Name: spot variation fluorescence correlation spectroscopy for analysis of molecular diffusion at the plasma membrane of living cells
Uploaded: 2020-11-12T14:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 56 s
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SB、SM、DMは、CNRS、インサーム、エクス・マルセイユ大学からの機関資金と、フランス国立研究庁(ANR-17-CE15-0032-01およびANR-18-CE15-0021-02)およびフランスの「Investissement d'Avenir」(ANR-10-INBS-04 France-BioImaging、ANR-11-LABX-054 labex INFORM)からのプログラム助成金によって支援されました。KWは、バイオテクノロジーとナノテクノロジーの分野における学際的な環境博士課程研究のプログラムである「BioTechNan」を認識しています。EBは、プロジェクト番号2016/21/D/NZ1/00285に基づくポーランド国立科学センター(NCN)、ならびにフランス政府および在ポーランドフランス大使館の財政的支援を認める。MŁは、ポーランド開発省(CBR POIR.02.01.00-00-0159/15-00/19)および国立研究開発センター(Innochem POIR.01.02.00-00-0064/17)からの財政的支援を認めています。TT は、プロジェクト番号 2016/21/B/NZ3/00343 に基づくポーランド国立科学センター (NCN) およびヴロツワフ バイオテクノロジー センター (KNOW) からの財政的支援を認めています。

著者らには開示するものは何もありません。

ここでは、標準的な蛍光顕微鏡へのsvFCSモジュールの実装、FCS拡散法則解析のおかげで生細胞中の原形質膜組織のダイナミクスを解読するための強力な実験的アプローチについて説明しました。概念的には、svFCSは、照明領域23のサイズを変化させながら時間領域における蛍光の相関測定という単純な原理に基づいている。この戦略は、顕微鏡測定からナノスコピック情報を推論するのに役立っており、定常状態25および生理学的プロセス30、31、32、33における原形質膜組織に寄与する主な物理化学的要素を解読するのに役立つ。全体として、これらのsvFCS分析は、様々な細胞型における脂質依存性ナノドメインの存在と、異なるシグナル伝達事象の同調におけるそれらの直接的な意味合いを明確に実証している。
このフレームワーク内では、光子収差を最適化し、光収差を最小限に抑えるためにsvFCSセットアップを構築する際に考慮する必要がある光学的側面がいくつかあります。したがって、svFCS測定を行う際にチューブレンズを取り外すことができる顕微鏡を使用することをお勧めします。さらに、単一の虹彩がsvFCSセットアップにおいて重要な役割を果たします:それは対物レンズの後方開口部でのビームサイズを変えるので、効果的なウエストサイズ(すなわち、有効励起量)を直接変化させます。ビーム直径は、最小のウエストサイズ34を得るために、客観的な背中の瞳孔に収まるべきである。このオプションは、ウエストサイズの調整に役立ち、光子バジェットの最適化を保証し、実装が簡単です。最後に、光路に沿って最小限の数の光学部品が使用されます。系が複雑でないほど、失われる光子は少なくなります。これらのオプションはすべて、svFCS 実験の堅牢性を大幅に向上させます。
プロトコル自体に関しては、いくつかの重要なステップを考慮する必要があります。最も重要なのは、svFCS測定を成功させるために不可欠な光路の適切なアライメントです(プロトコル、セクション2)。これは、300μWのレーザー照明下で約200kHzの2nM Rh6G溶液からの蛍光シグナルを分析することによって確認するのは簡単です。すべての虹彩を開く必要があり、ACFは重要な振幅(通常はG0〜1.5〜2.0)を持つ必要があります。もう1つの重要な点は、細胞とsvFCS分析のためのそれらの準備に関するものです(プロトコル、セクション4〜8)。それらの密度は、観察される単離された細胞が分析に利用できるように適合させなければならない。非接着細胞は、ポリ-L-リジン溶液を用いてチャンバー付きカバーガラス上に固定化されなければならない。細胞標識からの蛍光シグナルは強すぎてはならず、または適合が困難な非常に平坦なACFをもたらし、適合パラメータは重要な誤差を伴う。さらに、細胞内の非均質な標識および蛍光凝集体は、svFCS測定を解釈することを非常に困難にする。最後に、コレステロールオキシダーゼ処理は細胞生存率に影響し、svFCS分析は治療後1時間を超えてはならない。また、上部原形質膜からの蛍光変動は支持体に付着していないため記録した方がよく、支持体との物理的相互作用による分子の拡散を妨げるおそれがない。
svFCS技術には、検出量を調整するためのモダリティの多様性により、さまざまなアプローチで使用するのに十分な進歩があり、生細胞におけるさまざまな生物学的プロセスを研究することが可能になりました。励起体積のサイズを調整する代替手段は、可変ビームエキスパンダ35を使用することである。また、z方向36に沿って原形質膜の切片からの蛍光シグナルを記録することにより照明領域の大きさを単純に変調することも可能である。これは、拡散則37,38を導出するための理論的枠組みが開発された標準的な共焦点顕微鏡上で行うことができる。
svFCS法は、原形質膜の不均質な側方組織の特性評価に必要な時空間分解能を提供するが、幾何学的閉じ込めモードは相互に排他的ではない。一方向または他の方向へのt0の偏差は、排他的に、支配的な閉じ込めモード25を明らかにする。さらに、本svFCS法の別の重要な限界は、古典的な光回折限界(〜200nm)から生じる。これは、細胞原形質膜内の分子を閉じ込めるドメインよりも疑いなく大きい。したがって、閉じ込めの分析は、拡散の法則から外挿されたt0値から推測される。
この欠点は、代替方法を実装することによって克服されています。当初、ナノアパーチャで穿孔された金属膜を使用して、非常に小さな膜領域(すなわち、75〜250nmの間で変化する半径の単一ナノメートルアパーチャの光学回折限界以下)を照らす可能性を提供しました39。単離ドメイン組織の理論的拡散法則から予測された遷移レジームがこのように報告され、ナノメートル膜の不均一性の特徴的なサイズの精緻化と脂質依存性ナノドメインが占める表面積の定量的推定を可能にした39。あるいは、近接場走査型光学顕微鏡40または平面光ナノアンテナ41を用いたナノメートル照明も開発されている。最近では、誘導放出枯渇(STED)とFCSを組み合わせることで、非常に高い空間分解能で拡散法則を文書化するための強力で敏感なツールが提供されました。このSTED-FCSは、短期間に起こるナノスケールの分子拡散特性へのアクセスを提供し、原形質膜における脂質プローブの動的組織化の研究を可能にする42,43。しかし、STEDプロセスにおける蛍光の不完全な抑制は、FCSにおける自己相関曲線の解析に課題を投げかけている。
この困難を克服するために新しいフィッティングモデルが開発され、拡散時間および平均分子数測定値44の精度が向上した。最後に、原形質膜での分子拡散が遅い場合、svFCS原理は、画像相関分光法45によって記録されたデータに適用することができる。最近、原子間力顕微鏡(AFM)とイメージング全反射FCS(ITIR-FCS)を組み合わせることで、ナノドメイン46の密度が高いため、原形質膜、特にパーコレーション閾値に近い膜構成で分子拡散を妨げるメカニズムの性質の微細化に寄与することが実証されている。
結論として、svFCSによる拡散法則の確立は、動的集団脂質と膜タンパク質の会合によって生じる局所的な不均一性を推測するための実験的証拠を提供してきた。Wohlandと同僚46が述べているように、「FCS拡散法則分析は、動的情報から解像度限界以下の構造的および組織的特徴を推測するための貴重なツールであり続ける」。それでも、原形質膜で起こる分子事象のダイナミクスをよりよく理解できるように、拡散法則の解釈を洗練させる新しいモデルを開発する必要があります。

