (granule cells, Purkinje cells and inhibitory interneurons), granule neurons are by far the most numerous and are the most abundant type of neurons in the mammalian brain. In rodents, cerebellar granule neurons are generated during the first two post-natal weeks from progenitor cells in the outermost layer of the cerebellar cortex, the external granule layer (EGL). The protocol presented here describes techniques to enrich and culture granule neurons and their progenitor cells from post-natal mouse cerebellum. We will describe procedures to obtain cultures of increasing purity3,4, which can be used to study the differentiation of proliferating progenitor cells into granule neurons5,6. Once the progenitor cells differentiate, the cultures also provide a homogenous population of granule neurons for experimental manipulation and characterization of phenomena such as synaptogenesis, glutamate receptor function7, interaction with other purified cerebellar cells8,9 or cell death7.

Isolation and Culture of Post-Natal Mouse Cerebellar Granule Neuron Progenitor Cells and Neurons

Here we present a method to isolate and culture cerebellar granule neuron progenitor cells and cerebellar granule neurons from postnatal mouse.

ポストナタールマウス小脳顆粒ニューロン前駆細胞と神経細胞の単離と培養

The cerebellar cortex is a well described structure that provides unique opportunities for studying neuronal properties and development1,2. Of the ...

生物学

CRISPR-mediated Loss of Function Analysis in Cerebellar Granule Cells Using In Utero Electroporation-based Gene Transfer

Brain malformation is often caused by genetic mutations. Deciphering the mutations in patient-derived tissues has identified potential causative factors of the diseases. To validate the contribution of a dysfunction of the mutated genes to disease development, the generation of animal models carrying the mutations is one obvious approach. While germline genetically engineered mouse models (GEMMs) are popular biological tools and exhibit reproducible results, it is restricted by time and costs. Meanwhile, non-germline GEMMs often enable exploring gene function in a more feasible manner. Since some brain diseases (e.g., brain tumors) appear to result from somatic but not germline mutations, non-germline chimeric mouse models, in which normal and abnormal cells coexist, could be helpful for disease-relevant analysis. In this study, we report a method for the induction of CRISPR-mediated somatic mutations in the cerebellum. Specifically, we utilized conditional knock-in mice, in which Cas9 and GFP are chronically activated by the CAG (CMV enhancer/chicken &#223;-actin) promoter after Cre-mediated recombination of the genome. The self-designed single-guide RNAs (sgRNAs) and the Cre recombinase sequence, both encoded in a single plasmid construct, were delivered into cerebellar stem/progenitor cells at an embryonic stage using in utero electroporation. Consequently, transfected cells and their daughter cells were labeled with green fluorescent protein (GFP), thus facilitating further phenotypic analyses. Hence, this method is not only showing electroporation-based gene delivery into embryonic cerebellar cells but also proposing a novel quantitative approach to assess CRISPR-mediated loss-of-function phenotypes.

CRISPR-mediated Loss of Function Analysis in Cerebellar Granule Cells Using In Utero Electroporation-based Gene Transfer

Conventional loss-of-function studies of genes using knockout animals have often been costly and time-consuming. Electroporation-based CRISPR-mediated somatic mutagenesis is a powerful tool to understand gene functions in vivo. Here, we report a method to analyze knockout phenotypes in proliferating cells of the cerebellum.

CRISPR を介した損失関数における小脳顆粒細胞のエレクトロポレーション法による遺伝子導入の子宮内を使用して

Brain malformation is often caused by genetic mutations. Deciphering the mutations in patient-derived tissues has identified potential causative factors ...

Ex Vivo Imaging of Postnatal Cerebellar Granule Cell Migration Using Confocal Macroscopy

During postnatal development, immature granule cells (excitatory interneurons) exhibit tangential migration in the external granular layer, and then radial migration in the molecular layer and the Purkinje cell layer to reach the internal granular layer of the cerebellar cortex. Default in migratory processes induces either cell death or misplacement of the neurons, leading to deficits in diverse cerebellar functions. Centripetal granule cell migration involves several mechanisms, such as chemotaxis and extracellular matrix degradation, to guide the cells towards their final position, but the factors that regulate cell migration in each cortical layer are only partially known. In our method, acute cerebellar slices are prepared from P10 rats, granule cells are labeled with a fluorescent cytoplasmic marker and tissues are cultured on membrane inserts from 4 to 10 hr before starting real-time monitoring of cell migration by confocal macroscopy at 37 &#176;C in the presence of CO2. During their migration in the different cortical layers of the cerebellum, granule cells can be exposed to neuropeptide agonists or antagonists, protease inhibitors, blockers of intracellular effectors or even toxic substances such as alcohol or methylmercury to investigate their possible role in the regulation of neuronal migration.

