この作品は、LNNにルンドベックジュニアグループリーダーフェローシップによってサポートされていました。 PWWは自然科学とカナダの工学研究評議会（NSERC）からの助成金のサポートを認めるものです。また、ディスク顕微鏡を回転へのアクセスのために、南デンマーク大学のデンマークの分子バイオイメージングセンターに感謝します。

KICS分析のための原形質膜におけるEGFPタグ化タンパク質の獲得は、落射蛍光顕微鏡、TIRFセットアップまたは目的の膜の画像を取得するように設定スピニングディスク顕微鏡で行うことができる。カメラの画素サイズ、並びに画像フレーム間の時間は、分析のために必要とされる。 4-30 60Hzのフレームレートで100-1,200フレームの画像シーケンスを分析のために使用することができる。取得の間、撮像期間を通して焦点で膜を維持し、蛍光が均一に分布された平膜の画分に集中することが重要である。小胞の移動、突出膜領域および細胞小器官は、後の分析の過程で行うトリミングすることができます。セルのドリフトや動きがないように、収集時間が選択されるべきである。 MATLAB用KICSコードスクリプトを取得するには、ポール·ワイズマンにお問い合わせください（Paul.Wiseman @ McGill.ca）。 KICSコードが初めて使用されるとき、オープンMATラボと、ファイルをクリックし、設定されたパスは、サブフォルダで[追加]をクリックし、KICSコードが置かれているコンピュータ上のフォルダを探します。その後、[OK]をクリックし、保存して閉じ。今、次のポイントで説明する作物の分析に進みます。 1。TIFFスタックとしてイメージング解析プログラムに目的のイメージシーケンスをインポート stack1.tif：名前でファイルを保存します。 <ol><li>移動細胞小器官を除いた、膜領域を突出膜の平坦部に関心領域（ROI）の矩形領域を選択します。十分な統計が良好なk 2をプロットするために生成されるようにトリミングサイズが選択される。 </li><li>地域をクロップして、適切なフォルダにTIFFファイルとして作物を保存します。同じ映画からいくつかの作物がある場合は、 例えば 、「stack1crop.tif &quot;、&quot; stack1crop2.tif &quot;、&quot; stack1crop3.tifを「数の増分を使用しています。 </li><li>ローカルで作物を含むフォルダを配置コンピュータ上ではなくサーバー上で、KICS分析をしている間。 </li></ol> 2。分析を実行する一つ解析ソフトウェアの一つに作物をインポート<ol><li>コマンドウィンドウでMATLABやタイプ &quot;icsgui」を開いて、ENTERを押します。 ICS GUIは、画像相関分光法グラフィカル·ユーザー·インターフェース·プログラムのための実行可能ファイルの名前である。 </li><li> ICSのGUIで「KICS」タブをクリックします。分析ウィンドウのスクリーンショットを図1に示す。 </li><li>フォルダ名「MATLABコード」とフォルダを検索し、ファイル名のファイルまでスクロールし、「スクリプト」とダブルクリックして、これを開きます。または、ファイルを右クリックし、 &quot;MATLABで開く&quot;やファイルへ移動、MATLABでのオープンとスクリプトファイルを開く]を選択します。このファイルは、エディタと呼ばれています。 </li><li>エディタのスクロールの「ロードKICSデータセット」と、それから始まるコマンドラインにファイル名とフォルダの場所をコピーまたは入力してIMG = 例えば &quot;：ユーザードキュメント AQP3dynamics stack1crop.tif C」と。 例えば、[1:500] -フォルダの場所を以下のコマンドラインでは、分析されるフレーム数を設定します。データ系列内のすべての連続した​​映画のために同じ設定を使用します。後のフレームの焦点ドリフトが存在する場合、これらは分析から除外されるべきである。 </li><li>エディタで「保存」してから「セルを評価する」をクリックします。データセットは、現在分析中にソフトウェアにロードされる。 </li><li> GUIのKICS分析]ウィンドウでは、解析のための設定を入力します。 <ol><li> 「T細胞」のボックスをUnclick。 </li><li>入力した時間数を分析することが遅れる。タイムラグ（τ）の数は、拡散プロットに影響しますし、拡散プロットが直線的になるように選択しなければならない。 25を入力して起動し、拡散プロットは線形であるところにまで減少。 τはKICS分析を比較し、時間差が時間bが-遅れ時間の数であるetween 1フレームと次。線形プロットを与える最小の値を選択する必要があります。線形適合が得られるように時間の最大数は、より高い値がライン嵌合できないデータを生成する選択し、選択されたラグ。 </li><li>最大K 2の値を入力します（ 図1の円1を参照）、それは通常、20から50です。良好なk 2をプロットラインに沿って分布している多数のデータポイントが存在するプロットである。 70を入力し始めて、K 2と拡散プロットを評価し、データが直線のまわりのクラスタを指す最も低い値を選択した後に減少する。 kは2値はフーリエ空間における空間kベクトルの二乗の大きさである。 最初に、解析は最高の値が決定されるまで、データ系列のすべての連続した映画のために同じ設定を使用し、繰り返したが、常に選択した設定は、データへの良好なフィット感を与えていることを確認する必要があります。良いKを2プロットと線形拡散プロット。 </li><li> 「ストアの設定をして続行」をクリックします。 </li><li>すべてのグラフを表示するには「はい」ボタンをクリックします。 </li><li> 「ロード·イメージシリーズ」（ 図1の円2参照）をクリックして、「ワークスペース」をクリックしてください。 </li><li> 「imgSerCrop」を選択して、「ワークスペースからインポート」をクリックしてください。 </li><li>イメージング·システム収集の設定を入力します。ボックスに「画素サイズ」は、画像スタックが取得される撮像システムのための投影されたピクセルサイズを入力する。 AQP3-EGFPについては、0.111を用いた。ボックス」フレーム間の時間（秒）を入力 &quot;は、0.1150はAQP3-EGFPのために使用した。 </li><li> 「関心領域を選択」をクリックし、「1」を入力し、[OK]をクリックし、「画像全体を使用する」。 </li><li> 「ドゥKICS分析」をクリックして、「不動のフィルタリング」を行うには、[はい]をクリックします。結果は画像として自動的に開きます。 </li><li>設定ウィンドウを最小化し、セル情報WINDOを最小限に抑えるW、および光物理ウィンドウを最小化します。ダイナミクスウィンドウで、ダイナミクスのプロットは、データ点を相関させ、自由拡散を想定することができることを意味し、負の傾きを持つラインにデータの線形近似を示していることを確認します。特定のタイムラグのための拡散係数を記録し、2の設定を（それがフィットの標準偏差を注意することは必要ありません）K。 K 2のプロットのデータポイントは、遅れている所定の時間線の周りのクラスタ化されなければならない。 </li><li>チェックボックス &quot;イメージとしてオープン数値を保存」、結果ファイルを保存する」イメージとしてオープン数値を保存」をクリックしてください。 Cの下に新しいフォルダに保存：ユーザードキュメントはAQP3diffusionを。 「明確な現在のデータを &quot;クリックして次の作物の分析に進みます。 </li></ol></li></ol>計算された拡散係数3。平均は、分析したデータの概​​要を把握するために計算されている<ol><li> SPREに各ROIから個々の拡散係数を入力してくださいadsheet（τに注意し、2の値をkとを確認してください）、以上のように作物の名前を使用します。 </li><li>表計算プログラムを使用して、平均拡散係数と標準偏差を計算する。 </li><li> 5％の有意水準を使用して統計的差異を評価するために、コルモゴロフ - スミルノフ検定や学生のt検定を実行します。細胞（例えば、未処理対処理された）との間のQuantitaveの比較を行うことができる。 </li><li>それぞれの作物のための解析ソフトウェアによって生成され、各時間遅れのために、各条件についてのデータを平均化した拡散プロットのスプレッドシートのバージョンを開く。論文やプレゼンテーションで提示するための新たな平均を拡散プロットを生成します。 </li></ol>