原形質膜組織の複雑さ 細胞膜組織化の現在の理解は、いくつかの態様1を考慮に入れなければならない。第一に、複合脂質組成は、細胞タイプ間だけでなく、単一の細胞(膜小器官/原形質膜)内でも変化する。その上、関連するまたは内因性の膜タンパク質は、ほとんどが動的多量体複合体で組織化され、大きなドメインが膜の外側に伸びており、膜貫通ドメイン単独の領域よりも有意に広い領域を占める。さらに、膜関連タンパク質は、タンパク質機能を調節する役割を果たす特異的な脂質結合または脂質相互作用能力を示す。これらは、脂質2の局所組成およびアクセシビリティに直接依存する。
最後に、膜タンパク質の固有の不斉構造および脂質の分布のために、2つの膜小葉の間にかなりのレベルの非対称性が観察される。実際、合成と加水分解の間の脂質代謝バランスは、小葉間の脂質フリップフロップと組み合わされて、そのような不斉分布を生成する。二重層を横切る任意の輸送は、極性頭部群を膜の疎水性内部を通って移動させるのに必要な自由エネルギーによって制約されるので、通常は選択的トランスポーターによって支援される。細胞型ごとに、非対称性はしっかりと維持される傾向がある。全体として、これらの因子は、原形質膜の横方向の不均一性または区画化に寄与する3,4。
我々は、10分の1から数百ナノメートルおよびマイクロ秒から秒のスケールで動的横方向の不均一性に寄与する二重層内および二重層全体にわたる固有の分子拡散を考慮に入れることによって、原形質膜のこの表現を豊かにする。例えば、脂質依存性膜ナノドメイン(コレステロールとして定義されるいわゆる脂質いかだ、およびスフィンゴ脂質に富むシグナル伝達プラットフォーム)は、原形質膜の区画化に寄与する5,6。しかしながら、膜組織の現在の見解は、脂質ラフトのみに限定されない。膜ナノドメインは、組成、起源、および機能においてより複雑で不均一である。それでも、原形質膜におけるそれらの存在は緊密に配位されなければならず、タンパク質と脂質との間の動的相互作用は、膜ナノドメインの空間分布および化学修飾において重要であるようである1,3,7,8。
svFCSの原理と原形質膜の組織をプローブするためのその応用 膜ドメインの解析は、主に生物物理学的手法によって多くの進歩を遂げているが、原形質膜の局所組織を決定する決定要因は、適切な空間的および時間的分解能で洗練される必要がある。個々の分子の追跡に基づく決定要因は、優れた空間精度を提供し、異なる運動モード9,10,11,12の特性評価を可能にするが、古典的な低いカメラフレームレートでは時間分解能が限られており、かなりの数の軌道を記録するためにより多くの実験的努力を必要とする。あるいは、膜成分の拡散係数は、フォトブリーチング後の蛍光回収(FRAP)13または蛍光相関分光法(FCS)14によって評価することができる。後者は、主にその高感度および選択性、顕微鏡的検出体積、低侵襲性、および広いダイナミックレンジのために、より注目を集めている15。
FCSの概念的基礎は、約50年前にMagdeと同僚によって導入されました16,17.これは、蛍光発光のゆらぎを高い時間分解能(μsからsまで)で記録することに基づいています18。その現代版では、生細胞における測定は、関心領域内(例えば、原形質膜)内に位置する小さな共焦点励起体積(〜0.3フェムトリットル)によって行われる。観察体積に出入りする蛍光分子の拡散によって発生する蛍光シグナルは、非常に高い時間分解能(すなわち、検出器上の各光子の到達時間)で収集される。次に、信号を計算して自己相関関数(ACF)を生成し、そこから分子が焦点体積内にとどまる平均時間td(拡散時間)が抽出され、観察体積中に存在する平均粒子数(N)とともに、ACFの振幅に反比例する。この最後のパラメータは、観察体積内の分子濃度に関する有用な情報である可能性があります。
それ以来、バイオフォトニクスの機器が急速に発展し、生命系で起こる動的現象の記述を可能にするため、ますます多くのFCSモダリティが実装されています。それでも、分子種は拡散係数値のより重なり合う分布を経験するであろうが、これは通常、分子が時間19において非線形の関係で拡散する異常な拡散特性によって反映され、この異常な部分拡散の生物学的意味を特定することは困難である。過去には、この困難は、FRAPによる分子拡散を1つの領域からではなく、さまざまなサイズの領域から記録し、それによって追加の空間情報を提供することによっていくらか克服されてきました。これにより、例えば、膜マイクロドメイン20、21、22の概念化が可能となった。
この戦略のFCS測定への変換(すなわち、いわゆるスポット変動蛍光相関分光法(svFCS))は、観察の焦点体積のサイズを変化させることによって確立され、蛍光の変動を異なる空間スケールで記録することを可能にする23。したがって、svFCSアプローチは、研究された分子の分子拡散モードおよび膜分配のタイプ(単離されたドメイン対連続ドメイン24)の同定および決定を可能にする間接的な空間情報を提供する。この場合23,25の検出ビーム半径サイズに対応するウエスト(ω)値によって定義される様々な空間スケールの関数として拡散時間tdをプロットすることによって、所与の生理学的条件における所与の分子の拡散法則を特徴付けることができる。したがって、svFCSは、時間領域26における単一粒子追跡への完全な類似体である。ブラウン拡散制約の下では、拡散時間tdとウエストωとの間に厳密に線形の関係が期待されるべきである(図1)23,25。このスキームからの拡散法則の逸脱の起源は、細胞骨格メッシュワーク、分子クラウディング、ナノドメインにおける動的分割、またはこれらと他の効果の任意の組み合わせ(図1)などの非排他的な理由に起因する可能性があり、実験的にテストする必要があります25。
ここでは、ゼロから構築されたカスタムメイドのsvFCS光学系を日常的に使用するために必要なすべての制御チェックポイントを提供し、その実験的アプローチに関する以前のプロトコルレビュー27,28を補完します。また、概念実証として、脂質ラフトナノドメインに局在することが知られている原形質膜グリコシルホスファチジルイノシトールアンカータンパク質であるThy1-GFPのsvFCS拡散法則(DL)の確立のためのセットアップの較正、細胞の準備、データ取得、および解析に関するガイドラインを提供します29。最後に、コレステロールオキシダーゼ処理による脂質ラフトナノドメインの部分的な不安定化がThy1-GFPの拡散特性にどのように影響するかを実証する。さらに、svFCS セットアップをゼロから構築する方法の詳細については、補足資料を参照してください。