Ex Vivo Imaging of Postnatal Cerebellar Granule Cell Migration Using Confocal Macroscopy

During postnatal cerebellum development, immature granule cells originating from the germinal zone exhibit distinct modalities of migration to reach their final destination and to establish neuronal networks. This protocol describes the preparation of cerebellar slices and the confocal macroscopic approach used to investigate the factors that regulate neuronal migration.

共焦点肉眼検査を使用した生後小脳顆粒細胞の移動のex vivoイメージング

During postnatal development, immature granule cells (excitatory interneurons) exhibit tangential migration in the external granular layer, and then ...

Modeling Neuronal Death and Degeneration in Mouse Primary Cerebellar Granule Neurons

Cerebellar granule neurons (CGNs) are a commonly used neuronal model, forming an abundant homogeneous population in the cerebellum. In light of their post-natal development, abundance, and accessibility, CGNs are an ideal model to study neuronal processes, including neuronal development, neuronal migration, and physiological neuronal activity stimulation. In addition, CGN cultures provide an excellent model for studying different modes of cell death including excitotoxicity and apoptosis. Within a week in culture, CGNs express N-methyl-D-aspartate (NMDA) receptors, a specific ionotropic glutamate receptor with many critical functions in neuronal health and disease. The addition of low concentrations of NMDA in conjunction with membrane depolarization to rodent primary CGN cultures has been used to model physiological neuronal activity stimulation while the addition of high concentrations of NMDA can be employed to model excitotoxic neuronal injury. Here, a method of isolation and culturing of CGNs from 6 day old pups as well as genetic manipulation of CGNs by adenoviruses and lentiviruses are described. We also present optimized protocols on how to stimulate NMDA-induced excitotoxicity, low-potassium-induced apoptosis, oxidative stress and DNA damage following transduction of these neurons.

This protocol describes a simple method for isolating and culturing primary mouse cerebral granule neurons (CGNs) from 6-7 day old pups, efficient transduction of CGNs for loss and gain of function studies, and modelling NMDA-induced neuronal excitotoxicity, low-potassium-induced cell death, DNA-damage, and oxidative stress using the same culture model.

神経細胞死とマウス プライマリ小脳顆粒ニューロンの変性をモデリング

Cerebellar granule neurons (CGNs) are a commonly used neuronal model, forming an abundant homogeneous population in the cerebellum. In light of their ...

Utilizing In Vivo Postnatal Electroporation to Study Cerebellar Granule Neuron Morphology and Synapse Development

Neurons undergo dynamic changes in their structure and function during brain development to form appropriate connections with other cells. The rodent cerebellum is an ideal system to track the development and morphogenesis of a single cell type, the cerebellar granule neuron (CGN), across time. Here, in vivo electroporation of granule neuron progenitors in the developing mouse cerebellum was employed to sparsely label cells for subsequent morphological analyses. The efficacy of this technique is demonstrated in its ability to showcase key developmental stages of CGN maturation, with a specific focus on the formation of dendritic claws, which are specialized structures where these cells receive the majority of their synaptic inputs. In addition to providing snapshots of CGN synaptic structures&#160;throughout cerebellar development, this technique can be adapted to genetically manipulate granule neurons in a cell-autonomous manner to study the role of any gene of interest and its effect on CGN morphology, claw development, and synaptogenesis.

Utilizing In Vivo Postnatal Electroporation to Study Cerebellar Granule Neuron Morphology and Synapse Development

Here we describe a method to visualize synaptogenesis of granule neurons in the mouse cerebellum over the time course of postnatal brain development when these cells refine their synaptic structures and form synapses to integrate themselves into the overall brain circuit.

in vivo生後エレクトロポレーションによる小脳顆粒ニューロンの形態とシナプス発生の研究

Neurons undergo dynamic changes in their structure and function during brain development to form appropriate connections with other cells. The rodent ...

