VECT-HORUSへの財政支援は、フォンユニークInterministériel（FUI / MEDULプロジェクト）から承認され、通信社国立·デ·ラ·ルシェルシュ（ANR、TIMPAD、VECtoBrain、VEC2Brain、ADHOCとPREVENTAD共同プロジェクト）からとUMR7259の実験室ホルスVEC​​Tする。 UMR7259研究所もCNRSからエクスマルセイユ大学からの財政支援を認めるものです。

ラットアストロサイトの1。生産各調製のためのセックスのどちらかの10新生児のWistarラットを使用しています。 <ol><li>ハサミで頭部を切断したラットを犠牲にし、層流フードの下で乾燥したペトリ皿にすぐに転送します。小脳なしに頭蓋骨から脳を取り出して、冷たい解剖バッファーを含むペトリ皿にそれらをすぐに転送する：HBSSを1％ウシ血清アルブミン（エンドトキシン、BSAの低レベル）、100μg/ mlのペニシリン100単位/ mlおよびストレプトマイシンを補充した。 </li><li> 2大脳半球を分離し、氷上で解剖バッファーで清潔なペトリ皿にそれらを転送するために、半分に脳を切った。視神経をカットし、実体顕微鏡下で髄膜を除去します。 </li><li>冷たい解剖バッファーの50ミリリットルで広く皮質の部分を洗ってください。 </li><li> 15ミリリットルファルコンチューブに3脳からの皮質の部分を配置し、ピペッティングにより解離し、クーデターダウンル回、10 mlの0.05％トリプシン6mlの中に青色チップを備えた使い捨てピペット - EDTA、37℃で5分間0.02％ </li><li> 24 10％FBSを添加したDMEM mlの以下の抗生物質、ペニシリン100単位/ mlおよびストレプトマイシン100μg/ mlの、グリア細胞培地（GCM）という名前のメディア、そして室温で5分間300×gで遠心分離器を追加します。 FBSバッチはアストロサイトcuturesの成長と生存のために選択され、検証された。 </li><li> 75cm 2の Tフラスコ（T75）に10ミリリットルのGCMとプレートの解離した細胞を含むペレットを再懸濁します。細胞の破片やDNAを除去するために、次の日に培地を変更します。週に2回培養液を交換してください。 </li><li>増殖の1週間後、そっとGCM中37℃で24時間の間に60 rpmでオービタルシェーカーでグリア細胞を振る。 T75は、37℃加湿雰囲気において、5％CO 2/95％空気のインキュベーター内に配置できない場合は、5mMのHEPESを含む培地を補う。 R 2回細胞を洗浄非付着性ミクログリア細胞を残したまま削除。 </li><li>播種から3週間後に、カルシウムとマグネシウムを含まないDPBSで細胞を2回洗浄します。 、温かいトリプシン3mlの0.05％-EDTA 0.02％の追加、37℃でインキュベートし、細胞層が分散するまで待つ（通常は5分）。 8分間、120×gで15ミリリットルのFalcon遠心チューブに細胞懸濁液を転送し、GCMを10mlを添加してトリプシン活性を阻害する。 </li><li> 90％FBS中で星状細胞ペレットを再懸濁し、10 - 10％のDMSO、液体窒素中で（2×10 6個のクライオバイアル当たり細胞）およびストアクリオバイアルにそれらを転送する。 </li></ol>ラット脳微小血管の2。分離我々の実験手順は、マルセイユの医学部の倫理委員会によって承認され、国家と欧州の規制（EU指令第609分の86）に適合している。すべての努力が動物の苦痛を最小限にし、使用する動物の数を減らすために行われた。 <ol><li>各製造方法および1 experimente用R、3 5週齢のWistar系ラットを使用しています。 </li><li>最初の週の月曜日には、両方の無菌培養水に1μgの/ 2程度（T75あたり10ミリリットル）で、IV型コラーゲンおよびフィブロネクチンでコーティングすることにより、2 T75フラスコを準備します。微小血管播種まで37℃で接着させる。 </li><li>最初の週の水曜日の朝、頸椎脱臼に続いて、その後、姿勢と呼吸の中断の損失を眠気を誘発するために、CO 2の増加フラックス下にラットを安楽死させる。 70％エタノールで頭をスプレーします。ハサミで頭をカットし、層流フードの下で乾燥したペトリ皿にそれらを転送します。 </li><li>氷上で冷却し、冷たい解剖緩衝液で満たされたペトリ皿にそれらを転送して、小脳および視神経ことなく頭蓋骨から脳を削除する（HBSSは1％のBSA、ペニシリン100単位/ mlおよびストレプトマイシン100μg/ mlの添加） 。 </li><li>用から2大脳半球と別々の脳を分離するために半分に脳をカットebrain。解剖用緩衝液で氷上でクリーンなペトリ皿に前脳を転送します。 </li><li>慎重にN°5の湾曲鉗子で実体顕微鏡下で前脳から髄膜を除去するために冷たい解剖バッファを持つ、新しいシャーレに半球のカップルを取る。その後、ミエリンの羽毛布団を削除して、皮質のシェルを得るために、脳の内部を清掃してください。これらのステップは、組織保存と細胞生存のために2つ以上の時間を取るべきではありません。 </li><li> 20ミクロンに続く異なるクリアランスの2杵のそれぞれとストローク上下に10、71ミクロンで7ミリリットルダウンスホモジナイザー冷解剖バッファーの6ミリリットルに3脳から皮質を解離する。 </li><li>室温で5分間千×gで50ミリリットルファルコンチューブと遠心分離機の1ミリリットル中1皮質と同等のものを得るために、サスペンションを分割。上清を捨てる。 </li><li>コラゲナーゼ/ディスパーゼ（60μg/ mlのRの混合物を含む酵素溶液1mlを1皮質からサスペンションダイジェスト11; 0.3 U / ml）を、DNアーゼI型（35μg/ mlの - 20 K単位/ ml）およびゲンタマイシン（50μg/ ml）を37℃で30分間、シェーカーで</li><li> 1は、25％のBSA / HBSS 1X 10mlで1皮質から消化し、室温で15分間3600×gでの密度に依存する遠心分離による独立したミリリットル混ぜる。慎重にきれいな50ミリリットルファルコンチューブにアッパーディスク（ミエリンと脳実質）、上清を転送し、遠心分離を繰り返します。 4℃で脳の微小血管を含む得られたペレットを保つ</li><li>慎重にアッパーディスク、上清を捨てる。冷HBSS 1X 1mlで脳の微小血管を含む両方の得られたペレットを再懸濁し、きれいな50ミリリットルファルコンチューブに移す。 </li><li> 5分間1,000×gで、20冷HBSS 1X mlの遠心分離を加えることにより微小血管を洗ってください。上清を捨てる。 </li><li> SHで、37℃で1時間の間にステップ2.9で説明したように、さらに同じ酵素溶液1mlを1皮質から微小血管ダイジェストアーカー。 </li><li>その後、1チューブに3皮質のそれぞれから消化微小血管をミックスし、さらにチューブあたり1年半（1.5）皮質に相当から抽出された微小血管を得るために、2 50ミリリットルファルコンチューブに分離。室温で5分間1,000×gでの冷解剖バッファと遠心機の30ミリリットルを追加します。 </li><li> 20％のウシ乏血小板血漿由来血清、塩基性線維芽細胞成長因子（bFGF、2 ng / mlの）、ヘパリン（100μg/ ml）を、ゲンタマイシン（50μg/ ml）を補充したDMEM/F12 10ml中の微小血管ペレットを再懸濁およびHEPES（2.5 mM）を、4μg/ mlのピ​​ューロマイシンで補充した内皮細胞培地（ECM）と呼ば。 </li><li> 、インキュベーターから2コーティングされたT75フラスコを取り、コーティングの過剰を吸引し、1 T75フラスコ（T75フラスコあたり1.5皮質から抽出された微小血管）に各チューブから微小血管プレート。 </li></ol> RBEC Primoculturesの3。精製及び増殖<ol><li>精製：水曜日から金曜日まで、puromを追加ycin培地に4μg/ mlの時。木曜日にメディアを変更します。金曜日に、月曜日までの2μg/ mlで細胞を洗浄し、ピューロを追加します。 </li><li>増殖：第二週の月曜日に、細胞を洗浄し、培養物は第二週の水曜日に90％の集密度に達するまで培養培地にインスリン、トランスフェリン及び亜セレン酸ナトリウムのサプリメントを追加します。 </li></ol> 4分化： インビトロ BBBモデルの設定<ol><li>第二週の月曜日、両方の無菌培養水中の0.5μg/cm2上部コンパートメント内のミックス（500μLでIV型コラーゲンとフィブロネクチンのミックスでコーティングすることにより、フィルター（ポリエチレン、12井戸、孔サイズ1.0μm）を用意と下部コンパートメント内の無菌培養水の1.5ミリリットル）。 RBEC播種まで37℃で接着させる。 </li><li>二週目の月曜日には、5日間共培養の確立の前に、37℃、転送時クライオバイアルからアストロサイトを解凍10ミリリットルGCMと15ミリリットルファルコン中。室温で8分間120×gでサスペンションを遠心分離する。 </li><li> 12ウェルプレート中で1cm 2当たり30×10 3細胞の密度でプレートし、GCMにおける星状細胞ペレットを再懸濁。 </li><li>第二週の水曜日は、ちょうどトリプシンでRBECの解離の前に、DMEM/F12培地で2回プレコーティングされたフィルターを洗浄。下部コンパートメント内の1.5ミリリットルと上の区画に0.5ミリリットル：ECMとチャンバーを事前に記入してください。 </li><li>二週目の水曜日には、カルシウムとマグネシウムを含まないDPBSで二回RBECを洗う。正確に30秒の間にT75フラスコあたりの37℃でのEDTA 0.02％溶液 - 暖かいトリプシン4ミリリットルの0.05％を追加します。その後、トリプシン溶液3.5ミリリットルを削除して、顕微鏡下で観察します。細胞層は、マトリックスからデタッチし始めると、すべてのセルは、フローティングされるまで静かにT75フラスコの端をタップすることで彼らを助ける。 </li><li> T75フラスコあたりのECMの9ミリリットルを加え、15ミリリットルファルコンチューブに移す。非常に静かに細胞を解離黄色のチップを搭載した10ミリリットルピペットで4回上下にピペッティングして懸濁液（溶液中の気泡の発生を避けるため）。懸濁液中の細胞（約3×10 6 cells/T75）をカウントし、すぐに高濃度（160×10 3細胞/フィルターゆえ約18 filters/T75）（ 図8で予備コーティングし、プレフィルフィルターにプレート）。翌日（木曜日）、細胞破片を除去するための上部コンパートメントの二倍の媒体を変更してください。 </li><li>第二週の木曜日、共培養の確立前日、基礎コンパートメントから1月3日馴化培地を補充することができる分化培地（500nmにおけるヒドロコルチゾンとECM）の1.5ミリリットルでアストロサイトの培養液を交換してください前の共培養（内皮細胞とアストロサイトとの間の接触の3日間）の。 </li><li>二週目の金曜日は、分化の0日として定義されます。フィルタコンタから培養培地を交換分化培地でRBEC ining。アストロサイトを含むウェルにRBECフィルターを転送します。これらの条件下で、in vitroモデルは、分化し、3日以内に接合関連タンパク質を発現する。 </li><li>モデルは、第三週の月曜日と水曜日の間、3日以上の間、それらの最適な分化を維持する。 </li></ol>