<table><tbody><tr><td>Aligment tool</td><td>Spanner Wrench for SM1-Threaded Retaining Rings</td><td>Thorlabs</td><td>SPW602</td></tr><tr><td>Avalanche Photodiode and Single Photon Counting Module (SPCM)</td><td>Single-Photon Counting Module, Avalanche Photodiode</td><td>Excelitas</td><td>SPCM-AQRH-15</td></tr><tr><td></td><td>BNC 50 &amp;Omega; plug to 50 &amp;Omega; plug lead 2 m</td><td>RS Components</td><td>742-4315</td></tr><tr><td></td><td>Coaxial cable 415 Cinch Connectors, RG-316, 50 &amp;Omega; With connector, 1.22 m, RoHS2</td><td>RS Components</td><td>885-8172</td></tr><tr><td></td><td>Tee 50&amp;Omega; RF Adapter BNC Plug to BNC Socket 0 &amp;rarr; 1GHz</td><td>RS Components</td><td>546-4948</td></tr><tr><td></td><td>Brennenstuhl 2.5 m, 8 Socket Type E &amp;ndash; French Extension Lead, 230 V</td><td>RS Components</td><td>768-5500</td></tr><tr><td></td><td>Mascot, 6W Plug In Power Supply 5V dc, 1.2A, 1 Output Switched Mode Power Supply, Type C</td><td>RS Components</td><td>452-8394</td></tr><tr><td></td><td>Crystek CCSMACL-MC-24 Reference Oscillator Power Cable RF Adapter</td><td>RS Components</td><td>792-4079</td></tr><tr><td>Fluorescence filtering</td><td>535/70 ET Bandpass, AOI 0&amp;deg; Chroma Diameter 25 mm</td><td>AHF filter</td><td>F47-539</td></tr><tr><td></td><td>Laser Beamsplitter zt488 RDC, AOI 45&amp;deg; Chroma 25.5 x 36 x 1 mm</td><td>AHF filter</td><td>F43-088</td></tr><tr><td></td><td>496/LP BrightLine HC Longpass Filter, AOI 0&amp;deg; Chroma Diameter 25</td><td>AHF filter</td><td>F37-496</td></tr><tr><td>Hardware correlator</td><td>80 MHz Digital Correlator</td><td>Correlator.com</td><td>Flex02-12D</td></tr><tr><td>Laser</td><td>LASER LASOS LDM-XT fiber coupled, 488 nm, 65 mW</td><td>Lasos</td><td>BLD-XT 488100</td></tr><tr><td>Laser safety</td><td>High-Performance Black Masking Tape, 1&quot; x 180&#039; (25 mm x 55 m) Roll</td><td>Thorlabs</td><td>T743-2.0</td></tr><tr><td></td><td>Lens Tissues, 25 Sheets per Booklet, 5 Booklets</td><td>Thorlabs</td><td>MC-5</td></tr><tr><td></td><td>Laser Safety Glasses, Light Orange Lenses, 48% Visible Light Transmission</td><td>Thorlabs</td><td>LG3B</td></tr><tr><td>Microscope</td><td>Zeiss Axiovert 200M Motorized Inverted Fluorescence Microscope&lt;br/&gt; Fine and coarse focusing, reflector turret rotation, objective nosepiece rotation, switching camera ports, and internal light shutters</td><td>Carl Zeiss</td><td></td></tr><tr><td></td><td>C-Apochromat 40x/1,2 W Korr.selected for FCS&lt;br/&gt; (D=0.14-0.19 mm) (WD=0.28 mm at D=0.17 mm), UV-VIS-IR</td><td>Carl Zeiss</td><td>421767-9971-711</td></tr><tr><td></td><td>Adapter W0.8 / M27x0.75 H &quot;5&quot;</td><td>Carl Zeiss</td><td>000000-1698-345</td></tr><tr><td></td><td>Middle ring W0.8 - W0.8 H &quot;5&quot;</td><td>Carl Zeiss</td><td>000000-1698-347</td></tr><tr><td>Optical path</td><td>D25.4mm Mirror, Protected Silver</td><td>Thorlabs</td><td>PF10-03-P01</td></tr><tr><td></td><td>D25.4mm, F=60.0.mm, Visible Achromat</td><td>Thorlabs</td><td>AC254-060-A</td></tr><tr><td></td><td>D25.4mm, F=35.0.mm, Visible Achromat</td><td>Thorlabs</td><td>AC254-035-A</td></tr><tr><td></td><td>25 &amp;micro;m mounted pinhole</td><td>Thorlabs</td><td>P25S I</td></tr><tr><td></td><td>25.4mm Mounted Zero, Order 1/2 Waveplate 488 nm</td><td>Thorlabs</td><td>WPH10M-488 (HWP)</td></tr><tr><td></td><td>20mm Polarizing Beamsplitter Cube 420-680 nm</td><td>Thorlabs</td><td>PBS201</td></tr><tr><td></td><td>Rotation Stage 56 mm x 26 mm Threaded ID</td><td>Thorlabs</td><td>RSP1/M</td></tr><tr><td></td><td>52 mm x 52 mm Kinematic Platform Mount</td><td>Thorlabs</td><td>KM100B/M</td></tr><tr><td></td><td>Adjustable Prism Clamp</td><td>Thorlabs</td><td>PM3/M</td></tr><tr><td></td><td>Beam block - active area 19 mm x 38 mm</td><td>Thorlabs</td><td>LB1/M</td></tr><tr><td></td><td>Iris Diaphragm 1 mm to 25 mm Aperture</td><td>Thorlabs</td><td>ID25/M</td></tr><tr><td></td><td>Left-Handed Kinematic Cylindrical Lens Mount</td><td>Thorlabs</td><td>KM100CL</td></tr><tr><td></td><td>1&quot; Optic Holder, M4 Tap</td><td>Thorlabs</td><td>MFF101/M</td></tr><tr><td></td><td>1&quot; Stackable Lens Tube</td><td>Thorlabs</td><td>SM1L03</td></tr><tr><td></td><td>Stackable Lens Mount for 1&quot; optic-usable depth &amp;frac12;</td><td>Thorlabs</td><td>SM1L05</td></tr><tr><td></td><td>Stackable Lens Mount For 1&quot;Optic-usable Depth 2&quot;</td><td>Thorlabs</td><td>SM1L20</td></tr><tr><td></td><td>Small Optical Rails 600mm, metric</td><td>Thorlabs</td><td>RLA600/M</td></tr><tr><td></td><td>Small Optical Rails 75mm, metric</td><td>Thorlabs</td><td>RLA075/M</td></tr><tr><td></td><td>Small Optical Rails 150mm, metric</td><td>Thorlabs</td><td>RLA150/M</td></tr><tr><td></td><td>Rail Carrier, Counterbored Hole 1&quot;x 1&quot;</td><td>Thorlabs</td><td>RC1</td></tr><tr><td></td><td>Rail Carrier, Perpendicular Dovetail</td><td>Thorlabs</td><td>RC3</td></tr><tr><td></td><td>High Precision Translating Lens Mount for 1 inch</td><td>Thorlabs</td><td>LM1XY/M</td></tr><tr><td></td><td>&amp;frac12; &quot; (12mm) Dovetail Translation Stage</td><td>Thorlabs</td><td>DT12/M</td></tr><tr><td></td><td>Rail Clamps</td><td>Thorlabs</td><td>CL6</td></tr><tr><td></td><td>Metric XYZ Translation Stage (Includes PT102)</td><td>Thorlabs</td><td>PT3/M</td></tr><tr><td></td><td>Black Rubberized Fabric</td><td>Thorlabs</td><td>BK5</td></tr><tr><td></td><td>Ball Driver kit/ 6 tools</td><td>Thorlabs</td><td>BD-KIT/M</td></tr><tr><td></td><td>Adapter with External M6 x 1.0 Threads and External M4 x 0.7 Threads</td><td>Thorlabs</td><td>AP6M4M</td></tr><tr><td></td><td>Mounting