<ol>
	<li>Kolin, D. L., Ronis, D., Wiseman, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=k-Space+image+correlation+spectroscopy:+A+method+for+accurate+transport+measurements+independent+of+fluorophore+photophysics.">k-Space image correlation spectroscopy: A method for accurate transport measurements independent of fluorophore photophysics.</a> Biophysical Journal. 91, 3061-3075 (2006).</li><li>Saxton, M. J., Jacobson, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-particle+tracking:+Applications+to+membrane+dynamics.">Single-particle tracking: Applications to membrane dynamics.</a> Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 26, 373-399 (1997).</li><li>Bannai, H., Levi, S., Schweizer, C., Dahan, M., Triller, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+the+lateral+diffusion+of+membrane+molecules+with+quantum+dots.">Imaging the lateral diffusion of membrane molecules with quantum dots.</a> Nat Protoc. 1, 2628-2634 (2006).</li><li>Jaqaman, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robust+single-particle+tracking+in+live-cell+time-lapse+sequences.">Robust single-particle tracking in live-cell time-lapse sequences.</a> Nat Methods. 5, 695-702 (2008).</li><li>Pinaud, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+partitioning+of+a+glycosyl-phosphatidylinositol-anchored+protein+in+glycosphingolipid-rich+microdomains+imaged+by+single-quantum+dot+tracking.">Dynamic partitioning of a glycosyl-phosphatidylinositol-anchored protein in glycosphingolipid-rich microdomains imaged by single-quantum dot tracking.</a> Traffic. 10, 691-712 (2009).</li><li>Wieser, S., Axmann, M., Schutz, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Versatile+analysis+of+single-molecule+tracking+data+by+comprehensive+testing+against+Monte+Carlo+simulations.">Versatile analysis of single-molecule tracking data by comprehensive testing against Monte Carlo simulations.</a> Biophys J. 95, 5988-6001 (2008).</li><li>Sbalzarini, I. F., Koumoutsakos, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Feature+point+tracking+and+trajectory+analysis+for+video+imaging+in+cell+biology.">Feature point tracking and trajectory analysis for video imaging in cell biology.</a> Journal of Structural Biology. 151, 182-195 (2005).</li><li>Durisic, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+and+correction+of+blinking+bias+in+image+correlation+transport+measurements+of+quantum+dot+tagged+macromolecules.">Detection and correction of blinking bias in image correlation transport measurements of quantum dot tagged macromolecules.</a> Biophys J. 93, 1338-1346 (2007).</li><li>Umenishi, F., Verbavatz, J. M., Verkman, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=cAMP+regulated+membrane+diffusion+of+a+green+fluorescent+protein-aquaporin+2+chimera.">cAMP regulated membrane diffusion of a green fluorescent protein-aquaporin 2 chimera.</a> Biophys J. 78, 1024-1035 (2000).</li><li>Levin, M. H., Haggie, P. M., Vetrivel, L., Verkman, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diffusion+in+the+endoplasmic+reticulum+of+an+aquaporin-2+mutant+causing+human+nephrogenic+diabetes+insipidus.">Diffusion in the endoplasmic reticulum of an aquaporin-2 mutant causing human nephrogenic diabetes insipidus.</a> The Journal of biological chemistry. 276, 21331-21336 (2001).</li><li>Semrau, S., Schmidt, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Particle+image+correlation+spectroscopy+(PICS):+retrieving+nanometer-scale+correlations+from+high-density+single-molecule+position+data.">Particle image correlation spectroscopy (PICS): retrieving nanometer-scale correlations from high-density single-molecule position data.</a> Biophys J. 92, 613-621 (2007).</li><li>Petersen, N. O., Hoddelius, P. L., Wiseman, P. W., Seger, O., Magnusson, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitation+of+membrane+receptor+distributions+by+image+correlation+spectroscopy:+concept+and+application.">Quantitation of membrane receptor distributions by image correlation spectroscopy: concept and application.</a> Biophys J. 65, 1135-1146 (1993).</li><li>Marlar, S., Arnspang, E. C., Koffman, J. S., L&#248;cke, E. M., Christensen, B. M., Nejsum, L. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elevated+cAMP+increases+aquaporin-3+plasma+membrane+diffusion.">Elevated cAMP increases aquaporin-3 plasma membrane diffusion.</a> Am J Physiol Cell Physiol. 306, (2014).</li></ol>