Michel Khrestchatisky is director of the UMR7259 laboratory, co-founder and scientific counsel of VECT-HORUS biotechnology company.

私たちは、RBECの精製および培養後、さらに特徴的なBBB特性を用いたin vitro BBBモデルを生成するために、初代ラットアストロサイトとの共培養のセットアップ、脳の微小血管の分離と、めっきのための週刊再生可能なプロトコルの実装について説明します。 首尾体外 BBB培養で標準化を確立するプロセスの複数の連続的なステップで最適な条件を必要とする。モデルは、（A） のin vitro BBBモデルの「聖杯」のままで、最低傍細胞透過性を得るために最適化され、（b）の流出およびRMTメカニズムを検証した。 RBECの生産、精製及び増殖 RBEC栽培の最大の課題は、異なる文化間の再現性を達成することである。プロトコルの標準化は、DISのための高品質なツールが必要ですセクション、高品質の試薬および試薬の有効期限に関して。実験者は、皮質表面からの髄膜および大血管の迅速な除去のために実体顕微鏡下で顕微解剖の熟練される必要がある。脳を単離して、機械的に分離されると、大きな課題の一つは、新たに単離した脳の微小血管の最適な酵素消化である。使用される酵素の種類と品質が重要です。バッチ間の低い変動性を有する高濃度のコラゲナーゼ·タイプIとIIとディスパーゼの組み合わせを使用した。また、重要な酵素消化の持続時間および酵素濃度/消化の組織重量/体積の比である。脳の微小血管の生産の最高の収率は30分、1時間、それぞれ、両方の消化中に60μg/ mlので混合ディスパーゼ/コラゲナーゼの1ミリリットル中に1脳から皮質に相当して得られた。 また、重要な細胞を汚染の排除であるS（アストロサイト、主に周皮細胞）。これらの細胞は、内皮細胞よりも速い速度で増殖し、良好な傍細胞拘束性と均一な細胞単層の確立を防止し、後者でタイトジャンクショ​​ンを確立していない。非内皮細胞が除去されている間、脳内皮細胞が微小血管に見出される他の細胞型と比較して、排出ポンプ、特にP-gpのはるかに高いレベルで発現することを考慮すると、それらは、P-gpのリガンド薬物のそれ以外の毒性濃度をより良く耐える。最初の二日間、4μg/ mlのピ​​ューロマイシンでの処理は、良好な内皮細胞の純度を得るために2μg/ mlの少なくとも2日間続いた。この選択には、細静脈、前毛細血管動脈以上の微小血管からのものと比較毛細血管内皮細胞を支持し、より緊密な単層につながることができます。また、貧しい人血漿由来ウシ血清の使用は、内皮細胞47,48の純粋培養を得ることが不可欠です。プラズマデアived血清は、平滑筋細胞および周皮細胞のために、従って、線維芽細胞に対して分裂促進性である血小板由来増殖因子（PDGF）を欠く。 我々は、マウス由来のIV型コラーゲンの混合物を有するプラスチックとフィルタの治療及びヒトフィブロネクチンは、ラットの尾から伝統的に推奨されるコラーゲンタイプIと比較して、増殖収量の2倍の増加で、重要な利点をもたらすことを観察した。細胞増殖のための重要な手がかりは、インテグリンおよび増殖因子（bFGF）の活性化などの細胞外マトリックス49によって提供される。培地の緩衝液濃度及びpHは、傍細胞気密50に積極的に影響を与えることが記載されており、我々は、少なくとも5mMのHEPES緩衝液を添加して培養物との間の良好な再現性が観察された。 挿入フィルター上の共培養設立：RBECの分化 脳内皮細胞は、BたらEENを精製し、6日間増殖し、これらはフィルター上に播種することができる。高密度細胞播種は完璧な単層を得るために重要である。 12ウェルプレートフィルター当たり160x10 3細胞の播種密度で播種後のコンフルエントな単層を24時間を得るために必要かつ十分であった。しかしながら、その環境からの一次脳毛細血管内皮細胞の単離は、それが一次細胞、および特に脳毛細血管内皮細胞は、強く、環境によって調節および誘導因子はによって産生されることが知られているように、BBB のin vitroモデルの構築におけるパラドックスである異なる周囲の細胞型。脳毛細血管内皮細胞は、単独で急速に脱分化を培養し、いくつかの特定の脳内皮マーカーを失う。このように、一次内皮細胞は、低継代（P1）で使用されるべきであり、再接続された、少なくとも部分的に、星状細胞により馴化星状細胞47,51又は媒体との共培養によるそれらの環境と。これが成立脳内皮細胞とアストロサイトのようなアストロサイト分化のための真の双方向の誘導に関与している。アストロサイトとのRBECを培養するinterendothelial TJ 52,23の強い誘導につながった。再誘導の分子機構はほとんどわかっていない、と研究は、最適な内皮細胞分化53,54を促進することができアストロサイトから分泌される特定の変調因子を特定するためにいくつかの研究室で進行中である。白血病抑制因子（LIF）を含む、脳内皮細胞によって分泌される因子は、アストロサイト分化55,56を誘導することが示されている。共培養の確立の前に、星状細胞を分化グルココルチコイド受容体アゴニストヒドロコルチゾンを含む培地と共培養馴化培地に曝露した。ヒドロコルチゾンは、脳内皮細胞の気密性 ​​を向上させることが知られており、特にラットおよびマウス57 58,59内皮細胞からBBBモデルにおいて使用される。エアコンMEDIウム3日後、内皮細胞/アストロサイトの共培養系の下部区画から回収し、後の使用のために凍結される。共培養条件培地の使用は、2日以上のための最適な傍細胞透過性と文化の間も改善再現性の3日前の内皮細胞分化の時間を減少させた。 全体的に、我々が説明するプロトコルは、0.26±0.11×10 -3センチ最高の一次電池ベースのBBBモデル22と同様/分の300オーム以上の再現性TEER·cm 2であり、平均傍細胞透過係数PE（LY）が得られる12。我々は微小血管酵素消化の提案された変調に本原稿に記載するプロトコルは、ラットの脊髄60から、およびマウス脳から内皮細胞に拡張することができる。 分子·機能解析 加えてTJ誘導のために、星状細胞はまた、脳内皮細胞における61 P-gpのような排出トランスポーターの発現に寄与する。我々は、実際にBBBモデルにおける排出トランスポーターP-gpの発現を示し、我々は、生化学的アプローチを用いて、P-gp排出ポンプ局在化、および機能的アッセイを用いてP-gpの活性の極性を示す。 GLT-1の発現は、微小血管の基底膜画分に検出されたが、培養されたRBECでは検出されなかった。私たちは、GLT-1がダウンウエスタンブロット分析によって検出可能なin vivo条件下 、結果的にはないと比較して、当社のRBEC培養でレギュレートされたと仮定した。過剰なグルタミン酸が神経毒性であり、 生体内で、GLT-1は、先端区画（血液循環）に基礎コンパートメント（実質）からのグルタミン酸流出を担当しています。星状細胞培養物においては、GLT-1発現は非常に低いままであり、媒体62,63にグルタミン酸を添加することによって誘導される。 またをconfこのようなLRP1、LDLRとのTfRなどの頂端膜に流入輸送体の発現をIRM。のTfRとLDLRの機能は、以前に体外 BBBモデル64 のウシで示すように、単層の反管腔側に腔側からTF-Cy3およびDiLDLの結合実験および輸送に実証された。興味深いことに、星状細胞からの脂質の要件が65,66は、さらに、インビトロで含む、星状細胞および脳内皮細胞との間の生理学的なクロストークを確認する脳毛細血管内皮細胞上のLDLRの発現を増加させることが示されている。我々は、蛍光色素で搬送を例示するために選択したようなCy3及びDIIを使用する蛍光分光分析は、ほとんどの実験室で提供され、 体外BBBモデルで検証するために有用であることを証明できることを考えるととして。