Base, 25 mm x 58 mm x 10 mm, 5 Pack</td><td>Thorlabs</td><td>BA1S/M-P5</td></tr><tr><td></td><td>Lens Mount for 25.4mm optic</td><td>Thorlabs</td><td>LMR1/M</td></tr><tr><td></td><td>SM1 FC/APC Adapter</td><td>Thorlabs</td><td>SM1FCA</td></tr><tr><td></td><td>Kinematic Mirror Mount For 1 inch Optics</td><td>Thorlabs</td><td>KM100</td></tr><tr><td></td><td>Silicon Power Head, 400-1100nm, 50mW</td><td>Thorlabs</td><td>S120C</td></tr><tr><td></td><td>12.7 mm Post Holders, Spring-Loaded Hex-Locking Thumbscrew,&lt;br/&gt; L=50 mm, 5 Pack</td><td>Thorlabs</td><td>PH50/M-P5</td></tr><tr><td></td><td>Post Holder with Spring-Loaded Hex-Locking Thumbscrew, L=20 mm</td><td>Thorlabs</td><td>PH20/M</td></tr><tr><td></td><td>12.7 mm x 50 mm Stainless Steel Optical Post, M4 Stud,&lt;br/&gt; M6-Tapped Hole, 5 Pack</td><td>Thorlabs</td><td>TR50/M-P5</td></tr><tr><td></td><td>12.7 mm x 75 mm Stainless Steel Optical Post, M4 Stud,&lt;br/&gt; M6-Tapped Hole, 5 Pack</td><td>Thorlabs</td><td>TR75/M-P5</td></tr><tr><td></td><td>USB Power and Energy Meter Interface</td><td>Thorlabs</td><td>PM100USB</td></tr><tr><td></td><td>12.7 mm x 30 mm Stainless Steel Optical Post, M4 Stud,&lt;br/&gt; M6-Tapped Hole</td><td>Thorlabs</td><td>TR30/M</td></tr><tr><td></td><td>12.7 mm x 20 mm Stainless Steel Optical Post, M4 Stud,&lt;br/&gt; M6-Tapped Hole</td><td>Thorlabs</td><td>TR20/M</td></tr><tr><td></td><td>750 mm long Structural Rail (detection box)</td><td>Thorlabs</td><td>XE25L750/M</td></tr><tr><td></td><td>350 mm long Structural Rail (detection box)</td><td>Thorlabs</td><td>XE25L350/M</td></tr><tr><td></td><td>Quick Corner Cube for 25 mm Rails</td><td>Thorlabs</td><td>XE25W3</td></tr><tr><td></td><td>Right-Angle Bracket for 25 mm Rails</td><td>Thorlabs</td><td>XE25A90</td></tr><tr><td></td><td>Black posterboard 20&quot; x 30&quot; (508 mm x 762 mm), 1/16&quot; (1.6 mm) Thick, 5 Sheets</td><td>Thorlabs</td><td>TB5</td></tr><tr><td></td><td>Hinge for 25 mm Rail Enclosures</td><td>Thorlabs</td><td>XE25H</td></tr><tr><td></td><td>Lid Stop for 25 mm Rail Enclosures</td><td>Thorlabs</td><td>XE25LS</td></tr><tr><td></td><td>M4 Cap Screw Kit</td><td>Thorlabs</td><td>HW-KIT1/M</td></tr><tr><td></td><td>M6 Cap Screw Kit and Hardware kit</td><td>Thorlabs</td><td>HW-KIT2/M</td></tr><tr><td></td><td>Table Clamp, L-Shape, 5 Pack</td><td>Thorlabs</td><td>CL5-P5</td></tr><tr><td></td><td>SM1 Ring-Actuated Iris Diaphragm (&amp;Oslash;0.8 - &amp;Oslash;12 mm)</td><td>Thorlabs</td><td>SM1D12D</td></tr><tr><td></td><td>&amp;Oslash;1&quot; SM1-Mounted Frosted Glass Alignment Disk w/&amp;Oslash;1 mm Hole</td><td>Thorlabs</td><td>DG10-1500-H1-MD</td></tr><tr><td></td><td>Honeycomb Optical Table Top, Standa</td><td>Standa</td><td>1HB10-15-12</td></tr><tr><td></td><td>Optical Table support, Standa</td><td>Standa</td><td>1TS05-12-06-AR</td></tr><tr><td>Sample nano-positionning</td><td>Precision XYZ Nanopositioning</td><td>Physik Instrumente</td><td>PI P527-3.CD</td></tr><tr><td></td><td>Digital Multi-Channel Piezo Co, 3 Channels, -30 to 130 V&lt;br/&gt; Sub- D Connector(s), Capacitive Sensors,</td><td>Physik Instrumente</td><td>PI E727-3.CD</td></tr><tr><td>Temperature chamber</td><td>Zeiss 200M Inverted Microscope Incubator System MATT BLK</td><td>Digital Pixel</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Dual Channel Microprocessor Temperature Controller</td><td>Digital Pixel</td><td>DP_MTC_2000_DUO</td></tr><tr><td></td><td>Two Vibration Free Heater Modules</td><td>Digital Pixel</td><td>DP_150_VF</td></tr><tr><td></td><td>PT100 Temperature Sensor</td><td>Digital Pixel</td><td>DP_P100_TS</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Biological Reagents and Materials&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cell culture and transfection</td><td>Cos7 cells</td><td>ATCC&amp;reg;</td><td>CRL-1651&amp;trade;</td></tr><tr><td></td><td>8- well Lab-Tek chambers</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>155411PK</td></tr><tr><td></td><td>Dulbecco&#039;s Modified Eagle Medium (DMEM)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11965092</td></tr><tr><td></td><td>Fetal bovine serum</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>16000044</td></tr><tr><td></td><td>L-glutamine</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>25030081</td></tr><tr><td></td><td>PBS buffer</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14190144</td></tr><tr><td></td><td>PenStrep</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15140122</td></tr><tr><td></td><td>PolyJet Transfection Reagent</td><td>SignaGen Laboratories</td><td>SL100688</td></tr><tr><td>Cholesterol content measurement</td><td>Amplex Red Cholesterol Assay Kit</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A12216</td></tr><tr><td></td><td>Protease Inhibitor Cocktail</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>87786</td></tr><tr><td></td><td>Phosphatase Inhibitor Cocktail</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>78420</td></tr><tr><td></td><td>ROTI Nanoquant Working Solution</td><td>Roth</td><td>K880</td></tr><tr><td></td><td>GloMax Discover Microplate Reader</td><td>Promega</td><td>GM3000</td></tr><tr><td>svFCS measurements</td><td>HBSS buffer</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14025092</td></tr><tr><td></td><td>Hepes buffer</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15630080</td></tr><tr><td></td><td>Cholesterol oxidase</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C8868</td></tr><tr><td></td><td>Rhodamine 6G</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>83697-1G</td></tr></tbody></table>

