ここでは、一次神経培養準備に適合する高含有受容体の入稿アッセイを示す。この方法は、表面に固定ニューロンのセラー間受容体プールを別々に標識する。その受容体の全体的な密度に対する正規化された表面または内在化された受容体密度の比率としてのデータの提示を可能にする。
高い含有量および受容体の密売アッセイは、様々な要因に応答してニューラルネットワーク内の受容体の密売プロファイルのバルク変化を測定するための効果のある手段を提供する。代替方法よりもはるかに少ない時間と材料を消費します。破壊やプリセプターの人身売買は、複数の神経疾患に関連しており、薬物療法の魅力的な標的と考えられています。
例えば研究は、アルツハイマー病の最も初期の兆候の1つはシナプス損失と減少シナプスおよびプリセプタープールであることを示しています。この手法では、さまざまな難易度の多くの異なる手順が必要です。特に、96ウェルプレートを扱い、井戸を操作することは、経験のない人にとっては難しいことが証明されるからです。
実験の結果は不適切な処理に対して非常に敏感であるため、実行されるさまざまな手順を確認すると便利です。講師 開始するには、各ウェルから既存の培地の 100 マイクロリットルを除去することにより、96 ウェルプレートのニューロンを供給します。そして、摂氏37度に予温された100マイクロリットルのメディアに置き換えます。
3~4日おき。1日のvitro 14では、マルチピペットを使用して各井戸から100マイクロリットルのメディアを取り除き、メディアをプールする。2マイクロリットルのTTXストック溶液をプールされたコンディショムメディアの1ミリリットルに加え、TTXの4マイクロモル溶液を作成します。
4マイクロモルTTX溶液の100マイクロリットルで各ウェルのニューロンを治療します。プール条件メディアが十分でない場合は、以前に保存されたメディアの一部を追加します。摂氏37度で5%CO2インキュベーターで4時間インキュベートします。
この後、既存のTTX含有培地を除去し、200マイクロリットルの予め温めた神経培地を加え、マイクロプレートを室温で15分間インキュベートする。まず、マイクロプレートから神経培地を取り出します。マイクロプレートの対応するウェルに抗gluA1または抗gluA2抗体溶液の50マイクロリットルを加えます。
2次抗体の制御ウェルにのみ50マイクロリットルの神経培地を加えます。抗体結合を可能にするために室温で20分間インキュベートする。この後、既存のメディアを井戸から削除します。
マイクロプレートを1ウェルあたり100マイクロリットルの室温ニューロン培地で3回洗浄し、非結合抗体を除去します。その後、DHPGストック溶液の100マイクロリットルを各ウェルに加えます。摂氏37度で5%の二酸化炭素インキュベーターで10分間インキュベートします。
次に、DHPG溶液を取り除き、各ウェルに100マイクロリットルの神経培地を加えます。このプロセスをもう一度繰り返します。その後、5%の二酸化炭素インキュベーターを摂氏37度で5分間インキュベートします。
実験の日に4%パラホルムアルデヒドと4%スクロースNPBSの溶液を準備します。各ウェルから培地を取り出し、パラホルムアルデヒドとスクロース溶液の100マイクロリットルに交換します。追加する時間ポイントごとにこのプロセスを繰り返します。
マイクロプレートを摂氏4度で20分間インキュベートします。その後、固定剤を取り除き、各ウェルに100マイクロリットルのDPBSを加えます。DPBSを取り外し、各ウェルに150マイクロリットルのブロッキングバッファーを追加します。
室温で90分間インキュベートします。ブロッキングバッファーを取り外し、各ウェルに2次抗体溶液の50マイクロリットルを加えます。プレートを光から保護したまま、室温で60分間インキュベートします。
抗体溶液を取り除き、各ウェルに100マイクロリットルのTBSを加えます。室温で5分間インキュベートします。このプロセスを繰り返し、TBSを添加するウェルから培地を取り出し、室温で4回インキュベートする。
この後、マイクロプレートからTBSを取り出します。各ウェルに4%パラホルムアルデヒドと4%スクロースの溶液の100マイクロリットルを追加します。室温で15分間インキュベートします。
パラホルムアルデヒド溶液を取り出し、各ウェルに100マイクロリットルのTBSを加え、室温で5分間インキュベートします。この手順を 2 回繰り返します。まず、2%サポニンを含むTBSの溶液を調製し、溶液をボルテックス溶液を短時間で調製し、サポニン粉末を完全に溶解させた。