著者は、彼らが競合する経済的利益を持っていないことを宣言します。

本論文では、蛍光タンパク質で標識されたタンパク質の顕微鏡画像から拡散係数を決定するために、KICS解析法を適用する方法の詳細なステップバイステップの概要を発表した。分析は、標識密度の非常に広いダイナミックレンジを有するプローブの選択とは無関係であり、従って、量子ドットならびにEGFPのような色素および蛍光タンパク質で標識されたタンパク質に適用することができる?...

原形質膜タンパク質の4次元空間時間的組織及び横移動度が厳密に調節され、タンパク質の機能、活性およびタンパク質 - タンパク質相互作用において役割を果たし得る。原形質膜タンパク質の側方拡散は、伝統的に、量子ドットのタイムラプス撮影から単一の粒子のための拡散係数を計算するか、標識された細胞膜タンパク質2-4を染色することによって研究されている。このアプローチは、タンパク質の折り畳みおよび機能が損なわれる可能性があり、したがって、いくつかのタンパク質のために達成することができない量子ドットまたは染料標識のための原形質膜タンパク質、細胞外のタグの挿入を必要とする。量子ドットの立体容積が5タンパク質の拡散を遅くすることが示されており、また、集団内のタンパク質の小さな部分だけが量子ドットで標識され、そしてこの画分は合計で表す場合、それは知られていない原形質膜タンパク質のプール。単一粒子TRAcking量子ドット標識されたタンパク質の画像シリーズからの拡散係数の（SPT）の測定は、大規模な解析アルゴリズムに続く2次元ガウスフィットの粒子の画像化されたピーク位置をマッピングが含まれます。分析は、顕微鏡点広がり関数（典型的には2次元空間ガウシアン）と記述する粒子軌道にパーティクル位置のその後の架橋の近似値に経時系列の画像フレームごとに大規模な非線形曲線フィッティングを必要とする、計算上非常に集約的である単一分子6,7の動き。 最近開発された画像相関法はk空間イメージ相関分光法（KICS）は、蛍光原形質膜タンパク質をタグ化拡散係数の相対的な単純な測定を可能にする。日常的にKICSによって蛍光タンパク質で標識された膜タンパク質の拡散係数を計算する可能性が成立するユニークなツールである従来の量子井戸に比べていくつかの利点がSPT分析ドット：細胞外標識を消費し、細胞外のタグと時間の無挿入が必要とされない（蛍光タンパク質を発現する細胞株が使用されてもよい）;拡散係数は、量子ドットで標識されたサブセットと比較して、蛍光タンパク質のプール全体から抽出され;分析は、単一のタンパク質を追跡する必要なく、簡単であり、分析は、追加のユーザプログラミングのための要件なしで既存のコードを使用して行うことができる。これは拡散係数の高速計算及び計算を可能に平均化技術であるため、この方法は迅速である。タンパク質の人口のためにこれらの急速な普及の測定は、骨の折れるSPT法による人口のサブ​​セットに対して得、より詳細な分子の輸送情報を補完します。 KICS時間は、第1のフーリエ空間に変換されている蛍光顕微鏡画像シーケンスを相関し、それによってオンスを分離する分子輸送1によるものと光物理のためuorescence変動。その結果、KICSは数密度、流速、および複雑な光退色によって、公正なあるかまたはフルオロフォアの点滅しながら、蛍光標識された分子の拡散を決定することができる。これは、KICSすばやくカスタム書き込みアルゴリズムの必要なしに蛍光標識された細胞膜タンパク質の拡散動力学を決定するための有用なツールとなる。他に蛍光標識されたタンパク質は、KICSはまた、量子ドットで標識された膜タンパク質8に適用することができる。 本稿では、コ​​ードとどのように生成されたプロットを、評価するための使用方法を、作物を配置する方法を示すことにより、EGFPタグ化細胞膜タンパク質の拡散係数を抽出するためにKICSを使用する方法のステップバイステップの概要を説明した拡散から係数が抽出される。一例として、半全反射顕微鏡において、ディスクセットを紡糸して得られたデータは、蛍光を発するEGFPでタグ付けされた腎臓の水チャネルタンパク質アクアポリン3（AQP3）のNCE（TIRF）モードでは、提示されている。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="406">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DMEM</td>
			<td style="width:71px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">31600-083</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">FBS</td>
			<td style="width:71px;">Invitrogen</td>
			<td>10082147</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Penicilin&#160;&#160;</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/13752?lang=en&amp;region=DK">13752</a></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Kanamycin</td>
			<td style="width:71px;">Gibco</td>
			<td>15160070</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Streptomycin</td>
			<td style="width:71px;">Gibco</td>
			<td>11860038</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Phenol red free medium</td>
			<td style="width:71px;">Gibco</td>
			<td>11880-028</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DMSO</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/d8418?lang=en&amp;region=DK">D8418&#160;</a></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">HEPES</td>
			<td style="width:71px;">Gibco</td>
			<td>15630056</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Apparatus</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Spinning Disk Microscope</td>
			<td style="width:71px;">Nikon</td>
			<td style="width:119px;">Ti Eclipse</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">EMCCD Camera</td>
			<td style="width:71px;">Andor</td>
			<td style="width:119px;">Ixon+</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