spot variation fluorescence correlation spectroscopy for analysis of molecular diffusion at the plasma membrane of living cells

原形質膜組織に関連するものを含む生細胞における動的な生物学的プロセスは、それぞれナノメートルからマイクロメートルおよびマイクロ秒から分の範囲の様々な空間的および時間的スケールで起こる。このような広範囲の生物学的プロセスは、従来の顕微鏡検査アプローチに挑戦する。ここでは、カスタマイズされた古典的な蛍光顕微鏡を使用してスポット変動蛍光相関分光法(svFCS)測定を実施する手順を詳述します。このプロトコルには、svFCSセットアップの特定の性能チェックと、生理学的条件下での生細胞の原形質膜上のsvFCSによる分子拡散測定のガイドラインが含まれています。さらに、コレステロールオキシダーゼ処理によって原形質膜ラフトナノドメインを破壊する手順を提供し、原形質膜の側方組織におけるこれらの変化がsvFCS分析によってどのように明らかにされるかを実証します。結論として、この蛍光ベースの方法は、適切な空間的および時間的分解能を有する原形質膜の側方組織に関する前例のない詳細を提供することができる。

我々は、Cos-7細胞で発現したThy1-GFPについてDLを生成した(図4、黒四角)。拡散法則は正のt0値(19.47ミリ秒±2ミリ秒)を有し、Thy1-GFPが原形質膜のナノドメイン構造に閉じ込められていることを示す。Thy1-GFPを発現する細胞のコレステロールオキシダーゼ処理は、DL t0値を7.36±1.34ミリ秒にシフトさせた(図4、灰色の四角)。この観察は、Thy1-GFP閉じ込めの性質がコレステロール含有量に依存し、脂質ラフトナノドメインと関連していることを確認する。これら2つの拡散法則は、t0およびDeff値に関して、上述の統計的検定(ステップ9.1.3を参照)によれば異なることが示されている。さらに、我々は、COaseで処理された細胞に対する非処理Cos-7細胞における総細胞コレステロールの濃度を評価した。COase処理では、総コレステロール含有量の小さいながらも有意な減少が観察されます(図5)。この酵素は原形質膜の外側の小葉でアクセス可能なコレステロールプールにのみ作用するので、観察されたコレステロールの減少は原形質膜にのみ関連しており、脂質ラフトナノドメインの不安定化をもたらすと仮定する。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61823/61823fig01.jpg"> 図1:異なる形態の膜組織についてスポット変動FCSによって確立されたシミュレートされた蛍光相関分光法(FCS)拡散法則。 (上パネル)膜組織の模式的表現 - (A)自由拡散、(B)メッシュワークバリア、および(C)トラップ/ドメイン閉じ込め - 単一の分子(赤)の軌道を描画します。青い丸は腰ωの膜とレーザー光の交点を示す。(下パネル)FCS拡散法則は、拡散時間tdを半径ω2の2乗の関数としてプロットすることによって表される。拡散則投影(緑色の破線)は、自由拡散の場合に(A)原点(t0=0)において時間軸をインターセプトする。(B)メッシュワーク障壁がある場合の負軸(t0<0)に、またはトラップおよびドメイン(脂質ラフト)がある場合の(C)正軸(t0>0)に。D はブラウン運動の横方向拡散係数です。Deff、有効拡散係数;Dマイクロ、メッシュワークトラップ内の微視的な拡散係数;Dinは、ドメイン内部の拡散係数;Doutは、ドメイン外の拡散係数;L、正方形ドメインの側面のサイズ。rD は円形ドメインの半径です。この数字は、彼とマルゲ6から修正されています。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61823/61823fig01large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61823/61823fig2v2.jpg"> 図2:svFCSハードウェア制御の概略図 コンピュータは、シリアル(顕微鏡、外部シャッター)、USB(XYZ圧電ステージ、相関器)、PCI(アクイジションボード)のさまざまな通信プロトコルを介してすべてのデバイスを制御します。DAQ:データ集録ボード、APD:アバランシェフォトダイオード、SPCM:シングルフォトンカウンティングモジュール、DO:デジタル出力。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61823/61823fig2v2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61823/61823fig03.jpg"> 図3:svFCSセットアップの励起光路と発光光路の模式図 svFCSセットアップには、(1)ファイバ488nmレーザの出力がコリメートされ、(2)1/2波長板と偏光ビームスプリッタの組み合わせが光パワーを設定する、(3)チューブレンズフリー電動顕微鏡を通過した後にサンプルに集束されたレーザビーム、および(4)蛍光が単一のフォトンカウンティングモジュールに結合されたアバランシェフォトダイオードにコンフォカル状の検出経路を介して検出される、 これはハードウェア相関器に信号を配信します。シンプルさは、システムに感度、堅牢性、使いやすさを与えます( 補足資料で広くコメントされています)。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61823/61823fig03large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61823/61823fig04.jpg"> 図4:Cos-7で表されるThy1-GFPの拡散解析から生成されたsvFCS拡散法則。 処理なし(NT、黒四角)およびコレステロールオキシダーゼ処理後のCos-7細胞(COase、灰色の円)のsvFCS拡散法則。グラフの挿入は、提示された2つのsvFCS拡散法則の間の有意差の統計的検定を表す(Mailfert et al.28による)。テスト値(T)は、両方の拡散法則が異なる場合、3.8に設定されたしきい値を超える必要があります。高いほど、拡散法則の差は大きくなります。T の値は色分けされています。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61823/61823fig04large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61823/61823fig05.jpg"> 図5:Cos-7細胞における総コレステロール含有量の比較。 Cos-7細胞を無処理(NT)または1U/mLのコレステロールオキシダーゼ(COase)で1時間処理した。データは、3 連の 1 つの実験の例を表しています。両側の不対応の t検定を使用して、統計的差を評価しました(α=0.05)。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61823/61823fig05large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
材料の表: svFCS のセットアップに必要な光学素子のリスト。
補足資料: このドキュメントでは、svFCS セットアップをゼロから構築する方法について説明します。 <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61823/61823_R1_Supp%20Mat_final.docx" target="_blank">このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>

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Spot Variation Fluorescence Correlation Spectroscopy for Analysis of Molecular Diffusion at the Plasma Membrane of Living Cells

本稿は、生細胞の原形質膜における分子拡散を測定するためのスポット変異蛍光相関分光法(svFCS)顕微鏡を構築する方法に関するプロトコルを提示することを目的としている。

生細胞原形質膜における分子拡散解析のためのスポット変異蛍光相関分光法

Dynamic biological processes in living cells, including those associated with plasma membrane organization, occur on various spatial and temporal scales, ...