しかしながら、蛍光の定量化は、放射能よりもはるかに感度が低いと有意なデータを得るための実験の数の増加を必要とする。理想的には、TFおよびLDLは通常、このような結合/取り込み及び輸送実験のための（ヨウ素125）の放射性標識である。 また、CCL2リリースとBBBの開放によって明らかにされるように提案されたプロトコルを用いて得られた分化した内皮細胞単層は、TNF-αによって誘導される炎症に反応することを示している。 CCL2（MCP-1）およびその受容体CCR2が、多発性硬化症などのCNS ​​病理に関与している、実験的自己免疫性脳脊髄炎（EAE）67、CNS外傷68とは、神経炎症条件下69,70の下でCNSへの白血球遊走メディエーターとして知られている。 BBBの開口部がCCL2濃度が上（頂端）と下位（基礎）の区画の両方の間で平衡化することができるため、テストのプロトコルでは、我々のCCL2偏分泌に結論付けることはできません。その結果、我々は明らかに、24時間（ 図5A）で、頂端区画内にRBECによって生成CCL2の量を過小評価しています。 一般概要とin vitroモデル BBBの制限：人間の比較に対するインビトロおよびげっ歯類に対するI Nビボ in vitroでのBBB通路に有効であることが証明され、多くの有望な中枢神経系薬は、多くの場合、ヒト以外の種から単離された細胞に基づいて体外 BBBモデルで預け予測可能性の欠如のために臨床試験に失敗しました。それはタンパク質ネットワーク、シグナル伝達、トランスポーターと受容体の機構的な側面を研究することになると我々の知る限り、 生体外 BBBモデルは、おそらくより予測となる。 in vitroで研究するためにあらゆるメカニズム、経路またはターゲットは、同じ動物種との相補的な環境合図（他の細胞型、化学物質、蛋白質）によるその調節のために特徴づけられ、 その場での研究にするために結合する必要がある、および可能な場合は、下記の誘発の制限、注意して、ヒトから分離された微小血管内皮細胞を用いた。 in vitroでのBBBモデルは、ボディの規制から分離自律システムとして見られることがありますが、まだ主要なin vivoでの特性や環境の合図による規制の可能性に恵まれている。内皮細胞単層は、神経グリア血管部（NGVU）の重要な構成要素の数を欠き、血液及び身体調節から単離されているので、インビトロ BBBモデルには「理想的な」は、まだ71,72,73提案されていない。周皮細胞のニューロン17,18又は74,16又はプラスチックコーティングまたは内皮に基づいて、最も一般的で、「最も簡単な製「 インビトロ BBBモデルにおける細胞増殖に用いられる培地および血清に用いられる細胞外マトリックスの種々の成分の欠如アストロサイトに分化した細胞は、タンパク質の発現を調節することができるiのN in vivo の状況75との比較。これらのモデルは、 生体内で表示された多くのトランスポーターを発現し、すべてではなくてもよい。いくつかの場合において、トランスポートパラメータは、第離された微小血管（ インビボ状況に最も近い）で確認した後、細胞培養系76,61において研究。 分子生物学的研究が可能となった同じ種から単離された微小血管と低通過内皮細胞培養における遺伝子およびタンパク質の発現特性評価、異なる種の間で、最も頻繁にそのようなげっ歯類（マウスおよびラット）またはin牛や豚からの小動物から人間77,78,75,15との比較。 in vivoおよびin vitroの脳の微小血管内皮細胞におけるトランスクリプトームの間の比較は、示差的に発現され、最も頻繁にインビトロで有意にダウンレギュレートされた多数の遺伝子転写物を示した。などのTfRやPRなどの流入輸送体をコードする転写小胞輸送に関与oteinsは主に細胞内のエンドサイトーシスおよび小胞輸送の一般的な減少を示唆して、培養された脳内皮細胞において下方制御されています。純度（ピューロマイシン処理）及びヒドロコルチゾンを用いた治療の面で培養操作は、より「 インビボ様」遺伝子発現プロファイル77を復元するのに役立ち得る。トランスクリプトームの研究はまた、さらに体外 BBBモデル75 内の齧歯類に基づいて、ヒトにおける薬剤の取り込みに予測を複雑にし、種間の重要な相違点を明らかにした。ヒト内皮細胞とアストロサイトの共培養を含むインビトロ BBBモデルは、15に記載されている。関連するが、それらは、死後のヒト組織への調節のアクセスを必要と異質性は、年齢、疾患、およびおそらく医学的に依存してヒト脳内皮細胞の品質/特性の中にあるように、これらのモデルは、定期的に実施するのがより困難であるtreatmenドナーのT。努力はよりよい生理的、解剖学的およびin vivoでの BBBの機能特性を再現新しいin vitroモデルを開発するために行われなければならない。 3セル型を含む共培養物は、非常に限定的であり、日常的に実施が困難で表示される。現在までに、最も複雑な生体外 BBBモデルは、アストロサイトと血管様組織を含み、血流75,79,80,81,82を模倣媒体の流れを含んでダイナミックなin vitroモデル（DIV-BBB）です83,84,85。脳の内皮細胞は流れにさらされると、生成された剪断応力は、例えば、細胞分裂、分化、移動およびアポトーシス80内皮細胞生理学に関与する別の遺伝子の発現を調節する細胞表面でmechanotransducersを活性化する。 インビボ、せん断応力血流によって生成されるの確立を許可する細胞接触、で有糸分裂停止を担当してい血管80内の内皮細胞単層。正常なヒト脳微小血管内皮細胞のゲノムおよびプロテオーム解析は、BBB内皮生理学84のせん断応力の影響を示した。せん断応力は、CYP450によって媒介75,86、酸化は75酵素および細胞生存、内皮細胞接着度が高く、排出ポンプの誘導およびトランス75、グルコース代謝の調節のより良好な分極に関与する発現を増加させることによって、傍細胞透過性の調節オクルディンとZO-1 87,75,80、結果的に高いTEERのような細胞間の接合部の要素をコードする遺伝子の約1,500 - 2,000Ω·cm 2で、 生体内で知られているに最も近い79,80パラメータ バイオテクノロジー及び製薬産業、医薬品のルーチンのスクリーニング、あるいはハイスループットスクリーニング（HTS）および動物実験を削減する努力において、主導セットアップするのに日常的により難しいままで脳内皮細胞の初代培養物の交換に使用される異なる細胞株の開発。ほとんどの場合、脳内皮細胞の初代培養物は、プラスミドDNAのトランスフェクションにより、またはレトロウイルスベクターを用いて感染88,89,75のいずれかによって、不死化遺伝子（SV40又はポリオーマウイルスラージT抗原またはアデノウイルスE1A）で形質導入した。 88,75などRBE4、GP8/3.9、GPNT、RBEC1、TR-BBBSまたはrBCEC4ラット細胞株などの脳由来の内皮細胞株が開発されてきたいくつかの、b.End3マウス細胞株90,75、PBMEC/C1 - 2ブタ細胞株87,75、およびhCMEC/D3ヒト細胞株89,75。他のモデルは、マディン·ダービーイヌ腎臓（MDCK）またはたCaco2細胞株12,75などの非脳由来の細胞に基づいている。異なるヒト脳血管内皮細胞株の中で、hCMEC/D3は広く引用されていますDと2005 91,92年の設立以来、BBBのモデルとして改良された。初代培養細胞株に存在利点と制限などである。彼らは、初代培養よりも扱いやすい延長寿命を持って、十分に特徴付けされており、大規模な実験間の再現性を可能にします。しかしながら、細胞株は、組織特異的機能を失う環境規制を失い、 インビボ75、89中の細胞とは全く異なる分子表現型を獲得することができる。具体的には、単層の細胞株から現在減少し圧迫感、低TEERおよびshowポータープロファイル変動75,89を生成しました。このように、一次細胞での動物実験や研究は、多くの場合、その複雑さにもかかわらず、好ましい。