easy measurement of diffusion coefficients of egfp-tagged plasma membrane proteins using k-space image correlation spectroscopy

横方向の拡散および原形質膜タンパク質の区画化は、細胞内で緊密に調節され、従って、これらのプロセスを研究することは、原形質膜タンパク質の機能および調節への新しい洞察を明らかにする。最近ではk空間イメージ相関分光法（KICS）1は、プローブ光物理学によって導入系統的な偏りを回避し、蛍光タグ付き原形質膜タンパク質の画像から直接拡散係数のルーチン測定を可能にするために開発された。分析のための理論的基礎は複雑であるが、この方法は、タンパク質の拡散係数を測定するために自由に利用可能なコードを用いてnonexpertsによって実現することができる。 KICSは逆数（のk）空間に、各画像をフーリエ変換した後に蛍光顕微鏡画像スタックから時間相関関数を計算する。続いて、平均円形、自然対数変換及び線形相関関数にフィットする拡散係数が得られる。この論文は、KICS介して画像解析し、拡散係数の測定にステップバイステップのガイドを提供しています。 まず、蛍光標識された原形質膜タンパク質の高フレームレート画像シーケンスは、蛍光顕微鏡を用いて取得される。次いで、関心領域（ROI）、細胞内小器官を避け小胞の移動やメンブレン領域の突出が選択される。 ROIのスタックは、自由に利用可能なコードにインポートされ、いくつかの定義されたパラメータ（方法の項を参照）がKICS解析のために設定されている。次に、プログラムは、k空間時間相関関数からのプロット &quot;斜面の傾き」を生成し、拡散係数はプロットの勾配から計算される。以下腎水路アクアポリン3標準的な例として、EGFPでタグを用いて、膜タンパク質の拡散係数を測定するためのステップバイステップKICS手順である。

KICSと、分析されるべき適切な画像スタックを取得するために、異なる顕微鏡システムを使用することができる。なお、落射蛍光顕微鏡ならびにTIRFまたはスピニングディスクセットアップから画像シーケンスを分析することが可能である。膜は、任意の大規模な移動、細胞小器官なしで、または小胞/オブジェクトを移動平面である必要があります。本稿では、9.2ヘルツのフレームレートで原...