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Research

JoVE Journal

Biochemistry

2.7K ビュー.  Aix Marseille Univ. 本稿は、生細胞の原形質膜における分子拡散を測定するためのスポット変異蛍光相関分光法(svFCS)顕微鏡を構築する方法に関するプロトコルを提示することを目的としている。

ビデオ: Spot Variation Fluorescence Correlation Spectroscopy for Analysis of Molecular Diffusion at the Plasma Membrane of Living Cells

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating these studies, reincorporation of detergent-solubilized membrane proteins into liposomes is a stochastic process where protein topology is impossible to enforce. This paper offers an alternative method to these challenging techniques that utilizes a liposome-based scaffold. Protein solubility is enhanced by deletion of the transmembrane domain, and these amino acids are replaced with a tethering moiety, such as a His-tag. This tether interacts with an anchoring group (Ni2+ coordinated by nitrilotriacetic acid (NTA(Ni2+)) for His-tagged proteins), which enforces a uniform protein topology at the surface of the liposome. An example is presented wherein the interaction between Dynamin-related protein 1 (Drp1) with an integral membrane protein, Mitochondrial Fission Factor (Mff), was investigated using this scaffold liposome method. In this work, we have demonstrated the ability of Mff to efficiently recruit soluble Drp1 to the surface of liposomes, which stimulated its GTPase activity. Moreover, Drp1 was able to tubulate the Mff-decorated lipid template in the presence of specific lipids. This example demonstrates the effectiveness of scaffold liposomes using structural and functional assays and highlights the role of Mff in regulating Drp1 activity.

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

This paper describes a method for assessing the interactions and assemblies of integral membrane proteins in vitro with various partner factors in a lipid-proximal environment.

足場リポソームを使用することにより、脂質近位タンパク質 - タンパク質相互作用を再構成します<em&gt;インビトロ</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

生化学

High Precision FRET at Single-molecule Level for Biomolecule Structure Determination

A protocol on how to perform high-precision interdye distance measurements using F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) at the single-molecule level in multiparameter fluorescence detection (MFD) mode is presented here. MFD maximizes the usage of all &#34;dimensions&#34; of fluorescence to reduce photophysical and experimental artifacts and allows for the measurement of interdye distance with an accuracy up to ~1 &#197; in rigid biomolecules. This method was used to identify three conformational states of the ligand-binding domain of the N-methyl-D-aspartate (NMDA) receptor to explain the activation of the receptor upon ligand binding. When comparing the known crystallographic structures with experimental measurements, they agreed within less than 3 &#197; for more dynamic biomolecules. Gathering a set of distance restraints that covers the entire dimensionality of the biomolecules would make it possible to provide a structural model of dynamic biomolecules.

A protocol for high-precision FRET experiments at the single molecule level is presented here. Additionally, this methodology can be used to identify three conformational states in the ligand-binding domain of the N-methyl-D-aspartate (NMDA) receptor. Determining precise distances is the first step towards building structural models based on FRET experiments.

生体分子構造決定のための単分子レベルでの高精度FRET

A protocol on how to perform high-precision interdye distance measurements using F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) at the single-molecule ...

Automated Protocols for Macromolecular Crystallization at the MRC Laboratory of Molecular Biology

When high quality crystals are obtained that diffract X-rays, the crystal structure may be solved at near atomic resolution. The conditions to crystallize proteins, DNAs, RNAs, and their complexes can however not be predicted. Employing a broad variety of conditions is a way to increase the yield of quality diffraction crystals. Two fully automated systems have been developed at the MRC Laboratory of Molecular Biology (Cambridge, England, MRC-LMB) that facilitate crystallization screening against 1,920 initial conditions by vapor diffusion in nanoliter droplets. Semi-automated protocols have also been developed to optimize conditions by changing the concentrations of reagents, the pH, or by introducing additives that potentially enhance properties of the resulting crystals. All the corresponding protocols will be described in detail and briefly discussed. Taken together, they enable convenient and highly efficient macromolecular crystallization in a multi-user facility, while giving the users control over key parameters of their experiments.

Automated systems and protocols for the routine preparation of a large number of screens and nanoliter crystallization droplets for vapor diffusion experiments are described and discussed.

MRC 分子生物学研究所高分子結晶化のプロトコルを自動

When high quality crystals are obtained that diffract X-rays, the crystal structure may be solved at near atomic resolution. The conditions to crystallize ...

A Fluorescence Fluctuation Spectroscopy Assay of Protein-Protein Interactions at Cell-Cell Contacts

A variety of biological processes involves cell-cell interactions, typically mediated by proteins that interact at the interface between neighboring cells. Of interest, only few assays are capable of specifically probing such interactions directly in living cells. Here, we present an assay to measure the binding of proteins expressed at the surfaces of neighboring cells, at cell-cell contacts. This assay consists of two steps: mixing of cells expressing the proteins of interest fused to different fluorescent proteins, followed by fluorescence fluctuation spectroscopy measurements at cell-cell contacts using a confocal laser scanning microscope. We demonstrate the feasibility of this assay in a biologically relevant context by measuring the interactions of the amyloid precursor-like protein 1 (APLP1) across cell-cell junctions. We provide detailed protocols on the data acquisition using fluorescence-based techniques (scanning fluorescence cross-correlation spectroscopy, cross-correlation number and brightness analysis) and the required instrument calibrations. Further, we discuss critical steps in the data analysis and how to identify and correct external, spurious signal variations, such as those due to photobleaching or cell movement.
In general, the presented assay is applicable to any homo- or heterotypic protein-protein interaction at cell-cell contacts, between cells of the same or different types and can be implemented on a commercial confocal laser scanning microscope. An important requirement is the stability of the system, which needs to be sufficient to probe diffusive dynamics of the proteins of interest over several minutes.

This protocol describes a fluorescence fluctuation spectroscopy-based approach to investigate interactions among proteins mediating cell-cell interactions, i.e. proteins localized in cell junctions, directly in living cells. We provide detailed guidelines on instrument calibration, data acquisition and analysis, including corrections to possible artefact sources.

細胞間の接触でタンパク質間相互作用の分析計蛍光の変動

A variety of biological processes involves cell-cell interactions, typically mediated by proteins that interact at the interface between neighboring ...