中枢神経系（CNS）障害を治療するために開発された多くの薬物は、治療上適切な濃度で脳実質に到達することができない。 BBBは、病原体から、プラズマ組成の変動による脳の神経組織を保護し、脳1内外にイオンが、ペプチド、タンパク質、さらには細胞の非特異的フラックスを制限することにより、脳実質の恒常性を維持する。 BBB特性は、特殊なクラスの脳微小血管内皮細胞や、神経細胞、グリア細胞（より正確にはアストロサイトのエンドフィート）、などの神経グリア血管ユニット（NGVU）の隣接する要素間の密接な近接性やクロストークによって誘導され、維持されるおよび周皮細胞は、IV型コラーゲン、フィブロネクチン、ラミニンおよびプロテオグリカン2,3を中心に構成されて基底膜に鞘で覆わ。毛細血管レベルでの内皮の32％、重要なを果たしている - 周皮細胞は、約22をカバー内皮細胞増殖、血管新生および炎症プロセスの調節において役割。内皮細胞は、毛細血管の内表面を覆う連続シートを形成する。それらは、頂端領域で帯状構造を形成し、それが細胞極性に寄与するのTJ、相互に接続されている。星状細胞は、BBB特性を調節し、例えば、TGF-β、GDNF、bFGFおよびIL-6などの重要な調節因子の供給源である。不完全な機能を備えたGFAP欠損したアストロサイトは、BBBの特性4を規制することができません。ニューロンは直接BBBの形成に構造的に関係するだけでなく、タンパク質発現およびBBB機能5の重要な側面を規制されていません。 さらにBBBの構造、生理学、病理学を研究するために、BBBのin vitroモデルは、研究ツールとして開発されました。脳内皮細胞ベースのインビトロ BBBモデルにおいて実現するために、種々の種から抽出されている8,9ブタウシ6,7、、ラット10,11,12、また、マウス13とヒトの14,15から低継代初代培養上。これらのモデルは、in vivoでの BBBを模倣することが知られている場合に特にラットまたはマウスおよび/ ​​または周皮16,12からグリア細胞及び/又は神経前駆細胞由来のアストロサイト17および/ ​​またはニューロン18と共培養した。それらは、インビトロ / インビボ実験と比較および/ ​​またはトランスジェニックモデル19から製造脳内皮細胞の研究において可能にするので、「ラボにおける「モデルはしばしば齧歯類から製造される。 新たにインビトロ BBBモデルにおいて開発もインビボ試験15,20,21,3,6,22,11,23の前に潜在的なCNS薬剤候補の脳への取り込みを予測するのに役立つように設計されている。 インビトロ BBBモデルは、通常、比較するために使用されているCNSへのI）は、公知の浸透またはlと：を有する薬剤の輸送BBBなし中枢効果全体のOW透過性、及びii）同じ種の動物モデルで測定された、同じ薬の見かけPeの。容易にBBBを通過する薬物は、主に親油性であり、脂質媒介自由拡散（カフェイン、カルバマゼピンなど）によって脳内皮細胞膜を横切る。ジゴキシン、ベラパミルまたはシクロスポリンAのような負に運ば薬は積極的なP-gpのような脳内皮排出トランスポーターによって押し出される。しかしながら、新たに開発された治療用分子の多くは、そのような組換えタンパク質、siRNAまたはモノクローナル抗体などの生物薬剤である。特定のトランスポーターのI）が存在しない、と傍細胞経路を受けるの高分子量分子を防ぐ内皮細胞のII）しっかりと充填層：それらのほとんどが起因してBBBを通過しないでください。これらの制限により、「トロイの木馬」戦略は、ベクトル、BBBでの既知の受容体に対する（抗体、ペプチド）、関係Iを使用して実装されていますN受容体は、トランスポートまたはトランスサイトーシス（RMT）、トランスフェリンなど（TF）受容体（のTfR）、インスリン受容体（IR）、またはLDL受容体のメンバー（LDLR）関連受容体ファミリー（LDLR、LRP1）を媒介した。このような受容体は、 生体内で 24,25 で孤立した脳毛細血管に及び、BBBで発見されている。これらの受容体の転写プロファイルは、特に、LDLRファミリーのものは、分析し、共培養直接脳26からのそれらの抽出後の星状細胞または脳毛細血管内の脳内皮細胞および脳内皮細胞間で比較した。 Pardridge 24は、インスリン受容体およびインスリン増殖因子受容体27,28に対する抗体、続いて、トランスフェリン受容体（TfRの）に対してOX-26抗体を用いてフィールドを開いた。これらの抗体ベースのベクターを用いて、ArmaGenテクノロジーズは、BBB 29を越え、タンパク質を含む、薬物を送達するために、BBBの分子トロイの木馬プラットフォーム技術を開発しました。ザ·文献はLRP1脳血管内皮細胞での発現と強力なエンドサイトーシス/スカベンジャー受容体としての役割を示すデータが豊富である。ウェスタンブロット分析は、LRP1が脳毛細血管に富む画分に、ラットの脳毛細血管内皮細胞30において発現されることを示唆した。このようなBBB 31を越え、効率的な薬物の流入を促進アプロチニン由来のペプチドベクターを用いたAngiochem目標LRP1などの企業。しかし、LRP1もAβおよび血液32に脳実質からの流出/クリアランスの能動輸送に関与している。このようなデータは、そのリガンドによってはBBBを通過双方向輸送にLRP1を伴う。 biOasisはVECT-HORUSがLDLR 34を対象とするペプチドベクトルを開発していますが、このようなBBB 33全体のリソソーム酵素や抗体などの生物製剤の輸送のためにタンパク質メラノを使っトランセンド技術を開発しています。データは、LRPおよびLDLRの差分を輸送するために使用できることがあるが示唆されているこのようなBBB 37全体のリソソーム酵素35,36またはナノ粒子複合体としてのerent分子。 我々の関心のある分野は、ベクター分子およびCNS疾患の治療のためのベクトル化された薬剤候補を用いて、CNSへの薬物送達である。具体的には、BBBを横切る薬物送達は、神経炎症、その範囲が変化してもよいプロセスのコンテキスト内で考慮されなければならないが、これは、脳炎、多発性硬化症、アルツハイマー病などの神経炎症を含む、おそらくすべてのCNS病変および疾患に共通であるBBBの炎症と、潜在的にBBBの生理学および透過性の変化は、傍細胞及び経細胞輸送は、病的状態の38,39,40,41,42,43で増幅することができることを考慮に関連付けられている。例えば、TNF-α、TWEAK、および他のサイトカインは、炎症を調節し、 インビトロ BBBモデルを用いた実験は、それらが目の傍細胞特性を変化させることができることを示しているE内皮細胞単層38,39,40と、そのTNF-αはまた、LDL 41の経細胞輸送の増加、ホロトランスフェリン42ラクトフェリン43につながる。 我々の目的は、開発し、特性化することでした最適化され、再現性の高いラット同系BBBモデルは、一次脳内皮細胞とアストロサイトの共培養を使用した。私たちは、それぞれ脳内皮細胞の生産とアストロサイト制作のための5週齢および新生児ウィスターラットを使用していました。 1つの課題は、「毎週再現可能な「BBBモデルの生成を可能にするプロトコルを確立することであった。この目的を達するために、生産プロトコルのすべてのステップは、最初の週の水曜日に脳の微小血管の生産から開始し、週の固定日に実施された。解剖は、過去3年の間にほぼ毎週行った。さらに、培養の再現性を向上させるために、品質保証システムを確立した。すべてreagenTSと化学物質データベース（入国日、株式、有効期限など）で参照されました。 モデルは、内皮細胞の組織化および純度などの多くの基準は、次の特徴づけられた、TEER、LY透過性、炎症誘発性剤、TJタンパク質の定性的および定量的な発現、例えば、P-gpのような排出トランスポーターの機能性、および受容体に応答しなどのTfRまたはLDLR内皮細胞単層全体にトランスサイトーシスに関与。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="666">
	<tbody>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:189px;">Product</td>
			<td style="width:149px;">Company</td>
			<td style="width:153px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:175px;">Comments / expiration term</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:189px;">BSA fraction V low endotoxin</td>
			<td style="width:149px;">PAA</td>
			<td style="width:153px;">K45-011-500g</td>
			<td style="width:175px;">4 &#176;C&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;width:189px;">Penicillin-Streptomycin</td>
			<td style="width:149px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:153px;">15140-122</td>
			<td style="width:175px;">&#160;- 20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;width:189px;">0,05% Trypsin-EDTA (1X)</td>
			<td style="width:149px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:153px;">25300-054</td>
			<td style="width:175px;">&#160;- 20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;width:189px;">DMEM High Glucose</td>
			<td style="width:149px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:153px;">61965-026</td>
			<td style="width:175px;">4 &#176;C&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="36">
			<td height="36" style="height:36px;width:189px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td style="width:149px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:153px;">10270-098</td>
			<td style="width:175px;">&#160;- 20 &#176;C / 1 year</td>
		</tr>
		<tr height="46">
			<td height="46" style="height:47px;width:189px;">T75 flasks</td>
			<td style="width:149px;">Becton Dickinson Falcon</td>
			<td style="width:153px;">353135</td>
			<td style="width:175px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:43px;width:189px;">HEPES buffer (1 M)</td>
			<td style="width:149px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:153px;">15630-056</td>
			<td style="width:175px;">4 &#176;C / 1 year</td>
		</tr>
		<tr height="50">
			<td height="50" style="height:51px;width:189px;">Collagene type IV mouse (10 x 1 mg)</td>
			<td style="width:149px;">Becton Dickinson</td>
			<td style="width:153px;">356233</td>
			<td style="width:175px;">&#160;- 20 &#176;C / 1 month</td>
		</tr>
		<tr height="48">
			<td height="48" style="height:48px;width:189px;">Fibronectin humain plasma (5 mg)</td>
			<td style="width:149px;">Becton Dickinson</td>
			<td style="width:153px;">356008</td>
			<td style="width:175px;">&#160;- 20 &#176;C / 1 month</td>
		</tr>
		<tr height="46">
			<td height="46" style="height:47px;width:189px;">Vannas Spring Scissors, straight (9 cm)</td>
			<td style="width:149px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:153px;">91500-09</td>
			<td style="width:175px;"></td>
		</tr>
		<tr height="46">
			<td height="46" style="height:47px;width:189px;">Scissors, straight (9 cm)</td>
			<td style="width:149px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:153px;">14568-09</td>
			<td style="width:175px;"></td>
		</tr>
		<tr height="46">
			<td height="46" style="height:47px;width:189px;">Forceps Dumont #5/45 (11 cm)</td>
			<td style="width:149px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:153px;">11251-35</td>
			<td style="width:175px;"></td>
		</tr>
		<tr height="46">
			<td height="46" style="height:47px;width:189px;">Graefe Forceps, tip width 0,8 mm</td>
			<td style="width:149px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:153px;">11050-10</td>
			<td style="width:175px;"></td>
		</tr>
		<tr height="46">
			<td height="46" style="height:47px;width:189px;">Graefe Forceps, curve tip width 0,8 mm</td>
			<td style="width:149px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:153px;">11051-10</td>
			<td style="width:175px;"></td>
		</tr>
		<tr height="50">
			<td height="50" style="height:51px;width:189px;">Collagenases / Dispase mix (2 x 5 mg)</td>
			<td style="width:149px;">Roche Diagnostics</td>
			<td style="width:153px;">05 401 054 001</td>
			<td style="width:175px;">- 20 &#176;C / 3 months</td>
		</tr>
		<tr height="52">
			<td height="52" style="height:52px;width:189px;">DNase I (100 mg / 569 KU / mg)</td>
			<td style="width:149px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:153px;">DN25-100 mg</td>
			<td style="width:175px;">&#160;- 20 &#176;C / 1 year</td>