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Easy Measurement of Diffusion Coefficients of EGFP-tagged Plasma Membrane Proteins Using k-Space Image Correlation Spectroscopy

本論文では、生きた哺乳動物細胞内で蛍光標識した細胞膜タンパク質の拡散係数を測定するための変動解析手法のk空間画像相関分光法（KICS）のステップバイステップガイドを提供しています。

k空間画像相関分光法を用いて、EGFPタグ付きプラズマ膜タンパク質の拡散係数を簡単に測定

Lateral diffusion and compartmentalization of plasma membrane proteins are tightly regulated in cells and thus, studying these processes will reveal new ...

easy-measurement-diffusion-coefficients-egfp-tagged-plasma-membrane

Research

JoVE Journal

Biology

10.6K ビュー.  Aarhus University. 本論文では、生きた哺乳動物細胞内で蛍光標識した細胞膜タンパク質の拡散係数を測定するための変動解析手法のk空間画像相関分光法（KICS）のステップバイステップガイドを提供しています。 

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Measuring Diffusion Coefficients via Two-photon Fluorescence Recovery After Photobleaching

Multi-fluorescence recovery after photobleaching is a microscopy technique used to measure the diffusion coefficient (or analogous transport parameters) of macromolecules, and can be applied to both in vitro and in vivo biological systems. Multi-fluorescence recovery after photobleaching is performed by photobleaching a region of interest within a fluorescent sample using an intense laser flash, then attenuating the beam and monitoring the fluorescence as still-fluorescent molecules from outside the region of interest diffuse in to replace the photobleached molecules. We will begin our demonstration by aligning the laser beam through the Pockels Cell (laser modulator) and along the optical path through the laser scan box and objective lens to the sample. For simplicity, we will use a sample of aqueous fluorescent dye. We will then determine the proper experimental parameters for our sample including, monitor and bleaching powers, bleach duration, bin widths (for photon counting), and fluorescence recovery time. Next, we will describe the procedure for taking recovery curves, a process that can be largely automated via LabVIEW (National Instruments, Austin, TX) for enhanced throughput. Finally, the diffusion coefficient is determined by fitting the recovery data to the appropriate mathematical model using a least-squares fitting algorithm, readily programmable using software such as MATLAB (The Mathworks, Natick, MA).

In this article we will describe the procedure for measuring diffusion coefficients using multi-photon fluorescence recovery after photobleaching. We will begin by aligning the laser along the optical path to the sample and determining the proper experimental parameters, then continue generating and finally fitting fluorescence recovery curves.

光退色後二光子蛍光回復を経由して拡散係数の測定

Multi-fluorescence recovery after photobleaching is a microscopy technique used to measure the diffusion coefficient (or analogous transport parameters) ...

生物学

Crystallizing Membrane Proteins for Structure Determination using Lipidic Mesophases

A detailed protocol for crystallizing membrane proteins by using lipidic mesophases is described. This method has variously been referred to as the lipidic cubic phase or in meso method. The method has been shown to be quite versatile in that it has been used to solve X-ray crystallographic structures of prokaryotic and eukaryotic proteins, proteins that are monomeric, homo- and hetero-multimeric, chromophore-containing and chromophore-free, and alpha-helical and beta-barrel proteins. Recent successes using in meso crystallization are the human engineered beta2-adrenergic and adenosine A2a G protein-coupled receptors. Protocols are presented for reconstituting the membrane protein into the monoolein-based mesophase, and for setting up crystallizations in the manual mode. Additional steps in the overall process, such as crystal harvesting, are to be addressed in future video articles. The time required to prepare the protein-loaded mesophase and to set up a crystallization plate manually is about one hour.

Herein is described the procedure implemented in the Caffrey Membrane Structural and Functional Biology Group to set up manually crystallization trials of membrane proteins in lipidic mesophases.

脂質中間相を用いた構造決定のための膜タンパク質の結晶化

A detailed protocol for crystallizing membrane proteins by using lipidic mesophases is described. This method has variously been referred to as the ...

Quantitative Measurement of GLUT4 Translocation to the Plasma Membrane by Flow Cytometry

Glucose is the main source of energy for the body, requiring constant regulation of its blood concentration. Insulin release by the pancreas induces glucose uptake by insulin-sensitive tissues, most notably the brain, skeletal muscle, and adipocytes. Patients suffering from type-2 diabetes and/or obesity often develop insulin resistance and are unable to control their glucose homeostasis. New insights into the mechanisms of insulin resistance may provide new treatment strategies for type-2 diabetes.
The GLUT family of glucose transporters consists of thirteen members distributed on different tissues throughout the body1. Glucose transporter type 4 (GLUT4) is the major transporter that mediates glucose uptake by insulin sensitive tissues, such as the skeletal muscle. Upon binding of insulin to its receptor, vesicles containing GLUT4 translocate from the cytoplasm to the plasma membrane, inducing glucose uptake. Reduced GLUT4 translocation is one of the causes of insulin resistance in type-2 diabetes2,3.
The translocation of GLUT4 from the cytoplasm to the plasma membrane can be visualized by immunocytochemistry, using fluorophore-conjugated GLUT4-specific antibodies.
Here, we describe a technique to quantify total amounts of GLUT4 translocation to the plasma membrane of cells during a chosen duration, using flow cytometry. This protocol is rapid (less than 4 hours, including incubation with insulin) and allows the analysis of as few as 3,000 cells or as many as 1 million cells per condition in a single experiment. It relies on anti-GLUT4 antibodies directed to an external epitope of the transporter that bind to it as soon as it is exposed to the extracellular medium after translocation to the plasma membrane.

This protocol describes a rapid technique to quantify the translocation of GLUT4 from the cytoplasm to the plasma membrane of cells by flow cytometry.

フローサイトメトリーによる細胞膜へのGLUT4転の定量的測定

Glucose is the main source of energy for the body, requiring constant regulation of its blood concentration. Insulin release by the pancreas induces ...