From Fast Fluorescence Imaging to Molecular Diffusion Law on Live Cell Membranes in a Commercial Microscope

It has become increasingly evident that the spatial distribution and the motion of membrane components like lipids and proteins are key factors in the regulation of many cellular functions. However, due to the fast dynamics and the tiny structures involved, a very high spatio-temporal resolution is required to catch the real behavior of molecules. Here we present the experimental protocol for studying the dynamics of fluorescently-labeled plasma-membrane proteins and lipids in live cells with high spatiotemporal resolution. Notably, this approach doesn&#8217;t need to track each molecule, but it calculates population behavior using all molecules in a given region of the membrane. The starting point is a fast imaging of a given region on the membrane. Afterwards, a complete spatio-temporal autocorrelation function is calculated correlating acquired images at increasing time delays, for example each 2, 3, n repetitions. It is possible to demonstrate that the width of the peak of the spatial autocorrelation function increases at increasing time delay as a function of particle movement due to diffusion. Therefore, fitting of the series of autocorrelation functions enables to extract the actual protein mean square displacement from imaging (iMSD), here presented in the form of apparent diffusivity vs average displacement. This yields a quantitative view of the average dynamics of single molecules with nanometer accuracy. By using a GFP-tagged variant of the Transferrin Receptor (TfR) and an ATTO488 labeled 1-palmitoyl-2-hydroxy-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (PPE) it is possible to observe the spatiotemporal regulation of protein and lipid diffusion on &#181;m-sized membrane regions in the micro-to-milli-second time range.

Spatial distribution and temporal dynamics of plasma membrane proteins and lipids is a hot topic in biology. Here this issue is addressed by a spatio-temporal image fluctuation analysis that provides conceptually the same physical quantities of single particle tracking, but it uses small molecular labels and standard microscopy setups.

商業顕微鏡でのライブ細胞膜上の分子拡散法への高速蛍光イメージングから

It has become increasingly evident that the spatial distribution and the motion of membrane components like lipids and proteins are key factors in the ...

生物工学

Dual-Color Fluorescence Cross-Correlation Spectroscopy to Study Protein-Protein Interaction and Protein Dynamics in Live Cells

We present a protocol and workflow to perform live cell dual-color fluorescence cross-correlation spectroscopy (FCCS) combined with F&#246;rster Resonance Energy transfer (FRET) to study membrane receptor dynamics in live cells using modern fluorescence labeling techniques. In dual-color FCCS, where the fluctuations in fluorescence intensity represent the dynamic &#34;fingerprint&#34; of the respective fluorescent biomolecule, we can probe co-diffusion or binding of the receptors. FRET, with its high sensitivity to molecular distances, serves as a well-known &#34;nanoruler&#34; to monitor intramolecular changes. Taken together, conformational changes and key parameters such as local receptor concentrations and mobility constants become accessible in cellular settings.
Quantitative fluorescence approaches are challenging in cells due to high noise levels and the vulnerability of the sample. Here we show how to perform this experiment, including the calibration steps using dual-color labeled &#946;2-adrenergic receptor (&#946;2AR) labeled with eGFP and SNAP-tag-TAMRA. A step-by-step data analysis procedure is provided using open-source software and templates that are easy to customize.
Our guideline enables researchers to unravel molecular interactions of biomolecules in live cells in situ with high reliability despite the limited signal-to-noise levels in live cell experiments. The operational window of FRET and particularly FCCS at low concentrations allows quantitative analysis at near-physiological conditions.

We present an experimental protocol and data analysis workflow to perform live cell dual-color fluorescence cross correlation spectroscopy (FCCS) combined with F&#246;rster Resonance Energy transfer (FRET) to study membrane receptor dynamics in live cells using modern fluorescence labeling techniques.

生細胞におけるタンパク質相互作用とタンパク質ダイナミクスを研究するための二色蛍光相互相関分光法

We present a protocol and workflow to perform live cell dual-color fluorescence cross-correlation spectroscopy (FCCS) combined with F&#246;rster Resonance ...

Molecular Diffusion in Plasma Membranes of Primary Lymphocytes Measured by Fluorescence Correlation Spectroscopy

Fluorescence correlation spectroscopy (FCS) is a powerful technique for studying the diffusion of molecules within biological membranes with high spatial and temporal resolution. FCS can quantify the molecular concentration and diffusion coefficient of fluorescently labeled molecules in the cell membrane. This technique has the ability to explore the molecular diffusion characteristics of molecules in the plasma membrane of immune cells in steady state (i.e., without processes affecting the result during the actual measurement time). FCS is suitable for studying the diffusion of proteins that are expressed at levels typical for most endogenous proteins. Here, a straightforward and robust method to determine the diffusion rate of cell membrane proteins on primary lymphocytes is demonstrated. An effective way to perform measurements on antibody-stained live cells and commonly occurring observations after acquisition are described. The recent advancements in the development of photo-stable fluorescent dyes can be utilized by conjugating the antibodies of interest to appropriate dyes that do not bleach extensively during the measurements. Additionally, this allows for the detection of slowly diffusing entities, which is a common feature of proteins expressed in cell membranes. The analysis procedure to extract molecular concentration and diffusion parameters from the generated autocorrelation curves is highlighted. In summary, a basic protocol for FCS measurements is provided; it can be followed by immunologists with an understanding of confocal microscopy but with no other previous experience of techniques for measuring dynamic parameters, such as molecular diffusion rates.

A method to measure protein diffusion in membranes of primary immune cells using fluorescence correlation spectroscopy (FCS) is described. In this paper, the use of antibodies for fluorescent labeling is illustrated.

蛍光相関分光法により測定初代リンパ球のプラズマ膜における分子拡散

Fluorescence correlation spectroscopy (FCS) is a powerful technique for studying the diffusion of molecules within biological membranes with high spatial ...

免疫・感染学

Determination of Lipid Raft Partitioning of Fluorescently-tagged Probes in Living Cells by Fluorescence Correlation Spectroscopy (FCS)

In the past fifteen years the notion that cell membranes are not homogenous and rely on microdomains to exert their functions has become widely accepted. Lipid rafts are membrane microdomains enriched in cholesterol and sphingolipids. They play a role in cellular physiological processes such as signalling, and trafficking1,2 but are also thought to be key players in several diseases including viral or bacterial infections and neurodegenerative diseases3.
Yet their existence is still a matter of controversy4,5. Indeed, lipid raft size has been estimated to be around 20 nm6, far under the resolution limit of conventional microscopy (around 200 nm), thus precluding their direct imaging. Up to now, the main techniques used to assess the partition of proteins of interest inside lipid rafts were Detergent Resistant Membranes (DRMs) isolation and co-patching with antibodies. Though widely used because of their rather easy implementation, these techniques were prone to artefacts and thus criticized7,8. Technical improvements were therefore necessary to overcome these artefacts and to be able to probe lipid rafts partition in living cells.
Here we present a method for the sensitive analysis of lipid rafts partition of fluorescently-tagged proteins or lipids in the plasma membrane of living cells. This method, termed Fluorescence Correlation Spectroscopy (FCS), relies on the disparity in diffusion times of fluorescent probes located inside or outside of lipid rafts. In fact, as evidenced in both artificial membranes and cell cultures, probes would diffuse much faster outside than inside dense lipid rafts9,10. To determine diffusion times, minute fluorescence fluctuations are measured as a function of time in a focal volume (approximately 1 femtoliter), located at the plasma membrane of cells with a confocal microscope (Fig. 1). The auto-correlation curves can then be drawn from these fluctuations and fitted with appropriate mathematical diffusion models11.
FCS can be used to determine the lipid raft partitioning of various probes, as long as they are fluorescently tagged. Fluorescent tagging can be achieved by expression of fluorescent fusion proteins or by binding of fluorescent ligands. Moreover, FCS can be used not only in artificial membranes and cell lines but also in primary cultures, as described recently12. It can also be used to follow the dynamics of lipid raft partitioning after drug addition or membrane lipid composition change12.