		</tr>
		<tr height="37">
			<td height="37" style="height:37px;width:189px;">Gentamicin (10 mg/mL)</td>
			<td style="width:149px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:153px;">15710-049</td>
			<td style="width:175px;">4 &#176;C / 1 year</td>
		</tr>
		<tr height="37">
			<td height="37" style="height:37px;width:189px;">DMEM/F12</td>
			<td style="width:149px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:153px;">31331-028</td>
			<td style="width:175px;">4 &#176;C&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="49">
			<td height="49" style="height:49px;width:189px;">Bovine serum from platelet poor plasma (500 mL)</td>
			<td style="width:149px;">Clinisciences</td>
			<td style="width:153px;">BT-214-100</td>
			<td style="width:175px;">&#160;- 20 &#176;C / 1 year</td>
		</tr>
		<tr height="44">
			<td height="44" style="height:44px;width:189px;">bFGF (10 &#181;g)</td>
			<td style="width:149px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:153px;">13256-029</td>
			<td style="width:175px;">&#160;- 20 &#176;C / 6 months</td>
		</tr>
		<tr height="49">
			<td height="49" style="height:49px;width:189px;">Heparine Na salt from porcine mucosa Grade I</td>
			<td style="width:149px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:153px;">H3149-100KU</td>
			<td style="width:175px;">4 &#176;C / 1 year</td>
		</tr>
		<tr height="37">
			<td height="37" style="height:37px;width:189px;">Puromycin</td>
			<td style="width:149px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:153px;">P8833-10 mg</td>
			<td style="width:175px;">&#160;- 20 &#176;C / 6 months</td>
		</tr>
		<tr height="37">
			<td height="37" style="height:37px;width:189px;">ITSX</td>
			<td style="width:149px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:153px;">51500-056</td>
			<td style="width:175px;">4 &#176;C / 1 year</td>
		</tr>
		<tr height="50">
			<td height="50" style="height:51px;width:189px;">Polyethylene hanging cell insert for 12-well plates</td>
			<td style="width:149px;">Millipore</td>
			<td style="width:153px;">PIRP15R48</td>
			<td style="width:175px;">Porosity: 1 &#181;m 
			Surface: 1,1 cm2</td>
		</tr>
		<tr height="46">
			<td height="46" style="height:47px;width:189px;">Hydrocortisone</td>
			<td style="width:149px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:153px;">H0888-1 g</td>
			<td style="width:175px;">&#160;- 20 &#176;C / 1 year</td>
		</tr>
		<tr height="37">
			<td height="37" style="height:37px;width:189px;">Mouse anti-CD31 / PECAM&#160;</td>
			<td style="width:149px;">Chemicon</td>
			<td style="width:153px;">MAB1393, clone TLD-3A12 (1 mg/mL)</td>
			<td style="width:175px;">1/200 - fixation PFA 4%</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:43px;width:189px;">Rabbit anti-Von Willebrand</td>
			<td style="width:149px;">Chemicon</td>
			<td style="width:153px;">AB7356</td>
			<td style="width:175px;">1/200 - fixation PFA 4%</td>
		</tr>
		<tr height="48">
			<td height="48" style="height:48px;width:189px;">Mouse anti-Desmine</td>
			<td style="width:149px;">Chemicon</td>
			<td style="width:153px;">MAB3430</td>
			<td style="width:175px;">1/200 - fixation PFA 4%</td>
		</tr>
		<tr height="48">
			<td height="48" style="height:48px;width:189px;">Mouse anti-Vimentine</td>
			<td style="width:149px;">Invitrogen, Zymed</td>
			<td style="width:153px;">08-0052 clone V9, (58 &#181;g/mL)&#160;</td>
			<td style="width:175px;">1/50 - fixation PFA 4%</td>
		</tr>
		<tr height="48">
			<td height="48" style="height:48px;width:189px;">Mouse anti-Claudin-5</td>
			<td style="width:149px;">Invitrogen, Zymed</td>
			<td style="width:153px;">35-2500, (500 &#181;g/mL)</td>
			<td style="width:175px;">1/200 - fixation PFA 4%</td>
		</tr>
		<tr height="46">
			<td height="46" style="height:47px;width:189px;">Rabbit anti-ZO-1</td>
			<td style="width:149px;">Invitrogen, Zymed</td>
			<td style="width:153px;">61-7300 (250 &#181;g/mL)</td>
			<td style="width:175px;">1/200 - fixation PFA 4%</td>
		</tr>
		<tr height="45">
			<td height="45" style="height:45px;width:189px;">Rabbit anti-Occludine&#160;</td>
			<td style="width:149px;">Invitrogen, Zymed</td>
			<td style="width:153px;">71-1500 (250 &#181;g/mL)</td>
			<td style="width:175px;">1/200 - fixation PFA 4%</td>
		</tr>
		<tr height="72">
			<td height="72" style="height:72px;width:189px;">Alexa fluor 488, 594 conjugated secondary antibodies</td>
			<td style="width:149px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:153px;"></td>
			<td style="width:175px;">1/800</td>
		</tr>
		<tr height="46">
			<td height="46" style="height:47px;width:189px;">Lucifer yellow CH, dilithium salt</td>
			<td style="width:149px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:153px;">L0259</td>
			<td style="width:175px;">&#160;- 20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;width:189px;">TNF-a Human</td>
			<td style="width:149px;">PeproTech</td>
			<td style="width:153px;">300-01A</td>
			<td style="width:175px;">&#160;- 20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="48">
			<td height="48" style="height:48px;width:189px;">Rat MCP-1 ELISA Kit</td>
			<td style="width:149px;">PeproTech</td>
			<td style="width:153px;">900-K59</td>
			<td style="width:175px;">4 &#176;C / - 20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="49">
			<td height="49" style="height:49px;width:189px;">Mouse anti-P-glycoprotein</td>
			<td style="width:149px;">Covance, Eurogentec</td>
			<td style="width:153px;">SIG-38710-1000, clone C219 (1mg/mL)</td>
			<td style="width:175px;">1/400 - fixation PFA 4% 
			1/200 (western blot)</td>
		</tr>
		<tr height="52">
			<td height="52" style="height:52px;width:189px;">Rabbit anti-GLT-1</td>
			<td style="width:149px;">Abcam</td>
			<td style="width:153px;">ab41621</td>
			<td style="width:175px;">1/1000 (western blot)</td>
		</tr>
		<tr height="52">
			<td height="52" style="height:52px;width:189px;">Rhodamine 123</td>
			<td style="width:149px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:153px;">83702</td>
			<td style="width:175px;">4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="52">
			<td height="52" style="height:52px;width:189px;">Verapamil hydrochloride</td>
			<td style="width:149px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:153px;">V4629</td>
			<td style="width:175px;">4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="52">
			<td height="52" style="height:52px;width:189px;">Cyclosporine A</td>
			<td style="width:149px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:153px;">30024</td>
			<td style="width:175px;">4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="122">
			<td height="122" style="height:123px;width:189px;">Monoclonal anti a2 Macroglobulin Receptor (CD91, LRP1) against b-chain of amino acid 4291-4344 within an EGF repeat</td>
			<td style="width:149px;">American Diagnostica</td>
			<td style="width:153px;">3501 (100 &#181;g/mL)</td>
			<td style="width:175px;">1/5 - fixation PFA 4%</td>
		</tr>
		<tr height="37">
			<td height="37" style="height:37px;width:189px;">Mouse anti-LDLR</td>
			<td style="width:149px;">R&#38;D systems</td>
			<td style="width:153px;">AF2255 (200 &#181;g/mL)</td>
			<td style="width:175px;">1/50 - fixation PFA 4%</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;width:189px;">Rat transferrin-Cy3</td>
			<td style="width:149px;">Gentaur</td>
			<td style="width:153px;">JOR160050</td>
			<td style="width:175px;">4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="37">
			<td height="37" style="height:37px;width:189px;">DiILDL</td>
			<td style="width:149px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:153px;">L-3482</td>
			<td style="width:175px;">4 &#176;C</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