Crystallization of Membrane Proteins in Lipidic Mesophases

Membrane proteins perform critical functions in living cells related to signal transduction, transport and energy transformations, and, as such, are implicated in a multitude of malfunctions and diseases. However, a structural and functional understanding of membrane proteins is strongly lagging behind that of their soluble partners, mainly, due to difficulties associated with their solubilization and generation of diffraction quality crystals. Crystallization in lipidic mesophases (also known as in meso or LCP crystallization) is a promising technique which was successfully applied to obtain high resolution structures of microbial rhodopsins, photosynthetic proteins, outer membrane beta barrels and G protein-coupled receptors. In meso crystallization takes advantage of a native-like membrane environment and typically produces crystals with lower solvent content and better ordering as compared to traditional crystallization from detergent solutions. The method is not difficult, but requires an understanding of lipid phase behavior and practice in handling viscous mesophase materials. Here we demonstrate a simple and efficient way of making LCP and reconstituting a membrane protein in the lipid bilayer of LCP using a syringe mixer, followed by dispensing nanoliter portions of LCP into an assay or crystallization plate, conducting pre-crystallization assays and harvesting crystals from the LCP matrix. These protocols provide a basic guide for approaching in meso crystallization trials; however, as with any crystallization experiment, extensive screening and optimization are required, and a successful outcome is not necessarily guaranteed.

The protocols describe the essential steps for obtaining diffraction quality crystals of a membrane protein starting from reconstitution of the protein in a lipidic cubic phase (LCP), finding initial conditions with LCP-FRAP pre-crystallization assays, setting up LCP crystallization trials and harvesting crystals.

脂質中間相における膜タンパク質の結晶化

Membrane proteins perform critical functions in living cells related to signal transduction, transport and energy transformations, and, as such, are ...

Quantification of Proteins Using Peptide Immunoaffinity Enrichment Coupled with Mass Spectrometry

There is a great need for quantitative assays in measuring proteins. Traditional sandwich immunoassays, largely considered the gold standard in quantitation, are associated with a high cost, long lead time, and are fraught with drawbacks (e.g. heterophilic antibodies, autoantibody interference, 'hook-effect').1 An alternative technique is affinity enrichment of peptides coupled with quantitative mass spectrometry, commonly referred to as SISCAPA (Stable Isotope Standards and Capture by Anti-Peptide Antibodies).2 In this technique, affinity enrichment of peptides with stable isotope dilution and detection by selected/multiple reaction monitoring mass spectrometry (SRM/MRM-MS) provides quantitative measurement of peptides as surrogates for their respective proteins. SRM/MRM-MS is well established for accurate quantitation of small molecules 3, 4 and more recently has been adapted to measure the concentrations of proteins in plasma and cell lysates.5-7 To achieve quantitation of proteins, these larger molecules are digested to component peptides using an enzyme such as trypsin. One or more selected peptides whose sequence is unique to the target protein in that species (i.e. "proteotypic" peptides) are then enriched from the sample using anti-peptide antibodies and measured as quantitative stoichiometric surrogates for protein concentration in the sample. Hence, coupled to stable isotope dilution (SID) methods (i.e. a spiked-in stable isotope labeled peptide standard), SRM/MRM can be used to measure concentrations of proteotypic peptides as surrogates for quantification of proteins in complex biological matrices. The assays have several advantages compared to traditional immunoassays. The reagents are relatively less expensive to generate, the specificity for the analyte is excellent, the assays can be highly multiplexed, enrichment can be performed from neat plasma (no depletion required), and the technique is amenable to a wide array of proteins or modifications of interest.8-13 In this video we demonstrate the basic protocol as adapted to a magnetic bead platform.

Stable Isotope Standards and Capture by Anti-Peptide Antibodies (SISCAPA) couples affinity enrichment of peptides with stable isotope dilution mass spectrometry (MRM-MS) to provide quantitative measurement of peptides as surrogates for their respective proteins. Here we describe the protocol using magnetic particles in a partially automated format.

質量分析法とあいまってペプチドイムノエンリッチメントを使用したタンパク質の定量化

There is a great need for quantitative assays in measuring proteins. Traditional sandwich immunoassays, largely considered the gold standard in ...

Mapping Molecular Diffusion in the Plasma Membrane by Multiple-Target Tracing (MTT)