2マイクロメートルのフィルターを使用して、自己蛍光を引き起こす可能性のある粒子を除去するために溶液をフィルターします。この2%サポニン溶液を150マイクロリットルずつ各ウェルに加え、室温で15分間インキュベートします。次いでサポニン溶液を取り出し、各ウェルに150マイクロリットルのブロッキングバッファーを加える。
室温で90分間インキュベートします。この後、ブロッキングバッファーを取り除き、各ウェルに2次抗体溶液の50マイクロリットルを加えます。室温で60分間インキュベートします。
その後、各ウェルに100マイクロリットルのTBSを加え、室温で5分間インキュベートします。このプロセスを繰り返し、TBSを加え、室温で4回インキュベートします。赤外線レーザーイメージングシステムを使用して、メーカーの指示に従って96ウェルマイクロプレートをイメージします。
スキャン解像度を84マイクロメートルに設定します。使用される96ウェルマイクロプレートのベース高さに応じたスキャン品質と焦点オフセット。イメージスタジオメニューボタンをクリックし、デジタルメディア用の画像をエクスポートし、300 dpi の解像度でTIFF形式で画像をエクスポートします。
イメージをイメージ J フィジーで開きます。画像メニューをクリックしてカラーチャンネルを分割し、チャンネルを分割してカラーを表示します。次に、分析ツールからROIマネージャを開きます。
数字で円を分類するには、ROI マネージャのラベルのチェックボックスをオンにします。6 80(または赤いチャネル)で、円ツールを選択し、最初のウェルに正確にフィットする円を描くことによって、対象領域を選択します。次に、Ctrl キーを押しながら T キーを押し、円を次のウェルにドラッグします。
すべてのウェルが丸で囲まれるまで、このプロセスを繰り返します。ROI マネージャーからメジャーをクリックします。表示される値を選択し、スプレッドシートにコピーします。
次に、緑色のチャンネルをクリックし、選択したROIを画像に移調します。ROI マネージャーからメジャーをクリックします。表示される値を選択し、スプレッドシートにコピーします。
この後、テキストプロトコルで概説されているように表面受容体の発現を計算します。この手順では、アンパ受容体の密売を調節する際のアークの持続性を高含量アンパ受容体の人身売買およびアッセイを用いて検討する。ニューロンは、作用電位を阻害し、アークレベルを低下させるナトリウムイオンチャネルブロッカーTTXで処理されます。
続いて、アーク翻訳とユビキチン化を誘導するDHPGが続く。アパ受容体サブユニットを含むgluA1およびgluA2の表面および内在化プールの両方を、DHPG洗浄後5分および15分で測定した。ArcKRニューロンは、タイプニューロンの間に比べて、DHPGで治療するとグルA1エンドシトーシスの増加を示す。
この効果は、ニューロンがTTXのみで処理される場合には見られない。gluA2サブユニットの表面発現は、ワイル型ニューロンと比較して短い時点で有意に増加する。サブユニットの置換候補を示します。
細胞が液体でない固定パラホルムアルデヒドであることを保証し、実験の日に新鮮な準備をする必要があります。細胞は、表面受容体の標識後に再固定する必要があります。共焦点顕微鏡のような他の方法は、ニューロン構造および受容体の局在化における関連する変化をさらに特徴付けるために単一細胞化分解能を提供することができる。
アークの時間的ダイナミクスを破壊すると、MgluR媒介LTD.の将来の方向は、他の刺激に応答して密売するアンパ受容体を測定することである。このアッセイは、処置が慎重に調整され、適切に検証されることを条件として、他の細胞タイプ、治療および受容体に適応可能である可能性がある。
細胞密度、処理時間、固定ステップ、透過性ステップ、試薬選択が目的のシステムを最適化されるように注意する必要があります。アッセイの成功と効率的な完了のためには、実験の日にDHPG溶液と4%パラホルムアルデヒド、4%スクロース溶液を調製することが重要です。観察された効果が治療に特異的であることを確認するために、バキールまたはTTXでよく処理されたコントロールが必要です。
また、非特異的結合によって産生されるバックグラウンド蛍光を制御するために二次抗体のみで処理されたウェルを含めることも重要です。