setting-up an in vitro model of rat blood-brain barrier (bbb): a focus on bbb impermeability and receptor-mediated transport

血液脳関門（BBB）は、特に、血液と神経組織との間の分子および細胞フラックスを調節する。私たちの目的は、内皮細胞単層全体にトランスサイトーシスに関与する受容体を研究するため、一次ラット脳内皮細胞（RBEC）とアストロサイトの共培養を用いて、BBBのin vitroモデルで再現性の高いラット同系を開発し、特徴づけることでした。アストロサイトは、トリプシン消化後、機械的切開によって単離し、それ以降の共培養のために凍結した。 RBECは、5週齢のラット皮質から単離した。脳を髄膜と白質の洗浄、及び機械的に酵素消化後に解離させた。その後、組織ホモジネートは、神経組織から血管フラグメントを分離するためにウシ血清アルブミン中で遠心分離した。血管フラグメントは、それらの細胞外マトリックスからの内皮細胞を解放する第2の酵素消化を受けた。このような周皮細胞のような残りの混入細胞はFだったurtherピューロ含有培地中での微小血管フラグメントをめっきすることによって解消。次いで、それらをウェルの底上に成長させたアストロサイトとの共培養のためのフィルター上に継代した。 RBECは、セル境界での典型的な現地化などオクルディン、クローディン5およびZO-1のようなタイトジャンクショ​​ン（TJ）タンパク質を高レベルで発現した。脳内皮単層の経内皮電気抵抗（TEER）のTJの気密性 ​​が平均·cm 2で300オームに達したことを示す。ルシファーイエロー（LY）のための内皮透過係数（PE）は0.26±0.11×10 -3センチメートル/分の平均と高度に再現性があった。単層で編成脳内皮細胞は、流出輸送体P-糖タンパク質（P-gpの）を発現ローダミン123、P-gpのためのリガンドの偏光輸送を示し、内皮細胞単層を横切ってトランスフェリン-Cy3およびDiILDLの特定のトランスポートを示した。結論として、我々 は、in vitroを設定するためのプロトコルを提供により品質保証の方法に非常に再現性があり、それがBBBトランスポーターと受容体の研究に適してBBBモデル。

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Setting-up an In Vitro Model of Rat Blood-brain Barrier BBB: A Focus on BBB Impermeability and Receptor-mediated Transport

本研究の目的は、ラット同系内皮細胞とアストロサイトの共培養が関与する生体外 BBBモデルの再現性を検証することでした。内皮細胞単層は、高いTEERと低LY透過性を提示した。特定のTJタンパク質の発現は、炎症および輸送体および受容体の機能性に機能的応答を評価した。

設定アップ<em&gt;体外</emラット血液脳関門の&gt;モデル（BBB）：BBB不透過性および受容体媒介輸送に注力

The blood brain barrier (BBB) specifically regulates molecular and cellular flux between the blood and the nervous tissue. Our aim was to develop and ...

setting-up-an-vitro-model-rat-blood-brain-barrier-bbb-focus-on-bbb

Research

JoVE Journal

Medicine

Setting-up an In Vitro Model of Rat Blood-brain Barrier (BBB): A Focus on BBB Impermeability and Receptor-mediated Transport

42.2K ビュー.  VECT-HORUS SAS. 本研究の目的は、ラット同系内皮細胞とアストロサイトの共培養が関与する生体外 BBBモデルの再現性を検証することでした。内皮細胞単層は、高いTEERと低LY透過性を提示した。特定のTJタンパク質の発現は、炎症および輸送体および受容体の機能性に機能的応答を評価した。 

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MRI-guided Disruption of the Blood-brain Barrier using Transcranial Focused Ultrasound in a Rat Model

Focused ultrasound (FUS) disruption of the blood-brain barrier (BBB) is an increasingly investigated technique for circumventing the BBB1-5. The BBB is a significant obstacle to pharmaceutical treatments of brain disorders as it limits the passage of molecules from the vasculature into the brain tissue to molecules less than approximately 500 Da in size6. FUS induced BBB disruption (BBBD) is temporary and reversible4 and has an advantage over chemical means of inducing BBBD by being highly localized. FUS induced BBBD provides a means for investigating the effects of a wide range of therapeutic agents on the brain, which would not otherwise be deliverable to the tissue in sufficient concentration. While a wide range of ultrasound parameters have proven successful at disrupting the BBB2,5,7, there are several critical steps in the experimental procedure to ensure successful disruption with accurate targeting. This protocol outlines how to achieve MRI-guided FUS induced BBBD in a rat model, with a focus on the critical animal preparation and microbubble handling steps of the experiment.

Microbubble-mediated focused ultrasound disruption of the blood-brain barrier (BBB) is a promising technique for non-invasive targeted drug delivery in the brain1-3. This protocol outlines the experimental procedure for MRI-guided transcranial BBB disruption in a rat model.

ラットモデルでの経頭蓋集束超音波を用いた血液脳関門のMRI誘導破壊

Focused ultrasound (FUS) disruption of the blood-brain barrier (BBB) is an increasingly investigated technique for circumventing the BBB1-5. The BBB is a ...