Our goal is to obtain a comprehensive description of molecular processes occurring at cellular membranes in different biological functions. We aim at characterizing the complex organization and dynamics of the plasma membrane at single-molecule level, by developing analytic tools dedicated to Single-Particle Tracking (SPT) at high density: Multiple-Target Tracing (MTT)1. Single-molecule videomicroscopy, offering millisecond and nanometric resolution1-11, allows a detailed representation of membrane organization12-14 by accurately mapping descriptors such as cell receptors localization, mobility, confinement or interactions.
We revisited SPT, both experimentally and algorithmically. Experimental aspects included optimizing setup and cell labeling, with a particular emphasis on reaching the highest possible labeling density, in order to provide a dynamic snapshot of molecular dynamics as it occurs within the membrane. Algorithmic issues concerned each step used for rebuilding trajectories: peaks detection, estimation and reconnection, addressed by specific tools from image analysis15,16. Implementing deflation after detection allows rescuing peaks initially hidden by neighboring, stronger peaks. Of note, improving detection directly impacts reconnection, by reducing gaps within trajectories. Performances have been evaluated using Monte-Carlo simulations for various labeling density and noise values, which typically represent the two major limitations for parallel measurements at high spatiotemporal resolution.
The nanometric accuracy17 obtained for single molecules, using either successive on/off photoswitching or non-linear optics, can deliver exhaustive observations. This is the basis of nanoscopy methods17 such as STORM18, PALM19,20, RESOLFT21 or STED22,23, which may often require imaging fixed samples. The central task is the detection and estimation of diffraction-limited peaks emanating from single-molecules. Hence, providing adequate assumptions such as handling a constant positional accuracy instead of Brownian motion, MTT is straightforwardly suited for nanoscopic analyses. Furthermore, MTT can fundamentally be used at any scale: not only for molecules, but also for cells or animals, for instance. Hence, MTT is a powerful tracking algorithm that finds applications at molecular and cellular scales.

Mapping Molecular Diffusion in the Plasma Membrane by Multiple-Target Tracing MTT

Multiple-Target Tracing is a homemade algorithm developed for tracking individually labeled molecules within the plasma membrane of living cells. Efficiently detecting, estimating and tracing molecules over time at high-density provide a user-friendly, comprehensive tool to investigate nanoscale membrane dynamics.

複数のターゲットトレース（MTT）による原形質膜中の分子拡散のマッピング

Our goal is to obtain a comprehensive description of molecular processes occurring at cellular membranes in different biological functions. We aim at ...

Use of a Robot for High-throughput Crystallization of Membrane Proteins in Lipidic Mesophases

Structure-function studies of membrane proteins greatly benefit from having available high-resolution 3-D structures of the type provided through macromolecular X-ray crystallography (MX). An essential ingredient of MX is a steady supply of ideally diffraction-quality crystals. The in meso or lipidic cubic phase (LCP) method for crystallizing membrane proteins is one of several methods available for crystallizing membrane proteins. It makes use of a bicontinuous mesophase in which to grow crystals. As a method, it has had some spectacular successes of late and has attracted much attention with many research groups now interested in using it. One of the challenges associated with the method is that the hosting mesophase is extremely viscous and sticky, reminiscent of a thick toothpaste. Thus, dispensing it manually in a reproducible manner in small volumes into crystallization wells requires skill, patience and a steady hand. A protocol for doing just that was developed in the Membrane Structural &amp; Functional Biology (MS&amp;FB) Group1-3. JoVE video articles describing the method are available1,4. 
The manual approach for setting up in meso trials has distinct advantages with specialty applications, such as crystal optimization and derivatization. It does however suffer from being a low throughput method. Here, we demonstrate a protocol for performing in meso crystallization trials robotically. A robot offers the advantages of speed, accuracy, precision, miniaturization and being able to work continuously for extended periods under what could be regarded as hostile conditions such as in the dark, in a reducing atmosphere or at low or high temperatures. An in meso robot, when used properly, can greatly improve the productivity of membrane protein structure and function research by facilitating crystallization which is one of the slow steps in the overall structure determination pipeline. 
In this video article, we demonstrate the use of three commercially available robots that can dispense the viscous and sticky mesophase integral to in meso crystallogenesis. The first robot was developed in the MS&amp;FB Group5,6. The other two have recently become available and are included here for completeness.	
An overview of the protocol covered in this article is presented in Figure 1. All manipulations were performed at room temperature (~20 &deg;C) under ambient conditions.

Herein is described a robotic approach to high-throughput crystallization of membrane proteins in lipidic mesophases for use in structure determination using macromolecular X-ray crystallography. Three robots capable of handling the viscous and sticky protein-laden mesophase integral to the method are introduced.

脂質中間相における膜タンパク質のハイスループット結晶化のためのロボットの使用

Structure-function studies of membrane proteins greatly benefit from having available high-resolution 3-D structures of the type provided through ...

The Cell-based L-Glutathione Protection Assays to Study Endocytosis and Recycling of Plasma Membrane Proteins

Membrane trafficking involves transport of proteins from the plasma membrane to the cell interior (i.e. endocytosis) followed by trafficking to lysosomes for degradation or to the plasma membrane for recycling. The cell based L-glutathione protection assays can be used to study endocytosis and recycling of protein receptors, channels, transporters, and adhesion molecules localized at the cell surface. The endocytic assay requires labeling of cell surface proteins with a cell membrane impermeable biotin containing a disulfide bond and the N-hydroxysuccinimide (NHS) ester at 4 &#186;C -&#160;a temperature at which membrane trafficking does not occur. Endocytosis of biotinylated plasma membrane proteins is induced by incubation at 37 &#186;C. Next, the temperature is decreased again to 4 &#186;C to stop endocytic trafficking and the disulfide bond in biotin covalently attached to proteins that have remained at the plasma membrane is reduced with L-glutathione. At this point, only proteins that were endocytosed remain protected from L-glutathione and thus remain biotinylated. After cell lysis, biotinylated proteins are isolated with streptavidin agarose, eluted from agarose, and the biotinylated protein of interest is detected by western blotting. During the recycling assay, after biotinylation cells are incubated at 37 &#176;C to load endocytic vesicles with biotinylated proteins and the disulfide bond in biotin covalently attached to proteins remaining at the plasma membrane is reduced with L-glutathione at 4 &#186;C as in the endocytic assay. Next, cells are incubated again at 37 &#176;C to allow biotinylated proteins from endocytic vesicles to recycle to the plasma membrane. Cells are then incubated at 4 &#186;C, and the disulfide bond in biotin attached to proteins that recycled to the plasma membranes is reduced with L-glutathione. The biotinylated proteins protected from L-glutathione are those that did not recycle to the plasma membrane.