Modeling Neuronal Injury in Mouse Primary Cerebellar Granule Neurons

Source: Laaper, M. et al., <a href="https://app.jove.com/v/55871">Modeling Neuronal Death and Degeneration in Mouse Primary Cerebellar Granule Neurons.</a>&#160;J. Vis. Exp. (2017).
This video demonstrates the generation of a neuronal injury model in mouse primary cerebellar granule neurons. It outlines the steps involved in inducing neuronal injury using NMDA, an excitatory neurotransmitter receptor agonist, and glycine, a co-agonist. NMDA and glycine bind to specific neuronal receptors, causing their overstimulation and resulting in a massive intracellular calcium influx, which leads to neuronal cell damage and death.

マウス初代小脳顆粒ニューロンにおける神経損傷のモデル化

1. Experimental Preparation
NOTE: The following stock solutions can be prepared and maintained until use.

	Dissection Solution
	
		Dissolve 3.62 g of ...

JoVE Encyclopedia of Experiments

Neuropathology

Trauma

Modeling Reactive Oxygen Species-Induced Neuronal Death in Mouse Cerebellar Granule Neurons

Source: Laaper, M. et al., <a href="https://app.jove.com/v/55871">Modeling Neuronal Death and Degeneration in Mouse Primary Cerebellar Granule Neurons.</a>&#160;J. Vis. Exp. (2017).
This video outlines the generation of a neuronal injury model using reactive oxygen species (ROS) in mouse primary cerebellar granule neurons. It details the process of inducing oxidative stress by adding high concentrations of hydrogen peroxide. ROS exposure causes DNA strand breaks and genomic instability. Additionally, the oxidation of cellular proteins impairs their functions, while lipid peroxidation compromises membrane integrity. This cascade leads to cytochrome c release and caspase activation, resulting in neuronal apoptosis.

マウス小脳顆粒ニューロンにおける活性酸素種誘発性ニューロン死のモデル化

Neurodegenerative Diseases

Isolation and Culture of Mouse Primary Cerebellar Granule Neurons

Source: Laaper, M., et al. <a href="https://app.jove.com/v/55871">Modeling Neuronal Death and Degeneration in Mouse Primary Cerebellar Granule Neurons.</a> J. Vis. Exp. (2017)
This video demonstrates the technique for isolating and culturing primary mouse cerebellar granule neurons. Cells are treated with an antimetabolite to eliminate proliferating glial cells and produce a pure culture of cerebellar granule neurons.

マウス初代小脳顆粒ニューロンの単離と培養

All procedures involving sample collection have been performed in accordance with the institute&#39;s IRB guidelines.
1. Experimental Preparation
NOTE: ...

小脳顆粒ニューロンの遺伝子操作

要約

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この動画の章

チック小脳スライスと顆粒細胞前駆体の空間的にターゲットを絞ったエレクトロポレーションの ex vivo培養

神経形態形成の研究のための方法：

ポストナタールマウス小脳顆粒ニューロン前駆細胞と神経細胞の単離と培養

CRISPR を介した損失関数における小脳顆粒細胞のエレクトロポレーション法による遺伝子導入の子宮内を使用して

共焦点肉眼検査を使用した生後小脳顆粒細胞の移動のex vivoイメージング

神経細胞死とマウスプライマリ小脳顆粒ニューロンの変性をモデリング

in vivo生後エレクトロポレーションによる小脳顆粒ニューロンの形態とシナプス発生の研究

マウス初代小脳顆粒ニューロンにおける神経損傷のモデル化

マウス小脳顆粒ニューロンにおける活性酸素種誘発性ニューロン死のモデル化

マウス初代小脳顆粒ニューロンの単離と培養

小脳顆粒ニューロンの遺伝子操作

要約

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チック小脳スライスと顆粒細胞前駆体の空間的にターゲットを絞ったエレクトロポレーションの ex vivo培養

神経形態形成の研究のための方法：

ポストナタールマウス小脳顆粒ニューロン前駆細胞と神経細胞の単離と培養

CRISPR を介した損失関数における小脳顆粒細胞のエレクトロポレーション法による遺伝子導入の子宮内を使用して

共焦点肉眼検査を使用した生後小脳顆粒細胞の移動のex vivoイメージング

神経細胞死とマウス プライマリ小脳顆粒ニューロンの変性をモデリング

in vivo生後エレクトロポレーションによる小脳顆粒ニューロンの形態とシナプス発生の研究

マウス初代小脳顆粒ニューロンにおける神経損傷のモデル化

マウス小脳顆粒ニューロンにおける活性酸素種誘発性ニューロン死のモデル化

マウス初代小脳顆粒ニューロンの単離と培養

神経細胞死とマウスプライマリ小脳顆粒ニューロンの変性をモデリング