Determination of Lipid Raft Partitioning of Fluorescently-tagged Probes in Living Cells by Fluorescence Correlation Spectroscopy FCS

A technique to probe the lipid raft partitioning of fluorescent proteins at the plasma membrane of living cells is described. It takes advantage of the disparity in diffusion times of proteins located inside or outside of lipid rafts. Acquisition can be performed dynamically in control conditions or after drug addition.

脂質ラフトの決定は、蛍光相関分光法（FCS）による生細胞の蛍光タグ付きプローブの分割

In the past fifteen years the notion that cell membranes are not homogenous and rely on microdomains to exert their functions has become widely accepted. ...

生物学

Image Processing Protocol for the Analysis of the Diffusion and Cluster Size of Membrane Receptors by Fluorescence Microscopy

Particle tracking on a video sequence and the posterior analysis of their trajectories is nowadays a common operation in many biological studies. Using the analysis of cell membrane receptor clusters as a model, we present a detailed protocol for this image analysis task using Fiji (ImageJ) and Matlab routines to: 1) define regions of interest and design masks adapted to these regions; 2) track the particles in fluorescence microscopy videos; 3) analyze the diffusion and intensity characteristics of selected tracks. The quantitative analysis of the diffusion coefficients, types of motion, and cluster size obtained by fluorescence microscopy and image processing provides a valuable tool to objectively determine particle dynamics and the consequences of modifying environmental conditions. In this article we present detailed protocols for the analysis of these features. The method described here not only allows single-molecule tracking detection, but also automates the estimation of lateral diffusion parameters at the cell membrane, classifies the type of trajectory and allows complete analysis thus overcoming the difficulties in quantifying spot size over its entire trajectory at the cell membrane.

Here, we present a protocol for single particle tracking image analysis that allows quantitative evaluation of diffusion coefficients, types of motion and cluster sizes of single particles detected by fluorescence microscopy.

画像処理プロトコル、拡散の解析と蛍光顕微鏡による膜受容体のクラスター サイズ

Particle tracking on a video sequence and the posterior analysis of their trajectories is nowadays a common operation in many biological studies. Using ...

Easy Measurement of Diffusion Coefficients of EGFP-tagged Plasma Membrane Proteins Using k-Space Image Correlation Spectroscopy

Lateral diffusion and compartmentalization of plasma membrane proteins are tightly regulated in cells and thus, studying these processes will reveal new insights to plasma membrane protein function and regulation. Recently, k-Space Image Correlation Spectroscopy (kICS)1&#160;was developed to enable routine measurements of diffusion coefficients directly from images of fluorescently tagged plasma membrane proteins, that avoided systematic biases introduced by probe photophysics. Although the theoretical basis for the analysis is complex, the method can be implemented by nonexperts using a freely available code to measure diffusion coefficients of proteins. kICS calculates a time correlation function from a fluorescence microscopy image stack after Fourier transformation of each image to reciprocal (k-) space. Subsequently, circular averaging, natural logarithm transform and linear fits to the correlation function yields the diffusion coefficient. This paper provides a step-by-step guide to the image analysis and measurement of diffusion coefficients via kICS.
First, a high frame rate image sequence of a fluorescently labeled plasma membrane protein is acquired using a fluorescence microscope. Then, a region of interest (ROI) avoiding intracellular organelles, moving vesicles or protruding membrane regions is selected. The ROI stack is imported into a freely available code and several defined parameters (see Method section) are set for kICS analysis. The program then generates a &#34;slope of slopes&#34; plot from the k-space time correlation functions, and the diffusion coefficient is calculated from the slope of the plot. Below is a step-by-step kICS procedure to measure the diffusion coefficient of a membrane protein using the renal water channel aquaporin-3 tagged with EGFP as a canonical example.

This paper provides a step by step guide to the fluctuation analysis technique k-Space Image Correlation Spectroscopy (kICS) for measuring diffusion coefficients of fluorescently labeled plasma membrane proteins in live mammalian cells.

k空間画像相関分光法を用いて、EGFPタグ付きプラズマ膜タンパク質の拡散係数を簡単に測定

Lateral diffusion and compartmentalization of plasma membrane proteins are tightly regulated in cells and thus, studying these processes will reveal new ...

生細胞原形質膜における分子拡散解析のためのスポット変異蛍光相関分光法

要約

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足場リポソームを使用することにより、脂質近位タンパク質 - タンパク質相互作用を再構成します

生体分子構造決定のための単分子レベルでの高精度FRET

MRC 分子生物学研究所高分子結晶化のプロトコルを自動

細胞間の接触でタンパク質間相互作用の分析計蛍光の変動

商業顕微鏡でのライブ細胞膜上の分子拡散法への高速蛍光イメージングから

生細胞におけるタンパク質相互作用とタンパク質ダイナミクスを研究するための二色蛍光相互相関分光法

蛍光相関分光法により測定初代リンパ球のプラズマ膜における分子拡散

脂質ラフトの決定は、蛍光相関分光法（FCS）による生細胞の蛍光タグ付きプローブの分割

画像処理プロトコル、拡散の解析と蛍光顕微鏡による膜受容体のクラスターサイズ

k空間画像相関分光法を用いて、EGFPタグ付きプラズマ膜タンパク質の拡散係数を簡単に測定

生細胞原形質膜における分子拡散解析のためのスポット変異蛍光相関分光法

要約

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足場リポソームを使用することにより、脂質近位タンパク質 - タンパク質相互作用を再構成します

生体分子構造決定のための単分子レベルでの高精度FRET

MRC 分子生物学研究所高分子結晶化のプロトコルを自動

細胞間の接触でタンパク質間相互作用の分析計蛍光の変動

商業顕微鏡でのライブ細胞膜上の分子拡散法への高速蛍光イメージングから

生細胞におけるタンパク質相互作用とタンパク質ダイナミクスを研究するための二色蛍光相互相関分光法

蛍光相関分光法により測定初代リンパ球のプラズマ膜における分子拡散

脂質ラフトの決定は、蛍光相関分光法（FCS）による生細胞の蛍光タグ付きプローブの分割

画像処理プロトコル、拡散の解析と蛍光顕微鏡による膜受容体のクラスター サイズ

k空間画像相関分光法を用いて、EGFPタグ付きプラズマ膜タンパク質の拡散係数を簡単に測定

画像処理プロトコル、拡散の解析と蛍光顕微鏡による膜受容体のクラスターサイズ