医学

Rat Model of Blood-brain Barrier Disruption to Allow Targeted Neurovascular Therapeutics

Endothelial cells with tight junctions along with the basement membrane and astrocyte end feet surround cerebral blood vessels to form the blood-brain barrier1. The barrier selectively excludes molecules from crossing between the blood and the brain based upon their size and charge. This function can impede the delivery of therapeutics for neurological disorders. A number of chemotherapeutic drugs, for example, will not effectively cross the blood-brain barrier to reach tumor cells2. Thus, improving the delivery of drugs across the blood-brain barrier is an area of interest.
The most prevalent methods for enhancing the delivery of drugs to the brain are direct cerebral infusion and blood-brain barrier disruption3. Direct intracerebral infusion guarantees that therapies reach the brain; however, this method has a limited ability to disperse the drug4. Blood-brain barrier disruption (BBBD) allows drugs to flow directly from the circulatory system into the brain and thus more effectively reach dispersed tumor cells. Three methods of barrier disruption include osmotic barrier disruption, pharmacological barrier disruption, and focused ultrasound with microbubbles. Osmotic disruption, pioneered by Neuwelt, uses a hypertonic solution of 25% mannitol that dehydrates the cells of the blood-brain barrier causing them to shrink and disrupt their tight junctions. Barrier disruption can also be accomplished pharmacologically with vasoactive compounds such as histamine5 and bradykinin6. This method, however, is selective primarily for the brain-tumor barrier7. Additionally, RMP-7, an analog of the peptide bradykinin, was found to be inferior when compared head-to-head with osmotic BBBD with 25% mannitol8. Another method, focused ultrasound (FUS) in conjunction with microbubble ultrasound contrast agents, has also been shown to reversibly open the blood-brain barrier9. In comparison to FUS, though, 25% mannitol has a longer history of safety in human patients that makes it a proven tool for translational research10-12.
In order to accomplish BBBD, mannitol must be delivered at a high rate directly into the brain's arterial circulation. In humans, an endovascular catheter is guided to the brain where rapid, direct flow can be accomplished. This protocol models human BBBD as closely as possible. Following a cut-down to the bifurcation of the common carotid artery, a catheter is inserted retrograde into the ECA and used to deliver mannitol directly into the internal carotid artery (ICA) circulation. Propofol and N2O anesthesia are used for their ability to maximize the effectiveness of barrier disruption13. If executed properly, this procedure has the ability to safely, effectively, and reversibly open the blood-brain barrier and improve the delivery of drugs that do not ordinarily reach the brain 8,13,14.

Blood-brain barrier disruption aids the delivery of certain drugs to the brain. Mannitol delivered intra-arterially shrinks cells surrounding blood vessels in order to physically disrupt the barrier.

血液脳関門の破壊のラットモデルは、対象となる神経血管治療を許可する

Endothelial cells with tight junctions along with the basement membrane and astrocyte end feet surround cerebral blood vessels to form the blood-brain ...

Stretch in Brain Microvascular Endothelial Cells (cEND) as an In Vitro Traumatic Brain Injury Model of the Blood Brain Barrier

Due to the high mortality incident brought about by traumatic brain injury (TBI), methods that would enable one to better understand the underlying mechanisms involved in it are useful for treatment. There are both in vivo and in vitro methods available for this purpose. In vivo models can mimic actual head injury as it occurs during TBI. However, in vivo techniques may not be exploited for studies at the cell physiology level. Hence, in vitro methods are more advantageous for this purpose since they provide easier access to the cells and the extracellular environment for manipulation.
Our protocol presents an in vitro model of TBI using stretch injury in brain microvascular endothelial cells. It utilizes pressure applied to the cells cultured in flexible-bottomed wells. The pressure applied may easily be controlled and can produce injury that ranges from low to severe. The murine brain microvascular endothelial cells (cEND) generated in our laboratory is a well-suited model for the blood brain barrier (BBB) thus providing an advantage to other systems that employ a similar technique. In addition, due to the simplicity of the method, experimental set-ups are easily duplicated. Thus, this model can be used in studying the cellular and molecular mechanisms involved in TBI at the BBB.

Stretch in Brain Microvascular Endothelial Cells cEND as an In Vitro Traumatic Brain Injury Model of the Blood Brain Barrier

In vitro traumatic brain injury models are being developed to reproduce in vivo brain deformation. Stretch-induced injury has been employed for astrocytes, neurons, glial cells, aortic, and brain endothelial cells. However, our system uses a blood brain barrier (BBB) model that possesses properties constituting a legitimate model of the BBB to establish an in vitro&#160;TBI model.

として脳微小血管内皮細胞（CEND）でストレッチ<em&gt;インビトロ</em血液脳関門の&gt;外傷性脳損傷モデル

Due to the high mortality incident brought about by traumatic brain injury (TBI), methods that would enable one to better understand the underlying ...

Excitotoxic Stimulation of Brain Microslices as an In vitro Model of Stroke

Examining molecular mechanisms involved in neuropathological conditions, such as ischemic stroke, can be difficult when using whole animal systems. As such, primary or &#39;neuronal-like&#39; cell culture systems are commonly utilized. While&#160;these systems are relatively easy to work with, and are useful model systems in which various functional outcomes (such as cell death) can be readily quantified, the examined outcomes and pathways in cultured immature neurons (such as excitotoxicity-mediated cell death pathways) are not necessarily the same as those observed in mature brain, or in intact tissue. Therefore, there is the need to develop models in which cellular mechanisms in mature neural tissue can be examined. We have developed an in vitro technique that can be used to investigate a variety of molecular pathways in intact nervous tissue. The technique described herein utilizes rat cortical tissue, but this technique can be adapted to use tissue from a variety of species (such as mouse, rabbit, guinea pig, and chicken) or brain regions (for example, hippocampus, striatum, etc.). Additionally, a variety of stimulations/treatments can be used (for example, excitotoxic, administration of inhibitors, etc.). In conclusion, the brain slice model described herein can be used to examine a variety of molecular mechanisms involved in excitotoxicity-mediated brain injury.

Excitotoxic Stimulation of Brain Microslices as an In vitro Model of Stroke

We have developed a brain slice model which can be used to examine molecular mechanisms involved in excitotoxicity-mediated brain injury.&#160;This technique generates viable mature brain tissue and reduces animal numbers required for experimentation, whilst keeping the neuronal circuitry, cellular interactions, and postsynaptic compartments partly intact.

脳Microslicesの興奮毒性刺激<em&gt;インビトロ</em&gt;脳卒中のモデル

Examining molecular mechanisms involved in neuropathological conditions, such as ischemic stroke, can be difficult when using whole animal systems. As ...

Oxygen-Glucose Deprivation and Reoxygenation as an In Vitro Ischemia-Reperfusion Injury Model for Studying Blood-Brain Barrier Dysfunction

Ischemia-Reperfusion (IR) injury is known to contribute significantly to the morbidity and mortality associated with ischemic strokes. Ischemic cerebrovascular accidents account for 80% of all strokes. A common cause of IR injury is the rapid inflow of fluids following an acute/chronic occlusion of blood, nutrients, oxygen to the tissue triggering the formation of free radicals.
Ischemic stroke is followed by blood-brain barrier (BBB) dysfunction and vasogenic brain edema. Structurally, tight junctions (TJs) between the endothelial cells play an important role in maintaining the integrity of the blood-brain barrier (BBB). IR injury is an early secondary injury leading to a non-specific, inflammatory response. Oxidative and metabolic stress following inflammation triggers secondary brain damage including BBB permeability and disruption of tight junction (TJ) integrity.
Our protocol presents an in vitro example of oxygen-glucose deprivation and reoxygenation (OGD-R) on rat brain endothelial cell TJ integrity and stress fiber formation. Currently, several experimental in vivo models are used to study the effects of IR injury; however they have several limitations, such as the technical challenges in performing surgeries, gene dependent molecular influences and difficulty in studying mechanistic relationships. However, in vitro models may aid in overcoming many of those limitations. The presented protocol can be used to study the various molecular mechanisms and mechanistic relationships to provide potential therapeutic strategies. However, the results of in vitro studies may differ from standard in vivo studies and should be interpreted with caution.

Oxygen-Glucose Deprivation and Reoxygenation as an In Vitro Ischemia-Reperfusion Injury Model for Studying Blood-Brain Barrier Dysfunction

Ischemia-Reperfusion (IR) injury is associated with a high rate of morbidity and mortality. The goal of the in vitro model of oxygen-glucose deprivation and reoxygenation (OGD-R) described here is to assess the effects of ischemia reperfusion injury on a variety of cells, particularly in blood-brain barrier (BBB) endothelial cells.

などの酸素グルコース欠乏および再酸素化<em&gt;インビトロ</em&gt;虚血再灌流傷害モデル血液脳関門の機能障害を研究するための

Ischemia-Reperfusion (IR) injury is known to contribute significantly to the morbidity and mortality associated with ischemic strokes. Ischemic ...

A Rat Carotid Balloon Injury Model to Test Anti-vascular Remodeling Therapeutics

The rat carotid balloon injury is a well-established surgical model that has been used to study arterial remodeling and vascular cell proliferation. It is also a valuable model system to test, and to evaluate therapeutics and drugs that negate maladaptive remodeling in the vessel. The injury, or barotrauma, in the vessel lumen caused by an inflated balloon via an inserted catheter induces subsequent neointimal growth, often leading to hyperplasia or thickening of the vessel wall that narrows, or obstructs the lumen. The method described here is sufficiently sensitive, and the results can be obtained in relatively short time (2 weeks after the surgery). The efficacy of the drug or therapeutic against the induced-remodeling can be evaluated either by the post-mortem pathological and histomorphological analysis, or by ultrasound sonography in live animals. In addition, this model system has also been used to determine the therapeutic window or the time course of the administered drug. These studies can leadto the development of a better administrative strategy and a better therapeutic outcome. The procedure described here provides a tool for translational studies that bring drug and therapeutic candidates from bench research to clinical applications.