Membrane trafficking involves transport of proteins from the plasma membrane to the cell interior (i.e. endocytosis) followed by trafficking to lysosomes for degradation or to the plasma membrane for recycling. Methods described in this article are designed to study endocytosis and recycling of plasma membrane proteins.

セルベースの​​L-グルタチオン保護アッセイ細胞膜タンパク質のエンドサイトーシスとリサイクルを研究するために、

Membrane trafficking involves transport of proteins from the plasma membrane to the cell interior (i.e. endocytosis) followed by trafficking to lysosomes ...

Imaging Plasma Membrane Deformations With pTIRFM

To gain novel insights into the dynamics of exocytosis, our group focuses on the changes in lipid bilayer shape that must be precisely regulated during the fusion of vesicle and plasma membranes. These rapid and localized changes are achieved by dynamic interactions between lipids and specialized proteins that control membrane curvature. The absence of such interactions would not only have devastating consequences for vesicle fusion, but a host of other cellular functions that involve control of membrane shape. In recent years, the identity of a number of proteins with membrane-shaping properties has been determined. What remains missing is a roadmap of when, where, and how they act as fusion and content release progress.
Our understanding of the molecular events that enable membrane remodeling has historically been limited by a lack of analytical methods that are sensitive to membrane curvature or have the temporal resolution to track rapid changes. PTIRFM satisfies both of these criteria. We discuss how pTIRFM is implemented to visualize and interpret rapid, submicron changes in the orientation of chromaffin cell membranes during dense core vesicle (DCV) fusion. The chromaffin cells we use are isolated from bovine adrenal glands. The membrane is stained with a lipophilic carbocyanine dye,1,1&#39;-dioctadecyl-3,3,3&#39;,3&#39;-tetramethylindodicarbocyanine, 4-chlorobenzenesulfonate, or&#160;diD. DiD intercalates in the membrane plane with a &#34;fixed&#34; orientation and is therefore sensitive to the polarization of the evanescent field. The diD-stained cell membrane is sequentially excited with orthogonal polarizations of a 561&#160;nm laser (p-pol, s-pol). A 488&#160;nm laser is used to visualize vesicle constituents and time the moment of fusion. Exocytosis is triggered by locally perfusing cells with a depolarizing KCl solution. Analysis is performed offline using custom-written software to understand how diD emission intensity changes relate to fusion pore dilation.

Polarization-based Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy (pTIRFM) enables real-time detection of cell membrane dynamics. This article describes the implementation of pTIRFM for the study of membrane remodeling during regulated exocytosis. The technique is generalizable to other processes in cell biology that directly or indirectly involve changes in membrane shape.

pTIRFMによる画像形成細胞膜変形は

To gain novel insights into the dynamics of exocytosis, our group focuses on the changes in lipid bilayer shape that must be precisely regulated during ...

Using Digital Image Correlation to Characterize Local Strains on Vascular Tissue Specimens

Characterization of the mechanical behavior of biological and engineered soft tissues is a central component of fundamental biomedical research and product development. Stress-strain relationships are typically obtained from mechanical testing data to enable comparative assessment among samples and in some cases identification of constitutive mechanical properties. However, errors may be introduced through the use of average strain measures, as significant heterogeneity in the strain field may result from geometrical non-uniformity of the sample and stress concentrations induced by mounting/gripping of soft tissues within the test system. When strain field heterogeneity is significant, accurate assessment of the sample mechanical response requires measurement of local strains. This study demonstrates a novel biomechanical testing protocol for calculating local surface strains using a mechanical testing device coupled with a high resolution camera and a digital image correlation technique. A series of sample surface images are acquired and then analyzed to quantify the local surface strain of a vascular tissue specimen subjected to ramped uniaxial loading. This approach can improve accuracy in experimental vascular biomechanics and has potential for broader use among other native soft tissues, engineered soft tissues, and soft hydrogel/polymeric materials. In the video, we demonstrate how to set up the system components and perform a complete experiment on native vascular tissue.

We describe the use of digital image correlation to characterize the local surface strain field on vascular tissue samples subjected to uniaxial tensile testing. These measurements facilitate precise quantification of the sample mechanical response and the generation of constitutive stress-strain relations.

デジタル画像相関を使用すると、血管の組織標本のローカル株を特徴づけるために、

Characterization of the mechanical behavior of biological and engineered soft tissues is a central component of fundamental biomedical research and ...