The rat carotid balloon injury model described below allows researchers to evaluate drugs or therapeutics that negate injury-induced arterial hyperplasia. Detailed pre-surgical preparation, surgical procedure, and post-surgical cares of the animal are described.

ラット頸動脈バルーン損傷モデルは、抗血管リモデリングの治療薬をテストします

The rat carotid balloon injury is a well-established surgical model that has been used to study arterial remodeling and vascular cell proliferation. It is ...

Glaucoma-inducing Procedure in an In Vivo Rat Model and Whole-mount Retina Preparation

Glaucoma is a disease of the central nervous system affecting retinal ganglion cells (RGCs). RGC axons making up the optic nerve carry visual input to the brain for visual perception. Damage to RGCs and their axons leads to vision loss and/or blindness. Although the specific cause of glaucoma is unknown, the primary risk factor for the disease is an elevated intraocular pressure. Glaucoma-inducing procedures in animal models are a valuable tool to researchers studying the mechanism of RGC death. Such information can lead to the development of effective neuroprotective treatments that could aid in the prevention of vision loss. The protocol in this paper describes a method of inducing glaucoma - like conditions in an in vivo rat model where 50 &#181;l of 2 M hypertonic saline is injected into the episcleral venous plexus. Blanching of the vessels indicates successful injection. This procedure causes loss of RGCs to simulate glaucoma. One month following injection, animals are sacrificed and eyes are removed. Next, the cornea, lens, and vitreous are removed to make an eyecup. The retina is then peeled from the back of the eye and pinned onto sylgard dishes using cactus needles. At this point, neurons in the retina can be stained for analysis. Results from this lab show that approximately 25% of RGCs are lost within one month of the procedure when compared to internal controls. This procedure allows for quantitative analysis of retinal ganglion cell death in an in vivo rat glaucoma model.

Glaucoma-inducing Procedure in an In Vivo Rat Model and Whole-mount Retina Preparation

Glaucoma is characterized by damage to retinal ganglion cells. Inducing glaucoma in animal models can provide insight into the study of this disease. Here, we outline a procedure that induces loss of RGCs in an in vivo rat model and demonstrates the preparation of whole-mount retinas for analysis.

緑内障誘導の手順<em&gt;インビボ</em&gt;ラットモデルと全体のマウント網膜準備

Glaucoma is a disease of the central nervous system affecting retinal ganglion cells (RGCs). RGC axons making up the optic nerve carry visual input to the ...

In Vitro Assays to Assess Blood-brain Barrier Mesh-like Vessel Formation and Disruption

Blood-brain barrier (BBB) coverage plays a central role in the homeostasis of the central nervous system (CNS). The BBB is dynamically maintained by astrocytes, pericytes and brain endothelial cells (BECs). Here, we detail methods to assess BBB coverage using single cultures of immortalized human BECs, single cultures of primary mouse BECs, and a humanized triple culture model (BECs, astrocytes and pericytes) of the BBB. To highlight the applicability of the assays to disease states, we describe the effect of oligomeric amyloid-&#946; (oA&#946;), which is an important contributor to Alzheimer&#39;s disease (AD) progression, on BBB coverage. Further, we utilize the epidermal growth factor (EGF) to illuminate the drug screening potential of the techniques. Our results show that single and triple cultured BECs form meshwork-like structures under basal conditions, and that oA&#946; disrupts this cell meshwork formation and degenerates the preformed mesh structures, but EGF blocks this disruption. Thus, the techniques described are important for dissecting fundamental and disease-relevant processes that modulate BBB coverage.

In Vitro Assays to Assess Blood-brain Barrier Mesh-like Vessel Formation and Disruption

Maintaining blood-brain barrier coverage is key for the homeostasis of the central nervous system. This protocol describes in vitro techniques to delineate the fundamental and pathological processes that modulate blood-brain barrier coverage.

血液脳関門メッシュ様血管形成および崩壊を評価するためのインビトロアッセイ

Blood-brain barrier (BBB) coverage plays a central role in the homeostasis of the central nervous system (CNS). The BBB is dynamically maintained by ...

Improved Method for the Establishment of an In Vitro Blood-Brain Barrier Model Based on Porcine Brain Endothelial Cells

The aim of this protocol presents an optimized procedure for the purification and cultivation of pBECs and to establish in vitro blood-brain barrier (BBB) models based on pBECs in mono-culture (MC), MC with astrocyte-conditioned medium (ACM), and non-contact co-culture (NCC) with astrocytes of porcine or rat origin. pBECs were isolated and cultured from fragments of capillaries from the brain cortices of domestic pigs 5-6 months old. These fragments were purified by careful removal of meninges, isolation and homogenization of grey matter, filtration, enzymatic digestion, and centrifugation. To further eliminate contaminating cells, the capillary fragments were cultured with puromycin-containing medium. When 60-95% confluent, pBECs growing from the capillary fragments were passaged to permeable membrane filter inserts and established in the models. To increase barrier tightness and BBB characteristic phenotype of pBECs, the cells were treated with the following differentiation factors: membrane permeant 8-CPT-cAMP (here abbreviated cAMP), hydrocortisone, and a phosphodiesterase inhibitor, RO-20-1724 (RO). The procedure was carried out over a period of 9-11 days, and when establishing the NCC model, the astrocytes were cultured 2-8 weeks in advance. Adherence to the described procedures in the protocol has allowed the establishment of endothelial layers with highly restricted paracellular permeability, with the NCC model showing an average transendothelial electrical resistance (TEER) of 1249 &#177; 80 &#937; cm2, and paracellular permeability (Papp) for Lucifer Yellow of 0.90 10-6 &#177; 0.13 10-6 cm sec-1 (mean &#177; SEM, n=55). Further evaluation of this pBEC phenotype showed good expression of the tight junctional proteins claudin 5, ZO-1, occludin and adherens junction protein p120 catenin. The model presented can be used for a range of studies of the BBB in health and disease and, with the highly restrictive paracellular permeability, this model is suitable for studies of transport and intracellular trafficking.

Improved Method for the Establishment of an In Vitro Blood-Brain Barrier Model Based on Porcine Brain Endothelial Cells

The aim of the protocol is to present an optimized procedure for the establishment of an in vitro blood-brain barrier (BBB) model based on primary porcine brain endothelial cells (pBECs). The model shows high reproducibility, high tightness, and is suitable for studies of transport and intracellular trafficking in drug discovery.

体外血液脳関門ブタ脳血管内皮細胞に基づくモデルの確立のための改良法

The aim of this protocol presents an optimized procedure for the purification and cultivation of pBECs and to establish in vitro blood-brain barrier (BBB) ...

Endothelial Cell Transcytosis Assay as an In Vitro Model to Evaluate Inner Blood-Retinal Barrier Permeability

Dysfunction of the blood-retinal barrier (BRB) contributes to the pathophysiology of several vascular eye diseases, often resulting in retinal edema and subsequent vision loss. The inner blood-retinal barrier (iBRB) is mainly composed of retinal vascular endothelium with low permeability under physiological conditions. This feature of low permeability is tightly regulated and maintained by low rates of paracellular transport between adjacent retinal microvascular endothelial cells, as well as transcellular transport (transcytosis) through them. The assessment of retinal transcellular barrier permeability may provide fundamental insights into iBRB integrity in health and disease. In this study, we describe an endothelial cell (EC) transcytosis assay, as an in vitro model for evaluating iBRB permeability, using human retinal microvascular endothelial cells (HRMECs). This assay assesses the ability of HRMECs to transport transferrin and horseradish peroxidase (HRP) in receptor- and caveolae-mediated transcellular transport processes, respectively. Fully confluent HRMECs cultured on porous membrane were incubated with fluorescent-tagged transferrin (clathrin-dependent transcytosis) or HRP (caveolae-mediated transcytosis) to measure the levels of transferrin or HRP transferred to the bottom chamber, indicative of transcytosis levels across the EC monolayer. Wnt signaling, a known pathway regulating iBRB, was modulated to demonstrate the caveolae-mediated HRP-based transcytosis assay method. The EC transcytosis assay described here may provide a useful tool for investigating the molecular regulators of EC permeability and iBRB integrity in vascular pathologies and for screening drug delivery systems.

Endothelial Cell Transcytosis Assay as an In Vitro Model to Evaluate Inner Blood-Retinal Barrier Permeability

This protocol illustrates an in vitro endothelial cell transcytosis assay as a model to evaluate inner blood-retinal barrier permeability by measuring the ability of human retinal microvascular endothelial cells to transport horseradish peroxidase across cells in caveolae-mediated transcellular transport processes.

内血網膜バリア透過性を評価する ためのin vitro モデルとしての内皮細胞トランスサイトーシスアッセイ

Dysfunction of the blood-retinal barrier (BRB) contributes to the pathophysiology of several vascular eye diseases, often resulting in retinal edema and ...